專利名稱：重組人成骨蛋白－1的“一步純化”法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人成骨蛋白-1的純化方法，尤其涉及一種基因工程菌所表達的重組人成骨蛋白-1(rhOP-1)成熟肽的“一步純化”方法，屬生物技術(shù)制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
成骨蛋白-1(Osteogenic protein-1，OP-1)，又名骨形成蛋白-7(Bonemorphogenetic protein-7，BMP-7)，是TGF-β超家族中的一員。OP-1是一種多用途的蛋白可用于治療骨及軟骨的缺損及在矯形和整形外科有廣泛的應(yīng)用。其在骨折方面的治療作用已被大量的臨床試驗所證明是非常有效的，它能治愈現(xiàn)有的所有技術(shù)無法治愈的骨不連和骨缺損。在治療牙周病方面OP-1還具有能促進牙周重建、牙槽骨密度增高等功效，這對于牙的種植具有重大的應(yīng)用前景(Giannobile WV et al.，J Periodontol.，1998，69129)。
利用基因工程原核表達體系可以獲得大量的目的蛋白，但是，OP-1的純化、復(fù)性卻一直是一個具有挑戰(zhàn)性的難題，通常的純化需要多步層析才能夠完成，耗時長，丟失多。目前雖然有表達成功的報道，但是尚沒有一套高效率重組人成骨蛋白-1(rhOP-1)的純化、復(fù)性方法。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種重組人成骨蛋白-1(rhOP-1)成熟肽的“一步純化”方法，利用本發(fā)明提供的方法，將rhOP-1的粗品提取液通過離子交換柱層析一步純化，即可獲得高純度的rhOP-1蛋白，實現(xiàn)純化生產(chǎn)rhOP-1的目的，并且本發(fā)明所述的方法還具有高效快速的優(yōu)點，適合企業(yè)生產(chǎn)放大。
本發(fā)明所述的基因工程菌所表達的重組人成骨蛋白-1(rhOP-1)成熟肽利用常規(guī)技術(shù)設(shè)計引物，從人胚胎組織中獲得了目的基因；利用基因工程技術(shù)構(gòu)建表達質(zhì)粒，通過宿主菌轉(zhuǎn)化實驗篩選、建立了重組人成骨蛋白-1(rhOP-1)高效表達體系，構(gòu)建了含有目的蛋白OP-1成熟肽基因(即人OP-1成熟肽基因序列，其核苷酸序列為http//www.ncbi.nlm.nih.gov/，公開的SEQ ID NO.1http//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nucleotide&val＝4502426公開序列mat_peptide999---1415/gene＝″BMP7″；所述核苷酸序列SEQ ID NO.1表達的蛋白質(zhì)序列為SEQ ID NO.2(139氨基酸，其序列為http//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？val＝4502427&itemID＝7&view＝gpwithparts公開序列)表達系統(tǒng)；宿主菌為常規(guī)技術(shù)使用的BL21系列、DH5α大腸桿菌(①李邦??；莊玉輝人成骨蛋白-1成熟肽基因在大腸桿菌中的克隆與表達生物技術(shù)通訊1999.03.30；10(1)17-19；②陳文；史俊南；付士紅；孫葉芳；梁國棟；侯云德人成骨蛋白-1成熟肽基因5’端的修飾及其在大腸桿菌中的表達牙體牙髓牙周病學(xué)雜志1998.03.30；8(1)3-6，)。利用常規(guī)熱誘導(dǎo)表達，即可獲得目的蛋白質(zhì)的高表達，目的蛋白的表達量占菌體總蛋白的30％左右，本發(fā)明所述的rhOP-1在大腸桿菌中以包涵體的形式存在。
本發(fā)明所述的基因工程菌所表達的重組人成骨蛋白-1的“一步純化”法，其特征在于將工程菌破碎，包涵體洗滌，重組蛋白變性，一步層析純化，SDS-PAGE電泳分析，即可獲得95％以上純度的重組人成骨蛋白-1。
其中，所述工程菌破碎可以是采用冰浴超聲裂菌或者其他常規(guī)裂菌方法，將工程菌破碎至鏡檢細菌破碎率大于98％，即得包涵體混合液。
其中，所述包涵體洗滌是將包涵體混合液于4℃，6000g，離心15～20min，收集其沉淀物；用包涵體洗滌液1和包涵體洗滌液2依次分別以4℃，8000g條件，洗滌離心20～30min，得包涵體沉淀物；上述包涵體洗滌液1成分是20mmol/L磷酸鹽緩沖液，體積百分比為1％ Triton 100，pH 6.0；上述包涵體洗滌液2成分是20mmol/L磷酸鹽緩沖液，2mol/L Urea，pH 6.0。
