專利名稱：粒細(xì)胞集落刺激因子的制作方法
粒細(xì)胞集落刺激因子本發(fā)明涉及粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)融合多肽及二聚體；編碼所述多肽的核 酸分子，以及使用所述蛋白質(zhì)/ 二聚體的治療方法。細(xì)胞因子受體可分為三種獨立的類別。第1類(稱之為造血生成素 (haemotopoietin)或生長激素家族)受體的特征是，在它們的胞外結(jié)構(gòu)域的氨基末端部分 中含有4個保守半胱氨酸殘基，并且在C末端部分中出現(xiàn)保守的Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser基 序。該受體由兩條多肽鏈組成。第1類受體可以細(xì)分為GM-CSF亞家族(包括IL-3、IL-5、 GM-CSF、GCSF)和IL-6亞家族(包括IL_6、IL_11和IL-12)。在IL-6亞家族中，具有共同的 轉(zhuǎn)導(dǎo)亞基(gpl30)，該轉(zhuǎn)導(dǎo)亞基與一個或兩個不同的細(xì)胞因子亞基結(jié)合。還有一種亞家族被 稱為IL-2亞家族(包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15)。在第2類(干擾素受體家族)中也 存在重復(fù)的Cys基序，其配體為α、β和Y干擾素，但是缺乏保守的Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser 基序。GCSF刺激粒細(xì)胞祖細(xì)胞的增殖和分化。GCSF由編碼來源于不同的mRNA剪切的兩 個多肽的單一基因編碼。所述多肽的長度為177和180個氨基酸，成熟多肽具有19. 6kD的 分子量。GCSF由內(nèi)皮和巨噬細(xì)胞生成，并且通過在骨髓粒細(xì)胞祖細(xì)胞上表達的GCSF受體 (GCSFR)起作用，所述骨髓粒細(xì)胞祖細(xì)胞在活化時導(dǎo)致成熟為粒細(xì)胞。然后，它們可以分化 為嗜中性粒細(xì)胞前體和成熟的嗜中性粒細(xì)胞。重組GSCF的主要治療應(yīng)用是在經(jīng)受癌癥化 療而導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞丟失且隨后發(fā)展中性粒細(xì)胞減少癥的患者的治療中。中性粒細(xì)胞減 少癥導(dǎo)致免疫抑制，并使患者暴露于感染和敗血病。另外，在收集并于造血干細(xì)胞移植中使 用之前，使用重組GCSF來增加體內(nèi)造血干細(xì)胞的數(shù)量。
本公開內(nèi)容涉及具有改良的藥代動力學(xué)(PK)和活性的GCSF重組形式的鑒別。該 新型GCSF分子具有生物活性，形成二聚體并具有改良的穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種核酸分子，所述核酸分子包含編碼具有粒細(xì)胞 集落刺激因子活性的多肽的核酸序列，所述多肽包含直接或間接地與粒細(xì)胞集落刺激因子 受體多肽的至少一個細(xì)胞因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域相連的粒細(xì)胞集落刺激因子多肽。根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種融合多肽，所述融合多肽包含直接或間接地與 粒細(xì)胞集落刺激因子受體多肽的至少一個細(xì)胞因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域相連的粒細(xì)胞集落刺激因 子多肽或其活性部分的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述融合多肽包含粒細(xì)胞集落刺激因子受體 多肽的兩個細(xì)胞因子同源結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的又一個優(yōu)選的實施方案中，所述融合多肽還含有免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu) 域。在本發(fā)明的又一個優(yōu)選的實施方案中，所述融合多肽包括至少一個纖連蛋白III 結(jié)構(gòu)域；優(yōu)選地2或3個纖連蛋白III結(jié)構(gòu)域。GCSFR是一種復(fù)合體，它含有一系列有助于自身分子結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域。GCSFR可以細(xì) 分為若干個從結(jié)構(gòu)和功能上定義的區(qū)域。該受體長度為812個氨基酸，并且就其包括細(xì)胞 外結(jié)構(gòu)域、單個跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域而言，該受體是典型的細(xì)胞因子受體。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域具有一種模塊式結(jié)構(gòu)，所述模塊式結(jié)構(gòu)包含成熟多肽的氨基末端；免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu) 域(氨基酸1-97)；第一細(xì)胞因子同源結(jié)構(gòu)域(97-201)和第二細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域(202-313)， 以及三個纖連蛋白III結(jié)構(gòu)域。在功能上，第一和第二細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域結(jié)合GCSF。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述融合多肽包含SEQ ID NO 31中所表示的 氨基酸殘基97-201。在本發(fā)明的一個備選的優(yōu)選的實施方案中，所述融合多肽包含SEQ IDNO 31的氨 基酸殘基202-313。在本發(fā)明的一個備選的優(yōu)選的實施方案中，所述融合多肽含有SEQ IDNO 31的氨 基酸殘基97-313。在本發(fā)明的又一個優(yōu)選的實施方案中，所述融合多肽含有SEQ IDNO 31的氨基酸 殘基1-97。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，多肽與細(xì)胞因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域相連接，其中在 所述融合多肽中，所述粒細(xì)胞集落刺激因子多肽被置于所述細(xì)胞因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基末端。在本發(fā)明的一個備選的優(yōu)選的實施方案中，粒細(xì)胞集落刺激因子多肽與細(xì)胞因子 結(jié)合結(jié)構(gòu)域相連接，其中在所述融合多肽中，所述粒細(xì)胞集落刺激因子多肽被置于所述細(xì) 胞因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域的羧基末端。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，粒細(xì)胞集落刺激因子通過肽連接體，優(yōu)選地 柔性肽連接體與粒細(xì)胞集落刺激因子受體多肽的結(jié)合結(jié)構(gòu)域相連接。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述肽連接分子包含至少一個拷貝的肽 GlyGlyGlyGlySer0在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述肽連接分子包含2、3、4、5、6、7、8、9或10 個拷貝的肽 GlyGlyGlyGlySer。優(yōu)選地，所述肽連接分子由6個拷貝的肽GlyGlyGlyGlySer組成。在本發(fā)明的一個備選的實施方案中，所述多肽不含有肽連接分子，而是粒細(xì)胞集 落刺激因子多肽和粒細(xì)胞集落刺激因子受體多肽的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的直接融合體。