專利名稱：一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)是人中性粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)cDNA克隆的獲得，表達(dá)G-CSF菌種的構(gòu)建，及G-CSF大規(guī)模純化，制成藥品。
人外周血各種成熟血細(xì)胞均源自于骨髓造血干細(xì)胞的分化增殖，從造血干細(xì)胞到外周成熟細(xì)胞之間，存在一系列調(diào)節(jié)因子，形成網(wǎng)絡(luò)，控制著人體各種血細(xì)胞的數(shù)量和功能，維持機(jī)體白細(xì)胞的穩(wěn)定。
人G-CSF是該網(wǎng)絡(luò)中存在于正常人體，刺激CFU-GM分化為CFU-G的因子，具有刺激前體細(xì)胞分化增殖為成熟外周中性粒細(xì)胞并增強(qiáng)其功能的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)因子。
人G-CSF的發(fā)現(xiàn)是從生物活性研究開(kāi)始的，早在1980年，Asano等人[Asano，etal.，Br.J.Cancer，41，689-694(1980)]發(fā)現(xiàn)一些癌癥患者體內(nèi)有粒細(xì)胞增多現(xiàn)象，當(dāng)把這些人癌細(xì)胞移植到裸鼠體內(nèi)后也發(fā)生粒細(xì)胞增多現(xiàn)象，表明人癌細(xì)胞可產(chǎn)生一種使鼠粒細(xì)胞增多的集落刺激因子(CSF)。把人口腔(鱗狀)癌細(xì)胞株chu-2的條件培養(yǎng)液在體外刺激人和小鼠骨髓細(xì)胞時(shí)，能形成嗜中性粒細(xì)胞集落[Nomura.H，etal.，EMBO，5,871-876(1986)]人膀胱癌5637細(xì)胞株的條件培養(yǎng)液，能誘使人骨髓白血病細(xì)胞素HL-60和小鼠粒單系白血病細(xì)胞系WEHI-3BO+分化，故被稱為多向刺激因子。(Sonia.LM.Amgen Patent 1985.08.23US 768,959； Sonia.LM.1986 Science 23761-65)后來(lái)Strife等發(fā)現(xiàn)，如果骨髓細(xì)胞樣品在去除成熟髓系和淋巴系細(xì)胞后，再用這種多向刺激因子作用，則其促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞集落形成，其多向刺激活性是由于輔助細(xì)胞的間接作用造成的。[Strife.A，etal.，Blood，69，1508-1523(1987)]隨后，從上述條件培養(yǎng)基中分離純化出具有粒細(xì)胞集落刺激活性的蛋白組份，它是一種小分子糖蛋白，分子量在18-22KD[Lu Hs，etal.，Arch Biochem Biophys.268 1781-92(1989)]其糖基化與否并不影響G-CSF刺激嗜中性粒細(xì)胞分化增殖的活性。僅影響體內(nèi)清除速率、穩(wěn)定性，[Oheda.M，etal.，J.Biol.Chem，265，11432-11435(1990)]并進(jìn)一步證實(shí)其受體細(xì)胞主要是嗜中性細(xì)胞，是嗜中性粒細(xì)胞終端分化和活化因子。在人體正常生理狀態(tài)下，主要由單核巨噬細(xì)胞系產(chǎn)生。由于80年代基因重組技術(shù)的飛速發(fā)展，已能利用DNA重組技術(shù)大量生產(chǎn)可供臨床應(yīng)用的人重組G-CSF。美國(guó)柯瑞英-艾格公司就重組生產(chǎn)G-CSF獲得專利(優(yōu)先權(quán)號(hào)US 768949和US 835548，中國(guó)專利號(hào)ZL86106234)發(fā)明人通過(guò)從膀胱癌細(xì)胞株5637(A1)中提取總RNA，純化出PolyA+RNA，制備cDNA庫(kù)，轉(zhuǎn)化E.coliHB101備用，再把天然極微量的G-CSF純化，測(cè)序，設(shè)計(jì)并合成一組20bp左右混合探針，利用此探針與cDNA文庫(kù)雜交，篩選出編碼G-CSF的cDNA，擴(kuò)增這些陽(yáng)性克隆后，切下G-CSF基因進(jìn)行序列分析，然后把此基因重組于如PNWI等表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化于E.coli中表達(dá)G-CSF蛋白。由于人體中含有的天然的G-CSF極其稀少，在如此稀少的情況下把它純化，用于準(zhǔn)確分析N-氨基酸序列是極其困難的，并且混合探針設(shè)計(jì)合成耗費(fèi)試劑，設(shè)備，且雜交條件嚴(yán)格，工作量大。
