專利名稱：補(bǔ)體因子h的純化方法
補(bǔ)體因子H的純化方法本發(fā)明提供一種從含有因子H的物料中純化高純度和高生物活性的補(bǔ)體因子H的方法。獲得的血漿補(bǔ)體因子H濃縮物可以在病理?xiàng)l件下被用作治療性補(bǔ)體抑制劑，特別是在涉及替代性補(bǔ)體系統(tǒng)的異?；罨臈l件下。
背景技術(shù)：
補(bǔ)體因子H是主要肝源的血衆(zhòng)糖蛋白，首先由Nilsson和Mueller-Eberhard發(fā)現(xiàn)(1965，J Exp Med, 122，277-298)。它由 20 個(gè)短共有重復(fù)序列(short consensusrepeats, SRC)的重復(fù)序列構(gòu)成或由補(bǔ)體控制蛋白(complement control proteins, CCP)的重復(fù)序列構(gòu)成，其中每個(gè)由60個(gè)氨基酸組成。由SCR模塊構(gòu)成的蛋白被認(rèn)為是結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的分子。將補(bǔ)體因子H暴露于不同的苛刻的化學(xué)和物理?xiàng)l件下并不會(huì)使其失活(Kask etal.(2004) Protein Sc1.13， 1356-1364)。它通過多個(gè)分子機(jī)制，成為補(bǔ)體旁路的必要調(diào)節(jié)因素。首先，補(bǔ)體因子H作為因子I介導(dǎo)的激活的補(bǔ)體成分3b (C3b)剪切的必要輔因子。其次，它與因子B片段Bb競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至C3b，從而抑制含有C3b和Bb的復(fù)合物的C3轉(zhuǎn)化酶的形成，進(jìn)而抑制補(bǔ)體擴(kuò)增的發(fā)生。再者，在補(bǔ)體因子H的分子結(jié)構(gòu)中存在數(shù)個(gè)不同的結(jié)合域，用于結(jié)合不同的短共有重復(fù)序列(SCR)上的配體，這使得能夠通過不同的結(jié)合親和性來區(qū)分宿主和非宿主。換句話說，通過向帶有足夠配體的表面提供足夠的結(jié)合親和性，補(bǔ)體因子H能夠區(qū)分在哪個(gè)表面阻止補(bǔ)體活化(宿主)，而在哪個(gè)表面不阻止(例如，病原體)(Meri and Pangburn (1990)PNAS 87， 3982-3986)。已經(jīng)被證明的是，補(bǔ)體因子H與含有補(bǔ)體旁路異?；罨亩喾N病理生理學(xué)病癥有關(guān)，即膜增生性II型腎小球腎炎(也被稱為致密物沉積??；在Pickering and Cook, ClinExp Immunol (2008), 151，210-230中被討論)、非典型溶血尿毒綜合癥(在Noris andRemuzzi, Clin Exp Immunol (2008), 151, 199-20中被討論)以及重要的年齡相關(guān)性黃斑變性(Hageman et al.(2005) PNAS 102，7227-7232)。有證據(jù)表明，在補(bǔ)體因子H的402位點(diǎn)的酪氨酸至組氨酸的氨基酸替換(Y402H)(在健康的西方人中有30%的顯著的雜合子患病率)，使個(gè)體易患年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD) (Hageman, G.S.et al., Proc Natl AcacI Sci U S ^102, 7227-7232，(2005) ; Edwards, A.0.et al., Science308, 421-424，(2005) ; Klein, R.J.etal., Science308, 385-389，(2005) ; Haines, J.L.et al., Science308, 419-421，(2005))。補(bǔ)體因子H 402H風(fēng)險(xiǎn)變種增大了發(fā)展AMD的風(fēng)險(xiǎn)(對(duì)雜合子個(gè)體為2-4倍，對(duì)純合子個(gè)體為5-7倍)。已發(fā)現(xiàn)Y402H多態(tài)性會(huì)使補(bǔ)體因子H功能失調(diào)具體表現(xiàn)為在損傷部位的減少的結(jié)合能力(Clark, S.J.et al., Biochem Soc Trans., 2010, 38, 1342-8;Kelly, U.et al., J Immunol., 2010, 185, 5486-94)和補(bǔ)充調(diào)節(jié)(Lauer, N.et al.,J Immunol., 2011)。鑒于AMD病理-病因中補(bǔ)體的重大影響(Anderson, D.H.et al.,Prog Retin Eye Res., 2010, 29，95-112)，研究純化的Ci7H在AMD病人的治療中作為治療性補(bǔ)體抑制劑的價(jià)值是非常吸引人的，特別是在表達(dá)CHl風(fēng)險(xiǎn)變種的個(gè)體中。
進(jìn)一步地,流形實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(manifold experimental data)證明在某些病理中涉及補(bǔ)體旁路，這強(qiáng)烈表明使用補(bǔ)體抑制劑來有效地調(diào)節(jié)潛在的被消除的補(bǔ)體活化。被討論由補(bǔ)體抑制劑治療的病理包括缺血再灌注損傷(Huang et al.(2008) J Immunol 181，8068-8076; Stahl et al.(2003) J Pathol 162，449-455)、由在近端腎小管中帶有異常補(bǔ)體活化的蛋白尿?qū)е碌穆阅I病(He et al.(2005) J Immunol 174，5750-5757;Abbate et al.(2008) J Am Soc Nephrol 19, 1158-1167)或自身免疫性腦脊髓炎(Griffiths et al.