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種核酸分子，所述核酸分子包含選自如下的核 酸序列i)SEQ ID NO 5中所表示的核酸序列；ii)SEQ ID NO 7中所表示的核酸序列；iii)SEQ ID NO 9中所表示的核酸序列；iv) SEQ ID NO 11中所表示的核酸序列；v) SEQ ID NO 13中所表示的核酸序列；vi) SEQ ID NO 15中所表示的核酸序列；vii) SEQ ID NO 17中所表示的核酸序列；viii) SEQ ID NO 19中所表示的核酸序列；或一種核酸分子，該核酸分子包含在嚴(yán)格雜交條件下與SEQ IDN0:5-SEQ ID NO 19 雜交的核酸序列，并且該核酸分子編碼具有粒細(xì)胞集落刺激因子受體調(diào)節(jié)活性的多肽。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述核酸分子編碼具有激動劑活性的多肽。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述核酸分子編碼具有拮抗劑活性的多肽。當(dāng)兩個互補的核酸分子相互之間經(jīng)受一定數(shù)量的氫鍵合時，發(fā)生核酸分子的雜 交。雜交嚴(yán)格性，可根據(jù)核酸周圍的環(huán)境條件、雜交方法的本質(zhì)，以及所用核酸分子的組成 和長度而發(fā)生變化。關(guān)于獲得特定程度的嚴(yán)格性所需的雜交條件的計算，在以下中進行了 討論Sambrook 等，MolecularCloning :A Laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊) (Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,2001)；禾口 Tijssen, LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Acid Probes (生物化學(xué)和分子生物學(xué)實驗室技術(shù)-與核酸探針雜交)，第一 部分，第二章(ElseviehNew York，1993)。Tm是核酸分子的50%的給定鏈與其互補鏈發(fā)生 雜交時的溫度。下述為雜交條件的示例性設(shè)定，但不限于此驢細(xì)削牛(介Λ糊辟Φ 90%胃一性請歹斷棘)雜交5XSSC，65°C，16 小時洗滌兩次2 X SSC,室溫(RT)，每次15分鐘洗滌兩次0. 5 X SSC, 650C，每次20分鐘 鼎(介Λ糊辟Φ 80%胃一性請歹丨隨棘)雜交5X_6XSSC，65°C-70°C，16-20 小時
洗滌兩次 2 X SSC, RT,每次5-20分鐘洗滌兩次1 X SSC, 550C -70°C，每次30分鐘低嚴(yán)格性(允許共有至少50%同一性的序列進行雜交)雜交6XSSC，RT-55°C, 16-20 小時洗滌至少兩次 2 X -3 X SSC, RT_55°C，每次20-30分鐘在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO 5中所表示的 核酸序列或由其組成。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO 7中所表示的核 酸序列或由其組成。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO 9中所表示的核 酸序列或由其組成。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO 11中所表示的核 酸序列或由其組成。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID N0:13中所表示的核 酸序列或由其組成。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID N0:15中所表示的核 酸序列或由其組成。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID N0:17中所表示的核 酸序列或由其組成。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID N0:19中所表示的核酸序列或由其組成。根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種多肽，該多肽由根據(jù)本發(fā)明的核酸編碼。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種多肽，該多肽包含選自以下組成的組的氨基酸序列或由其組成SEQ ID NO :6、8、10、12、14、16、18、20、25、26、27、28、29 或 30。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述多肽具有激動劑活性。在本發(fā)明的一個備選的優(yōu)選的實施方案中，所述多肽具有拮抗劑活性。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種同型二聚體，所述同型二聚體由兩個多肽組 成，其中所述多肽中的每一個包含i)包含粒細(xì)胞集落刺激因子或其受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第一部分，所述第一部分任選 地通過肽連接分子連接于ii)包含粒細(xì)胞集落刺激因子受體的細(xì)胞因子同源結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的第二部 分。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO :6或由其組成。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO :8或由其組成。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO: 10或由其組成。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO: 12或由其組成。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO 14或由其組成。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO: 16或由其組成。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO: 18或由其組成。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO 20或由其組成。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO 25或由其組成。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO 26或由其組成。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO 27或由其組成。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO 28或由其組成。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO 29或由其組成。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO 30或由其組成。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了 一種載體，該載體包含根據(jù)本發(fā)明的核酸分子。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述載體是適于表達根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的表達載體。包含根據(jù)本發(fā)明的核酸的載體不需要包括啟動子或其它調(diào)節(jié)序列，尤其是在所述 載體被用于將核酸引入細(xì)胞內(nèi)以重組到基因組內(nèi)用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時。優(yōu)選地，載體內(nèi)的核酸 可操作地連接到適宜的啟動子或其它調(diào)節(jié)元件以在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄。該載體可以是在多種 宿主內(nèi)發(fā)揮作用的雙功能表達載體?！皢幼印笔侵皋D(zhuǎn)錄起始位點上游的核苷酸序列，且該 序列包含轉(zhuǎn)錄所需的所有調(diào)節(jié)區(qū)域。適宜的啟動子包括用于在真核或原核細(xì)胞內(nèi)表達的組 成型的、組織特異性的、可誘導(dǎo)的、發(fā)育的或其它啟動子?！翱刹僮鞯剡B接”是指作為相同核 酸分子的一部分結(jié)合，適當(dāng)?shù)囟ㄎ徊⒍ㄏ?，以便從啟動子起始轉(zhuǎn)錄?？刹僮鞯剡B接于啟動子 的DNA，是啟動子“轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控下的”。在一個優(yōu)選的實施方案中，啟動子是組成型的、可誘導(dǎo)的或可調(diào)控的啟動子。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種細(xì)胞，該細(xì)胞使用根據(jù)本發(fā)明的核酸分子 或載體進行轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化。優(yōu)選地，所述細(xì)胞為真核細(xì)胞?？蛇x地，所述細(xì)胞為原核細(xì)胞。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述細(xì)胞選自以下組成的組真菌細(xì)胞(例 如畢赤酵母屬(Pichia spp)、酵母屬(Saccharomyces spp)、鏈孢霉屬(Neurospora spp))； 昆蟲細(xì)胞(例如灰翅夜蛾屬(Spodoptera spp))；哺乳動物細(xì)胞(例如COS細(xì)胞，CHO細(xì) 胞)；植物細(xì)胞。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述細(xì)胞是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包含根據(jù)本發(fā) 明的多肽，包含賦形劑或載體。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述藥物組合物與另外的治療劑組合。在施用時，本發(fā)明的藥物組合物以藥學(xué)可接受的制品施用。這種制品可常規(guī)地含 有藥學(xué)可接受濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑、相容的載體，以及任選的其它治療劑。本發(fā)明的藥物組合物可以通過任何常規(guī)的途徑施用，包括注射。所述施用和應(yīng)用 可以是，例如，口服的、靜脈內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、腔內(nèi)的、關(guān)節(jié)內(nèi)的、皮下的、局部的 (眼睛)、皮膚的(例如乳膏狀脂溶性插入物，插入皮膚或粘膜)、透皮的或鼻內(nèi)的。本發(fā)明的藥物組合物以有效量施用?！坝行Я俊笔菃为?、或與另外劑量或協(xié)同藥物 一起產(chǎn)生期望響應(yīng)的藥物/組合物的量。這可包括僅暫時延緩疾病的進程，雖然更優(yōu)選的 是，它包括永遠(yuǎn)終止疾病的進程。這可以采用常規(guī)的方法進行監(jiān)測，或可以根據(jù)診斷方法進 行監(jiān)測。施用于受治療者的藥物組合物的劑量，可以根據(jù)不同的參數(shù)進行選擇，尤其是根 據(jù)所使用的施用方式以及受治療者的狀態(tài)(即，年齡、性別)。當(dāng)施用時，本發(fā)明的藥物組 合物以藥學(xué)可接受的量，以及以藥學(xué)可接受的組合物應(yīng)用。當(dāng)在藥物中使用時，鹽應(yīng)當(dāng)是藥 學(xué)可接受的，但是非藥學(xué)可接受的鹽可以方便地用來制備其藥學(xué)可接受的鹽，并且不排除 在本發(fā)明的范圍之外。此類藥理學(xué)和藥學(xué)可接受的鹽包括但不限于，由下述酸制備的鹽鹽 酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、水楊酸、檸檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸，及類似 酸。另外，藥學(xué)可接受的鹽可制備為堿金屬鹽或堿土鹽，例如鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。如果需要，藥物組合物可以與藥學(xué)可接受的載體結(jié)合。此處使用的術(shù)語“藥學(xué)可接 受的載體”，指的是適宜施用于人類的一種或多種相容的固體或液體填充劑、稀釋劑或包封物質(zhì)。術(shù)語“載體”指的是天然或合成的有機或無機成分，活性成分與其結(jié)合以促進應(yīng)用。 藥物組合物的組分還能夠以不產(chǎn)生顯著影響預(yù)期藥效的方式與本發(fā)明的分子以及相互之 間共混。藥物組合物可以包含適宜的緩沖劑，包括鹽形式的乙酸；鹽形式的檸檬酸；鹽形 式的硼酸；和鹽形式的磷酸。藥物組合物還可以任選地包含適宜的防腐劑，例如苯扎氯銨；三氯叔丁醇；對羥 基苯甲酸酯類和硫柳汞。
藥物組合物可以方便地以單位劑型存在，并且可以通過任何一種藥劑學(xué)領(lǐng)域公知 的方法進行制備。所有的方法都包括將活性劑與構(gòu)成一種或多種輔助成分的載體結(jié)合的步 驟。一般而言，通過均一和緊密地將活性化合物與液體載體、精細(xì)分開的固體載體，或兩者 結(jié)合而制備所述組合物，之后如果需要，將該產(chǎn)品塑形。適宜口服施用的組合物，可以制備成離散的單元，例如膠囊、片齊U、錠劑，每種都含 有預(yù)定數(shù)量的活性化合物。其它組合物包括水性液體或非水性液體中的懸浮液，例如糖漿 齊U、酏劑或乳劑。適宜腸胃外施用的組合物方便地包括無菌水性或非水性制品，所述制品優(yōu)選地與 接受者血液等滲。采用適宜的分散劑或濕潤劑以及懸浮劑，根據(jù)已知的方法可以配制該制 品。無菌的可注射制品還可以是在無毒、胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌的可注射 的溶液或懸浮液，例如溶于1，3_ 丁二醇中的溶液?？捎玫目山邮艿娜軇┦撬?、林格溶液和 等滲氯化鈉溶液。此外，無菌不揮發(fā)油方便地用作溶劑或懸浮介質(zhì)。對于此目的，可以使 用任何溫和的不揮發(fā)油，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。另外，脂肪酸例如油酸，可以 用于制備注射劑。適用于口服、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)等施用的載體配方，見Remington’ s Pharmaceutical Sciences (雷明頓制藥禾斗學(xué))，Mack Publishing Co.，Easton，PA。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種治療患有將受益于施用粒細(xì)胞集落刺激因子 激動劑的病況的人類受治療者的方法，所述方法包括施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的至少一種 多肽。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方法中，所述多肽靜脈內(nèi)施用。在本發(fā)明的一個備選的優(yōu)選的方法中，所述多肽皮下施用。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的方法中，所述多肽以兩天的間隔施用；優(yōu)選地，所述多肽 以每周、每2周或每月的間隔施用。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方法中，所述病況是中性粒細(xì)胞減少癥。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種刺激人類受治療者造血祖細(xì)胞增殖和/或分 化的方法，所述方法包括施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的至少一種多肽。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方法中，所述方法是體外方法。在本發(fā)明一個備選的優(yōu)選的方法中，所述方法是體內(nèi)方法。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方法中，在刺激造血祖細(xì)胞之后，從所述人類受治療者收 集骨髓，并用于造血祖細(xì)胞移植。優(yōu)選地，將所述收集的骨髓施用于需要骨髓移植的人類受治療者。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的多肽用于制備治療中性粒細(xì)胞減少 癥的藥物的用途。