利用基因工程手段構(gòu)建的表達(dá)外源目的基因的菌株常采用E.coli表達(dá)系統(tǒng)，且多以包含體形式表達(dá)于菌體內(nèi)。包含體是以表達(dá)產(chǎn)物為主，聚集形成的蛋白性質(zhì)的顆粒，目的蛋白具有正確的一級(jí)結(jié)構(gòu)順序，但缺乏正確的構(gòu)象，因而不具備其生物活性，欲研究或利用其生物活性，必須先經(jīng)變性劑充分增溶，爾后經(jīng)復(fù)性過(guò)程恢復(fù)其天然構(gòu)象，才能顯示其活性。到目前為止，復(fù)性完全是自發(fā)的和隨機(jī)的，因此復(fù)性速度慢，回收率低，目前國(guó)內(nèi)外所用的蛋白質(zhì)復(fù)性方法均是依據(jù)排除使蛋白變性的環(huán)境，具體采用透析或大量稀釋方法，降低變性劑濃度，使目的蛋白復(fù)性。
透析法需要時(shí)間長(zhǎng)，一般要24小時(shí)以上，且需要多次更換透析溶液，更主要的是透析袋內(nèi)部溶液在透析過(guò)程中是不均一的，靠近透析膜的溶液變性劑濃度下降快而內(nèi)部下降慢，只有部分蛋白處于適于復(fù)性的變性劑濃度范圍，其它蛋白很容易聚集、絮凝、沉淀，使復(fù)性回收率下降，而稀釋法的大體積稀釋試樣給后工序的純化工藝帶來(lái)不便，而且要增大設(shè)備的處理容量。雖有用中空纖維以超濾方式進(jìn)行復(fù)性，但均采用內(nèi)壓式中空纖維，這方式類似于血透原理，雖然可以用于大規(guī)模生產(chǎn)，但存在下述缺點(diǎn)復(fù)性蛋白溶液自中空纖維一端流向另一端，變性劑濃度變化劇烈，蛋白被濃縮，部份蛋白來(lái)不及復(fù)性就超過(guò)折疊范圍，沉淀析出，此沉淀進(jìn)一步聚集在中空纖維內(nèi)，堵塞通路，造成壓力上升，中空纖維破損。而且此方式不利于NaOH在位清洗。
本發(fā)明的目的是提出一種新的改進(jìn)的，獲得G-CSF cDNA的方法，以及一種新的有效表達(dá)系統(tǒng)，使能高效生產(chǎn)G-CSF。
本發(fā)明的目的還在于提供一種使變性蛋白復(fù)性的簡(jiǎn)便，快速，高活性回收率，處理量大的新方法。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種工業(yè)化藥品生產(chǎn)具有人G-CSF活性多肽的純化方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的利用PCR技術(shù)設(shè)計(jì)一對(duì)引物從人血白細(xì)胞總RNA中直接釣出G-CSF cDNA(參表I)，測(cè)序正確后擴(kuò)增獲得較多G-CSF cDNA，并構(gòu)建于依賴T7 RNA聚合酶的表達(dá)載體PGENS1(參圖6)成為表達(dá)型重組體PGENSG，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)plysS，篩選后獲得表達(dá)G-CSF的陽(yáng)性克隆，經(jīng)發(fā)酵、離心收集、勻漿破碎后得到含目的蛋白的包含體。
根據(jù)

圖1，組成復(fù)性裝置，將待復(fù)性蛋白及起始復(fù)性液置于復(fù)性反應(yīng)器中，用蠕動(dòng)泵抽出蛋白液，經(jīng)中空纖維外側(cè)功能層由下端注入中空纖維柱，變性劑因超濾作用進(jìn)入纖維中心管路并注入廢液缸，而蛋白沿管壁外側(cè)重新回到復(fù)性反應(yīng)器中，同時(shí)以同樣速度將貯液注入復(fù)性反應(yīng)器，使反應(yīng)器內(nèi)體積維持恒定，經(jīng)不斷循環(huán)，反應(yīng)器中變性劑濃度逐步下降，變性蛋白在溫和的條件下完成水合表面的脫水過(guò)程和折疊過(guò)程，直至復(fù)性。