(2009) J Immunol 182， 4368-4377)。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)患有非典型溶血尿毒綜合癥的病人的治療由血漿處理(血漿輸注或血漿取出)組成，其基本原理是修正病人的功能性補(bǔ)體因子H模塊的缺乏(Noris andRemuzzi, Clin Exp Immunol (2008), 151，210-230)。但是，這種治療伴有某些缺點(diǎn)，給予適量的功能性因子H需要大量的血漿。關(guān)于人類致密物沉積病的報(bào)道非常少(Licht C et al.(2006) Kidney Int.,70，42-50)。近期，出現(xiàn)了關(guān)于補(bǔ)體因子H在致密物沉積病的小鼠模型中充當(dāng)治療性手段的活體內(nèi)證據(jù)(Fakhouri et al.(2010) Kidney Int., 1_8)。在其中，由多步驟層析制得的血漿補(bǔ)體因子H濃縮物，完全改善了由補(bǔ)體因子H的完全缺失所引起的腎臟病變，最終這些作者認(rèn)為它是在致密物沉積病患者中進(jìn)行血漿治療的有效替代療法。迄今為止，沒有對(duì)干性年齡相關(guān)性黃斑變性(老年人法定失明的世界性首要原因)的治療方法?；加性绨l(fā)性黃斑變性的人群中，約90%臨床證明是非新生血管性干性，其特征是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞萎縮和黃斑區(qū)光受體缺失(Klein et al.(2004) Am JOphthalmol.137，486-495)。在約30%的人群中可以發(fā)現(xiàn)雜合子態(tài)的補(bǔ)體因子H基因的某個(gè)單倍體型，在患有干性年齡相關(guān)性黃斑變性的病人中超過50%發(fā)現(xiàn)帶有這種單體型(Hageman et al.(2005) PNAS 102, 7227-7232)。補(bǔ)體因子H基因中的這一單核苷酸多態(tài)性在蛋白的402位點(diǎn)(Y402H)將酪氨酸替換為組氨酸，使得補(bǔ)體因子H對(duì)聚陰離子和其他天然配體的結(jié)合能力降低(Laine et al.(2007) J Immunol 178，3831-3836)。因此，Y402H的純合子攜帶者10%的患病率反映出，正常人群中每三人就有一位患年齡相關(guān)性黃斑變性的風(fēng)險(xiǎn)增加3倍，而每十人就有一位患病風(fēng)險(xiǎn)增加8倍。此外，近期的數(shù)據(jù)證實(shí)了構(gòu)成細(xì)胞外視網(wǎng)膜沉積物(稱為玻璃膜疣)的不可分割的一部分的多種補(bǔ)體成分和抑制劑在玻璃膜撫額形成中起到關(guān)鍵作用(Anderson et al.(2010) Prog Ret Eye Res 29, 95-112)。因此，補(bǔ)體在年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)發(fā)病機(jī)制中的重要作用強(qiáng)烈地顯示出補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑的醫(yī)療用途。特別地，天然內(nèi)源性補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑在受感染的視網(wǎng)膜組織(RPE和布魯赫膜)中的缺失以及局部視網(wǎng)膜補(bǔ)體系統(tǒng)在AMD發(fā)病機(jī)制中已確定出的作用表明補(bǔ)體因子H作為干性形式AMD的治療手段的潛在用途。因此，補(bǔ)體因子H的這種用途可以表明優(yōu)選通過定期的眼內(nèi)注射或靜脈內(nèi)注射來實(shí)現(xiàn)。這種單核苷酸多態(tài)性對(duì)于因子H的功能的影響尚在研究中，但是非?？赡苡绊懫湓趲追N疾病狀態(tài)中的調(diào)節(jié)功能。因此，對(duì)這樣的患者(但不限于此)施用功能性的因子H很可能對(duì)治愈疾病有幫助。
當(dāng)前，任何商業(yè)上可獲得的補(bǔ)體因子H的藥物組合物都是用來為患有補(bǔ)體因子H缺陷相關(guān)的疾病的患者給藥的，這些疾病的例子已在上文討論。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供因子H濃縮物以及相應(yīng)的從合適的因子H來源制備因子H濃縮物的方法，所述因子H來源選自血液或血漿及它們衍生部分、重組生產(chǎn)的因子H (優(yōu)選通過人類細(xì)胞系(如人胚腎細(xì)胞(HEK))來生產(chǎn)，或轉(zhuǎn)基因表達(dá)的蛋白質(zhì))。用于補(bǔ)體因子H濃縮物的純化的一種可能的來源是人血漿，其含有豐富的補(bǔ)體因子H，濃度為約500 Pg/ml。Carron et al., Biochimica et Biophysica Acta, General Subjects (1996),1289(3)，305-11公開了一種因子H純化方法，它通過使用凝血酶活化人血小板，再將上清液進(jìn)行凝膠純化以除去纖連蛋白和肝素瓊脂糖凝膠來實(shí)現(xiàn)。因子H的洗脫通過0.3MNaCl緩沖液實(shí)現(xiàn)，并進(jìn)一步通過DEAE-色譜來純化。另一種途徑是血漿依次進(jìn)行L-賴氨酸-Sepharose色譜、DEAE-Sephagel色譜和選擇性因子H-抗體親和色譜。Lundwall et al., Journal of Immunological Methods (1985), 81 (1),147-60描述了分離因子H的方法,該方法為在血衆(zhòng)中懸浮QAE-Sephadex兩次,將一次懸浮的QAE-S^hadex覆蓋在已填充的QAE-S^adex柱上，再洗脫含有因子H的組分。該組分隨后被加樣到SP-Sephadex柱上,再進(jìn)行最后的DEAE-Sephacel色譜，以獲得補(bǔ)體因子H。血纖維蛋白溶酶和/或血纖維蛋白溶酶原被認(rèn)為是可能存在的雜質(zhì)。