專利名稱：一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulatingfactor，G-CSF)具有促進(jìn)粒系造血干細(xì)胞增殖分化及增強(qiáng)成熟粒細(xì)胞功能的作用，對(duì)于骨髓移植時(shí)促進(jìn)中性白細(xì)胞增加、癌癥化療時(shí)引起的嚴(yán)重中性粒細(xì)胞缺乏癥、以及再生障礙性貧血伴隨的中性白細(xì)胞缺乏癥均有明顯療效。
基因工程重組G-CSF的生物學(xué)活性與天然的相似，可大規(guī)模生產(chǎn)，以滿足臨床需要?，F(xiàn)有的生產(chǎn)方法中大腸桿菌表達(dá)外源蛋白，多數(shù)以不溶性包涵體的形式存在，包涵體是不具有生物學(xué)活性的，在生產(chǎn)過程中需要經(jīng)過變性、復(fù)性處理，恢復(fù)其生物學(xué)活性。普遍存在的問題是復(fù)性率低，文獻(xiàn)報(bào)道的生產(chǎn)工藝多數(shù)是用包涵體直接復(fù)性的，復(fù)性率在20％左右。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有生產(chǎn)方法存在的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子復(fù)性率低和生產(chǎn)成本高的缺陷，本發(fā)明提供了一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的生產(chǎn)方法，生產(chǎn)步驟包括發(fā)酵→破菌、提取包涵體→分子篩層析→復(fù)性→陰離子交換→陽離子交換→原液，是一種簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、高效的生產(chǎn)方法。
選用BL21作為表達(dá)G-CSF的宿主菌G-CSF基因采用化學(xué)合成法，按照其基因序列，將編碼N端幾個(gè)氨基酸的密碼子改為大腸桿菌偏愛的密碼子，全基因合成后重組于表達(dá)載體PBV220中，轉(zhuǎn)化不同類型的大腸桿菌，對(duì)其表達(dá)量和傳代穩(wěn)定性進(jìn)行考察，篩選出高效表達(dá)且傳代穩(wěn)定的菌種，作為工程菌的菌種。重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)生產(chǎn)所用的工程菌等選用大腸桿菌BL21作宿主菌，重組質(zhì)粒PBV220-G-CSF在其中傳代穩(wěn)定且可實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。最突出的特點(diǎn)是發(fā)酵過程中升溫誘導(dǎo)后菌體仍可繼續(xù)繁殖，使其菌體密度進(jìn)一步提高。通過比較發(fā)現(xiàn)G-CSF在BL21中傳代穩(wěn)定、表達(dá)量高且生長(zhǎng)繁殖較快。表1為用DH5α和BL21表達(dá)G-CSF的比較。
表1.兩種宿主菌表達(dá)G-CSF的比較

在發(fā)酵過程中工程菌菌種接種于搖瓶的LB液體培養(yǎng)基中30℃振蕩培養(yǎng)，擴(kuò)增獲得一級(jí)種子液，再按1％轉(zhuǎn)種擴(kuò)大培養(yǎng)獲得二級(jí)種子液，然后按10％轉(zhuǎn)種于發(fā)酵罐中已滅菌的LB+M9培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，并通過通氣量和攪拌速度控制溶氧、用堿調(diào)pH值，適當(dāng)補(bǔ)料，進(jìn)一步增菌至OD600在2.5-3.0時(shí)，升溫至42℃熱誘導(dǎo)，誘導(dǎo)4h表達(dá)目的蛋白。通過發(fā)酵參數(shù)的控制，使細(xì)菌生長(zhǎng)旺盛，并在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)升溫誘導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)高密度高效表達(dá)。
G-CSF在大腸桿菌中以不溶性包涵體的形式表達(dá)，離心收集菌體后，用溶菌酶和超聲的方法破菌、提取包涵體，并進(jìn)行洗滌，包涵體用8mol/L的脲變性處理，溶解后的包涵體rhG-CSF純度可達(dá)70％以上，通過包涵體的提取和洗滌，G-CSF得到了初步純化。
為了提高復(fù)性效果，在復(fù)性之前用分子篩層析進(jìn)行了進(jìn)一步純化，除去了部分大分子雜質(zhì)。
rhG-CSF在原核細(xì)胞大腸桿菌中表達(dá)是以不溶性包涵體的形式存在的，需要變性、復(fù)性處理恢復(fù)其生物學(xué)活性。復(fù)性采用透析的復(fù)性方法，緩慢降低變性劑的濃度，并加入G-SH/GSSG，促進(jìn)二硫鍵的形成，使變性蛋白恢復(fù)其空間構(gòu)象，提高了復(fù)性率。