在本發(fā)明的又一個優(yōu)選的實施方案中，所述多肽以兩天的間隔施用；優(yōu)選地，所述 多肽以每周、每2周或每月的間隔施用。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了有效量的根據(jù)本發(fā)明的多肽在制備用于刺激人 類受治療者的造血祖細(xì)胞增殖和/或分化的藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種單克隆抗體，所述單克隆抗體與根據(jù)本發(fā) 明的多肽或二聚體結(jié)合。優(yōu)選地，所述單克隆抗體是與所述多肽或二聚體結(jié)合，但是不具體地特異性結(jié)合 粒細(xì)胞集落刺激因子或粒細(xì)胞集落刺激因子受體的抗體。所述單克隆抗體與本發(fā)明的多肽，或包含本發(fā)明多肽的二聚體呈遞的構(gòu)象抗原結(jié)
I=I O
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種制備產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤細(xì) 胞系的方法，所述方法包括以下步驟i)使用含有至少一種根據(jù)本發(fā)明的多肽的免疫原來免疫具有免疫活性的哺乳動 物；ii)將被免疫的具有免疫活性的哺乳動物的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以形成雜 交瘤細(xì)胞；iii)根據(jù)對(i)中的多肽的結(jié)合活性，篩選通過步驟(ii)中的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的 單克隆抗體；iv)培養(yǎng)該雜交瘤細(xì)胞以便增殖和/或分泌所述單克隆抗體；和ν)從培養(yǎng)上清液中回收單克隆抗體。優(yōu)選地，所述具有免疫活性的哺乳動物為小鼠?；蛘撸鼍哂忻庖呋钚缘牟溉閯?物為大鼠。使用雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體是本領(lǐng)域中公知的。用來生產(chǎn)單克隆抗體的 方法，由以下公開Kohler 和 Milstein，Nature 256,495-497(1975),以及 Donillard 和 Hoffman, "Basic Facts about Hybridomas，，in Compendiumof Immunology V. II ed. by Schwartz (Schwartz編寫的第V. II版免疫學(xué)概要中的“雜交瘤基本理論”)，1981，其通過引 用并入。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種雜交瘤細(xì)胞系，所述雜交瘤細(xì)胞系通過根據(jù) 本發(fā)明的方法獲得或可獲得。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種檢測生物樣品中的根據(jù)本發(fā)明的多肽的診斷 測試，所述測試包括i)提供待測試的分離的樣品；ii)將所述樣品與結(jié)合根據(jù)本發(fā)明的多肽或二聚體的配體接觸；和iii)檢測所述樣品中的所述配體的結(jié)合。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述配體是抗體；優(yōu)選地，是單克隆抗體。在整個說明書的描述和權(quán)利要求中，單詞“包含(comprise)，，和“含有 (contain) ”，以及這些單詞的變形，例如“包含(comprising) ”和“包含(comprises) ”，指的 是“包括但不限于”，并且不預(yù)期(和確實不)排除其它部分、添加劑、組分、整數(shù)或步驟。
在整個說明書的描述和權(quán)利要求中，單數(shù)包含復(fù)數(shù)，除非文中另有要求。尤其是，在使用不定冠詞的地方，該說明書理解為包括復(fù)數(shù)和單數(shù)，除非文中另有要求。結(jié)合本發(fā)明的特定方面、實施方案或?qū)嵤├枋龅奶卣?、整?shù)、特點、化合物、化學(xué) 部分或組，將被理解為適用于文中所描述的任何其它方面、實施方案或?qū)嵤├桥c之不 相容?，F(xiàn)在，將僅僅通過例子和參考以下的附圖描述本發(fā)明的實施方案圖Ia編碼在哺乳動物細(xì)胞系中表達的GCSF的核酸序列。信號序列以粗體小寫字 母表示。*指的是終止密碼子。核苷酸長度= 522bp，(不包括信號序列)；圖Ib氨基酸序 列長度=174aa(不包括信號序列)；圖2a編碼在大腸桿菌(pET21a(+))中表達的GCSF的核酸序列，具有6X組氨酸 標(biāo)簽;ATG起始密碼子以粗體表示。*指的是終止密碼子。粗斜體字母指的是在5’末端由 于組氨酸標(biāo)簽而產(chǎn)生的過量序列；圖2b成熟氨基酸序列長度=182aa(不包括甲硫氨酸起 始點)；圖3a編碼GCSF-L6-GCSFrEC(l-3)的核酸序列含有通過G4SX6與GCSF細(xì)胞外 受體結(jié)構(gòu)域1-3 (Ig，BN和BC)連接的GCSF。*指的是終止密碼子。信號序列以粗體小寫字 母表示；圖3b氨基酸序列長度=511aa(不包括信號序列)；圖4a編碼在大腸桿菌中表達的GCSF-L6-GCSFrEC(l_3)的核酸序列含有通過 G4SX6與GCSF細(xì)胞外受體結(jié)構(gòu)域l_3(Ig，BN和BC)連接的GCSF。*指的是終止密碼子； ATG起始密碼子以粗體表示。*指的是終止密碼子。粗斜體字母指的是在5’末端由于組氨 酸標(biāo)簽而產(chǎn)生的過量序列；圖4b氨基酸序列長度=519aa(不包括甲硫氨酸起始點)；圖5a編碼在哺乳動物細(xì)胞系中表達的GCSF-L8-GCSFrEC(l_3)的核酸序列含有 通過G4SX8與GCSF細(xì)胞外受體結(jié)構(gòu)域1-3 (Ig，BN和BC)連接的GCSF。*指的是終止密碼 子。信號序列以粗體小寫字母表示；圖5b氨基酸序列長度=521aa(不包括信號序列)圖6a編碼在大腸桿菌中表達的GCSF-L8-GCSFrEC(l_3)的核酸序列含有通過 G4SX8與GCSF細(xì)胞外受體結(jié)構(gòu)域l_3(Ig，BN和BC)連接的GCSF。*指的是終止密碼子； 圖6b氨基酸序列長度=529aa (不包括甲硫氨酸起始點)圖7a編碼GCSF-L6-GCSFrEC(l-2)的核酸含有通過G4SX6與GCSF細(xì)胞外受體 結(jié)構(gòu)域l-2(Ig和BN)連接的GCSF。*指的是終止密碼子。信號序列以粗體小寫字母表示； 圖7b氨基酸序列長度=404aa(不包括信號序列)圖8a編碼GCSF-L6-GCSFrEC(2-3)的核酸含有通過G4SX6與GCSF細(xì)胞外受體 結(jié)構(gòu)域2-3(BN和BC)連接的GCSF。*指的是終止密碼子。信號序列以粗體小寫字母表示； 圖8b氨基酸序列長度=416aa(不包括信號序列)圖9a編碼GCSFrEC (1-3) -L6-GCSF的核酸含有通過G4S X 6與GCSF連接的 GCSFrEC(結(jié)構(gòu)域1-3)。*指的是終止密碼子。信號序列以粗體小寫字母表示；圖9b氨基 酸序列長度=511aa(不包括信號序列)圖IOa編碼在哺乳動物細(xì)胞系中表達的GCSFrEC (2-3)-L6-GCSF的核酸含有通過 G4SX6與GCSF連接的GCSFrEC(結(jié)構(gòu)域2-3)。*指的是終止密碼子。信號序列以粗體小寫 字母表示；圖IOb氨基酸序列長度=416aa (不包括信號序列)圖Ila編碼在哺乳動物細(xì)胞系中表達的GCSFrEC的核酸序列含有GCSF受體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域1-3。信號序列以粗體小寫字母表示。*指的是終止密碼子；圖lib氨基酸序列長度=307aa (不包括信號序列)；以及