US 2008/318841 Al公開了從血漿冷沉淀物的上清液中純化因子H。上清液首先進(jìn)行陰離子交換色譜，隨后將未保留組分進(jìn)行第一次肝素親和色譜。未結(jié)合的因子H再進(jìn)行結(jié)合條件下的第二次肝素親和色譜，洗脫后，再進(jìn)行第一次陰離子交換色譜。因子H洗脫后，再進(jìn)行第二次陰離子交換色譜，最后濃縮因子H。WO 2008/113589 Al涉及通過多種方法純化因子H，這些方法包括一個(gè)或多個(gè)層析步驟，包括肝素親和色譜、疏水相互作用色譜(HIC)、陰離子交換色譜(AEC)、陽離子交換色譜、羥基磷灰石色譜(HAC)或免疫親和色譜。Nagasawa S.等在 Journal of Immunology, Vol.125, N0.2, 1980,第 578-582頁報(bào)道了通過補(bǔ)體C3b滅活劑剪切補(bǔ)體C4b以生產(chǎn)缺口形式的補(bǔ)體C4b，補(bǔ)體C4b作為補(bǔ)體C3b滅活劑的補(bǔ)體C4b的中間剪切產(chǎn)物。所公開的從血漿中純化補(bǔ)體C3b滅活劑(即人補(bǔ)體因子I)的方法包括陽離子交換色譜、陰離子交換色譜，隨后為肝素色譜。Mhatre A.等在 Veterinary Immunology and Immunopathology, Vol.14, N0.4，第357-375頁公開了牛補(bǔ)體因子H的分離方法，其報(bào)道了從血清中分離出牛補(bǔ)體因子H。該分離方法包括PEG沉淀，隨后為陰離子交換色譜、陽離子交換色譜以及超離心濃縮。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種從含因子H來源物中純化因子H的方法。另一個(gè)目的在于提供特別用于醫(yī)藥目的的因子H濃縮物。本發(fā)明公開一種從含有補(bǔ)體因子H的來源物中純化出補(bǔ)體因子H的方法，所述來源物例如是血液或血漿，特別是含有因子H的來源物的辛酸鹽沉淀，它是通過例如向血液或血漿組分中添加辛酸鹽離子來獲得，該方法包括以下步驟:
a)提供含因子H來源物，特別是重構(gòu)辛酸鹽沉淀以提供含有補(bǔ)體因子H的溶液；
b)進(jìn)行陽離子交換色譜， 特別是作為第一次色譜分析步驟；
c)進(jìn)行陰離子交換色譜；
d)進(jìn)行烴基磷灰石色譜；e)其后進(jìn)行超濾/滲濾以獲得補(bǔ)體因子H濃縮物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，還進(jìn)行了肝素親和色譜。在本發(fā)明的方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明還包括用于病原體去除和/或滅活的至少一種以下方法:
a)溶劑/洗滌劑處理；
b)巴氏滅菌；
c )蒸汽熱處理；
d)干燥熱處理；
e)納濾。在本發(fā)明的方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，補(bǔ)體因子H濃縮物被凍干，任選地與藥學(xué)上可接受的用于形成制劑的物質(zhì)一起被凍干。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及可由本發(fā)明的方法獲得的補(bǔ)體因子H。該因子H的特征是高純度和高活性。特別地，本發(fā)明的補(bǔ)體因子H可通過包含以下步驟的方法獲得:
a)重構(gòu)辛酸鹽沉淀以提供含有補(bǔ)體因子H的溶液；` b)通過溶劑/洗滌劑處理(S/D處理)進(jìn)行病毒滅活；
c)在下述條件下進(jìn)行陽離子交換色譜的色譜分析步驟:
將補(bǔ)體因子H結(jié)合至磺丙基型強(qiáng)陽離子交換樹脂，使用包含20mM檸檬酸鈉、pH 6.0的緩沖液洗滌，并用包含20mM檸檬酸鈉、0.2 M NaCUpH 6.0的洗脫緩沖液洗脫補(bǔ)體因子H ；
d)在下述條件下進(jìn)行陰離子交換色譜分析步驟:
將含有補(bǔ)體因子H的溶液(電導(dǎo)率0.1-0.5 mS/cm)施加于季銨型強(qiáng)陰離子交換樹脂，使用包含20 mM Tris, pH 8.6的緩沖液洗滌，并用包含20 mM Tris,0.2M NaCl、pH 8.6的洗脫緩沖液洗脫補(bǔ)體因子H ；
e)通過在陶瓷羥基磷灰石上加樣步驟d)的組分進(jìn)行陶瓷羥基磷灰石色譜，任選地在步驟d)的緩沖液交換已進(jìn)行之后進(jìn)行，并且用最高為I M NaCl的氯化鈉線性梯度來洗脫，并且收集在緩沖液的電導(dǎo)率為70 - 100 mS/cm時(shí)洗脫的組分；
f)任選地在下述條件下進(jìn)行肝素親和色譜分析步驟:將含有補(bǔ)體因子H的溶液施用于表面固定有肝素的樹脂，使用含20mM檸檬酸鈉、pH 6.0緩沖液洗滌，并用含20 mM檸檬酸鈉、0.2M NaCUpH 6.0的洗脫緩沖液洗脫補(bǔ)體因子H ；
g)隨后通過超濾/滲濾獲得補(bǔ)體因子H濃縮物，任選地，可提供納濾步驟并且可用作病毒去除步驟。本發(fā)明的補(bǔ)體因子H的進(jìn)一步特點(diǎn)是為液體或凍干制劑。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的補(bǔ)體因子H可被用來治療補(bǔ)體因子H缺陷或活性異常相關(guān)疾病。特別地，所述疾病選自膜增生性腎小球腎炎、致密物沉積病、溶血尿毒綜合癥、非典型溶血尿毒綜合癥或年齡相關(guān)性黃斑變性。此外，本發(fā)明的補(bǔ)體因子H可被用來制造治療缺血再灌注損傷、慢性腎病或自身免疫性腦脊髓炎的藥物。


