專利名稱：：表達(dá)禽流感病毒的h5血凝素的重組新城疫病毒的制作方法表達(dá)禽流感病毒的H5血凝素的重組新城疫病毒本發(fā)明涉及一種帶有另外的轉(zhuǎn)錄單元的單股反鏈病毒目(Mononegavirales)病毒載體，該轉(zhuǎn)錄單元包括與上游的單股反鏈病毒目病毒基因起始(GS)序列和下游的單股反鏈病毒目病毒基因末端(GE)序列可操作連接的異源基因。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種生產(chǎn)這種重組單股反鏈病毒目病毒載體的方法，并涉及包括這種單股反鏈病毒目病毒載體的疫苗。能在受感染宿主中復(fù)制的活病毒，誘導(dǎo)抗它們表達(dá)的抗原的強(qiáng)而且持久的免疫應(yīng)答。它們有效地引起體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而且刺激細(xì)胞因子和趨化因子通道。因此，活的，減毒病毒提供優(yōu)于基于滅活或亞基免疫原的疫苗組合物的顯著優(yōu)點(diǎn)，這些疫苗組合物一般主要只刺激免疫系統(tǒng)的體液性抗體手臂(humoralarm)。過去的十年，重組DNA技術(shù)已經(jīng)使DNA與RNA病毒基因組的遺傳工程領(lǐng)域都發(fā)生巨大變化。尤其是，引入外源基因到病毒的基因組中現(xiàn)在是可能的，以便新的載體病毒在宿主動(dòng)物中復(fù)制以后，外源基因緊接著表達(dá)，在宿主動(dòng)物中發(fā)揮生物學(xué)作用。因而，重組載體病毒已經(jīng)不僅開發(fā)用于控制和預(yù)防微生物引起的感染，而且用于設(shè)計(jì)靶治療用于非微生物引起的疾病如惡性腫瘤和基因治療中。通過命名為"反向遺傳學(xué)"的技術(shù)，完全來(lái)自克隆的cDNA的非節(jié)段性，負(fù)鏈RNA病毒(單股反鏈病毒目目的病毒)的產(chǎn)生(其于1994年首次報(bào)道(Schnelletal.，EMB0J13，4195-4203，1994))已經(jīng)使利用單股反鏈病毒目(MV)的病毒作為栽體成為可能。其后，描述利用MV目的許多病毒作為病毒栽體，以表達(dá)來(lái)源于病原體的外源抗原的研究已經(jīng)公開，其目的在于開發(fā)抗該病原體的疫苗。單股反鏈病毒目目劃分成4個(gè)主要家族副粘病毒科(paramyxoviridae)，彈狀病毒科(Rhabdoviridae)，纖絲病毒科(Filoviridae)和玻那病毒科(Bornaviridae)。屬于這些家族的病毒具有由單股，負(fù)(-)正義RNA分子表示的基因組，也即，該RNA基因組的極性與指定為正(+)正義的信使RNA(mRNA)的極性相反。主要的人與獸醫(yī)學(xué)MV病毒的分類列于下表中表l:單股反鏈病毒目目?jī)?nèi)病毒的分類<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>目前非常了解，而且多個(gè)作者綜述了MV目的病毒的基因組結(jié)構(gòu)和生活周期細(xì)節(jié)(Neumannetal.，J.Gen.Virology83，2635-2662，2002;Whelanetal.,Curr.Top.Microbiol.Immunol.203，63-119,2004;Conzelmann，K.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.203，1-41，2004)。盡管單股反鏈病毒目病毒具有不同的宿主和不同的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特性，但是它們具有許多共同的特征，如基因組結(jié)構(gòu)和它們的一般復(fù)制和基因表達(dá)模式所必要的元件，這說(shuō)明它們起源于一個(gè)共同的祖先。它們是包膜病毒，其在細(xì)胞的胞漿中復(fù)制，并產(chǎn)生沒有剪接的mRNA。單股反鏈病毒目病毒由兩個(gè)主要的功能單元組成，核糖核蛋白(RNP)復(fù)合體和包膜。已經(jīng)確定了上述所有家族的屬的典型病毒的全部基因組序列?；蚪M大小為大約9.OOO個(gè)核苷酸到大約19.OOO個(gè)核苷酸，而且它們包含5到10個(gè)基因。MV病毒的基因組的結(jié)構(gòu)和構(gòu)造是很類似的，而且取決于它們特別的基因表達(dá)模式。所有的MV病毒基因組包括3個(gè)核心基因，其編碼核蛋白(N或NP)，磷蛋白(P)和依賴于RNA的RNA聚合酶(L)。病毒包膜由基質(zhì)(M)蛋白和一種或多種跨膜糖蛋白(例如G，HN和F蛋白)組成，跨膜糖蛋白在病毒裝配/出芽以及在細(xì)胞附著和/或病毒侵入中發(fā)揮作用。取決于屬，通過在轉(zhuǎn)錄和病毒復(fù)制中顯示某些特異性調(diào)節(jié)功能，或涉及病毒宿主反應(yīng)的輔助蛋白(例如，C，V和NS蛋白)，來(lái)擴(kuò)展蛋白庫(kù)。MV病毒的基因順序是高度保守的，在位于3，末端或其附近的核心基因N和P，而且在5，遠(yuǎn)端位置的大(L)基因。M，表面糖蛋白基因，以及其它的輔助基因，位于N，P與L基因之間。在RNP復(fù)合物中，基因組或反基因組RNA用N蛋白緊密包裹，并與由L和P蛋白組成的依賴于RNA的RNA聚合酶相關(guān)。感染細(xì)胞以后，RNP復(fù)合物，而不是棵露的RNA基因組，用作兩個(gè)不同的RNA合成功能的模板，也即亞基因組mRNA的轉(zhuǎn)錄和全長(zhǎng)基因組RNA的復(fù)制。所有串聯(lián)排列的基因，通過所謂的"基因連接"結(jié)構(gòu)隔開?；蜻B接包括一個(gè)保守的"基因末端"(GE)序列，一個(gè)非轉(zhuǎn)錄的"基因間隔區(qū)"(IGR)和一個(gè)保守的"基因起始"(GS)序列。這些序列都是基因轉(zhuǎn)錄足夠的和必需的。轉(zhuǎn)錄期間，每個(gè)基因通過依賴于病毒RM的RNA聚合酶連續(xù)轉(zhuǎn)錄成mRNA，該RNA聚合酶在第一個(gè)GS序列的基因組RNA的3'末端起始轉(zhuǎn)錄過程。在每個(gè)基因連接中，由于GE序列上的RNA聚合酶的脫離，轉(zhuǎn)錄被中斷。在隨后的GS序列上發(fā)生轉(zhuǎn)錄的重新起始，盡管以降低的效率。由于這種中斷的過程，也稱為"終止-起始，，過程，轉(zhuǎn)錄減弱發(fā)生在每個(gè)基因連接中，結(jié)果MV病毒基因組中3，近端的基因比連續(xù)的下游基因轉(zhuǎn)錄得更多。MV病毒基因轉(zhuǎn)錄的模形式，其中每個(gè)基因是獨(dú)立的順反子或轉(zhuǎn)錄單位的部分，使這些病毒非常適基因組中的每個(gè)轉(zhuǎn)錄單位包括下列元件3，-GS-開放閱讀框(0RF)-GE-5，。在3，-和5，基因組末端，所有的MV病毒基因組具有短的非轉(zhuǎn)錄區(qū)，其分別稱為"前導(dǎo)"(大約40-50nt)和"尾隨，，(大約20-600nt)。前導(dǎo)和尾隨序列是必需的序列，其控制基因組RNA的復(fù)制，病毒衣殼化和包裝。反向遺傳學(xué)技術(shù)和感染性MV病毒的拯救，已經(jīng)使通過它的cDNA拷貝操作它的RM基因組成為可能。合成病毒RNA所需的最小復(fù)制起始復(fù)合物，是RNP復(fù)合物。感染性MV病毒可以通過(反)基因組RNA，和來(lái)自(T7)RNA聚合酶驅(qū)動(dòng)質(zhì)粒的合適支持蛋白的細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)拯救。1994年Schnell等的初步報(bào)告，1994(上文)，根據(jù)原來(lái)的方案(或其輕微的改變)，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了許多MV病毒種的可靠回收。新城疫和禽流感是禽類的重要疾病，其可能在養(yǎng)禽業(yè)世界范圍內(nèi)引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。新城疫病毒是MV目?jī)?nèi)的一種非節(jié)段的，負(fù)鏈RNA病毒?；蚪M，其長(zhǎng)度為大約15kb,包含6個(gè)基因，其編碼核蛋白(NP)，磷蛋白和V蛋白(P/V)，基質(zhì)(M)蛋白，融合(F)蛋白，血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)蛋白和依賴于RNA的RNA聚合酶或大(L)蛋白。