通過陰離子交換層析進(jìn)一步純化，去除殘留的雜質(zhì)和聚合體，并且復(fù)性液直接上陰離子交換柱純化，不需要濃縮。
純化工藝在分子篩層析和陰離子交換層析兩步純化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步陽離子交換，使得原液的細(xì)菌內(nèi)毒素殘留量水平明顯降低，比活有較大幅度的提高，可得到高純度、高比活的G-CSF原液。純化后的原液SDS-PAGE純度分析上呈現(xiàn)單一條帶，HPLC純度分析呈現(xiàn)單一峰，細(xì)菌內(nèi)毒素按＜3EU/300μg(國家標(biāo)準(zhǔn)10EU/300μg)標(biāo)準(zhǔn)檢查仍合格，菌體蛋白殘留量＜0.01％(國家標(biāo)準(zhǔn)是0.1％)。陰離子交換柱后的比活為1.1×108U/mg，陽離子交換柱后的比活達(dá)1.5×108U/mg。從包涵體到原液的總回收率在20％以上。


圖1發(fā)酵過程中誘導(dǎo)不同時(shí)間時(shí)的表達(dá)量
1分子量Marker(分子量分別是94、67、43、30、21、14.4KD，以下的Marker相同)2、3、4、5分別是42℃誘導(dǎo)1h、2h、3h、4h時(shí)G-CSF的表達(dá)量圖2rhG-CSF的分子篩層析曲線圖3.rhG-CSF的分子篩層析的SDS-PAGE分析結(jié)果1分子量Marker 2純化前 3純化后 4層析曲線中的第一個(gè)峰 5第2個(gè)峰的上升支 6第二個(gè)峰的下降支圖4DEAE-Sepharose FF離子交換層析曲線及SDS-PAGE分析結(jié)果1.上樣峰；2.0.1mol/L NaCl洗脫峰；3.1mol/L NaCl洗脫峰；4.分子量marker圖5.CM-Sepharose FF離子交換層析曲線圖6.rhG-CSF純化過程中的SDS-PAGE分析1包涵體 2分子篩純化后 3陰離子柱純化后 4陽離子柱純化后 5分子量Marker圖7.rhG-CSF原液的SDS-PAGE純度檢測(cè)結(jié)果具體實(shí)施方式
實(shí)施例1發(fā)酵將工程菌菌種接種于LA平板中，30℃培養(yǎng)，長(zhǎng)成菌落后，挑取單菌落接種于10mlLA液體培養(yǎng)液中，30℃振蕩培養(yǎng)獲得一級(jí)種子液，按1％轉(zhuǎn)種于LA液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)獲得二級(jí)種子液。
配制發(fā)酵培養(yǎng)基，能耐高壓的部分加入發(fā)酵罐中高壓滅菌，將不耐高壓的成分過濾除菌，等發(fā)酵罐中的液體降溫后補(bǔ)加進(jìn)去，并將新培養(yǎng)的種子液按10％的比例接種于發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。控制培養(yǎng)溫度為30℃、用氨水調(diào)pH值使pH穩(wěn)定在6.8和7.4之間、通過調(diào)節(jié)通氣量和轉(zhuǎn)速控制溶氧＞70％，并適當(dāng)補(bǔ)料。增菌至OD600在2.5-3.0時(shí)，升高溫度至42℃進(jìn)行熱誘導(dǎo)，誘導(dǎo)不同時(shí)間時(shí)的表達(dá)量見圖1。誘導(dǎo)4h結(jié)束發(fā)酵，離心收集菌體，-70℃凍存?zhèn)溆?。每升可得濕菌體10g以上，表達(dá)量達(dá)50％。
實(shí)施例2破菌、洗滌包涵體將濕菌體用TE(50mmol/LTris-Cl、5mmol/LEDTA)按1∶10(g/ml)的比例懸浮菌體，加溶菌酶至終濃度1mg/ml，4℃放置4h，冰浴中超聲破碎，6min/次，歇間3min，共7次。4℃、8500rpm離心15min，棄上清，沉淀重懸于T E緩沖液中，重復(fù)上述過程兩次，沉淀用2mol/L脲洗滌二遍。
沉淀用8mmol/L脲，2mmol/L EDTA，1mmol/L DTT，50mmol/LTris-HCl pH 8.0的液體溶解，4℃、8500rpm離心15min，上清即包涵體溶出液。
實(shí)施例3分子篩層析取上述包涵體溶出液，加DTT至終濃度5mmol/L，30℃水浴30min上柱，流動(dòng)相為8mmol/L脲，2mmol/L EDTA，1mmol/LDTT，50mmol/L Tris-HCl pH 8.0，流速約0.7ml/min，分部收集洗脫峰。層析曲線見圖2，目的蛋白位于第二個(gè)峰中，經(jīng)分子篩純化，可去掉分子量大于30KD的雜蛋白，見圖3。
實(shí)施例4復(fù)性初步純化后的樣品用8mmol/L脲、1mmol/L EDTA，1mmol/LDTT，50mmol/L Tris-HCl pH 8.0稀釋至OD280＝0.25，裝于透析袋中，對(duì)4倍體積的4mmol/L脲、20mmol/L Tris-HCl pH8.0，4mmol/LG-SH/1mmol/LGSSG透析過液，換1mmol/L脲、20mmol/L Tris-HCL，pH8.0，透析24h，換同樣體積的20mmol/LTris-HCl，pH8.0透析8h以上。將樣品溶液經(jīng)孔徑0.45um濾膜過濾，準(zhǔn)備上DEAE層析柱。