圖1展示了 4-20% TRIS-甘氨酸梯度SDS-Page，每個(gè)泳道施加5Pg不同蛋白質(zhì)并銀染。圖2A-2D展示了圖1的泳道I和3以及標(biāo)記物泳道的密度測(cè)試。通過銀染SDS-Page可以觀察到痕量的蛋白質(zhì)，但無法觀察到峰值的密度定量。密度測(cè)量的目的是改善雜質(zhì)的可視性(純?yōu)槎ㄐ栽?，因?yàn)閳D1的重印可能導(dǎo)致信息丟失。要澄清的是，用在本申請(qǐng)中的詞語“包含”應(yīng)被理解為也包括“由…組成”的意思。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供從任何因子H來源物，優(yōu)選從血漿分離物組分中純化補(bǔ)體因子H的方法。這種組分的例子為重構(gòu)的組分I+II+III沉淀和組分I+III沉淀(由重構(gòu)的組分I+II+III沉淀獲得)，并且是指通過冷乙醇分離過程獲得的組分。這些過程，例如Cohn、Kistler- Nitschmann以及它們的變化形式為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。令人驚訝的是，通過辛酸鹽沉淀法獲得的沉淀物含有功能性因子H，所述辛酸鹽沉淀法例如在WO 2005/082937中所描述的那樣進(jìn)行，即，將Cohn組分I+II+III或組分ΙΙ+ΙΠ溶解在水中，使用乙酸調(diào)節(jié)pH至約4.9，并通過添加辛酸鹽來沉淀同時(shí)保持pH不變，并且令人驚訝的是可從該中間物獲得高純度因子H的活性濃縮物。本領(lǐng)域技術(shù)人員要理解的，等同的中間物也是合適的，例如從Kis11er-Nitschmann或Hink分離程序或它們的變化形式獲得的中間物。本發(fā)明的純化過程還具有至少一種有效且專門的病原體去除、減少或滅活方法，例如巴氏滅菌、蒸汽熱處理、溶劑-洗滌劑處理(特別是Triton/TnBP)或納濾(特別是通過〈35 nm孔徑的過濾器，最優(yōu)選彡20 nm)。本文所使用的術(shù)語“病原體”是指，但不限于，病毒(例如HIV、細(xì)小病毒或各種形式的肝炎病毒)、真菌、細(xì)菌和/或蛋白質(zhì)(例如PrPSc;)。此外，可進(jìn)行凍干因子H濃縮物的最終容器干燥加熱，可結(jié)合進(jìn)行所描述的滅活和/或去除步驟。因子H純化方法的起始物料是來自血漿分離過程的組分。一種可能的富含因子H的血漿蛋白組分是來自Cohn分離程序的重構(gòu)的組分I+II+III沉淀。組分I+II+III沉淀是通過使來自新鮮冷凍 血漿的常規(guī)冷沉淀上清液進(jìn)行冷乙醇沉淀來獲得的。除免疫球蛋白夕卜，Cohn法的組分I+II+III還含有幾種脂蛋白、纖維蛋白原和幾種涉及溶解纖維蛋白系統(tǒng)的蛋白質(zhì)以及各種少量成分。通過辛酸鹽沉淀由組分I+II+III或組分II+III可獲得膏狀物，如WO2005/082937 Al (以上簡短地進(jìn)行了描述)或EP O 893 450 Al所描述的，組分I+II+III或組分II+III在pH 3.8-4.5時(shí)重構(gòu)，其后添加辛酸鹽和/或辛酸，從而導(dǎo)致pH改變成
5.0-5.2以及蛋白質(zhì)的沉淀。根據(jù)WO 2005/082937A1或EP 0893 450 Al制備的沉淀物是可被有利地用作功能性因子H濃縮物的純化的起始物料的辛酸鹽沉淀的例子。其他可用的辛酸鹽沉淀的起始物料的例子有Cohn組分1+111、Kistler-Nitschmann法的等同組分(例如沉淀物B)、Cohn_0ncley法的等同組分、Hink法的等同組分、含有重組法生產(chǎn)的因子H的溶液(優(yōu)選通過人細(xì)胞系表達(dá)，如人胚腎細(xì)胞(HEK)，或轉(zhuǎn)基因表達(dá)的蛋白質(zhì))。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比較的主要優(yōu)點(diǎn)是利用很少的色譜分析步驟的組合完成迄今未達(dá)到的活性和純度的補(bǔ)體因子H制劑的生產(chǎn)。與商業(yè)上獲得的補(bǔ)體因子H (來自Complement Technology Inc.(CompTech)的 A137 ;以及 Calbiochem)制劑相比，蛋白質(zhì)(通常伴隨有血漿性補(bǔ)體因子H制劑)的蛋白分解產(chǎn)物通過此方法可被保持在最低，表明天然的、完全糖基化的補(bǔ)體因子H產(chǎn)率最大化。由本方法獲得的最終的補(bǔ)體因子H濃縮物在補(bǔ)體因子H的體內(nèi)活性分析中產(chǎn)生出完全的生物學(xué)上的功能性蛋白。本文使用的術(shù)語“功能性補(bǔ)體因子H”是指任何測(cè)試的富含補(bǔ)體因子H的組分劑量依賴性地抑制與無補(bǔ)體因子H血清一起培養(yǎng)的羊紅細(xì)胞的補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血的能力。含因子H的辛酸鹽沉淀物在約4°C被溶解在包含20-50mM檸檬酸鈉、20_120mM甘氨酸、5-20mM乙二胺四乙酸(EDTA)、5-20mM乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、pH 6.0-7.5的緩沖液中，特別是pH 7.4、由20mM檸檬酸鈉、60mM甘氨酸、IOmM EDTAUOmM EGTA構(gòu)成的緩沖液。4°C離心20分鐘(5000 - 10000 rpm)，以從上清液中分離出未溶解的物質(zhì)。所產(chǎn)生的上清液隨后被進(jìn)行溶劑/洗滌劑(S/D)處理。其中，上清液被與0.3% (w/w)磷酸三正丁酯(TnBP)和 1% (w/w) Triton X-100 (聚乙二醇 p- (1，1，3，3-四甲基丁基)_苯基醚)混合至少40分鐘至12小時(shí)(取決于溫度)，特別是在室溫下50分鐘至在4°C時(shí)4小時(shí)。該溶液用0.3N HCl調(diào)節(jié)pH至約6.0,并在20-25°C下稀釋至電導(dǎo)率為4.4至5.2mS/cm，并用0.45ΜΠ1膜過濾。過濾后的溶液隨后被施加至用于陽離子交換色譜(CEX)的凝膠/樹脂，例如但不限于，基質(zhì)材料上經(jīng)由連接基團(tuán)附接有羧甲基或磺酸基的色譜材料，特別是強(qiáng)陽離子交換樹脂，例如Tosho的Toyopearl SP-650M,即，磺丙基連接至羥基化的聚丙烯酸基質(zhì)。在樣品在室溫下施加至色譜材料后，通過使用幾倍柱體積的平衡緩沖液洗滌來從凝膠中除去弱吸附的蛋白質(zhì)，所述平衡緩沖液包含20mM檸檬酸鈉、pH 6.0、電導(dǎo)率在20-251:的溫度時(shí)為約4. 8 ms/cm。所述洗滌步驟后為未結(jié)合蛋白質(zhì)組分的逐步梯度洗脫，這是通過在相同緩沖液中逐步增加氯化鈉(NaCl)濃度(0.1 M; 0.2 M;和IM NaCl)來實(shí)現(xiàn)的。通過額外含有0.2M NaCl的平衡緩沖液從CEX凝膠中洗脫出的組分被收集，并且該緩沖液被替換為20mM Tris-HCL緩沖液(pH為8.5-8.7，電導(dǎo)率在20_25°C溫度下為0.1至