NDV基因以3'-NP-P-M-F-HN-L-5，的順序連續(xù)排列，并被不同長(zhǎng)度的基因間隔區(qū)隔開。所有的基因放在基因起始(GS)序列之前，其后面是非編碼區(qū)，編碼NDV蛋白的開放式閱讀框，第二個(gè)非編碼區(qū)和基因末端(GE)序列。NDV基因組的長(zhǎng)度是6的倍數(shù)，其對(duì)于引入外源基因是必須考慮的。禽流感(AI)是一種禽類疾病，其特征在于從輕微呼吸性跡象到高死亡率的嚴(yán)重疾病。致病因子是屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的禽流感A病毒(AIV)。AIV包含編碼10個(gè)蛋白的8個(gè)負(fù)極性的基因組RNA節(jié)段。根據(jù)表面糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(N)的抗原性，對(duì)AI病毒劃分了亞型。迄今為止，16個(gè)血凝素(H1-H16)和9個(gè)神經(jīng)氨酸酶(Nl-N9)亞型是已知的。H和N的抗體在體液免疫應(yīng)答中是重要的，并抑制感染或預(yù)防疾病。禽流感和新城疫病毒，根據(jù)它們的毒性，可以劃分成兩個(gè)不同的致病型。由低致病的AIV(LPAI)或緩發(fā)型NDV引起的癥狀認(rèn)為較少相關(guān)。相反，由高強(qiáng)毒病毒(NDV:中發(fā)型和速發(fā)型菌抹)引起的高致病的禽流感(HPAI)和新城疫，是須申報(bào)的疾病。盡管用緩發(fā)型NDV菌林進(jìn)行抗NDV的常規(guī)疫苗接種，以保護(hù)雞抗高毒性的NDV菌林，但是在大多數(shù)國(guó)家不進(jìn)行抗HPAI的疫苗接種，因?yàn)橥ㄟ^根除策略控制HPAI。但是，疫苗接種可用作一種策略，來(lái)最小化損失和降低發(fā)病率。疫苗誘導(dǎo)的免疫性是亞型特異性的，其指亞型H5疫苗可以保護(hù)免遭H5AIV，但是不能保護(hù)免遭其它的H亞型。通常，流感病毒復(fù)制只限于肺，因?yàn)長(zhǎng)PAI病毒的血凝素只能被類胰蛋白酶Clara裂解，類胰蛋白酶Clara是一種局限于肺的絲氨酸蛋白酶。至今，所有的HPAI病毒都是H5和H7亞型。這些HPAI病毒在H切割位點(diǎn)包含許多堿性氨基酸，因此它可以被普遍存在的弗林蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶樣酶裂解成HAi和肛2亞基。這種病毒因此可以在其他的器官中生長(zhǎng)。H5和H7亞型疫苗可以為雞和火雞提供保護(hù)，免遭HPAI感染以后的臨床征象和死亡。除了常規(guī)滅活的基于油的全AIV以外，載體病毒，亞基蛋白和DM疫苗已經(jīng)用實(shí)驗(yàn)方法顯示有效用于抗AI的免疫。自用于各種病毒的反向遺傳學(xué)出現(xiàn)以來(lái)，生產(chǎn)用作疫苗載體的重組病毒是一種重要的應(yīng)用。已經(jīng)構(gòu)建了表達(dá)外源蛋白的各種重組負(fù)鏈RM病毒。并且，AIV的血凝素被插入道各種載體病毒中如傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)(Luschowetal.，Vaccine19，4249-59，2001)，牛瘋病毒(Walshetal.，J.Virol.74，10165-75，2000)和水泡性口膜炎病毒(VSV)(Robertsetal.，J.Virol.247，4704-11，1998)。NDV也用于表達(dá)AIV血凝素。流感A/WSN/33的血凝素基因被插入到NDV菌抹HitchnerB1的P與M基因之間。這些重組體保護(hù)小鼠免受致命感染，盡管在小鼠中存在可檢測(cè)的體重減輕，其在IO天內(nèi)完全恢復(fù)(Nakayaetal.J.Virol.75，11868-73，2001)。具有用于外源基因的相同插入位點(diǎn)的另外的重組NDV，表達(dá)LPAI的H7，但是僅僅40°/。的接種雞#皮保護(hù)免于速發(fā)型NDV和HPAI(Swayneetal.，AvianDis.47，1047-50，2003)。流感HA蛋白，被合成作為前體蛋白(HA。)。前體多肽HA。在保守的精氨酸(Arg)殘基處，被翻譯后裂解成兩個(gè)亞基，HAi和HA2。這種裂解有助于病毒的傳染性。(HA前體被裂解得越有效，病毒似乎越有毒力)。已經(jīng)對(duì)不同流感病毒的HA,-HA2連接區(qū)進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)致病菌林包含與切割位點(diǎn)鄰近的堿性氨基酸序列。(Senneetal.,AvianDiseases,40:425-437，1996;Steinhauser，Virology,258，1-20，1999;KawaokaandWebster,Proc.Nat1.Acad.Sci.USA,85，1988.)。在流感疫苗應(yīng)該提供的保護(hù)方面，高致病病毒是尤其重要的。然而，當(dāng)這類蛋白，也即，蛋白如致病的H5流感的HA蛋白(在它們的序列中具有堿性的氨基酸序列)插入到單股反鏈病毒目栽體中時(shí)，遇到某些問題。首先，基因序列似乎某種程度地不穩(wěn)定。在NDV載體的幾次繼代之后，該栽體中已經(jīng)插入了H5基因(NDVH5)，在編碼氨基酸的堿性序列的基因序列部分中發(fā)生自發(fā)突變。而且，這種堿性氨基酸序列的編碼序列，可能包含被mononegavirus識(shí)別為一種基因末端(GE)序列的序列。Whelan提供了單股反鏈病毒目的GE序列的綜述(Curr.Top.Microbiol.Immunol283，61-119,2004)。Monegavirales的GE序列的特征在于共同的保守序列:nUUUU。發(fā)現(xiàn)堿性氨基酸序列的編碼序列的部分，如存在于致病性H5型禽流感病毒的HA蛋白的裂解位點(diǎn)附近，與被單股反鏈病毒目載體的聚合酶識(shí)別為GE序列的GE序列類似。這可能導(dǎo)致全長(zhǎng)蛋白降低水平的蛋白表達(dá)，其可能影響基于這種載體的疫苗的功效。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供一種重組MV病毒載體，其顯示由外源基因編碼的蛋白的較高表達(dá)水平，該外源基因插入到載體病毒的基因組中，和/或顯示比已知MV病毒載體增加的免疫原性。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的重組單股反鏈病毒目病毒可滿足這個(gè)目標(biāo)。本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)帶有另外的轉(zhuǎn)錄單位的重組單股反鏈病毒目病毒載體的方法，該轉(zhuǎn)錄單位包括與上游的單股反鏈病毒目病毒基因起始(GS)序列和下游的單股反鏈病毒目病毒基因末端(GE)序列可操作連接的外源基因，特征在于該外源基因編碼一種蛋白，該蛋白包括至少3個(gè)堿性氨基酸的伸展序列，所述伸展序列由精氨酸(Arg)和/或賴氨酸(Lys)殘基組成，并至少l個(gè)賴氨酸，其中外源基因的核苷酸序列通過它不包含可以被單股反鏈病毒目病毒的病毒聚合酶識(shí)別為基因末端(GE)序列的序列的方式選擇?？梢员粏喂煞存湶《灸坎《镜牟《揪酆厦缸R(shí)別為基因末端序列的序列，是包含單股反鏈病毒目的大多數(shù)GE序列共有的最小保守序列的序列，即a/uCUUUU(在負(fù)正義中，其是Mononegavirus的基因組正義(genomicsense))。在正正義中(cDNA7JC平)，該基序是t/aGAAAA。對(duì)于使用的特定單股反鏈病毒目載體，將應(yīng)用本領(lǐng)域已知的特異性GE序列(Whelanetal.上文)。對(duì)于例如NDV，Whelan中所列的GE序列是aaucUUUUUUu。(-正義，其是單股反鏈病毒目的基因組正義(genomicsense))。在+正義中(cDNA水平)，該序列因此特征在于腺嘌呤殘基的伸展序列g(shù)AAAAAA。在本發(fā)明的載體中，這種GE序列不存在于外源蛋白的編碼序列內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員有幾種選擇來(lái)實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)?？