實(shí)施例5DEAE-SepharoseFF柱純化平衡緩沖液20mmol/L Tris-HCl pH8.0，目的蛋白在0.1mol/L NaCl的鹽濃度下被洗脫，1mol/L NaCl濃脫變性蛋白和雜蛋白，層析曲線和SDS-PAGE見圖4。
實(shí)施例6CM-SephroseFF陽離子交換柱純化平衡緩沖液20mmol/L NaAc-HCL PH4.0先用含0.3M NaCL的20mM NaAc-HAc PH4.0洗柱，再用含0.45M NaCL的20mM NaAc-HAc pH4.0緩沖液洗脫目的蛋白見圖5。
實(shí)施例7G-CSF純度分析采用SDS-PAGE和HPLC兩種方法進(jìn)行，結(jié)果見圖6、圖7，分別呈現(xiàn)單一條帶和單一峰。
權(quán)利要求
1.一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的生產(chǎn)方法，其特征在于操作步驟如下發(fā)酵→破菌、提取包涵體→分子篩層析→復(fù)性→陰離子交換→陽離子交換→原液。
2.如權(quán)利要求1所述重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的生產(chǎn)方法，其特征在于選用BL21作為表達(dá)G-CSF的宿主菌。
3.如權(quán)利要求1所述重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的生產(chǎn)方法，其特征在于發(fā)酵過程中，工程菌菌種接種于搖瓶的LB液體培養(yǎng)基中30℃振蕩培養(yǎng)，擴(kuò)增獲得一級(jí)種子液，再按1％轉(zhuǎn)種擴(kuò)大培養(yǎng)獲得二級(jí)種子液，然后按10％轉(zhuǎn)種于發(fā)酵罐中已滅菌的LB+M9培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，并通過通氣量和攪拌速度控制溶氧、用堿調(diào)pH值，適當(dāng)補(bǔ)料，進(jìn)一步增菌至OD600在2.5-3.0時(shí)，升溫至42℃熱誘導(dǎo)，誘導(dǎo)4h表達(dá)目的蛋白，通過發(fā)酵參數(shù)的控制，使細(xì)菌生長(zhǎng)旺盛，并在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)升溫誘導(dǎo)。
4.如權(quán)利要求1所述重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的生產(chǎn)方法，其特征在于破菌、提取包涵體的步驟中采用溶菌酶和超聲的方法破菌、提取包涵體，并進(jìn)行洗滌，包涵體用8mol/L的脲變性處理。
5.如權(quán)利要求1所述重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的生產(chǎn)方法，其特征在于復(fù)性步驟中采用透析的方法，緩慢降低變性劑的濃度，并加入G-SH/GSSG，促進(jìn)二硫鍵的形成。
6.如權(quán)利要求1所述重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的生產(chǎn)方法，其特征在于陰離子交換采用DEAE-SepharoseFF柱純化。
7.如權(quán)利要求1所述重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的生產(chǎn)方法，其特征在于陽離子交換采用CM-SephroseFF陽離子交換柱純化。
全文摘要
本發(fā)明一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的生產(chǎn)方法，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。生產(chǎn)工藝發(fā)酵→破菌、提取包涵體→分子篩層析→復(fù)性→陰離子交換→陽離子交換→原液。選用BL21作宿主菌，獲得繁殖速度快，傳代穩(wěn)定，表達(dá)量高的工程菌菌種；幾個(gè)純化步驟使得原液的細(xì)菌內(nèi)毒素殘留量水平明顯降低，比活有較大幅度的提高。包涵體先進(jìn)行初步純化后再進(jìn)行復(fù)性，復(fù)性采用透析法，緩慢降低變性劑的濃度，使復(fù)性率保持在較高水平。本發(fā)明的方法能夠達(dá)到穩(wěn)定、高效、批量生產(chǎn)的要求。
文檔編號(hào)C07K1/00GK1814779SQ200510045388
公開日2006年8月9日 申請(qǐng)日期2005年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月20日
發(fā)明者陳文芳, 宋磊, 劉紅軍 申請(qǐng)人:山東泉港藥業(yè)有限公司