0.5 mS/cm)。所獲得的溶液進(jìn)行陰離子交換色譜(AEX)。用于這種類型色譜的樹脂是熟知的，并且由(但不限于)連接有各種氣基、季按基或甲基橫酸鹽的基質(zhì)材料構(gòu)成，基質(zhì)材料例如是葡聚糖、瓊脂糖、丙烯酸聚合物或聚苯乙烯，特別是強(qiáng)陰離子交換樹脂，例如是Q-Sepharose XL (季銨基連接至瓊脂糖)。在用由20mM TRIS構(gòu)成的緩沖液(pH 8.6)洗滌吸附至AEX樹脂的因子H之后，通過增加在該緩沖液中的NaCl濃度進(jìn)行逐步梯度洗脫。通過包含20mM TRIS-HCl和0.25MNaCUpH 6.8的洗脫緩沖液從陰離子交換凝膠中洗脫出因子H，而用含有20mM Tris-HCl和至多0.2M NaCl的緩沖液洗脫的組分被丟棄。含因子H的組分被超濾/滲濾，用于緩沖液更換。五倍樣品體積被用包含5mM磷酸二氫鈉(NaH2P04*2 H2O), pH 6.50、電導(dǎo)率 0.5 至 0.7 mS/cm (20_25°C )的緩沖液更換。該溶液被進(jìn)行陶瓷羥基磷灰石色譜(CHA)。陶瓷羥基磷灰石在其表面上具有羥基和磷酸基以及鈣作為功能基團(tuán)，因此是一種混合模式的色譜材料，其陶瓷特性(即與晶型羥基磷灰石相比的高孔隙率)是由其生產(chǎn)過程獲得的，并且由于更高的比表面積而提供更好的分離性質(zhì)。使用 IOmM 磷酸二氫鈉(NaH2P04*2 H2O),pH 6.50、電導(dǎo)率約 1.1 mS/cm (20_25°C )的緩沖液平衡動(dòng)態(tài)載量>12.5 mg溶菌酶/g、最小孔徑為800-1000埃(即80_100nm)的陶瓷羥基磷灰石(例如來自Bio-Rad 的CHT II型40Mm)。使用濃度至多為IM NaCl的平衡緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫。收集在導(dǎo)電率為70-100 mS/cm (20_25°C )洗脫的組分用于超濾/滲濾。作為選擇，可在純化方法中在此時(shí)進(jìn)行親和色譜，特別是使用肝素連接至基質(zhì)的樹脂。如果進(jìn)行肝素親和色譜，來自陶瓷羥基磷灰石色譜的含有補(bǔ)體因子H的溶液被超濾/滲濾，以用于與包含20mM檸檬酸鈉、pH 6.0、電導(dǎo)率4.5-4.7 mS/cm (20_25°C )的緩沖液進(jìn)行緩沖液更換，并且被加樣至可用于肝素親和色譜的凝膠上，例如連接有肝素的瓊脂糖。這種樹脂的一個(gè)例子是GE Healthcare的Heparin Sepharose 6 FF。在用5倍柱體積的平衡緩沖液(即用于之前緩沖液更換的相同平衡緩沖液)洗滌凝膠和吸附的補(bǔ)體因子H后，通過在相同緩沖液中添加0.2M NaCl來洗脫補(bǔ)體因子H。從陶瓷羥基磷灰石色譜或任選的肝素親和色譜中獲得的因子H溶液被濃縮并通過超濾/滲濾以期望的制劑緩沖液(例如PH約7.4的磷酸緩沖液)來配制成期望的最終濃度，以獲得至少10mg/ml的配制成的因子H濃縮物,例如約50 mg/ml,特別是10-300 mg/ml。為了改善病原體安全性，也可以在濃縮/配制步驟之前或之后引入納濾，通過孔隙小于35nm的納濾器進(jìn)行，例如10-30 nm孔隙的納濾器，特別是20nm或15nm孔隙的納濾器。在濃縮和配制時(shí)進(jìn)行的超濾/滲濾之后，或在任選的納濾(其發(fā)生在用于濃縮和配制目的的超濾/滲濾之后)之后，含有因子H的濃縮物被無菌過濾并填充到最終容器中。為了除提供液體產(chǎn)物外還提供凍干產(chǎn)物，游戲要在最終生產(chǎn)步驟中對(duì)已經(jīng)填充在最終容器中的因子H濃縮物進(jìn)行凍干。根據(jù)本發(fā)明的方法制造的補(bǔ)體因子H的產(chǎn)率良好，并且具有迄今為止不存在 的純度和活性。測(cè)試補(bǔ)體因子H活性的實(shí)驗(yàn) 測(cè)試原理
測(cè)試補(bǔ)體因子H的生物學(xué)活性是通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)的，該實(shí)驗(yàn)利用活羊紅血細(xì)胞作為補(bǔ)體激活劑表面。這些羊紅細(xì)胞與無補(bǔ)體因子H血清一起培養(yǎng)以提供完整的血清補(bǔ)體成分同時(shí)缺少補(bǔ)體旁路的這種重要的調(diào)節(jié)劑。為保證只有旁路補(bǔ)體激活發(fā)生，這些試劑被用含有續(xù)離子和 EGTA 的 Veronal Buffered Saline (VBS) 一起孵育。重構(gòu)補(bǔ)體因子H的來源物保護(hù)羊紅細(xì)胞免受補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血。溶血的程度可通過測(cè)定胞質(zhì)外血紅蛋白在414nm波長下的吸收峰來確定。樣品的特定活性通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較而計(jì)算得出，標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過添加商業(yè)上獲得的純的補(bǔ)體因子H的濃縮物而獲得的。本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)例子顯示在圖1和2中，其測(cè)試了本發(fā)明的第三純化步驟獲得的補(bǔ)體因子H洗脫物。補(bǔ)體因子H活性測(cè)試的描述