梢赃x擇這樣的外源序列，其本來(lái)不含有可被單股反鏈病毒目病毒的病毒聚合酶識(shí)別為基因末端(GE)序列的序列。例如，當(dāng)外源基因序列編碼病毒蛋白時(shí)，可從病毒林獲得該外源基因，該病毒林天然攜帶編碼這種蛋白的基因，該蛋白的編碼序列不包含可能的GE序列(但是另一個(gè)病毒抹中的相同基因含有可能的GE序列)。但是，由于可以從野生型病毒獲得這種變體基因序列的機(jī)會(huì)較低，優(yōu)選通過位點(diǎn)定向誘變使外源基因的野生型序列發(fā)生突變，來(lái)改變序列到這種可能的GE序列不再存在的程度。得到的重組單股反鏈病毒目病毒載體同樣是本發(fā)明的一部分，其中外源基因編碼包含至少3個(gè)堿性氨基酸的伸展序列的蛋白，所述的伸展序列由精氨酸(Arg)和/或賴氨酸(Lys)殘基組成，并包含至少1個(gè)賴氨酸，該外源基因不包含可被單股反鏈病毒目病毒的病毒聚合酶識(shí)別為基因末端序列的序列。需要修飾的外源基因的部分，特別是在當(dāng)外源蛋白是致病性H5禽流感病毒的HA蛋白的情形中，可以是編碼至少3個(gè)堿性氨基酸的伸展序列的野生型外源基因序列的部分。堿性氨基酸的伸展序列，限定為包含選自賴氨酸(單字母代碼K)和精氨酸(單字母代碼R)的至少3個(gè)氨基酸，其中至少1個(gè)氨基酸殘基是賴氨酸。這將包括KKK序列，和2K與1R的組合(KKR，KRK,RKK)，以及1K與2R的組合(KRR，RKR和RRK),而且這里也提到了包括特定的3個(gè)氨基酸序列的較長(zhǎng)的堿性伸展氨基酸序列。如可以從Steinhauser等(上文)看到的，鄰近致病性流感病毒的HA蛋白中的裂解位點(diǎn)的堿性伸展氨基酸序列可以更長(zhǎng)，而且可包括序列如RRKKR或RRRKK。編碼賴氨酸的密碼子是aaa和aag，而編碼精氨酸的密碼子包括aga和agg。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，特別是在H5致病性禽流感病毒的HA蛋白的編碼序列中，編碼鄰近該蛋白的裂解位點(diǎn)的堿性伸展氨基酸序列的編碼序列，可包含GE基序t/aGAAAA。為了修飾存在于野生型外源基因中的GE序列，可以引入至少1個(gè)突變，借此GE序列內(nèi)的腺嘌呤伸展序列的"A，，該GE序列具有共同的基序(t/aGAAAA),原來(lái)存在于野生型外源基因序列中)被另一個(gè)核苷酸取代。實(shí)際上，如果引入突變到"aaaa"序列段中，該"aaaa，，序列段是公認(rèn)為GE序列的序列的一部分，至少1個(gè)腺噪呤核苷酸將必須被另一個(gè)核苷酸取代(例如，胍("g，，))。當(dāng)通過定點(diǎn)誘變改變序列時(shí)，這些改變優(yōu)選是沉默的(意思是該突變沒有導(dǎo)致氨基酸水平的突變)。但是，核酸水平的突變，其導(dǎo)致氨基酸水平的保守突變(指一個(gè)堿性氨基酸被另一個(gè)堿性氨基酸取代，例如，L變成R,或者R變成L)，也是可接受的。例如，當(dāng)在編碼堿性氨基酸伸展序列的野生型基因序列的部分中，至少一個(gè)賴氨酸殘基由密碼子"aaa"編碼時(shí)，在插入到本發(fā)明栽體中的修飾的外源基因中，這個(gè)密碼子可以突變成"aag"。或者，當(dāng)在野生型序列中，形成堿性氨基酸伸展序列的部分的特定精氨酸殘基由"aga"編碼時(shí)，在成為本發(fā)明載體的部分的基因中，這個(gè)密碼子可以突變成"agg"。在野生型序列中，至少一個(gè)"aaa，，密碼子(編碼賴氨酸)可以被突變，以產(chǎn)生修飾的外源基因序列，其被整合到本發(fā)明的載體中。這種突變可包括"aaa"密碼子被"aag"密碼子取代。這樣的載體是優(yōu)選的，即其中例如堿性氨基酸伸展序列包括并排的(inrow)至少兩個(gè)賴氨酸，而且其中這些賴氨酸中的至少一個(gè)由密碼子"aag"編碼，但是可以進(jìn)行兩個(gè)或多個(gè)突變。例如，當(dāng)編碼序列包含并排的兩個(gè)"aaa"密碼子時(shí)，兩個(gè)都可能,皮"aag"密碼子取代。特別是考慮到得到的載體的所需穩(wěn)定性時(shí)，優(yōu)選引入至少兩個(gè)突變到外源基因中。當(dāng)外源基因包含并排的兩個(gè)"aaa，，密碼子時(shí)，兩個(gè)都優(yōu)選被突變，而且可以被aag密碼子取代。用其中編碼堿性氨基酸伸展序列的外源基因的部分包含一個(gè)突變的栽體，獲得了好的結(jié)果，其中所述突變存在于每個(gè)都編碼堿性氨基酸的3個(gè)或4個(gè)連續(xù)密碼子中。在其中堿性伸展序列僅僅包含3個(gè)氨基酸的情況中，可進(jìn)行3個(gè)突變，但是當(dāng)存在4個(gè)堿性氨基酸或更多時(shí)，可進(jìn)行更多突變。例如，當(dāng)野生型序列包含氨基酸序列RRKK時(shí)，其由核苷酸序列agaagaaaaaaa編碼(+正義序列，其中在可能的GE序列基序下劃線)，該編碼序列可以突變成仍然編碼RRKK的ag￡ag￡aagaag。單股反鏈病毒目病毒載體優(yōu)選為新城疫病毒(NDV)載體，外源基因?yàn)橹虏⌒訦5禽流感病毒的HA蛋白。用NDV載體獲得了好的結(jié)果，其中已經(jīng)整合了修飾的致病性H5禽流感的HA基因(NDVH5m)。HA基因已經(jīng)整合到NDV載體的NDV融合(F)與血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)基因之間的基因間隔區(qū)中。HA基因是修飾的H5基因，其中根據(jù)本發(fā)明的方法，野生型"agaagaaaaaaa"序列已經(jīng)變成"aggaggaagaag，，序歹甘。該載體產(chǎn)生顯著更多的全長(zhǎng)HA轉(zhuǎn)錄物，表達(dá)顯著較高水平的HA，而且在它的包膜中還包含更多的HA蛋白。而且，NDVH5m在超過10次繼代都穩(wěn)定表達(dá)修飾的HA基因。用NDVH5m免疫接種雞，誘導(dǎo)NDV-與AIVH5-特異性抗體，并在分別用致死劑量的速發(fā)型NDV或高致病性AIV攻擊以后，保護(hù)雞抗臨床疾病。值得注意地，沒有觀察到流感病毒的排毒。而且，用NDVH5m免疫接種，容許根據(jù)抗AIV的核蛋白(NP)的抗體，對(duì)接種的和AIV領(lǐng)域病毒感染的動(dòng)物進(jìn)行血清學(xué)區(qū)分。因此，重組NDVH5m適合作為抗NDV和AIV的二價(jià)疫苗，而且可用作標(biāo)記疫苗用于控制禽流感(AI)。用于制備重組MV病毒載體的方法(該載體帶有包含外源基因的另外的轉(zhuǎn)錄單位)是本領(lǐng)域公知的。更特別地，在該方法中，分離的核酸分子和MV病毒的基因組，以它們的cDNA形式(+正義)使用。這允許容易的操作和插入想要的核酸分子到病毒基因組中。一般，基因組的不同部分可用于在兩個(gè)基因之間插入外源基因，也即基因間隔區(qū)(IGR)，基因的3，或5，非編碼區(qū)，以及基因組的3，啟動(dòng)子近端(N/NP基因之前)或5，遠(yuǎn)端(L基因之后)中。外源基因可以有利地插入到N/NP基因之前，NP-P，P-M，M-G/F,G/F-HN，HN-L之間，和L基因之后。最簡(jiǎn)單的方法是使用已經(jīng)現(xiàn)有的限制性內(nèi)切酶(RE)識(shí)別序列，在這些位點(diǎn)之一用酶進(jìn)行切割并引入合適的轉(zhuǎn)錄盒。由于天然存在的限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列并不總是位于預(yù)定位置，通?？梢酝ㄟ^定點(diǎn)誘變或PCR誘變，把RE識(shí)別位點(diǎn)引入到基因組中。待插入的轉(zhuǎn)錄盒的組成取決于插入的位點(diǎn)。例如，在轉(zhuǎn)錄盒被插入到IGR中的情況中，轉(zhuǎn)錄盒可以包含下列元件3'RE識(shí)別位點(diǎn)-GS-非編碼區(qū)-0RF(外源基因的)-非編碼區(qū)-GE-RE識(shí)別位點(diǎn)5，。做為選擇，在引入轉(zhuǎn)錄盒到天然MV病毒基因的V非編碼區(qū)的情況中，轉(zhuǎn)錄盒可由以下物質(zhì)組成3，RE識(shí)別位點(diǎn)-GE-IGR-GS-非編碼區(qū)-0RF(外源基因的)-非編碼區(qū)-RE識(shí)別位點(diǎn)5，。