其中，所述重組蛋白變性，一步層析純化是指將洗滌后得到的包涵體沉淀物用包涵體溶解液即平衡緩沖液A溶解，12000g離心20～30min，收集上清，即得rhOP-1提取液；將所述提取液用0.45μm微孔濾膜過濾或12000g離心15～30min后，取濾液或上清液上經(jīng)過平衡緩沖液平衡的強陽離子交換柱進行層析純化；洗脫時，先以體積百分比為10％的洗脫緩沖液B洗脫部分雜蛋白，再用體積百分比為20％洗脫緩沖液B洗脫目的蛋白質(zhì)，分部收集體積百分比為20％洗脫緩沖液B的洗脫峰。
上述包涵體沉淀物與包涵體溶解液即平衡緩沖液A的混合比，以克比毫升計，優(yōu)選是1∶10-50。
上述包涵體溶解液即平衡緩沖液A的成分是8mol/L Urea，20mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.0或8mol/L尿素，20mmol/L Tris-HCI，pH6.0；上述洗脫緩沖液B的成分是8mol/L Urea，20mmol/L磷酸鹽緩沖液，1mol/L NaCl，pH6.0。
在上述的基因工程菌所表達的重組人成骨蛋白-1的“一步純化”法中，所述包涵體溶解液即平衡緩沖液A中還可以添加1-10mmol/L的EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)；1-20mmol/L的DDT(二硫蘇糖醇)或者1-20mmol/L的二巰基乙醇。
在上述的基因工程菌所表達的重組人成骨蛋白-1的“一步純化”法中，所述強陽離子交換柱是SP-Sepharose系列(Amersham公司)、SP Resin HP系列(北京卓冠)、UNOsphereTMS系列(Bio-Rad公司)之一。
其中，所述強陽離子交換柱優(yōu)選是SP-Sepharose Fast Flow(SP-FF)或UNOsphereTMS Exchange Media強陽離子交換柱。
在上述的基因工程菌所表達的重組人成骨蛋白-1的“一步純化”法中，所述“一步純化”法是指將體積百分比為20％洗脫緩沖液B的洗脫峰收集的目的蛋白進行SDS-PAGE電泳分析，利用灰度掃描及軟件分析收集的目的蛋白的純度，即可獲得95％以上純度的重組人成骨蛋白-1。
本發(fā)明所提供的“一步層析純化法”純化生產(chǎn)rhOP-1方法的要點是先以體積百分比為10％的洗脫緩沖液B洗脫部分雜蛋白，再用體積百分比為20％洗脫緩沖液B洗脫目的蛋白質(zhì)(見圖1)，其中20％的B液洗脫峰2基本是目的蛋白rhOP-1，SDS-PAGE電泳分析各收集部分，即可獲得95％以上純度的目的蛋白質(zhì)(見圖2)。
從事本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地看出，本發(fā)明所述之平衡緩沖液A中可以添加1-10mmol/L的EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)；1-20mmol/L的DDT(二硫蘇糖醇)或者1-20mmol/L的二巰基乙醇；B液中的1mol/L NaCl，也可以是0.5-1mol/L濃度的NaCl，計算相對濃度，也可以獲得相應(yīng)B液梯度濃度的洗脫濃度，但是1mol/L NaCl在獲得目的蛋白后，可以直接再生層析柱，有提高純化效率的優(yōu)點。
用100％ B液洗脫其余結(jié)合蛋白并同時再生柱子；平衡液A液平衡后，可以重復(fù)上樣純化樣品。本發(fā)明的梯度濃度洗脫法大大提高了效率，降低了成本，具有高效快速的優(yōu)點，尤其適合企業(yè)生產(chǎn)放大。


圖1本發(fā)明典型的rhOP-1純化圖譜其中峰1為穿透峰；峰2為10％B液的洗脫峰；峰3為20％B液的第1個洗脫峰；峰4即為20％B液的第二個洗脫峰。
圖2本發(fā)明方法收集的蛋白進行的SDS-PAGE電泳圖其中泳道1為包涵體第一次溶解后的樣品；泳道1為包涵體第二次溶解后的樣品；液泳道3即為20％洗脫緩沖液B液的第二個洗脫峰收集的目的蛋白；泳道4為標準蛋白質(zhì)分子量marker。
具體實施例方式