首先，使用10 ml新鮮的Alsever氏溶液(4.2g/L NaCl、8g/L梓檬酸鈉*2H20、0.55g/L檸檬酸*H20和20.5g/L D-葡萄糖)洗滌并以2300 RPM在室溫下離心5分鐘。在分光光度計(jì)中測(cè)量上清液在280nm波長處的吸收峰以監(jiān)控其中的蛋白質(zhì)釋放。連續(xù)洗滌三次直到OD在280nm不再增加。包含羊紅細(xì)胞的團(tuán)塊被溶解，以產(chǎn)生在Alsever氏溶液中的33%的溶液。其次，將10μ1的33%的羊紅細(xì)胞溶液與20μ1無補(bǔ)體因子H的血清(Α337，Complement Technology Inc.)在500μ1小瓶中在4°C混合,并在4°C預(yù)培養(yǎng)15分鐘。預(yù)培養(yǎng)后,添加不同劑量的標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)體因子H(A137, Complement Technology Inc.)和富含補(bǔ)體因子H的樣品，添加20μ1的體積。為了使所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)稀釋液等同，剩余體積用0.9%NaCl溶液填補(bǔ)。隨后，向所有小瓶中快速添加30μ1 的 Veronal Buffered Saline (VBS) (2.5mM巴比妥鈉，144mM NaCl, IOmM乙二醇四乙酸(EGTA)，30mM MgCl2, pH 7.4)，以開始反應(yīng)(最終反應(yīng)體積為80μ1)。小瓶在37°C以450 RPM培養(yǎng)30分鐘。向所有小瓶中添加220μ1的冰冷2.5mM巴比妥鈉，144mM NaCl和IOmM乙二胺四乙酸(EDTA)，30mM MgCl2, pH 7.4以終止反應(yīng)，終體積為每瓶300μ1。所有樣品在室溫下在Microfuge (Eppendorf)中以20000g離心5分鐘，以從上清液中分離出細(xì)胞團(tuán)塊。ΙΟΟμΙ上清液被加入到96孔微孔板(Nunc) (2份)，并用分光光度計(jì)測(cè)量在414nm的吸收值(溶液中胞質(zhì)外血紅蛋白的消光度)。從每個(gè)樣品中減去本底溶解作為VBS緩沖液和羊紅細(xì)胞的吸收值。評(píng)價(jià)吸收值和補(bǔ)體因子H濃度的圖表可獲得補(bǔ)體因子H活性。特定樣品的活性的特異性可通過將該樣品稀釋液與已知可阻斷蛋白功能的對(duì)補(bǔ)體因子H特異的合適抗體(例如，A100，Quidel,鼠抗人補(bǔ)體因子H單克隆抗體)一起培養(yǎng)來測(cè)定。 實(shí)施例實(shí)施例1
含因子H的辛酸鹽沉淀物被在約4°C在緩沖液中溶解，該緩沖液包含20mM檸檬酸鈉、60mM甘氨酸、IOmM乙二胺四乙酸(EDTA)、IOmM乙二醇四乙酸(EGTA)、pH7.4。在4°C以約5050rpm (即約8000g)離心20分鐘，將未溶解物質(zhì)從上清液中分離出去。所產(chǎn)生的上清液隨后進(jìn)行溶劑/洗滌劑(S/D)處理。其中，上清液被與0.3% (w/w)磷酸三正丁酯(TnBP)和 1% (w/w) Triton X-100 (聚乙二醇 p- (1，1，3，3-四甲基丁基)-苯基醚)在室溫下混合60分鐘。該溶液用0.3N HCl調(diào)節(jié)pH至6.0，并在23°C溫度下稀釋至電導(dǎo)率為4.8 mS/cm，并用0.45Mm膜過濾。過濾后的溶液隨后被施加至Tosho的Toyopearl SP-650M。在樣品在室溫下施加至色譜材料后，通過使用幾倍柱體積的平衡緩沖液洗滌來從凝膠中除去弱吸附的蛋白質(zhì)，所述平衡緩沖液包含20mM檸檬酸鈉、pH 6.0、電導(dǎo)率在23°C的溫度時(shí)為約4.8 ms/cm。所述洗滌步驟后為未結(jié)合蛋白質(zhì)組分的逐步梯度洗脫，這是通過在相同緩沖液中逐步增加氯化鈉(NaCl)濃度(0.1 M; 0.2 M;和IM NaCl)來實(shí)現(xiàn)的。通過額外含有0.2M NaCl的平衡緩沖液從CEX凝膠中洗脫出的組分被收集，并且該緩沖液被替換為20mM Tris-HCL緩沖液(pH為8.6，電導(dǎo)率在24°C溫度下為0.4 mS/cm)。所獲得的溶液在Q-S印harose XL上進(jìn)行陰離子交換色譜。在用包含20mM TRIS的緩沖液(pH 8.6)洗滌吸附至AEX樹脂的因子H之后，通過增加在該緩沖液中的NaCl濃度進(jìn)行逐步梯度洗脫。通過包含20mM TRIS-HCl和0.25M NaCUpH 6.8的洗脫緩沖液從陰離子交換凝膠中洗脫出因子H，而用含有20mM Tris-HCl和至多0.2M NaCl的緩沖液洗脫的組分被丟棄。含因子H的組分被超濾/滲濾，用于緩沖液更換。五倍樣品體積被用包含5mM磷酸二氫鈉(NaH2P04*2 H2O), pH 6.50、電導(dǎo)率0.6 mS/cm的緩沖液更換。該溶液被進(jìn)行陶瓷羥基磷灰石色譜(CHA)。使用IOmM 磷酸二氫鈉(NaH2P04*2 H2O),pH 6.5、電導(dǎo)率約 1.1 mS/cm (22°C)的緩沖液平衡陶瓷羥基磷灰石(來自Bio-Rad 的CHT II型40Mm)。使用濃度至多為IM NaCl的平衡緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫。收集在導(dǎo)電率為70-100 mS/cm (20-25°C)洗脫的組分用于超濾/滲濾。所獲得的因子H溶液被濃縮至20mg/ml并被配制在pH為7.4的磷酸緩沖鹽溶液中。實(shí)施例2
進(jìn)行與實(shí)施例1中顯示的基本相同的過程，僅僅是在溫度上差別1_2°C，以及在3 mg/ml的因子H濃度時(shí)引入20nm納濾，因?yàn)檫^濾器沒有被阻塞，更高濃度的納濾明顯是可能的且是期望的。實(shí)施例3:
實(shí)施例3與實(shí)施例1基本相同，只是使用不同的S/D處理，即在4°C混合4小時(shí)，并且在陶瓷羥基磷灰石色譜后引入肝素親和色譜。來自陶瓷羥基磷灰石色譜的含有補(bǔ)體因子H的溶液被超濾/滲濾，以用于與包含20mM檸檬酸鈉、pH 6.0、電導(dǎo)率4.6 mS/cm (23°C)的緩沖液進(jìn)行緩沖液更換，并且被加樣至Heparin Sepharose 6 FF。在用5倍柱體積的平衡緩沖液(即用于之前緩沖液更換的相同平衡緩沖液)洗滌凝膠和吸附的補(bǔ)體因子H后，通過在相同緩沖液中添加0.2M NaCl來洗脫補(bǔ)體因子H。用該洗脫緩沖液洗脫的組分被配置和濃縮至50 mg/ml ο對(duì)比實(shí)施例
對(duì)比實(shí)施例 KUS 2008/0318841 Al;
至
段;LFB):
1.陰離子交換色譜，2.(非結(jié)合)肝素親和色譜；3.(結(jié)合)肝素親和色譜，4.第一次陽離子交換色譜，5.第二次陽離子交換色譜
按所給出的信息進(jìn)行試驗(yàn)，但是僅公開了樹脂和某些pH值，詳細(xì)地按照這些進(jìn)行。因?yàn)樵撋暾?qǐng)沒有公開緩沖液組分和濃度，決定使用20mM檸檬酸鈉緩沖液，以NaCl和HCl調(diào)節(jié)至所給出的pH值，估算出并控制離子強(qiáng)度以實(shí)現(xiàn)所給出的性質(zhì)。僅有的不同是使用冷上清(cryopoor)血衆(zhòng)作為起始物料,其是作為一種冷沉淀上清液弓I入的。對(duì)比實(shí)施例2 (W0 2008/113 589 Al的優(yōu)選實(shí)施方式，第38頁；ZLB Behring):
1.肝素親和色譜(肝素固定在HW-65-Toyopearl 上)，2.PEG沉淀，3.陰離子交換色譜
(Q-Sepharose XL),4.疏水相互作用色譜(Butyl-Sepharose FF)。詳細(xì)地根據(jù)所公開的樹脂進(jìn)行試驗(yàn)。對(duì)比實(shí)施例3 (Mhatre et al.方法)
1.第一次PEG沉淀，2.第二次PEG沉淀，3.陰離子交換色譜(DEAE-S印hacel )，4.陰離子交換色譜(CM-Sepadex ), 5.尺寸排除色 譜(Sephadex G-200)。血清通過冷上清血漿的復(fù)鈣和離心來制備。使用所描述的條件，但使用DEAE-Sepharose FF 替代 DEAE-Sephacel ,使用 CM-Sepharose FF 替代 CM-Sephadex ,以及使用Superdex _200替代Sephadex G-200。所使用的樹脂具有所公開的相同官能基團(tuán)，但具有某些不同的載體材料。對(duì)比實(shí)施例4 (Lundwall et al.方法)1.在陰離子交換樹脂(QAE-S印hadex )上的批量吸附，2.在陰離子交換樹脂(QAE-Sephadex )上的第二次批量吸附,3.陽離子交換色譜(SP_Sephadex ),4.陽離子交換色譜(DEAE-Sepharose FF )。嚴(yán)格根據(jù)過程中的步驟和條件進(jìn)行試驗(yàn)，僅有一個(gè)不同:SP-650M-Toyopearl 用于陽離子交換色譜，以替代SP-S印hadex 。圖1的說明
圖1展示4-20% TRIS-甘氨酸梯度SDS-Page (預(yù)制凝膠，Invitrogen ),每個(gè)泳道添力口 5Pg蛋白質(zhì),并根據(jù)制造商手冊(cè)進(jìn)行銀染(PlusOne Silver Staining Kit, Protein byGE Healthcare ，4 分鐘顯影)
泳道1:商業(yè)上獲得的因子H (CompTech, A137)
最明顯的雜質(zhì)發(fā)現(xiàn)在75 kDa、約105kDa和約200kDa。泳道2:本發(fā)明，4個(gè)色譜分析步驟
僅在150kD區(qū)域發(fā)現(xiàn)有關(guān)因子H的唯一條帶。在較低分子量區(qū)域(即從因子H至IOkDa及之外)以及較高分子量范圍內(nèi)(即250kDa及之外，一直到上樣點(diǎn))都未發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)。泳道3:本發(fā)明，3個(gè)色譜分析步驟
在150 kDa區(qū)域發(fā)現(xiàn)主條帶并且為因子H。在低分子量范圍(即從因子H到IOkDa及以外)未發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)。泳道4:根據(jù)US 2008/0318841 Al的實(shí)施例的因子H
在較低分子量范圍內(nèi)可見 幾個(gè)雜質(zhì)，特別是從IOOkDa至55kDa，在55kDa和IOOkDa處更明顯。在較高分子量范圍內(nèi)(即從約200kDa至加樣點(diǎn))發(fā)現(xiàn)另外的雜質(zhì)。泳道5:W0 2008/113 589 Al的優(yōu)選實(shí)施方式
在較低分子量區(qū)域可見幾個(gè)雜質(zhì)，特別是約IlOkDa至約60kDa范圍內(nèi)，在約IOOkDa處的濃度高些。在較高分子量區(qū)域(即約ISOkDa至加樣點(diǎn))發(fā)現(xiàn)額外的主要雜質(zhì)，特別是在約180kDa處，在約300kDa處有2個(gè)條帶，并且在250kDa和加樣點(diǎn)半途有2個(gè)條帶。泳道6:Mhatre et al.在較低分子量區(qū)域可見兩種雜質(zhì)，一條在約55kDa處，雖微弱但明顯可見，另一個(gè)濃度較高的在IOOkDa處。在較高分子量區(qū)域發(fā)現(xiàn)額外的雜質(zhì)，在約180kDa至接近加樣點(diǎn)處具有明顯可見的條帶區(qū)域，濃度最大的條帶位于該區(qū)域接近中央處。泳道7:LundwalI et al.從50kDa至加樣點(diǎn)處隨處可見蛋白質(zhì)，最強(qiáng)信號(hào)為因子H的條帶，但很難說它是主要條帶。泳道8:商業(yè)上獲得的因子H (Calbiochem)