類似地，在引入轉(zhuǎn)錄盒到天然MV病毒基因的3'非編碼區(qū)的情況中，轉(zhuǎn)錄盒可由以下物質(zhì)組成3，RE識(shí)別位點(diǎn)-非編碼區(qū)-0RF(外源基因的)-非編碼區(qū)-GE-IGR-GS-RE識(shí)別位點(diǎn)5，。這種轉(zhuǎn)錄盒的制備和將其插入到MV病毒基因組中，只涉及常規(guī)的分子生物技術(shù)，如所列的參考文獻(xiàn)中和本實(shí)施例中例示的。特別地，技術(shù)如定點(diǎn)誘變和PCR誘變可用于該目的(Peetersetal.，1999，上文；CurrentProtocolsinMolecularBiology,eds.:F.M.Ausubeletal.，WileyN.Y.，1995版，頁(yè)碼8.5.1.—8.5.9;和Kunkeletal.，MethodsinEnzymologyVol.154，376-382，1987)。更特別地，本發(fā)明的重組MV病毒載體，可通過沿用已久的"反向遺傳學(xué)"的方法制備，其能進(jìn)行MV目的非節(jié)段，負(fù)鏈RNA病毒的遺傳修飾(例如Conzelmann，K丄的綜述，CurrentTopicsMicrobiol.Immunol.203，1-41，2004;andWalpitaetal.，F(xiàn)EMSMicrobiol.Letters244，9-18，2005)。在該方法中，合適的細(xì)胞，在足以容許MV(反)基因組和支持蛋白轉(zhuǎn)錄和共表達(dá)，以及重組MV載體產(chǎn)生的條件下，通過包括含有編碼MV病毒的全長(zhǎng)基因組，或者，優(yōu)選，反基因組(正正義)的核苷酸序列的cDNA分子的栽體，和一種或多種包括含有編碼所需支持蛋白的核苷酸序列的cDNA分子的載體共轉(zhuǎn)染。在該方法中，編碼全長(zhǎng)MV病毒(反)基因組的所述核酸分子，包括如上所述限定的另外的轉(zhuǎn)錄單位。載體指復(fù)制子，如質(zhì)粒，噬菌體或粘粒，另一個(gè)DNA節(jié)段可能附著到其上，以便引起附著的DNA節(jié)段在用該載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中復(fù)制和它的轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)。優(yōu)選地，用于全長(zhǎng)基因組轉(zhuǎn)錄的載體是質(zhì)粒，其包括編碼MV病毒的(反)基因組的cDNA序列，旁臨為位于它的5'末端的T7聚合酶啟動(dòng)子，和位于它的3，末端的(肝炎Delta)核酶序列，盡管也可以使用T3或SP6RNA聚合酶啟動(dòng)子。對(duì)于合適的支持蛋白的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，優(yōu)選使用包括編碼這些蛋白的cDNA序列的質(zhì)粒，在合適的表達(dá)調(diào)控序列例如T7聚合酶啟動(dòng)子的調(diào)控下進(jìn)行。在用于制備本發(fā)明的重組MV病毒載體的一種特別優(yōu)選的方法中，使用編碼MV病毒的N(或NP)，P和L蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。用于這種反向遺傳學(xué)技術(shù)的轉(zhuǎn)染支持質(zhì)粒的量或比例，覆蓋了一個(gè)較大的范圍。用于支持質(zhì)粒N:P:L的比例范圍可以為大約20:10:1到1:1:2，而且每種病毒的有效轉(zhuǎn)染方案是本領(lǐng)域已知的。通過T7RNA聚合酶啟動(dòng)子和核酶序列的共同作用，使基因組RNA的精確拷貝在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中進(jìn)行，而且該RNA接著被共轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒提供的病毒支持蛋白包裝并復(fù)制。由感染轉(zhuǎn)染細(xì)胞的重組牛痘病毒，尤其是由牛痘病毒vTF7-3，提供T7聚合酶酶是優(yōu)選的，可是其他的重組痘栽體，如禽痘病毒，例如fpEFLT7po1,或其他的病毒載體也可用于T7RNA聚合酶的表達(dá)。來(lái)自牛痘病毒的拯救病毒的分離，可以通過簡(jiǎn)單的物理技術(shù)如過濾很容易地完成。對(duì)于仙臺(tái)病毒或NDV的拯救，可通過在具胚的卵中接種轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液來(lái)完成。在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞系用于轉(zhuǎn)錄和表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染，所述載體組成型表達(dá)(T7)RNA聚合酶和/或一個(gè)或多個(gè)所需的支持蛋白。例如，麻疹病毒的拯救可以在人胚腎細(xì)胞系，293-3-46中完成，其表達(dá)T7RNA聚合酶和麻療病毒支持蛋白N和P(Radeckeetal.，EMB0J.14，5773-5784，1995)。可有利地用于本發(fā)明的另一個(gè)4艮有用的細(xì)胞系，是基于BSR的細(xì)胞，其表達(dá)T7RNA聚合酶，也即BSR-T7/5細(xì)胞系(Buchholzetal.，J.Virol.73，251-259，1999)。而且，Conzelmann,K.K.(上文)的綜述和實(shí)施例1中，^>開了這里用于制備本發(fā)明的MV病毒的關(guān)于反向遺傳學(xué)技術(shù)的更詳細(xì)的信息。重組MV病毒載體穩(wěn)定表達(dá)外源基因的能力，已經(jīng)導(dǎo)致了用于預(yù)防和治療應(yīng)用的載體的發(fā)展。在本發(fā)明的重組MV病毒載體中，外源基因可以根據(jù)特定的MV病毒載體種類和病毒載體的應(yīng)用而改變。外源基因可以編碼(其他的)微生物病原體(例如病毒，細(xì)菌或寄生蟲)的抗原，特別是外源基因編碼能引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的病原體的抗原。例如，可以插入到本發(fā)明的病毒載體中的異源基因序列包括，但不限于流感病毒糖蛋白基因，尤其是，禽流感病毒的H5和H7血凝素基因，來(lái)源于傳染性嚢病病毒(IBDV)的基因，特別地(IBDV)的VP2,來(lái)源于傳染性支氣管炎病毒(IBV)，貓白血病毒，犬瘟熱病毒，馬傳染性貧血病毒，狂犬病病毒，埃利希氏體屬生物體，特別是犬埃里希氏體，呼吸道合胞病毒，富'J流感病毒，人metapneumoviruses和麻滲病毒的基因。做為選擇，外源基因可以編碼多肽免疫調(diào)節(jié)劑，其能例如通過共表達(dá)細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素(例如IL-2，IL-12，IFN-y，TNF-ot或GM-CSF)增強(qiáng)或調(diào)節(jié)對(duì)病毒感染的免疫應(yīng)答。MV目包括能在人和動(dòng)物，或在二者(例如，狂犬病病毒和新城疫病毒)中復(fù)制的病毒。因此，外源基因可以選自各種人和獸醫(yī)學(xué)微生物病原體。盡管所有的MV病毒都可用作本發(fā)明的病毒載體，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組MV病毒載體分別是彈狀病毒科的病毒，優(yōu)選狂犬病毒屬或彈狀病毒屬的病毒，更優(yōu)選狂犬病病毒或IHNV種。在一個(gè)也優(yōu)選的實(shí)施方案種，重組MV病毒是副粘病毒科，優(yōu)選Respovirus屬，特別是hPIV3或bPIV3種；Morbillivirus，特別是CDV種；Pne認(rèn)ovirus,特別是RSV種；和Avulavirus,特別是NDV種的病毒。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了一種重組MV病毒載體，其中病毒是新城疫病毒(NDV)。由于NDV能在人和動(dòng)物中，特別是禽類，更特別地雞中復(fù)制，本發(fā)明的重組NDV載體可包含編碼病原體，特別是呼吸病原體的抗原的外源基因，或包含編碼能在人或任何這些動(dòng)物中引起合適的免疫應(yīng)答的免疫調(diào)節(jié)劑的外源基因。