重組成纖維細胞生長因子-8b的生產(chǎn)方法及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程領(lǐng)域，具體設(shè)及重組成纖維細胞生長因子-8b的生產(chǎn)方法及 其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 成纖維細胞生長因子-8(fibroblastgrowthfactor8,FGF-8)屬于成纖維細胞 生長因子家族成員，與已發(fā)現(xiàn)家族成員具有30%~40%同源性。FGW最早于雄激素依賴 的小鼠乳腺癌細胞株SC-3提取獲得。人FGW基因位于染色體10q24區(qū)段，有6個外顯子， 由233個氨基酸組成，成熟FGW是由去掉N端39個氨基酸信號膚的194個氨基酸殘基組 成的多膚（分子量約為23kDa)，是等電點約為10. 5的堿性蛋白。人FGW具有a、b、e、f四 種亞型，F(xiàn)GF8b為其優(yōu)勢表達型，且其與FGF受體的結(jié)合能力最強。廣泛的文獻報道FGF8 與胚胎發(fā)育，細胞增殖、分化，腫瘤生長，組織損傷修復(fù)W及血管生成密切相關(guān)。研究表明 FGW是一種廣譜神經(jīng)營養(yǎng)因子，能維持神經(jīng)細胞存活和促進神經(jīng)干細胞定向分化成多己胺 值opamine，DA)神經(jīng)元?；赪上特性，F(xiàn)GW有望能夠直接用于治療退行性神經(jīng)性疾病，因 此受到學(xué)者的廣泛關(guān)注。FGW在實驗研究的需求將會大大增加。
[0003] 桿狀病毒表達系統(tǒng)自20世紀(jì)80年代開始至今，已經(jīng)成為基因工程四大表達系統(tǒng) (即桿狀病毒、大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)）之一，重組桿狀病毒載體具有重組 蛋白生產(chǎn)能力強、生產(chǎn)周期短，安全可靠和易擴大等優(yōu)點，而且表達的蛋白與天然蛋白結(jié)構(gòu) 和生物活性均非常相似，廣泛用于基因治療，疫苗生產(chǎn)，生物制藥。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對W上發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)表達成熟的FGF8b蛋白，獲得 具有生物活性的重組蛋白，為FGF8b的進一步研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。 陽0化]本發(fā)明的目的之一是提供一種重組成纖維細胞生長因子-8b蛋白的生產(chǎn)方法，W解決能夠大批量生產(chǎn)具有生物活性的FGF8b蛋白的問題，滿足生產(chǎn)和可W對FGF8b蛋白的 需求。
[0006] 本發(fā)明的還有一個目的是重組成纖維細胞生長因子-8b蛋白用于治療帕金森疾 病的用途，通過帕金森細胞模型，能夠看出本發(fā)明制備的FGF8b蛋白具有對帕金森細胞模 型具有保護作用。 陽007]為此，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0008] 一種重組成纖維細胞生長因子-8b蛋白的生產(chǎn)方法，包括W下步驟：
[0009] 步驟一、利用昆蟲桿狀病毒載體表達系統(tǒng)在昆蟲細胞中表達成纖維細胞生長因 子-8b蛋白，具體包括：
[0010] 1)獲得重組桿狀病毒Bacmid-FGF8b，其中FGF8b基因為成纖維細胞生長因子-8b 基因，其堿基序列如SEQIDNO: 1所示，
[0011] 2)用步驟1)得到的一定M0I的Bacmid-FGF8b重組桿狀病毒侵染昆蟲細胞，侵染 后于溫度25~29°C下震蕩懸浮培養(yǎng)3化~12化后收獲細胞液；W及，