復(fù)性后蛋白仍含有雜蛋白、熱源、核酸，須進(jìn)一步去除，本發(fā)明設(shè)計(jì)了離子交換層析接疏水層析，后接分子篩層析的順序組合。離子交換層析填料為DEAE，Q或QAE。rhG-CSF等電點(diǎn)介于5.8-6.2，PH適于7.0-9.0，可直接以復(fù)性時(shí)稀釋液作為上樣平衡液，平衡離子交換柱，爾后將復(fù)性濃縮好的G-CSF蛋白溶液直接上樣，并以上述相應(yīng)的流動(dòng)相加0.01-0.5N NaCl梯度進(jìn)行洗脫，此條件下洗脫的G-CSF蛋白可將復(fù)性過(guò)程中錯(cuò)配構(gòu)象及多聚體除去，參圖2。疏水柱選用butyl-，phenyl-或octyl基的疏水填料，將離子交換收集的目標(biāo)峰直接補(bǔ)加0.1-1.0N(NH4)2SO4或0.1-1.0N NaCl，即可上樣于疏水柱，疏水柱以離子交換時(shí)相應(yīng)的流動(dòng)相加上述0.1-1.0N(NH4)2SO4或0.1-1.0N NaCl平衡柱子，上樣結(jié)束后以20-50mM磷酸緩沖液，PH7.0-9.0洗脫。因磷酸鹽具有一定鹽析作用，目標(biāo)蛋白仍吸附在柱上，而在此充分洗滌的過(guò)程中核酸及熱原被充分洗脫，爾后以Tris鹽酸緩沖液或咪唑緩沖液及水順序地階段洗脫。G-CSF目標(biāo)峰在Tris鹽酸或咪唑鹽酸緩沖液的洗脫峰中。經(jīng)疏水層析后收集的目標(biāo)峰，可直接上樣于以5-50mM醋酸-醋酸鈉為流動(dòng)相平衡好的Sephacryl或Superdex層析柱，進(jìn)行精制。
本發(fā)明所用此流動(dòng)相旨在將可能存在的寡聚體進(jìn)一步去除的同時(shí)，可以將前述疏水條件下的體系改換為5-50mM醋酸-醋酸鈉，經(jīng)此分子篩層析得到的目標(biāo)蛋白G-CSF，可以直接用于制劑的配制，而無(wú)須采用透析等其他改換溶液體系的處理，減少處理步驟中可能的污染與損失。
本發(fā)明提供一種具有商業(yè)價(jià)值的，大規(guī)模獲得重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的方法，其突出的優(yōu)點(diǎn)在于(1)利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)代替混合探針釣G-CSF cDNA，所以省去合成大量混合探針的繁瑣工作。
(2)采用外壓式中空纖維柱復(fù)性，可減少中空纖維破損，復(fù)性處于可控制變性劑去除速度的過(guò)程中，縮短復(fù)性時(shí)間，使得復(fù)性收率高達(dá)70％，一次復(fù)性規(guī)模可達(dá)1-10g，所用的聚砜材料便于NaOH進(jìn)行原位清洗和消毒，可適應(yīng)藥物蛋白開(kāi)發(fā)生產(chǎn)的GMP要求。同時(shí)采用此復(fù)性方式，還可在復(fù)性完成后，直接調(diào)整泵的流量差，而將大體積蛋白溶液進(jìn)行濃縮，以便于后續(xù)純化工藝操作的方便與省時(shí)。
(3)離子交換層析、疏水層析和分子篩層析三種不同分離機(jī)理層析順序組合，使復(fù)性后的G-CSF得以純化精制，經(jīng)反相高效液相層析(HPLC-RP)及毛細(xì)管電泳(CE)檢測(cè)，其純度均大于95％。并且其生物活性達(dá)1×108u/mg。
本發(fā)明附圖的詳細(xì)說(shuō)明都在實(shí)施例中
圖1是表達(dá)載體PGENS1的組成與特性圖；圖2是離子交換層析圖譜；圖3是疏水層析圖譜；圖4是分子篩層析圖譜；圖5是重組工程菌的SDS-PAGE電泳圖；圖6是復(fù)性裝置圖1.代表復(fù)性貯液缺罐； 2.代表復(fù)性反應(yīng)器；3.代表磁力攪拌器； 4.代表中空纖維柱；5.代表蠕動(dòng)泵； 6.代表廢液罐；表I是rhG-CSF cDNA的全序列；以下的實(shí)例是為了詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明實(shí)例1G-CSF工程菌構(gòu)建健康的中國(guó)人外周血，用Ficoll作梯度離心，分離出白細(xì)胞層。取出白細(xì)胞在培養(yǎng)基中作短暫洗滌，直接用異硫氰酸胍/酚氯仿抽提出總RNA?？俁NA用作模板。以合成的反義鏈3′端寡核苷酸為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄液中加入合成的5′端和反義鏈3′端寡核苷酸引物，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法合成出G-CSF結(jié)構(gòu)基因。