實施例1按1g菌體10ml的比例加入裂解液懸浮工程菌，冰浴超聲裂菌。超聲功率400～1200w，超聲10s，間隔15s，重復(fù)45次(共19分鐘)。用相差顯微鏡檢測裂解率，離心裂解后的懸濁液(4℃，6000g，離心15min)棄去上清，保留沉淀。顯微鏡檢測若沒有達到98％以上細菌破裂，將沉淀重新用裂解液懸起重復(fù)裂解至98％以上細菌破裂，以上述條件離心收集沉淀物，即為包涵體混合物。
用包涵體洗滌液1(20mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.0，1％ Triton 100)和包涵體洗滌液2(20mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.0，2mol/L Urea)分別依次洗滌離心(8000g，25min)收集包涵體沉淀物。
將上述收集的包涵體用平衡緩沖液A(8mol/L Urea，20mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH6.0)以(克比毫升計)1g濕菌體2ml或者是包涵體沉淀物與包涵體溶解液即平衡緩沖液A的混合比以1∶10-20的比例混合，于4℃條件溶解包涵體30min以上或者過夜，12000g離心30min收集上清液，沉淀再以上述步驟溶解、離心，重復(fù)1-2次，進行SDS-PAGE電泳分析，視目的蛋白質(zhì)含量確定收集上清液。合并收集的上清液，即為rhOP-1提取液。
將rhOP-1提取液以0.45μm的微孔濾膜過濾或12000g離心20min后，取濾液或上清液上離子交換柱SP-Sepharose Fast Flow(SP-FF)強陽離子交換柱層析純化。具體步驟是1、用平衡緩沖液A(8mol/L Urea，20mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.0)平衡2-3個柱體積，流速為20cm-100cm/小時線性流速。
2、當柱流出液基線平穩(wěn)后，將通過0.45μm的微孔濾膜過濾或12000g離心30min后的rhOP-1提取液樣品等速上SP-FF柱。
3、上樣后用平衡緩沖液A洗柱1-2個柱床體積。
4、用90％的平衡液A和10％洗脫緩沖液B(A液+1mol/LNaCl)洗脫1-2個柱床體積，去除部分雜蛋白。
5、用80％的平衡液A液和20％緩沖液B洗脫3-5個柱床體積，分部收集20％緩沖液B的洗脫峰。
6、用100％緩沖液B洗脫其余結(jié)合蛋白并同時再生柱子；平衡液A液平衡后，可以重復(fù)以上步驟，繼續(xù)上樣純化樣品。
步驟5中，80％的A液和20％的B液的洗脫峰有2個(見圖1)，其中洗脫峰2基本是目的蛋白rhOP-1，SDS-PAGE電泳分析各收集部分，即可獲得95％以上純度的目的蛋白質(zhì)(見圖2)。
實施例2準備包涵體溶解液(8mol/L尿素，pH 6.0，20mmol/L磷酸鹽緩沖液，含1mmol/L的EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)；10mmol/L的DDT(二硫蘇糖醇)。
以實施例1方式裂菌、洗滌、離心獲得包涵體，收集的包涵體用上述包涵體溶解液溶解，以1g濕菌體∶8ml的比例混合，4℃溶解包涵體30min以上或者過夜。12000g離心25min收集上液，沉淀再以上述步驟溶解，離心，重復(fù)2次，進行SDS-PAGE電泳分析，視目的蛋白質(zhì)含量確定收集上清液。合并收集的上清液，即為rhOP-1提取液。
將上述收集的rhOP-1提取液以0.45μm的微孔濾膜過濾后上離子交換柱UNOsphereTM S Exchange Media(Bio-Rad公司)強陽離子交換柱層析梯度純化。具體步驟是1.用平衡緩沖液A(20mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.0，8mol/L Urea)平衡2-3個柱體積，流速為40cm-120cm/小時線性流速。
2.當柱流出液基線平穩(wěn)后.將通過0.45μm的微孔濾膜過濾后的rhOP-1提取液樣品等速上UNOsphereTM S Exchange Media柱。
3.上樣后用平衡緩沖液洗柱1-2個柱床體積(再平衡)。
4.用90％的平衡液A和10％緩沖液B(A液+1mol/LNaCl)洗脫1-2個柱床體積，去除部分雜蛋白。
5.用80％的平衡液A液和20％緩沖液B洗脫3-5個柱床體積，分部收集20％緩沖液B的洗脫峰。SDS-PAGE電泳分析各收集部分，即可獲得95％以上純度的目的蛋白質(zhì)。
6.用100％緩沖液B洗脫其余結(jié)合蛋白并同時再生柱子；平衡液A液平衡后，可以重復(fù)以上步驟，繼續(xù)上樣純化樣品。