[0012] 步驟二、從步驟一收獲的細胞液中純化得到成纖維細胞生長因子-8b蛋白。
[0013] 優(yōu)選的是，所述的重組成纖維細胞生長因子-8b蛋白的生產(chǎn)方法中，所述步驟2) 中，使用M0I為8的Bacmid-FGF8b重組桿狀病毒侵染昆蟲細胞。
[0014] 優(yōu)選的是，所述的重組成纖維細胞生長因子-8b蛋白的生產(chǎn)方法中，所述步驟2) 中，用Bacmid-FGF8b重組桿狀病毒侵染昆蟲細胞后于溫度26. 5~27. 5°C下震蕩懸浮培養(yǎng) 6化后收獲細胞。
[0015] 優(yōu)選的是，所述的重組成纖維細胞生長因子-8b蛋白的生產(chǎn)方法中，所述步驟1) 中，獲得的所述重組桿狀病毒Bacmid-FGF8b為第四代重組桿狀病毒。
[0016] 優(yōu)選的是，所述的重組成纖維細胞生長因子-8b蛋白的生產(chǎn)方法中，所述步驟1) 中，獲得重組桿狀病毒Bacmid-FGF8b的具體方法包括：
[0017] 步驟1. 1)WpUC57-FGF8b載體為模板，利用如沈QIDNO: 2和沈QIDNO: 3所示 的引物序列通過PCR擴增得到如SEQIDN0:1所示的核巧酸序列的基因片段，并將其構(gòu)建 到pFas巧ac質(zhì)粒上W得到pFas巧ac-FGF8b重組載體；
[0018] 步驟1. 2)利用步驟1. 1)中得到的pFas巧ac-FGF8b重組載體轉(zhuǎn)座含有Bacmid質(zhì) 粒的E.Coli畑lOBac感受態(tài)細胞中，從而使其發(fā)生同源重組W得到Bacmid-FGF8b重組載 體；
[0019] 步驟1. 3)利用Bacmid--FGF8b重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲細胞W得到第一代重組桿狀病 毒；
[0020] 步驟1. 4)將步驟1. 3)中得到的第一代重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染昆蟲細胞W表達得到第 二代重組桿狀病毒，之后再利用同樣的方法侵染昆蟲細胞直到得到第四代重組桿狀病毒。
[0021] 優(yōu)選的是，所述的重組成纖維細胞生長因子-8b蛋白的生產(chǎn)方法中，所述步驟二 中，從步驟一中收獲的細胞液中純化得到成纖維細胞生長因子-8b蛋白的具體過程包括：
[0022] 收集昆蟲細胞液后，首先于500g離屯、5min收集細胞沉淀，之后向所述細胞沉淀 中加入20倍昆蟲細胞液體積的憐酸緩沖液重懸細胞沉淀，冰上超聲破碎5min，然后再于 14000g離屯、20min收集上清液，再將上清液經(jīng)0. 22μm濾膜抽濾后W0. 5ml/min的流速上 樣于肝素親和層析柱，最后依次用含質(zhì)量體積濃度0. 6mol/L和1. 2mol/L化C1的憐酸緩沖 液對所述肝素親和層析柱進行梯度洗脫，即得到重組成纖維細胞生長因子-8b蛋白。
[0023] 優(yōu)選的是，所述的重組成纖維細胞生長因子-8b蛋白的生產(chǎn)方法中，所述憐酸緩 沖液的質(zhì)量體積濃度為50mmol/L。
[0024] 優(yōu)選的是，所述的重組成纖維細胞生長因子-8b蛋白的生產(chǎn)方法中，進行所述梯 度洗脫時，首先使用含質(zhì)量體積濃度〇.6mol/L化C1的憐酸緩沖液對所述肝素親和層析柱 W速率洗脫時間，然后再使用含質(zhì)量體積濃度和1. 2mol/L化C1的憐酸緩沖液對所述肝素 親和層析柱W速率洗脫時間。
[00巧]優(yōu)選的是，所述的重組成纖維細胞生長因子-8b蛋白的生產(chǎn)方法中，所述昆蟲細 胞為S巧細胞。
[00%] 重組成纖維細胞生長因子-8b蛋白用于治療帕金森疾病的用途。
[0027] 本發(fā)明的有益效果為：