Peeters等(J.Virology73，5001-5009，1999)，R6mer-0berdrfer等(J.Gen，Virol.80，2987-2995，1999)，以及Conzelmann，K.K.(上文)的綜述中，已經(jīng)公開了特別用于NDV的，NDV的遺傳操作的反向遺傳學(xué)方法。而且，已知NDV可用作栽體用于外源基因的表達(dá)，例如，用于在用NDV載體感染的動(dòng)物中引起免疫應(yīng)答(Nakayaetal.，2001，上文)和Swayneetal"AvianDis.47，1047-50，2003)。外源基因可以有利地引入到NDV基因組中的不同位置，如上面對(duì)MV病毒的一般描述的。特別地，在本發(fā)明的重組NDV載體中，外源基因(作為合適的轉(zhuǎn)錄單位的部分)，可以插入到下列NDV基因之間NP-P，P-M，M-F，F(xiàn)-HN，HN-L，而且位于3，近端-和5，遠(yuǎn)端的基因座(Zhaoetal.，2003，上文；Nakayaetal.,2001，上文)，優(yōu)選位于3，近端，P-M，M-F和F-HN區(qū)，F(xiàn)-HN區(qū)是最優(yōu)選的。在本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案中，提供了一種重組NDV載體，其中另外的轉(zhuǎn)錄單位位于F-HN基因之間。本發(fā)明的重組NDV栽體，可有利地用于在禽類，特別是雞中，誘導(dǎo)抗其他的病原體的免疫應(yīng)答。因此，重組NDV載體，優(yōu)選包括編碼禽病原體，特別是流感病毒，馬立克氏病病毒(MDV)，傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)，傳染性支氣管炎病毒(IBV)，傳染性嚢病病毒(IBDV)，雞貧血病毒(CAV)，reo病毒，禽逆轉(zhuǎn)錄病毒，家禽腺病毒，火雞鼻氣管炎病毒(TRTV)，大腸桿菌，Eimeriaspecies,Cryptosporidia,支原體如M.Gallinarum，M.synoviae和M.meleagridis，Salmonella-，Campylobacter-,Ornithobacterium(ORT)或Pasteurellasp的保護(hù)性抗原的外源基因。更優(yōu)選地，重組NDV載體包括編碼AIV,MDV，ILTV，IBV，TRTV，大腸桿菌，ORT或支原體的抗原的外源基因。特別地，重組NDV載體突變體包括流感病毒，優(yōu)選禽流感病毒(AIV)，更優(yōu)選高致病性AIV的血凝素(HA)基因，特別是H5或H7AIV的HA基因。原則上，所有的(禽)流感林的HA基因都可用于本發(fā)明。本領(lǐng)域已經(jīng)公開了許多HA基因的核苷酸序列，而且相關(guān)的HA基因可以從核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)，如GenBank或NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)重新得到。如上所述，最近分離的，高致病性H5N2亞型AIVA/雞/Italy/8/98的血凝素(HA)基因，可有利地用作本發(fā)明中的外源基因。在真核表達(dá)載體pcDNA3(Invitrogen)中逆轉(zhuǎn)錄，克隆該基因，并進(jìn)行測(cè)序(Luschowetal.，Vaccine,vol.19，p.4249-4259，2001，GenBank登錄號(hào)AJ305306)。使用產(chǎn)生人工的RE識(shí)別位點(diǎn)的特異性引物，該位點(diǎn)允許把HA基因插入到NDV基因組序列中，從獲得的表達(dá)質(zhì)粒pCD-HA5，通過擴(kuò)增，可以獲得HA基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如上所述，高致病性H7N1亞型AIVA/雞/Italy/445/99的HA基因，可用作本發(fā)明的外源基因。HA基因進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并通過PCR擴(kuò)增。1711bp產(chǎn)物克隆到Smal消化的栽體pUC18(Amersham)中，并進(jìn)行領(lǐng)'J序(Veitsetal.，J.Gen.Virol.84.3343-3352，2003;和GenBank登錄號(hào)AJ580353)。在本發(fā)明的一個(gè)特別有利的重組MV病毒載體中，MV載體病毒是減毒的，那就是說(shuō)，載體病毒對(duì)于靶動(dòng)物是不致病的，或者與野生型病毒相比，顯示毒性的大幅度削減。這里使用的許多MV病毒如病毒載體，具有如活的減毒疫苗如麻滲病毒和NDV—樣的長(zhǎng)安全記錄，但是其他的病毒，如SeV和VSV認(rèn)為對(duì)人是不致病的。此外，傳統(tǒng)方法存在以獲得和篩選減弱病毒，其顯示有限的復(fù)制或傳染可能性。這種技術(shù)包括在異源的基質(zhì)中連續(xù)(冷)傳代病毒，和化學(xué)誘變。本發(fā)明的重組NDV載體可來(lái)源于任何常規(guī)的ND疫苗林。這種商業(yè)可獲得的ND疫苗中存在的適合的NDV林的例子是Clone-30,LaSota，HitchnerBl,NDW，C2和AV4;Clone-30是優(yōu)選的林。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的重組MV病毒載體，能在動(dòng)物中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答。因此，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了抗微生物病原體的疫苗，其包括如上限定的活或滅活形式的重組MV病毒載體，和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。本發(fā)明的疫苗可通過常規(guī)方法制備，如通常用于商業(yè)可獲得的活和滅活MV病毒疫苗的那些方法。簡(jiǎn)要地，用重組MV病毒載體接種敏感的基質(zhì)并繁殖，直到病毒復(fù)制到想要的滴度，然后收獲含有病毒的物質(zhì)。接著，把收獲的物質(zhì)配制成具有免疫特性的藥物制品。能支持重組MV病毒載體復(fù)制的每種基質(zhì)，都可用于本發(fā)明。作為基質(zhì)，可使用來(lái)自于原核和真核來(lái)源的宿主細(xì)胞，取決于MV病毒。合適的宿主細(xì)胞可以是脊推動(dòng)物，例如，靈長(zhǎng)類動(dòng)物的細(xì)胞。適合的例子是人細(xì)胞系HEK,WI-38,MRC-5或H-239，猿細(xì)胞系Vero,嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞系CH0，BHK,犬細(xì)胞系MDCK或禽CEF或CEK細(xì)胞。本發(fā)明的重組NDV載體可以在其上面繁殖的特別適合的基質(zhì)是SPF具胚的卵。具胚的卵，可以用例如0.2mlNDV接種，其包括每個(gè)卵中含有至少102°EIDs。的尿嚢液。優(yōu)選的，9到ll天的具胚卵，用大約105°EIDs。接種，并接著在37C孵育2-4天。2-4天以后，優(yōu)選可通過收集尿嚢液，收獲ND病毒產(chǎn)物。通過過濾器(100pm)過濾上清液之后，液體其后可以2500g離心10min。本發(fā)明的疫苗包括與藥學(xué)上可接受的載體或通常用于這種組合物的稀釋劑一起的重組MV病毒載體?？梢詰腋∫旱男问交蚶鋬龈稍锏男问?，制備和銷售包含活病毒的疫苗。栽體包括穩(wěn)定劑，防腐劑和緩沖液。稀釋劑包括水，含水的緩沖液和多元醇。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供了包含滅活形式的重組MV病毒載體的疫苗。滅活疫苗的主要優(yōu)點(diǎn)是它的安全，和可誘導(dǎo)的長(zhǎng)期的高水平保護(hù)性抗體。繁殖步驟以后收獲的病毒滅活的目標(biāo)是，消除病毒的繁殖。通常，這可通過/>知的化學(xué)或物理方法完成。如果需要，本發(fā)明的疫苗可包含佐劑。