圖12a在pET21a(+)中表達的核酸序列GCSFrEC (細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域1-3)，具有6 X組 氨酸標(biāo)簽(*指的是終止密碼子，粗體字母指的是外Xhol限制性位點和6X組氨酸標(biāo)簽)； 圖12b氨基酸序列長度=315aa(不包括Met)；圖13a)使用PCR生成由側(cè)翼于適宜的限制性位點(包含在引物Rl_4內(nèi))的感興 趣的基因組成的DNA。b)PCR產(chǎn)物連接進入適宜載體中連接體區(qū)域的任一側(cè)。c)然后對構(gòu)建 體進行修飾以引入正確的連接體，其不包含任何不需要的序列(即，非天然限制性位點)； 以及圖14a)設(shè)計寡核苷酸以形成具有獨特重疊的部分雙鏈區(qū)域，并且在退火和加工 時，所述寡核苷酸將編碼具有側(cè)翼區(qū)的連接體，其將退火至配體和受體。b)使用“大引物 (megaprimer) ”和末端引物(Rl和R2)進行PCR,以形成LR-融合基因。Rl和R2引物被設(shè) 計為引入有用的側(cè)翼限制性位點以便連接入靶載體；圖15是粒細(xì)胞集落刺激因子受體的完整氨基酸序列；圖16示出表達GCSF嵌合構(gòu)建體的CHO flpln穩(wěn)定細(xì)胞系的蛋白質(zhì)印跡分析。泳 道1 = 4A1 ；泳道2 = 4D1 ；泳道3 =模擬培養(yǎng)基；泳道4 = 4A1 ；泳道5 = 4D1 ；泳道6 =模 擬培養(yǎng)基；A =非還原條件；B =還原條件。4A1和4D1都介于75kDa和IOOkDa之間運行。 GCSF介于37kDa和45kDa之間運行，如針對糖基化蛋白所預(yù)期的；圖17是GCSF LR-融合構(gòu)建體的圖示；圖18是表達4A1和4D1構(gòu)建體的CHO Flp-In穩(wěn)定細(xì)胞系的免疫印跡分析。泳道 M=分子量標(biāo)記(250、150、100、75、50、37、25*20kDa)；泳道 1 = 4A1 ；泳道 2 = 4D1 ；泳道 3 =模擬培養(yǎng)基；泳道4 = 4A1 ；泳道5 = 4D1 ；泳道6 =模擬培養(yǎng)基；泳道1_3 =還原條件， 而泳道4-6=非還原條件；圖19是表達GCSF、4B1、4C1、4C2和4E1構(gòu)建體的CHO Flp-In穩(wěn)定細(xì)胞系的免疫 印跡分析。泳道 M=分子量標(biāo)記(250、150、100、75、50、37、25、20*15kDa) ；_=無 DTT (二 硫蘇糖醇)(非-還原的)；+=含DTT (還原的)；圖20(A)4A1純化步驟的考馬斯染色的凝膠。泳道M =分子量標(biāo)記(250、150、100、 75、50、37、25、20和15kDa)；泳道1 =粗培養(yǎng)基IOX濃縮物；泳道2 = pH4. 5沉淀的粒狀沉 淀(pellet)；泳道3 = pH4. 5沉淀的上清液，泳道4 = pH5. 5SP未結(jié)合的，泳道5 = pH5. 5SP 結(jié)合的，泳道6-8 =從pH8. OQ柱中得到的級份4至6，泳道9 = 50%硫酸銨沉淀的粒狀沉 淀。⑶純化的4A1的免疫印跡。泳道M =分子量標(biāo)記(如上所述)，泳道1 = 4A1 (含DTT ； 還原的)，泳道2 = 4A1 (無DTT;非還原的)；以及圖21示出測量GCSF、Neulasta和GCSF LR融合體4A1活性的體外生物測定。材料和方法體外檢測檢測GCSF融合多肽活性的體外方法是本領(lǐng)域已知的。例如，收集動物血液、骨骼 和脾細(xì)胞以檢測GCSF的集落形成能力是已知的(見Liu等Blood，15 May 2000 ；95 (10), P3025-3031)。另外，表達GCSFR的細(xì)胞例如M-NFS-60細(xì)胞的用途，以及如通過3H-胸苷所 測量的被刺激而增殖的細(xì)胞的用途，是已知的。
體內(nèi)檢測可以使用不同的動物模型來檢測GCSF的活性。例如，Harada等(NatureMedicine 11 305-311,2005)描述了一種小鼠心肌梗塞模型，其中檢測GCSF的作用，以便監(jiān)測所施用 的重組GCSF對心臟功能的作用。免疫學(xué)檢測測量粒細(xì)胞集落刺激因子與多克隆和單克隆抗體結(jié)合的免疫測定是本領(lǐng)域已 知的?？梢杂蒙藤彨@得的粒細(xì)胞集落刺激因子抗體來檢測樣品中的粒細(xì)胞集落刺激因 子，并用于競爭性抑制研究。例如見，http //www, scbt. com/index, html, Santa Cruz Biotechnology Inc0融合蛋白的重組牛產(chǎn)通過使用經(jīng)設(shè)計退火至配體或受體，以及引入適宜限制性位點以便克隆進入靶載 體的引物的PCR，來生成融合蛋白的組分(圖13a)。PCR模板含有靶基因，并且由IMAGE克 隆、cDNA文庫或定制合成的基因獲得。一旦具有適宜側(cè)翼限制性位點的配體和受體基因被 合成，它們就在靶載體中連接體區(qū)域的任一側(cè)連接(圖13b)。然后通過在連接體區(qū)域任一 側(cè)的兩個獨特限制性位點之間插入定制合成長度的DNA，通過ssDNA修飾技術(shù)突變連接體 區(qū)域，通過在適宜限制性位點之間插入引物雙鏈體/多鏈體，或通過PCR修飾，來對構(gòu)建體 進行修飾以使其含有無側(cè)翼限制性位點的正確連接體(圖13c)?；蛘?，經(jīng)設(shè)計退火至所選配體或受體結(jié)構(gòu)域的具有側(cè)翼序列的連接體，最初是通 過創(chuàng)建寡核苷酸雙鏈體，然后對其加工以產(chǎn)生雙鏈DNA而合成的(圖14a)。之后，使用作為 “大引物”的連接體序列，針對“大引物”退火至的配體和受體的相反末端設(shè)計的引物，以及 作為模板的配體和受體，進行PCR。末端引物設(shè)計有適宜的限制性位點，以連接進入所選的 表達載體(圖14b)。融合蛋白的表達和純化在適宜的系統(tǒng)(例如，哺乳動物CHO細(xì)胞、大腸桿菌)中進行表達，而這依賴于 其中產(chǎn)生LR-融合基因的載體。然后使用多種方法針對表達進行分析，所述方法可包括 SDS-PAGE、非變性PAGE、蛋白質(zhì)印跡、ELISA中的一種或多種。一旦獲得了適宜水平的表達，就大規(guī)模表達LR-融合體，以產(chǎn)生足夠的蛋白用于 純化和隨后分析。使用一種或多種色譜學(xué)程序的適宜組合來進行純化，所述程序例如離子交換色譜 法、疏水相互作用色譜法、硫酸銨沉淀法、凝膠過濾法、尺寸排阻和/或親和色譜法(使用鎳 /鈷_樹脂、抗體_固定樹脂和/或配體/受體_固定樹脂)。使用多種方法分析純化的蛋白，所述方法可包括Bradford測定、SDS-PAGE、非變 性PAGE、蛋白質(zhì)印跡、ELISA中的一種或多種。LR-融合體的特征使用變性PAGE、非變性PAGE凝膠和蛋白質(zhì)印跡來分析融合多肽，并且采用對 LR-融合體非-構(gòu)象地(non-conformationally)敏感的抗體進行蛋白質(zhì)印跡。非變性溶解 狀態(tài)分子量信息，可以從諸如使用Superose G200分析柱的尺寸排阻色譜法和分析型超速 離心的技術(shù)獲得。統(tǒng)計
如果兩個組的方差為正態(tài)分布，則采用Student’ s檢驗進行比較，或者如果是非 正態(tài)分布，則采用Student-Satterthwaite，s檢驗。采用F檢驗對分布進行檢驗。使用單 因素方差分析來比較3組或更多組的平均值，如果顯著性水平為ρ < 0. 05，采用Durmett's 檢驗進行單獨比較。所有統(tǒng)計學(xué)檢驗在5 %顯著性水平都是雙側(cè)的，并且不針對漏失值進行 歸因。嵌合克降的構(gòu)建GCSF細(xì)胞外受體結(jié)構(gòu)域1-3，直接來源于從Image Consortium獲得的克隆的PCR， 并且克隆進入哺乳動物表達載體pSecTag-link。使用基因合成構(gòu)建4A1 (圖3a ；圖3b) 和4D1 (圖9a ；圖9b)兩種基因，并且克隆進入哺乳動物表達載體pSecTag-link，以形成 pGCSFsecTag-4Al和 4A5。GCSF和嵌合克降的哺乳動物穩(wěn)定表汰