[0028] 本發(fā)明成功在桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達了FGF8b，純化后蛋白純度達90%W上， 蛋白產(chǎn)量約為2. 78mg/l，能夠在短時間獲得大量的純化蛋白，且不需要再對蛋白進行翻譯 后加工，獲得方式快速方便，能夠滿足生產(chǎn)和研究的需要。并且，純化蛋白明顯促進NIH3T3 細胞增殖，且在0. 5ng/ml~64ng/ml之間有劑量依賴性。在帕金森細胞模型促增殖實驗， FGF8b蛋白起到明顯的保護作用，且對帕金森疾病也具有一定的抑制作用，本發(fā)明對帕金森 疾病的治療奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0029] 圖1為FGF8b基因片段和pFas憂ac載體雙酶切凝膠電泳鑒定圖。
[0030] 圖2為pFas巧ac-FGF8b雙酶切凝膠電泳鑒定圖。
[0031] 圖3為PCR鑒定重組桿狀病毒DNA凝膠電泳圖。
[0032] 圖4a為Westernblot檢測不同時間蛋白表達情況圖。
[0033] 圖4b為Westernblot檢測不同病毒滴度蛋白表達圖。
[0034] 圖5為FGF8b蛋白純化的SDS-PAGE分析圖。
[0035] 圖6為FGF8b蛋白純化的Westernblot鑒定圖。
[0036] 圖7為不同濃度的FGF8b和bFGF蛋白對NI冊T3細胞增殖活性分析圖。
[0037] 圖8為不同濃度MPP+對PC12細胞的毒性作用結(jié)果示意圖。 陽03引 圖9a為正常PC12細胞（100μπι)示意圖。
[0039] 圖9b為帕金森造模后的PC12細胞（100μm)示意圖。 W40] 圖10為不同濃度FGF8b和bFGF蛋白對帕金森細胞模型的細胞增殖作用的結(jié)果示 意圖。
[0041] 圖11a為空白對照處理的帕金森細胞模型的細胞調(diào)亡率的流失細胞檢測圖。 陽0創(chuàng)圖1化為MPP+處理的帕金森細胞模型的細胞調(diào)亡率的流失細胞檢測圖。 陽0創(chuàng)圖11c為MPP++FGF8b處理的帕金森細胞模型的細胞調(diào)亡率的流失細胞檢測圖。W44] 圖lid為MPP++bFGF處理的帕金森細胞模型的細胞調(diào)亡率的流失細胞檢測圖。 W45] 圖1le為流式細胞儀檢測FGF8b和bFGF對帕金森細胞模型的抗調(diào)亡作用的結(jié)果 示意圖。
【具體實施方式】
[0046] 根據(jù)本發(fā)明，可采用本領(lǐng)域技能中的常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細胞學(xué)和DNA重 組技術(shù)。如果出現(xiàn)于本文下來術(shù)語的定義如下。
[0047] "DNA分子"指脫氧核糖核巧酸（胸腺喀晚、胞喀晚、腺嚷嶺或鳥嚷嶺）的聚合形式， 是染色體主要組成成分，同時也是組成基因的材料。運一術(shù)語只指分子的一級和二級結(jié)構(gòu)， 不限制其任何具體的Ξ級形式。本術(shù)語包括特別是在線性DNA分子、病毒、染色體、質(zhì)粒中 國發(fā)現(xiàn)的雙鏈DNA。運里討論的結(jié)構(gòu)，按照習(xí)慣上給出的只是DNA正義鏈的5'到3'方向的 序列。
[0048] "載體"是指能夠轉(zhuǎn)運與其連接的另一個核酸的核酸分子，一種類型的載體是"質(zhì) 粒"，質(zhì)粒是其他的DNA片段可與其連接的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一類型的載體是病毒載體， 其可將其他的DNA片段連接至病毒基因組。某些載體整合至宿主細胞基因組中，并得W與 宿主基因組一起復(fù)制。并且，某些載體能指導(dǎo)與其可操作連接的基因的表達，一般使用的運 樣的表達載體為質(zhì)粒形式。