用于這種目的的適合的化合物和組合物的例子是氫氧化鋁，磷酸鋁或氧化鋁，基于例如礦物油的水包油或油包水乳劑，如BayolF⑧或Marco152@或植物油如維生素E醋酸鹽，和皂草苷。本發(fā)明疫苗的給藥可通過任何公知有效的形式進(jìn)行，而且取決于MV病毒載體的類型。適合的給藥模式包括，腸胃外，鼻內(nèi)，口服和噴霧接種疫苗。本發(fā)明的NDV栽體疫苗，優(yōu)選通過通常用于NDV疫苗接種的廉價(jià)集中使用技術(shù)來(lái)施用。對(duì)于NDV疫苗接種，這些技術(shù)包括飲用水和噴霧疫苗接種。本發(fā)明的疫苗包括有效劑量的重組MV病毒載體作為活性組分，也即免疫M(jìn)V病毒物質(zhì)的量，其將在接種的禽類中誘導(dǎo)抗通過毒性微生物有機(jī)體的攻擊的免疫性。免疫性這里定義為，疫苗接種以后，相較于未接種的組，在人或動(dòng)物群體中，誘導(dǎo)抗致死率和臨床癥狀的顯著較高水平的保護(hù)。特別地，本發(fā)明的疫苗預(yù)防大部分接種的人或動(dòng)物，以防疾病的臨床癥狀和致死率的發(fā)生。一般地，活疫苗可以1()U-1()U組織培養(yǎng)/胚胎感染劑量(TC/EID5。)的劑量施用，優(yōu)選以104°-10UTC/EID5o的劑量范圍。滅活疫苗可以包含104°-109°TC/EID5。的抗原同等物。本發(fā)明還包括聯(lián)合疫苗，其包括，除了本發(fā)明的重組MV病毒載體以外，能誘導(dǎo)保護(hù)以防另外的病原體的疫苗抹。附圖簡(jiǎn)述圖1表達(dá)AIVH5的重組NDV的構(gòu)建。轉(zhuǎn)錄調(diào)控信號(hào)通過灰色三角形用于轉(zhuǎn)錄起始進(jìn)行標(biāo)記，灰色矩形用于轉(zhuǎn)錄終止序列進(jìn)行標(biāo)記。NDV的HN0RF被AIV的H50RF取代，接著插入HN基因，如材料和方法中所述(步驟A-C)。重組NDVH5(步驟D)包含可信的HA序列，而重組NDVH5m攜帶HA，其中切割位點(diǎn)序列通過沉默突變改變(步驟E-F)。圖2NDV重組體產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物的Northern印跡分析。感染8小時(shí)以后，制備用NDV克隆30(NDV)，NDVH5,NDVH5m或AIVA/雞/Italy/8/98(H5N2)感染的CEK細(xì)胞和未感染細(xì)胞(NI)的總RNA。在變性瓊脂糖凝膠中分離RNA，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，并用NDV-F(左邊)，AIV-H5(中間)和NDV-HN(右邊)的"P標(biāo)記的基因特異性反義cRM雜交。6jig的各個(gè)RNA進(jìn)行Northern雜交，除了中間印跡的AIV道外，其中僅僅點(diǎn)樣2jig,以避免過度的AIV信號(hào)。RNA標(biāo)記的大小在左邊以千堿基(kb)表示。圖3在感染細(xì)胞中產(chǎn)生的，或整合到表達(dá)AIV的HA的NDV重組體中的蛋白的Western印跡分析。NDVClone30，NDVH5，NDVH5m或AIV(H5N2)的感染細(xì)胞(A)或純化病顆粒(B)的裂解物，用AIV亞型H5特異性抗血清(oc-AIV;上面板)，或用NDV特異性抗血清(ct-NDV;下面的板)孵育。用過氧化物酶綴合的第二抗體孵育以后，通過化學(xué)熒光顯示結(jié)合。標(biāo)記蛋白的位置表示于左邊，AIV血凝素的未裂解(HA。)和加工的形式(HAi，HA2)表示于右邊。在AIV感染的細(xì)胞或病顆粒中，對(duì)應(yīng)于NP/NA和M的另外的病毒蛋白也是可檢測(cè)的。圖4通過HI試驗(yàn)(A，灰條)或通過IF試驗(yàn)(A，白條)，測(cè)定HA特異性抗體。用速發(fā)型NDVHerts(B)或高致病性H5N2AIV(C，D)攻擊以后，用NDVH5m(H5m)免疫一次(B，C)或兩次(D)的雞，和對(duì)照動(dòng)物(C)的死亡率和臨床指數(shù)。每天觀察動(dòng)物的臨床征象，持續(xù)10天的時(shí)間，并劃分為健康的(O)，生病的(1)，嚴(yán)重生病的(2)，或死亡的(3)。計(jì)算臨床指數(shù)，其顯示每組這段時(shí)間的所有雞的平均值。圖5通過NP-ELISA進(jìn)行血清學(xué)檢查。通過間接的NP-ELISA，以1:500的稀釋度，研究雞的血清。對(duì)用rNDV/AIVH5-BMUT免疫后(p.i.)21天收集的，和隨后AIV攻擊(p.c.)以后21d收集的雞血清的提高的P/N-比例進(jìn)行繪圖。通過虛線標(biāo)記2.0的截止值。實(shí)施例實(shí)施例1:包括未修飾的(野生型)H5基因和修飾的H5基因的NDV載體的構(gòu)建和蛋白的表達(dá)。通過反向遺傳學(xué)構(gòu)建表達(dá)H5亞型的禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)的新城疫病毒(NDV)。緩發(fā)型NDV林Clone30的基因組的克隆全長(zhǎng)拷貝用于把編碼高致病性(HP)AIV分離物A/雞/Italy/8/98的HA的開放式閱讀框(H5N2，Genbank登錄號(hào)AJ305306)插入到NDV融合(F)基因與血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)基因之間的基因間隔區(qū)。3次繼代以后，NDVH5重組體的滴度與親代病毒Clone30的相似(109TCID5。/ml)，通過RT-PCR證實(shí)插入的H5基因的存在。為了證實(shí)外源基因的正確轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行Northern印跡分析(圖2)。盡管重組NDV與AIV(MN2)中的H50RF是相同的，克隆到NDV中的H5ORF的旁鄰為來(lái)源于HN基因的非編碼序列的大約270個(gè)核苷酸。因此，NDVH5與AIVmRNA之間的大小差異，分別與~2kb與1.7kbmRNA的預(yù)期大小很吻合(圖2，中間)。但是，NDVH5中出現(xiàn)了大約1kb的第二個(gè)轉(zhuǎn)錄物。(圖2，中間，第3道)。如Northern印跡分析顯示的，重組NDVH5m只產(chǎn)生預(yù)期大小的2kbHS轉(zhuǎn)錄物(圖2，中間，4道)，這證實(shí)NDVH5中的短轉(zhuǎn)錄物終止于HA切割位點(diǎn)，而且很可能只代表HAi區(qū)。由于修飾的結(jié)果，NDVH5m產(chǎn)生比NDVH5多1.8倍的全長(zhǎng)HA(HA。)。AIV感染細(xì)胞中的全長(zhǎng)HA轉(zhuǎn)錄物，分別比NDVH5m和NDVH5多3.4倍和6倍。不同于NDVH5的H5切割位點(diǎn)序列，其已經(jīng)在5次傳代中改變，該區(qū)內(nèi)的NDVH5序列在整個(gè)試驗(yàn)的IO次傳代中都保持穩(wěn)定(表l)。用NDVF和HN探針雜交證實(shí)旁鄰NDV基因的正確轉(zhuǎn)錄，因?yàn)橛H本NDVClone30的F與HNmRNA之間沒有大小差異(圖2)。而且，作為HA0RF插入的結(jié)果，只觀察到HN基因轉(zhuǎn)錄速率的輕微降低(圖2,右)。為了證實(shí)NDV重組體的AIVH5的特異性表達(dá)，對(duì)感染的CEF細(xì)胞進(jìn)行間接IF試驗(yàn)。用NDV特異性抗血清孵育，顯示用NDVClone30，NDVH5和NDVH5m感染的細(xì)胞中顯著的焚光，而用AIV-H5N2感染的細(xì)胞中沒有。另一方面，AIV亞型H5特異性抗血清，顯示在用AIV，NDVH5和NDVH5m感染的細(xì)胞中特異性表達(dá)H5，而用親本NDV感染的細(xì)胞是陰性的。盡管AIV感染細(xì)胞的H5表達(dá)強(qiáng)度顯著高于兩種重組體，但是發(fā)現(xiàn)NDV重組體的H5表達(dá)水平是顯著的。根據(jù)這個(gè)，只點(diǎn)樣多3倍的NDVH或NDVH5RNA量到RNA凝膠上，以獲得類似的雜交信號(hào)，示于圖2中(中間)，這表明AIV產(chǎn)生大約多3倍的轉(zhuǎn)錄物，和推測(cè)上這么多的蛋白。令人感興趣地，NDVH5m感染細(xì)胞的H5表達(dá)似乎比用NDVH5感染的細(xì)胞中更高效，其可歸因于取消了H5的成熟前轉(zhuǎn)錄終止的沉默突變。