經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳分離出條合成產(chǎn)物，切取λHindIII分子標(biāo)準(zhǔn)564bp處的DNA帶，再做第二次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，再電泳時(shí)可明晰地見(jiàn)到544bp的DNA帶。用第二次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)后的反應(yīng)液，經(jīng)純化后以平末端方法和質(zhì)粒載體pUC18直接重組連接，并轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)plysS受體菌中得到的轉(zhuǎn)化體按單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，抽取重組質(zhì)粒DNA，作DNA測(cè)序，證明含有G-CSF的結(jié)構(gòu)基因，其DNA序列與Gene Bank No.X03438 M17706中的G-CSF結(jié)構(gòu)基因完全一致(表2)。
以上有關(guān)總RNA抽提，多聚酶循環(huán)反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳，平末端DNA連接反應(yīng)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子篩選和DNA測(cè)序等一般的DNA克隆技術(shù)，都參照J(rèn).smbrook等1989，第二版的″分子克隆-實(shí)驗(yàn)指南″一書(shū)操作。
本方法所用的5′端和3′端DNA寡核苷酸引物分別為N端引物5′GAATCTAGACATGACACCATTAGGCCCTGCCAGC端引物5′CATGGAYCCTTAGGGCTGGGCAAGGTGGCGT本方法所用的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件為第一次反應(yīng)37℃ 2min→72℃ 2min→90℃ 1min循環(huán)5次再42℃ 2min→72℃ 2min→90℃ 1min循環(huán)30次再72℃保溫5min第二次反應(yīng)55℃1min→72℃2min→90℃1min→循環(huán)30次72℃保溫5min本方法所用的表達(dá)型重組質(zhì)粒的構(gòu)建，是利用引物寡核苷酸引入結(jié)構(gòu)基因兩端的NdeI和BamHI酶切點(diǎn)，酶切回收G-CSF基因，插入連接到以pUC為基礎(chǔ)，T7噬菌體啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒載體PGENS1(圖6)上，表達(dá)載體各組份來(lái)源復(fù)制子(ori)E.coli的coli E1型，選擇標(biāo)記Ampr，啟動(dòng)子T7噬菌體Φ10基因的啟動(dòng)子，終止序列T7噬菌體Φ10基因的終止序列，插入位點(diǎn)NdeI-BamHI。重組體轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)plysS，然后篩選而獲得rhG-CSF的表達(dá)型重組體G-CSF基因的5′端部分編碼子作E.coli型的優(yōu)化，以提高G-CSF的表達(dá)量，使之占總蛋白的20％以上(圖5)。
實(shí)例2包含體增溶液復(fù)性按圖1組配復(fù)性裝置。將包含體增溶液以一定比例混于復(fù)性起始液中。
復(fù)性起始液配方Urea1-6Mβ-疏基乙醇 5-20mMCu2SO410-40uM
Tris-HCl 20-50mMPH7.5-9.5復(fù)性蛋白濃度0.1mg/ml-1.5mg/mlEDTA 1-10mM貯液配方Cu2SO410uMTris-Cl 20-50mM PH 7.5-9.5EDTA 1-10mM貯液與復(fù)性液的體積比可控制在1∶3-1∶10，復(fù)性反應(yīng)器置于磁力攪拌器上，均勻攪拌，用蠕動(dòng)泵抽取復(fù)性液從中空纖維柱下端注入，從上部注回復(fù)性反應(yīng)器中，透出液被導(dǎo)入廢液缸。調(diào)節(jié)泵流量及進(jìn)入廢液缸的管路口徑使之體積維持恒定。