使用改良的Invitrogen載體pSecTag-V5/FRT_Hist，建立哺乳動物表達系統(tǒng)。該 系統(tǒng)允許在宿主基因組內(nèi)的特異位點中快速產(chǎn)生穩(wěn)定克隆，以形成高表達。這可以用于分 泌型或胞質(zhì)表達的蛋白。Flp-In宿主細(xì)胞系(flp-InCHO)具有單個Flp重組酶靶(FRT)位 點，該位點位于轉(zhuǎn)錄活性的基因組基因座。通過將載體(含F(xiàn)RT靶位點)和pOG44(瞬時表 達flp重組酶的質(zhì)粒)共轉(zhuǎn)染進入Flp-In細(xì)胞系，而形成穩(wěn)定的細(xì)胞系。采用潮霉素B進 行選擇。因為DNA的整合是定向的，所以不需要進行克隆的選擇。培養(yǎng)Flp-In細(xì)胞系使 用基本的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，按照生產(chǎn)商說明書進行。使用Fimene-6的CHO Flp-In細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染在轉(zhuǎn)染的前一天，以6X IO5每IOOmm培養(yǎng)皿將CHO Flp-In細(xì)胞接種于總體積為 IOml的Hams F12培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包含10% (ν/ν)胎牛血清、青霉素/鏈霉素和4mM L-谷氨酰胺。第二天，將570 μ 1不含血清的培養(yǎng)基(不含抗生素)加至1.5ml聚丙烯管。 之后，加入30μ1 fugene-6，并通過輕輕搖晃混合。針對每一次轉(zhuǎn)染，形成單獨的質(zhì)?；旌?物，該混合物將2 μ g感興趣的質(zhì)粒與18 μ g pOG44合并(質(zhì)粒包含將質(zhì)粒正確整合入宿主 基因組所必需的重組酶)。對照板中不含質(zhì)粒。通過輕輕搖晃將其與fugene-6混合，室溫放 置15分鐘，之后，逐步施用于每個培養(yǎng)皿的表面，該培養(yǎng)皿含有在F12培養(yǎng)基+10% FCS中 的CHO Flp-In細(xì)胞。輕輕搖晃所述板，確保充分混合，并在37°C /5% C02下放置24小時。 第二天，將培養(yǎng)基更換為含600 μ g/ml潮霉素B的選擇培養(yǎng)基。通常，將細(xì)胞保持在60%匯 合或更低。細(xì)胞一直在存在600 μ g/ml潮霉素B的情況下生長，直至對照板細(xì)胞(未轉(zhuǎn)染 細(xì)胞)死亡(即，無潮霉素抗性)。SDS-PAGE分析和蛋白質(zhì)印跡穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO Flp-In細(xì)胞系在75cm2瓶中生長大約3-4天，此時，收集樣品用于 分析。在存在和不存在25mM DTT的情況下，樣品與等體積的Laemmli上樣緩沖液混合，并 煮沸5分鐘。在4-20% (w/v)雙丙烯酰胺凝膠上分離樣品，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜(圖16)。在 含5% (w/v)牛奶蛋白質(zhì)的PBS-0.05% (v/v)Tween 20中封閉之后，使用特異性的抗GCSF 抗體，結(jié)合辣根過氧化物酶(HRP)軛合的二抗，進行樣品檢測。采用HRP檢測試劑盒，在膠 片上經(jīng)化學(xué)發(fā)光進行顯像。LR-融合體的構(gòu)建4Α1和4D1是合成的基因(Genecust，F(xiàn)rance)，并且插入到哺乳動物表達載體pSegTag中。通過使用PCR截短4A1和4D1基因，分別產(chǎn)生4B1和4E1。通過合成連接體區(qū) 域的引物雙鏈體，并使用PCR將其延伸為GCSF和GCSFR序列，產(chǎn)生4A2、4C1和4C2。由于 PCR未能將出4幻8連接體序列延伸為全長基因，因此沒有合成4A2。4C2作為4C1合成的副 產(chǎn)物產(chǎn)生。GCSF-LR融合蛋白構(gòu)建體的圖示，示于圖17。LR-融合體的表汰使用改良的Invitrogen載體pSecTag-V5/FRT_Hist，建立了哺乳動物表達系統(tǒng)。 在Invitrogen's Flp-In系統(tǒng)中，使用該載體來指導(dǎo)靶基因整合進入宿主細(xì)胞系，允許在宿 主基因組內(nèi)特異位點中快速產(chǎn)生穩(wěn)定克隆，以形成高表達。培養(yǎng)Flp-In細(xì)胞系使用基本細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，按照生產(chǎn)商說明書進行。
在6孔板內(nèi)，使用Fugene-6作為轉(zhuǎn)染試劑，產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系。CHOFlp-In細(xì)胞與 表達載體和P0G44共轉(zhuǎn)染，pOG44是一種表達flp重組酶的質(zhì)粒，所述flp重組酶是一種使 得LR-融合基因重組進入細(xì)胞染色體“熱點”的酶。使用潮霉素B來挑選具有陽性重組體 的細(xì)胞。一旦建立了穩(wěn)定的細(xì)胞系，就將其培養(yǎng)在75cm2培養(yǎng)板中，在50_70%匯合時，將培 養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。將培養(yǎng)物再孵育2-4天，之后，收集培養(yǎng)基樣品。將這些在13% SDS-PAGE凝膠上運行，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜以便進行免疫印跡。在含5% (w/v)牛奶蛋白質(zhì)的 PBS+0. 05% (v/v)Tween20中封閉之后，使用特異性的抗GCSF抗體，結(jié)合辣根過氧化物酶 (HRP)軛合的二抗，進行樣品檢測。使用HRP檢測試劑盒，在膠片上經(jīng)化學(xué)發(fā)光進行顯像。 顯示LR-融合體表達的免疫印跡，示于圖18和19。LR-融合體的純化下面詳述了 GCSF-LR的純化方法，且示于圖20。a)將蛋白酶抑制劑加入表達4A1的細(xì)胞的IOX濃縮培養(yǎng)基中。b)將該 IOX 濃縮培養(yǎng)基對 50mM TRIS, ImM EDTA, ρΗ8· 0 透析 2-4 小時。c)將來自(2)的蛋白和透析管轉(zhuǎn)移至IOmM TRIS, ImM EDTA, pH8. 0的溶液，持續(xù) 16小時(過夜)。d)加入0. 25倍體積的0. IM乙酸鹽緩沖液，pH4. 5。使用pH試紙(indicator strip)檢測pH，并以0. Iml等份試樣加入更多的0. IM乙酸鹽緩沖液，pH4. 5，直至pH達到 4. 5。e)然后在冰上孵育2小時，并定期混合。f)進行離心以去除沉淀，并將上清液轉(zhuǎn)移至新管中。g)以0. Iml等份試樣將0. 5M/0. IM NaOH加至上清液，直至pH變?yōu)?. 5_使用pH 試紙分析的PH。h)之后，將該溶液上樣到預(yù)先用25mM乙酸鹽緩沖液，pH5. 5平衡的5ml SP FF柱 上。收集未結(jié)合的蛋白。i)將未結(jié)合級分對25mM TRIS, ImM EDTA, ρΗ8· 0透析16小時(過夜)。j)將透析的樣品上樣至預(yù)先用25mM TRIS pH8. 0平衡的5ml Q FF柱上。k)用20倍柱體積的25mM TRIS，pH8. 0洗滌柱子。1)之后，用O-IM NaCl梯度在20倍柱體積內(nèi)從柱子上洗脫蛋白，收集1倍柱體積 的級份。[4A1在5ml柱子的級份4-7中被洗脫]。
m)將含有> 70%純4A1的級份匯集在一起，并在冰上孵育。η)加入等體積冰冷的飽和硫酸銨溶液，以達到50%硫酸銨的飽和度。在冰上孵育 2-3小時。ο)然后離心蛋白樣品，以使沉淀的蛋白成粒狀沉淀。ρ)將粒狀沉淀重懸于PBS，并將其對PBS透析。