實(shí)施例2:AIVH5蛋白整合到NDV顆粒的包膜中。以前的研究表明，在缺乏特異性整合信號(hào)時(shí)，外源蛋白可能被動(dòng)地整合到不相關(guān)病毒的包膜中(Kretzschmar，E.etal.，1997，J.ofVirology,vol.71，p.5982-5989)。由于這種被動(dòng)整合的效率主要取決于蛋白的表達(dá)水平，我們確定了重組病毒表達(dá)的HA蛋白是否正確地裂解，并整合到NDV重組體的包膜中(圖3)。在兩種重組體感染的細(xì)胞中，AIV亞型H5特異性抗血清檢測(cè)到了大約70，50和25kDa的3種蛋白，其表示未裂解的HA。和裂解的HAi和HA2蛋白(圖3A)。這證明重組體表達(dá)的HA可接近蛋白水解酶。用NDVH5病毒感染的細(xì)胞中產(chǎn)生的總HA蛋白顯著低于NDVH5m的，而且NDVH5感染細(xì)胞總的HA2蛋白幾乎不能看見。正如所料，在NDVClone30感染細(xì)胞總沒有檢測(cè)到反應(yīng)性，而在AIV-H5N2感染細(xì)胞中檢測(cè)到所有對(duì)應(yīng)的HA蛋白種類。由于AI特異性血清抗完整病毒，推測(cè)相當(dāng)于NP/NA和M的其他蛋白種類也在AIV感染的細(xì)胞中檢測(cè)到(圖3)。有趣地，純化病顆粒的Western印跡分析表明，HA蛋白有效地整合到兩種重組體的包膜中(圖3B)。雖然，對(duì)更多的NDVH5病毒蛋白進(jìn)行了Western印跡分析，整合到NDVH5中的HA2蛋白的量仍然顯著低于NDVH5m病顆粒中的HA2。這證明NDVH5產(chǎn)生和整合少得多的HA2蛋白，大概是由于較少蛋白的可利用性(由于切割位點(diǎn)的成熟前終止的結(jié)果)。實(shí)施例3:攜帶AIVHA蛋白的重組NDV在雞中是安全的。測(cè)定給定的NDV分離物的毒性程度的一種靈敏方法，是腦內(nèi)接種以后，確定病毒對(duì)1天齡雞的致病性(CEC(1992)OfficialJournaloftheEuropeanCommunityL260，1—20.)。最強(qiáng)的病毒將產(chǎn)生指數(shù)，其接近2.0的最大分?jǐn)?shù)，而緩發(fā)型林將產(chǎn)生接近0.0的值。因?yàn)锳IV的血凝素是重要的毒性決定子，測(cè)定NDVH5和NDVH5m的腦內(nèi)致病性指數(shù)(ICPI)，以評(píng)估HPAI病毒的H5的表達(dá)是否改變NDV毒性。ICPI值是0.0，在兩種重組體的最大可能分?jǐn)?shù)2之外，這證明除了它自身的蛋白外，AIVH5的表達(dá)沒有顯著影響NDV毒性。為了比較，緩發(fā)型NDV疫苗林的ICPI必須低于0.5，用于可能的活病毒疫苗應(yīng)用。實(shí)施例4:表達(dá)AIVHA蛋白的重組NDV保護(hù)雞抗NDV和AIV攻擊。由于NDVH5m較高地表達(dá)H5蛋白，在動(dòng)物試驗(yàn)中只試驗(yàn)了該重組體。重組體NDVH5因而以每只動(dòng)物106EIDs。的劑量，通過眼鼻途徑，施用給25只3周齡的雞。觀察期間，所有的動(dòng)物都保持健康，而沒有任何有害反應(yīng)或任何疾病的臨床征象。如通過HI試驗(yàn)所測(cè)定的，AIVH5特異性抗體于疫苗接種以后第14天在28。/。的血清中首次可檢測(cè)到，并在第21天增加到92%(圖4A)。但是，使用間接IF試驗(yàn)，在免疫后第7天在96%的血清中，檢測(cè)到抗AI的免疫性的較早發(fā)生(圖4A)。為了測(cè)定單次疫苗接種的保護(hù)作用，5和10個(gè)接種動(dòng)物的組，與合適數(shù)量的對(duì)照動(dòng)物，分別進(jìn)行抗NDV和AIV的第一輪致命攻擊。不出乎意料地，100%的接種動(dòng)物被保護(hù)抗致命速發(fā)型NDV攻擊，而所有的對(duì)照動(dòng)物在4天內(nèi)死亡，其顯示典型的ND征象(圖4B)。高致病性AIV-H5N2攻擊感染，在非免疫雞中引起嚴(yán)重疾病，其死亡率為100%。相反，所有的NDVH5m免疫組動(dòng)物經(jīng)受致死劑量的高致病性AIV后幸存。10只雞中的7只保持完全健康，而3只動(dòng)物顯示很輕^:的呼吸癥狀。但是，相較于對(duì)照組2.61的臨床分?jǐn)?shù)，0.05的結(jié)果臨床分?jǐn)?shù)是可以忽略的(圖4C)。為了確定加強(qiáng)疫苗接種在保護(hù)雞抗AI中的作用，剩余的10只雞在第一次疫苗接種以后42天接受第二次免疫，并在其后兩周進(jìn)行攻擊。致死劑量的同源HPAI病毒以后，所有的動(dòng)物完全防止臨床疾病，而所有的對(duì)照動(dòng)物發(fā)展嚴(yán)重疾病，并在4天內(nèi)死亡，其導(dǎo)致2.66的臨床分?jǐn)?shù)(圖4D)。實(shí)施例5:NDV-AI疫苗減少AIV脫落(shedding):對(duì)于成功的AI疫苗，除了安全和有效預(yù)防疾病以外，該疫苗應(yīng)該能有效預(yù)防病毒脫落。為了確定病毒脫落的數(shù)量，在攻擊后的不同時(shí)間，對(duì)氣管和泄殖腔拭子進(jìn)行定量實(shí)時(shí)RT-PCR。攻擊后第2天，在兩個(gè)對(duì)照組的所有未免疫但是攻擊的雞中都檢測(cè)到病毒RNA。第一次與第二次AIV攻擊的對(duì)照雞的拭子的閾循環(huán)(Ct)值，分別為32.2-38.1與29.2-35.5。由于所有的對(duì)照動(dòng)物在攻擊的4天內(nèi)死亡，對(duì)該組沒有進(jìn)行更進(jìn)一步的試驗(yàn)。相反，在大部分免疫動(dòng)物中沒有檢測(cè)到vRNA(60個(gè)拭子中的49個(gè))。實(shí)施例6:NP-ELISA檢測(cè)循環(huán)AIV:家禽常規(guī)疫苗接種的一個(gè)最大的擔(dān)憂，是疫苗接種可能使病毒能在禽類中未檢測(cè)到的循環(huán)。由于重組NDV疫苗只包含HA基因，基于高免疫原性核蛋白基因的ELISA，用于分析從攻擊之前和攻擊之后不同時(shí)間的接種動(dòng)物收集的血清。盡管抗AIVNP的抗體，攻擊感染之前存在于所有動(dòng)物的血清中，但是分別在AIV攻擊以后的第7和21天在90%和100%的雞中檢測(cè)到NP血清轉(zhuǎn)化(圖5)。這證明基于NP的ELISA試驗(yàn)不僅能把接種的動(dòng)物從感染動(dòng)物區(qū)分開，而且便于在接種的禽類中檢測(cè)任何循環(huán)病毒。實(shí)施例7:實(shí)施例1-6的材料和方法。病毒和細(xì)胞前面已經(jīng)描述了基于Clone-30疫苗株的重組NDV(Romer-Oberdorfer，A.，Mundt，E.,Mebatsion，T,，Buchholz，U.J.&Mettenleiter，T.C.(1999)，J.Gen.Virol.80(Pt11)，2987-2995.)。流感病毒分離物A/雞/Italy/8/98(H5N2)由I.Capua提供。速發(fā)型NDV林Herts33/56和NDVClone30疫苗(Nobi1is)獲自IntervetInt.BV，Boxmeer，TheNetherlands。病毒在無(wú)特異性病原(SPF)的10天齡具胚的雞蛋中繁殖。穩(wěn)定表達(dá)噬菌體T7RNA聚合酶的BSR-T7/5細(xì)胞(Buchholz,U.J.，F(xiàn)inke，S.&Conzelmann，K.K.(1999)J.Virol.73，251-259)用于從cDM回收感染性NDV。初級(jí)雞胚胎成纖維細(xì)胞(CEF)，初級(jí)雞胚胎腎(CEK)細(xì)胞，或鵪鵓肌細(xì)胞(QM9-R)，用于研究蛋白表達(dá)和病毒復(fù)制。表達(dá)AIVH5基因的重組病毒的構(gòu)建質(zhì)粒pf1NDV-1，其表達(dá)Clone30的全長(zhǎng)反基因組RNA(Romer-0berdorfer，A.，Mundt，E.，Mebatsion,T.，Buchholz,U.J.&Mettenleiter,T.C.(1999)J.Gen.Virol.80(Pt11)，2987-2995),用于引入AIVH5基因。首先，把Clone30基因組的Notl/BsiWI-片段(4953-8852nt)克隆到pUC18質(zhì)粒中(步驟A，圖1)。