最明顯的雜質(zhì)出現(xiàn)在75 kDa、約105kDa和約200kDa。雜質(zhì)顯得與CompTech因子H的雜質(zhì)相同，但濃度更大些。以相當(dāng)?shù)臈l件對(duì)這些樣品進(jìn)行Western雜交，即4-20% TRIS-甘氨酸梯度，每個(gè)泳道加樣5Pg蛋白質(zhì)，并且來源于羊的多克隆抗人因子H抗體(CompTech，A237)確認(rèn)了因子H的身份，但沒有顯示出各樣品之間的顯著區(qū)別。圖2A的描述(坐標(biāo)上的值為任意單位):圖2A展示了圖1的標(biāo)記物泳道的密度測(cè)量。
圖2B的描述:圖2B展示了圖1的泳道I的密度測(cè)量，在數(shù)據(jù)點(diǎn)約400和約480處明顯地顯示出雜質(zhì)，其對(duì)應(yīng)于105kDa和75kDa處的雜質(zhì)。圖2C和圖 2D的描述:圖2C和圖2D展示了圖1中的泳道2和泳道3的密度測(cè)量，在小于IlOkDa的分子量范圍內(nèi)沒有蛋白雜質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種從含有補(bǔ)體因子H的來源物中純化補(bǔ)體因子H的方法，所述來源物例如是血液或血漿，特別是含因子H來源物的辛酸鹽沉淀物，該辛酸鹽沉淀物例如是通過向血液或血漿組分添加辛酸鹽離子獲得的，所述方法包括: a)提供含因子H來源物，特別是重構(gòu)辛酸鹽沉淀物以提供含有補(bǔ)體因子H的溶液； b)進(jìn)行陽離子交換色譜，特別是作為第一次色譜分析步驟； c)進(jìn)行陰離子交換色譜； d)進(jìn)行羥基磷灰石色譜； e)隨后進(jìn)行超濾/滲濾以獲得補(bǔ)體因子H濃縮物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中進(jìn)行肝素親和色譜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述方法包括用于病原體去除和/或滅活的至少一種以下方法: a)溶劑/洗滌劑處理； b)巴氏滅菌； c )蒸汽熱處理； d)干燥熱處理；或 e)納濾。
4..根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的方法，其中所述補(bǔ)體因子H濃縮物被凍干。
5.權(quán)利要求1至4的任何一項(xiàng)的方法獲得的補(bǔ)體因子H。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的補(bǔ)體因子H，其可通過包含以下步驟的方法獲得: a)重構(gòu)辛酸鹽沉淀以提供含有補(bǔ)體因子H的溶液； b)通過溶劑/洗滌劑處理(S/D處理)進(jìn)行病毒滅活； c)在下述條件下進(jìn)行陽離子交換色譜的色譜分析步驟: 將補(bǔ)體因子H結(jié)合至磺丙基型強(qiáng)陽離子交換樹脂，使用包含20mM檸檬酸鈉、pH 6.0的緩沖液洗滌，并用包含20mM檸檬酸鈉、0.2 M NaCUpH 6.0的洗脫緩沖液洗脫補(bǔ)體因子H ； d)在下述條件下進(jìn)行陰離子交換色譜分析步驟: 將含有補(bǔ)體因子H的溶液(電導(dǎo)率0.1-0.5 mS/cm)施加于季銨型強(qiáng)陰離子交換樹脂，使用包含20 mM Tris, pH 8.6的緩沖液洗滌，并用包含20 mM Tris,0.2M NaCl、pH 8.6的洗脫緩沖液洗脫補(bǔ)體因子H ； e)通過在陶瓷羥基磷灰石上加樣步驟d)的組分進(jìn)行陶瓷羥基磷灰石色譜，任選地在步驟d)的緩沖液交換已進(jìn)行之后進(jìn)行，并且用最高為I M NaCl的氯化鈉線性梯度來洗脫，并且收集在緩沖液的電導(dǎo)率為70 - 100 mS/cm時(shí)洗脫的組分； f)任選地在下述條件下進(jìn)行肝素親和色譜分析步驟:將含有補(bǔ)體因子H的溶液施用于表面固定有肝素的樹脂，使用含20mM檸檬酸鈉、pH 6.0緩沖液洗滌，并用含20 mM檸檬酸鈉、0.2M NaCUpH 6.0的洗脫緩沖液洗脫補(bǔ)體因子H ； g)隨后通過超濾/滲濾獲得補(bǔ)體因子H濃縮物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的補(bǔ)體因子H，其特征在于通過納濾進(jìn)行病毒減少步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求5至7的任何一項(xiàng)所述的補(bǔ)體因子H，其特征在于，所述補(bǔ)體因子H為液體或凍干制劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求5至8的任何一項(xiàng)的補(bǔ)體因子H用來治療與補(bǔ)體因子H缺陷或活性異常相關(guān)的疾病。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的補(bǔ)體因子H，其中所述疾病選自膜增生性腎小球腎炎、致密物沉積病、溶血尿毒綜合癥、非典型溶血尿毒綜合癥或年齡相關(guān)性黃斑變性。
11.根據(jù)權(quán)利要求5至10的任何一項(xiàng)的補(bǔ)體因子H用來治療缺血再灌注損傷、慢性腎病或自身 免疫性腦脊髓炎。
全文摘要
一種從含有補(bǔ)體因子H的來源物中純化補(bǔ)體因子H的方法，所述來源物例如是血液或血漿，特別是含因子H來源物的辛酸鹽沉淀物，該辛酸鹽沉淀物例如是通過向血液或血漿組分添加辛酸鹽離子獲得的，所述方法包括a)提供含因子H來源物，特別是重構(gòu)辛酸鹽沉淀物以提供含有補(bǔ)體因子H的溶液；b)進(jìn)行陽離子交換色譜，特別是作為第一次色譜分析步驟；c)進(jìn)行陰離子交換色譜；d)進(jìn)行羥基磷灰石色譜；e)隨后進(jìn)行超濾/滲濾以獲得補(bǔ)體因子H濃縮物。
文檔編號(hào)A61K38/17GK103153333SQ201180049586
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2011年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月13日
發(fā)明者休伯特·布蘭德施泰特, 佩特拉·舒爾茲, 于爾根·勒米施 申請(qǐng)人:歐克塔醫(yī)藥公司