q)之后，分析蛋白樣品。體外牛物測定細(xì)胞制備將AML-193細(xì)胞(ATCC，批號3475266)從液氮儲器中取出，并在37°C水浴中放置2 分鐘。之后，把管形瓶中的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至含有9ml培養(yǎng)基(在Iscove's改良的Dulbecco's 培養(yǎng)基中含有5 % FBS、4mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素、5ng/mlGM_CSF、 5yg/ml胰島素、5yg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白)的15ml管中。以123Xg離心細(xì)胞5分鐘，在培養(yǎng)基 中重懸細(xì)胞粒狀沉淀，并且將細(xì)胞密度調(diào)整至2. 3X IO5個細(xì)胞/ml。細(xì)胞培養(yǎng)在CO2培養(yǎng)箱(5%C02，37°C)中，以3 X 105_2 X IO6個細(xì)胞/ml的密度于培養(yǎng)基中 培養(yǎng)細(xì)胞。每周進行傳代兩次，確保細(xì)胞密度不超過2. 5X IO6個細(xì)胞/ml。通過臺盼藍排 除評估細(xì)胞存活力。在測定前，通過以 125 Xg離心(spinning) 5分鐘用PBS洗滌細(xì)胞3 次。之后，在測定培養(yǎng)基(在Iscove's改良的Dulbecco's培養(yǎng)基中含有5% FBS、4mML-谷 氨酰胺、100U/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素、5 μ g/ml胰島素、5 μ g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白)中重構(gòu)粒 狀沉淀，并且將細(xì)胞密度調(diào)整至5X IO5個細(xì)胞/ml。標(biāo)準(zhǔn)品/樣品制備在PBS(1% BSA)中制備4A1的GCSF蛋白溶液的適當(dāng)稀釋液，用于生物活性檢測。 在50%磷酸鹽緩沖的鹽水溶液和水(都是無菌的)中，將GCSF(國際標(biāo)準(zhǔn)品，NIBSC，批號 88/502)重構(gòu)成lOng/ml (10000IU/ml)的濃度，分成40 μ 1的等份試樣，并在_80°C保存。在 每天測定時，從冰柜中取出1個管形瓶，并制備成工作濃度。GCSF-LR(4A1)的體外生物活性，示于圖21。
權(quán)利要求
一種核酸分子，其包含編碼具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽的核酸序列，所述多肽包含直接或間接地與粒細(xì)胞集落刺激因子受體多肽的至少一個細(xì)胞因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接的粒細(xì)胞集落刺激因子多肽。
2.一種融合多肽，其包含直接或間接地與粒細(xì)胞集落刺激因子受體多肽的至少一個 細(xì)胞因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接的粒細(xì)胞集落刺激因子多肽或其活性部分的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含粒細(xì)胞集落刺激因子受體多 肽的兩個細(xì)胞因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
4.如權(quán)利要求2或3所述的融合多肽，其中所述多肽還含有免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。
5.如權(quán)利要求2-4中任一項所述的融合多肽，其中所述多肽包含至少一個纖連蛋白 III結(jié)構(gòu)域。
6.如權(quán)利要求2-5中任一項所述的融合多肽，其中所述多肽含有SEQIDNO :31中所表 示的氨基酸殘基97-201。
7.如權(quán)利要求2-6中任一項所述的融合多肽，其中所述多肽含有SEQIDNO :31的氨基 酸殘基202-313。
8.如權(quán)利要求2-7中任一項所述的融合多肽，其中所述多肽含有SEQIDNO :31的氨基 酸殘基97-313。
9.如權(quán)利要求2-8中任一項所述的融合多肽，其中所述多肽含有SEQIDNO :31的氨基 酸殘基1-97。
10.如權(quán)利要求2-9中任一項所述的融合多肽，其中粒細(xì)胞集落刺激因子多肽與細(xì)胞 因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域相連，其中在所述融合多肽中，所述粒細(xì)胞集落刺激因子多肽被置于所述 細(xì)胞因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基末端。
11.如權(quán)利要求2-9中任一項所述的融合多肽，其中粒細(xì)胞集落刺激因子多肽與細(xì)胞 因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域相連，其中在所述融合多肽中，所述粒細(xì)胞集落刺激因子多肽被置于所述 細(xì)胞因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域的羧基末端。
12.如權(quán)利要求2-11中任一項所述的融合多肽，其中粒細(xì)胞集落刺激因子多肽通過肽 連接體與粒細(xì)胞集落刺激因子受體多肽的結(jié)合結(jié)構(gòu)域相連。
13.如權(quán)利要求12所述的融合多肽，其中所述肽連接分子含有至少一個拷貝的肽 GlyGlyGlyGlySer0
14.如權(quán)利要求13所述的融合多肽，其中所述肽連接分子含有2、3、4、5、6、7、8、9或10 個拷貝的肽 GlyGlyGlyGlySer。
15.如權(quán)利要求14所述的融合多肽，其中所述肽連接分子由6個拷貝的肽 GlyGlyGlyGlySer 組成。
16.如權(quán)利要求2-11中任一項所述的融合多肽，其中所述多肽不含有肽連接分子，而 是粒細(xì)胞集落刺激因子多肽和粒細(xì)胞集落刺激因子受體多肽的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的直接融合體。
17.一種核酸分子，其包含選自如下的核酸序列i)SEQID NO 5中所表示的核酸序列；ii)SEQID NO 7中所表示的核酸序列；iii)SEQID NO 9中所表示的核酸序列；iv)SEQ ID NO 11中所表示的核酸序列；ν) SEQ ID NO 13中所表示的核酸序列；vi)SEQ ID NO 15中所表示的核酸序列；vii)SEQ ID NO 17中所表示的核酸序列；viii)SEQ ID NO 19中所表示的核酸序列；或一種核酸分子，其包含在嚴(yán)格雜交條件下與SEQ ID NO :5-SEQ IDNO 19雜交的核酸序 列，并且該核酸分子編碼具有粒細(xì)胞集落刺激因子受體調(diào)節(jié)活性的多肽。
18.如權(quán)利要求17所述的核酸分子，其中所述核酸分子編碼具有激動劑活性的多肽。
19.如權(quán)利要求17所述的核酸分子，其中所述核酸分子編碼具有拮抗劑活性的多肽。
20.如權(quán)利要求17所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQIDNO :5中所表示的 核酸序列。
21.如權(quán)利要求17所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQIDNO :7中所表示的 核酸序列。
22.如權(quán)利要求17所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQIDNO :9中所表示的 核酸序列。
23.如權(quán)利要求17所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQIDN0:11中所表示的 核酸序列。
24.如權(quán)利要求17所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQIDNO :13中所表示的 核酸序列。
25.如權(quán)利要求17所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQIDNO :15中所表示的 核酸序列。
26.如權(quán)利要求17所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQIDNO :17中所表示的 核酸序列。
27.如權(quán)利要求17所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQIDNO :19中所表示的 核酸序列。
28.一種多肽，其由權(quán)利要求17-27中任一項所述的核酸編碼。
29.一種多肽，其包含選自由以下所組成的組的氨基酸序列SEQ IDN0:6、8、10、12、 14、16、18、20、25、26、27、28、29 或 30。
30.如權(quán)利要求29所述的多肽，其中所述多肽具有激動劑活性。
31.如權(quán)利要求29所述的多肽，其中所述多肽具有拮抗劑活性。