在此循環(huán)過(guò)程中，水及變性劑不斷從中空纖維透出。因超濾膜的分子量截留在3000-10,000，因此蛋白不會(huì)漏出，重新回到復(fù)性反應(yīng)器中進(jìn)行復(fù)性。整個(gè)復(fù)性過(guò)程需10小時(shí)。中空纖維材質(zhì)選用聚砜材料或硝酸纖維素酯或醋酸纖維素酯。
實(shí)例3G-CSF純化制備用20mM Tris-HCl PH 7.0-9.0平衡DEAE-Sepharose FF柱，以l00cm/h上樣，用離子交換流動(dòng)相I加0.01-0.5N NaCl進(jìn)行梯度洗脫，收集B峰(圖2)。
離子交換目標(biāo)峰中補(bǔ)加0.1-1.0N(NH4)2SO4，上phenyl-SepharoseFF柱，用20-50mM磷酸緩沖液，在PH7.0-9.0洗脫，而后以20mMTris-HCl pH 7.5洗脫，收集洗脫峰(圖3)，將疏水層析目標(biāo)峰中加入(NH4)2SO44℃老化過(guò)夜，10,000rpm，4℃，10min離心收集沉淀，用5-50mM NaAc-HAc PH4.0溶解沉淀，上Sephacyl S-200柱，洗脫，收集目標(biāo)峰(圖4)。*** SEQUENCE LIST *** (SINGLE)1 605′CCG CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC CAC AAC GGT TTC CCT CTA GCT AGA AAT61120AAT TTT GTT TAA CTT TAA GAA GGA GAT ATA CAT ATG ACA CCA TTA GGC CCT GCC AGC TCCMet Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser121 180CTG CCC CAG AGC TTC CTG CTC AAG TGC TTA GAG CAA GTG AGG AAG ATC CAG GGC GAT GGCLeu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Cys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly181 240GCA GCG CTC CAG GAG AAG CTG TGT GCC ACC TAC AAG CTG TGC CAC CCC GAG GAG CTG GTGAla Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val241 300CTG CTC GGA CAC TCT CTG GGC ATC CCC TGG GCT CCC CTG AGC AGC TGC CCC AGC CAG GCCLeu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala301 380CTG CAG CTG GCA GGC TGC TTG AGC CAA CTC CAT AGC GCC CTT TTC CTC TAC CAG GGG CTCLeu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu381 420CTG CAG GCC CTG GAA GGG ATC TCC CCC GAG TTG GGT CCC ACC TTG GAC ACA CTG CAG CTGLeu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu421 480GAC GTC GCC GAC TTT GCC ACC ACC ATC TGG CAG CAG ATG GAA GAA CTG GGA ATG GCC CCTAsp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro481 540GCC CTG CAG CCC ACC CAG GGT GCC ATG CCG GCC TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGC CGG GCAAla Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala541GGA GGG GTC CTG GTT GCC TCC CAT CTC CAG AGC TTC CTG GAG GTG TCG TAC CGC GTT CTAGly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu601 644CGC CAC CTT GCC CAG CCC TAA GGA TCC GGC TGC TAA CAA AGC CC 3′Arg His Leu Ala Gln Pro表I rhG-CSF cDNA的全序列ATG為G-CSF N端第一個(gè)氨基酸的編碼TAA為G-CSF C端終止信號(hào)CTG為G-CSF 成熟蛋白的第36位氨基酸(Leu)其后沒(méi)有GTGAGTGAG序列(Val-Ser-Glu)，表明為β型G-CSF。