權(quán)利要求
1.一種基因工程菌所表達的重組人成骨蛋白-1的“一步純化”法，其特征在于將工程菌破碎，包涵體洗滌，重組蛋白變性，一步層析純化，SDS-PAGE電泳分析即可獲得95％以上純度的重組人成骨蛋白-1。
2.按權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述工程菌破碎是將工程菌破碎至鏡檢細菌破碎率大于98％，即得包涵體混合液。
3.按權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述包涵體洗滌是將包涵體混合液于4℃，6000g離心15～20min，收集其沉淀物；用包涵體洗滌液1和包涵體洗滌液2依次分別以4℃，8000g條件，洗滌、離心20～30min，得包涵體沉淀物。
4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述重組蛋白變性，一步層析純化是指將洗滌后得到的包涵體沉淀物用包涵體溶解液即平衡緩沖液A溶解，12000g離心20～30min，收集上清，即得rhOP-1提取液；將所述提取液用0.45μm微孔濾膜過濾或12000g離心15～30min后，取濾液或上清液上經(jīng)過平衡緩沖液平衡的強陽離子交換柱進行層析純化；洗脫時，先以體積百分比為10％的洗脫緩沖液B洗脫部分雜蛋白，再用體積百分比為20％洗脫緩沖液B洗脫目的蛋白質(zhì)，分部收集體積百分比為20％洗脫緩沖液B的洗脫峰。
5.按權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述包涵體沉淀物與包涵體溶解液即平衡緩沖液A的混合比，以克比毫升計是1∶10-50。
6.按權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述包涵體溶解液即平衡緩沖液A的成分是8mol/L Urea，20mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.0或8mol/L尿素，20mmol/L Tris-HCI，pH6.0；所述洗脫緩沖液B的成分是8mol/L Urea，20mmol/L磷酸鹽緩沖液，1mol/L NaCl，pH 6.0。
7.按權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述包涵體溶解液即平衡緩沖液A中可以添加1-10mmol/L的乙二胺四乙酸二鈉；1-20mmol/L的二硫蘇糖醇或者1-20mmol/L的二巰基乙醇。
8.按權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述強陽離子交換柱是SP-Sepharose系列、SP Resin HP系列、UNOsphereTMS系列之一。
9.按權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述強陽離子交換柱是SP-Sepharose FastFlow或UNOsphereTMS Exchange Media強陽離子交換柱。
10.按權(quán)利要求4所述方法，其特征在于20％的B液洗脫峰第2峰為目的蛋白重組人成骨蛋白-1峰，將收集的體積百分比為20％洗脫緩沖液B的洗脫峰進行SDS-PAGE電泳分析，即可獲得95％以上純度的重組人成骨蛋白-1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因工程菌所表達的重組人成骨蛋白－1的“一步純化”法，其方法是，利用獲得的人成骨蛋白－1的成熟肽基因片段，通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化工程菌，發(fā)酵收集，將工程菌破碎，包涵體洗滌，重組蛋白變性，一步層析純化即可獲得95％以上純度的重組人成骨蛋白－1。本發(fā)明所提供的“一步層析純化法”具有高效快速的優(yōu)點，適合企業(yè)生產(chǎn)放大。
文檔編號C07K14/51GK1789276SQ200510045370
公開日2006年6月21日 申請日期2005年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月16日
發(fā)明者王世立, 韓金祥, 車睛, 張更林, 趙甜娜, 王國棟, 孫杰, 李俊玲 申請人:山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心