32.—種同型二聚體，所述同型二聚體由兩個多肽組成，其中所述多肽中的每一個含有i)含有粒細(xì)胞集落刺激因子或其受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第一部分，所述第一部分通過肽連 接分子任選地連接于 )含有粒細(xì)胞集落刺激因子受體的細(xì)胞因子同源結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分的第二部分。
33.如權(quán)利要求32所述的同型二聚體，其中所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :6ο
34.如權(quán)利要求32所述的同型二聚體，其中所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :8ο
35.如權(quán)利要求32所述的同型二聚體，其中所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽包含 SEQ ID NO :10ο
36.如權(quán)利要求32所述的同型二聚體，其中所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :12ο
37.如權(quán)利要求32所述的同型二聚體，其中所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :14ο
38.如權(quán)利要求32所述的同型二聚體，其中所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :16ο
39.如權(quán)利要求32所述的同型二聚體，其中所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :18ο
40.如權(quán)利要求32所述的同型二聚體，其中所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :20ο
41.如權(quán)利要求32所述的同型二聚體，其中所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽 包含SEQ ID Ν0:25或由其組成。
42.如權(quán)利要求32所述的同型二聚體，其中所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :26ο
43.如權(quán)利要求32所述的同型二聚體，其中所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :27ο
44.如權(quán)利要求32所述的同型二聚體，其中所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :28ο
45.如權(quán)利要求32所述的同型二聚體，其中所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :29ο
46.如權(quán)利要求32所述的同型二聚體，其中所述同型二聚體包含兩個多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :30ο
47.一種載體，其包含如權(quán)利要求1或17-27中任一項所述的核酸分子。
48.一種細(xì)胞，其采用如權(quán)利要求1或17-27中任一項所述的核酸分子或如權(quán)利要求 47所述的載體進行轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化。
49.如權(quán)利要求48所述的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
50.如權(quán)利要求48所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。
51.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含如權(quán)利要求2-16或28-31中任一項所述的 多肽，包含賦形劑或載體。
52.如權(quán)利要求51所述的組合物，其中所述藥物組合物與另外的治療劑組合。
53.一種治療患有將受益于施用粒細(xì)胞集落刺激因子多肽的病況的人類受治療者的方 法，所述方法包括施用有效量的如權(quán)利要求2-16或28-31中任一項所述的至少一種多肽。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述多肽是靜脈內(nèi)施用。
55.如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述多肽是皮下施用。
56.如權(quán)利要求53-55中任一項所述的方法，其中所述多肽以兩天的間隔施用。
57.如權(quán)利要求53-55中任一項所述的方法，其中所述多肽以每周的間隔施用。
58.如權(quán)利要求53-55中任一項所述的方法，其中所述多肽以每兩周的間隔施用。
59.如權(quán)利要求53-55中任一項所述的方法，其中所述多肽以每月的間隔施用。
60.如權(quán)利要求53-59中任一項所述的方法，其中所述病況是中性粒細(xì)胞減少癥。
61.一種刺激人類受治療者中造血祖細(xì)胞的增殖和/或分化的方法，所述方法包括施 用有效量的如權(quán)利要求2-16或28-31中任一項所述的至少一種多肽。
62.如權(quán)利要求61所述的方法，其中所述方法是體內(nèi)方法。
63.如權(quán)利要求61所述的方法，其中所述方法是體外方法。
64.如權(quán)利要求61或62所述的方法，其中在刺激造血祖細(xì)胞之后，從所述人類受治療 者收集骨髓，并用于造血祖細(xì)胞移植。
65.如權(quán)利要求64所述的方法，其中將所述收集的骨髓施用于需要骨髓移植的人類受 治療者。
66.如權(quán)利要求2-16或28-31中任一項所述的多肽用于制備治療中性粒細(xì)胞減少癥的 藥物的用途。
67.有效量的如權(quán)利要求2-16或28-31中任一項所述的多肽在制備刺激人類受治療者 造血祖細(xì)胞增殖和/或分化的藥物中的用途。
68.一種單克隆抗體，其與如權(quán)利要求2-16或28-46中任一項所述的多肽或二聚體結(jié)合。
69.如權(quán)利要求68所述的單克隆抗體，其中所述抗體是與多肽或二聚體結(jié)合，但不具 體地特異性結(jié)合粒細(xì)胞集落刺激因子或粒細(xì)胞集落刺激因子受體的抗體。
70.一種用于制備產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系的方法，所述方法包 括如下步驟i)采用含有根據(jù)本發(fā)明的至少一種多肽或其片段的免疫原來免疫具有免疫活性的哺 乳動物； )將被免疫的具有免疫活性的哺乳動物的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，以形成雜交 瘤細(xì)胞；iii)根據(jù)對(i)中的多肽的結(jié)合活性，篩選由步驟(ii)中的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆 抗體；iv)培養(yǎng)所述雜交瘤細(xì)胞以便增殖和/或分泌所述單克隆抗體；并且 ν)從培養(yǎng)上清液中回收所述單克隆抗體。
71.一種雜交瘤細(xì)胞系，其通過權(quán)利要求70所述的方法獲得或可獲得。
72.—種檢測生物樣品中的根據(jù)本發(fā)明的多肽的診斷測試，所述診斷測試包括i)提供待測試的分離的樣品；ii)將所述樣品與結(jié)合權(quán)利要求2-16或28-46中任一項所述的多肽或二聚體的配體接 觸；并且iii)檢測在所述樣品中所述配體的結(jié)合。
73.如權(quán)利要求72所述的方法，其中所述配體是抗體。
74.如權(quán)利要求73所述的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了粒細(xì)胞集落刺激因子融合多肽；編碼所述多肽的核酸分子，以及使用所述蛋白的治療方法。
文檔編號C07K14/535GK101827857SQ200880110315
公開日2010年9月8日 申請日期2008年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月3日
發(fā)明者喬恩·塞耶斯, 彼得·阿蒂米克, 理查德·羅斯 申請人:埃斯特瑞恩有限公司