權(quán)利要求
1.一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)的生產(chǎn)方法，其特征在于以反轉(zhuǎn)錄后的聚合酶鏈?zhǔn)?RT-PCR)反應(yīng)方法，釣取人外周血白細(xì)胞中粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)基因的cDNA，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli菌；以外壓式或內(nèi)壓式中空纖維超濾透析復(fù)性；以離子交換柱層析、疏水柱層析和分子篩柱層析順序組合純化，大規(guī)模制得高純度的藥用rhG-CSF蛋白。
2.權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于以外壓式或內(nèi)壓式中空纖維超濾方式透析變性的rhG-CSF溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于其中復(fù)性裝置由復(fù)性貯液缸、復(fù)性反應(yīng)器、中空纖維超濾器、廢液缸、蠕動(dòng)泵、不銹鋼管道和閥門構(gòu)成。
4.權(quán)利要求3所述的復(fù)性裝置，其特征在于采用并聯(lián)的中空纖維柱。
5.權(quán)利要求3所述中空纖維超濾器，其中中空纖維材料是醋酸纖維素酯、硝酸纖維素酯或聚砜。
6.權(quán)利要求3所述復(fù)性裝置，其中中空纖維超濾器膜中的截留分子量在3000-10000。
7.權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其中離子交換柱填料為DEAE、Q、QAE等陰離子交換劑，疏水柱填料為butyl-、phenyl-或octyl基的疏水介質(zhì)，分子篩柱填料為低吸附的Sephacryl系列或Superdex系列的介質(zhì)。
8.權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其中離子交換柱層析，其流動(dòng)相I為20-50mM咪唑鹽酸、巴比妥鹽酸、Tris鹽酸、硼砂-硼酸或磷酸緩沖液，PH的范圍在7.0-9.0，流動(dòng)相II為上述相應(yīng)的流動(dòng)相I中加0.01-0.5NNaCl梯度洗脫。
9.權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其中疏水柱層析，其流動(dòng)相為20-50mM咪唑鹽酸、巴比妥鹽酸、Tris鹽酸、硼砂-硼酸及磷酸緩沖液，PH范圍在7.0-9.0，其中流加0.1-1.0N(NH4)2SO4或0.1-1.0N NaCl，流動(dòng)相II分別以20-50mM PH范圍在7.0-9.0磷酸緩沖液、Tris鹽酸緩沖液或咪唑緩沖液及水順序洗脫。
10.權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其中分子篩柱層析，其流動(dòng)相為5-50mM醋酸-醋酸鈉。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)的生產(chǎn)方法。該方法采用反轉(zhuǎn)錄后的聚合酶鏈?zhǔn)?RT-PCR)反應(yīng)，釣取人粒細(xì)胞集落刺激因子基因，轉(zhuǎn)化E.coli菌；蛋白以中空纖維超濾透析方式復(fù)性，經(jīng)離子交換層析、疏水層析和分子篩層析順序組合，純化，大規(guī)模制得高純度的藥用rhG-CSF蛋白。
文檔編號(hào)C07K14/52GK1167150SQ96106418
公開(kāi)日1997年12月10日 申請(qǐng)日期1996年6月5日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月5日
發(fā)明者蘇勇, 孔鐵山, 王昌梅, 黃巖山, 孫漢棟 申請(qǐng)人:杭州九源基因工程有限公司