然后使用引物MP1(5'-gacaacagtcctcaaccatggaccgcgccg-V，SEQIDNO:1)和MP2(5'-ctggctagttgagtcaatt^M^gagttggaaagatggc-3'，SEQIDNO:2)，引入新建的Ncol和AfIII位點(diǎn)(步驟B)。通過包含人工Ncol或AfIII限制性位點(diǎn)的特異性引物(PH5F2:5'-ccttccatggagaaaatagtgcttc-3'，SEQIDNO:3，和PH5R2:5'-SEQIDNO:4)，已經(jīng)從質(zhì)粒pCD-HA5(Luschow，D.,Werner,0.，Mettenleiter，T.C.&Fuchs，W.(2001)Vaccine19，4249-4259)擴(kuò)增的AIVH5開放式閱讀框(0RF)，用于在利用NcoI和AfIII消化以后，取代Clone30的HNORF(步驟C)。而且，使用引物MP3(5'-caaaacagctcatggUcgtaatacgggUggacatgg-3'，SEQIDNO:5)和MP4(5'-gaaaaaactaccggcgatcgctgaccaaaggacgatatacggg-3z，SEQIDNO:6),將新的Sgfl-和SnaBI位點(diǎn)引入到L基因前面的基因間隔區(qū)中(步驟C)。使用引物MP3和MP5(5'-gaaaaaactaccg￡^￡^￡￡^tgaccaaaggacgatatacggg-3'，SEQIDNO:7)，產(chǎn)生了位于HN基因旁鄰類似的位點(diǎn)(步驟D)，用于克隆H50RF后的HN基因的目的(步驟E)。如圖1的步驟F所示，使用引物MPH5F2(5'-ggaatgtccctcaaagaaggaggaagaagagaggactatttggggc-3'SEQIDNO:8)，通過沉默突變對(duì)類似于NDV的轉(zhuǎn)錄終止序列的H5裂解序列進(jìn)行修飾。最后，pflNDV-1的Notl/BsiWI-片段被從步驟E或F獲得的類似片段取代，以分別產(chǎn)生全長(zhǎng)克隆NDVH或NDVHm(圖1)。得到的克隆的長(zhǎng)度(17196個(gè)核苷酸)可被6分解，從而滿足"6的規(guī)則"。這里描述的所有誘變反應(yīng)，都使用QuikChangeIIXL定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene)進(jìn)4亍。轉(zhuǎn)染和病毒回收為了回收表達(dá)AI的H5的重組NDV，4吏用Lipofectamine2000(Invitrogen),以1:1.5的DM:Lipofectamine2000比率，把全長(zhǎng)克隆與表達(dá)NP，P和L蛋白的質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染到BSR-T7細(xì)胞中。病毒繁殖和感染性病毒回收的確認(rèn)，基本上如前面所述的進(jìn)行(Romer-Oberdorfer，1999，supra;Engel-Herbert，I.，Werner,0.，Teifke，J.P.，Mebatsion，T.，Mettenleiter,T.C.&Romer-Oberdorfer，A.(2003)J.Virol.Methods108，19-28)。Northern印跡分析以每細(xì)胞10的感染復(fù)數(shù)(MOI)，用麗Clone30，NDVH5，NDVH5m或AIV-H5N2感染CEK細(xì)胞，并于37C孵育8h。如其它地方所述的，制備感染和未感染細(xì)胞的總RNA(Chomczynski，P.&Sacchi，N.(1987)AnalyticalBiochemistry162，156-159),在變性瓊脂糖凝膠中分離，并用放射性同位素標(biāo)記的cRNA雜交(Fuchs，W.&Mettenleiter，T.C.(1996)J.Gen.Virol.77(Pt9)，2221-2229)。包含AIV-固2血凝素，NDVClone30F和HN的開放式閱讀框架的質(zhì)粒，用于"P標(biāo)記的cRNA的體外轉(zhuǎn)錄(SP6/T7轉(zhuǎn)錄試劑盒，Roche)。Western印跡分析以5的M01，用NDVClone30，NDVH5，NDVH5m或AIV-H5N2感染CEK細(xì)胞，并于37。C孵育30h。連續(xù)蔗糖梯度(30-60%)純化的感染細(xì)胞或病顆粒的裂解物，通過SDS-PAGE進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)到硝酸纖維素濾膜上(Trans-BlotSDcell,Bio-Rad)。印跡用抗NDV的多克隆兔抗血清，或抗H5亞型的AIV的多克隆雞抗血清(IntervetInt.BV，Boxmeer，NL)進(jìn)行孵育。使用SuperSignalWestPico化學(xué)發(fā)光基質(zhì)(Pierce),在X光膠片(HyperfilmMP，Amersham)上，通過化學(xué)熒光檢測(cè)過氧化物酶綴合的種特異性第二抗體(Dianova)的結(jié)合。動(dòng)物試驗(yàn)根據(jù)歐洲共同體委員會(huì)指令中所描述的，通過測(cè)定1天齡雞中腦內(nèi)致病性指數(shù)(ICPI),來(lái)確定NDV重組體的安全(CEC(1992)OfficialJournaloftheEuropeanCommunityL260，1-20.)。把106EIDs。的NDVH5m通過眼鼻施用給25只3周齡的SPF雞中，來(lái)進(jìn)行疫苗接種實(shí)驗(yàn)。為了評(píng)估單次疫苗接種以后，重組體的保護(hù)能力，5只接種的與5只另外的對(duì)照一起，接種以后3周用1053ELDs。的NDV林Herts33/56進(jìn)行肌內(nèi)攻擊。同樣，10只接種的與9只另外的對(duì)照動(dòng)物一起用107'7EIDs。的高致病性AIV-H5N2進(jìn)行眼鼻攻擊。剩余的IO只雞在第一次接種以后6周接受第二次免疫接種，并在其后2周，與5只另外的對(duì)照動(dòng)物一起進(jìn)行類似的AI攻擊。免疫接種和攻擊感染以后，每天觀察所有雞的臨床征象，觀察10天。通過實(shí)時(shí)RT-PCR進(jìn)行病毒脫落分析收集口咽和泄殖腔拭子，以在攻擊以后第2，4，8和14天，通過實(shí)時(shí)RT-PCR分析AIV脫落。j吏用NucleoSpin試劑盒(Macherey-Nagel)，或者使用病毒■試劑盒(Qiagen)通過Tecan-Automat人工制備來(lái)自口咽或泄殖腔拭子的RNA。為了檢測(cè)攻擊感染以后的AIV脫落，使用基于M基因擴(kuò)增的甲型流感病毒實(shí)時(shí)RT-PCR方法(18)。通過異源內(nèi)部控制系統(tǒng)，檢查RT-PCR期間的RNA提取和抑制因子(19)。使用一步RT-PCR試劑盒(帶有鉑@了&8DNA聚合酶的SuperscriptIIIOne-stepRT-PCR系統(tǒng)(Invitrogen))，在MX30Q0p(Stratagene)循環(huán)儀上，進(jìn)行雙重分析。溫度模式是50。C30min,94°C2min,接著進(jìn)行42個(gè)循環(huán)的94*C30sec,57°C30sec和68匸30sec。HI和NP-ELISA:為了確定NDV和AIVH5抗體的存在，在第0，7,14和21天收集血樣，并進(jìn)行血細(xì)胞凝集-抑制(HI)試驗(yàn)，如歐洲共同體委員會(huì)指令所述(CEC(1992)OfficialJournaloftheEuropeanCommunityL260，l-20;CEC(1992)OfficialJournaloftheEuropeanCommunitiesL167，1-1620,21)。為了確定免疫接種以后AIV-H5的存在，通過用AIV感染的CEF孵育血清的1:100稀釋物，血清另外用于間接免疫熒光(IF)。通過基于核蛋白的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)(NP-ELISA)，研究抗AIV核蛋白(NP)的抗體。為了該目的，純化的重組桿狀病毒來(lái)源的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶-NP融合蛋白，其包含AIVNPgene的全部編碼區(qū)，用作抗原。在包含0.05%吐溫20的PBS中以1:300稀釋的血清，以一式兩份進(jìn)行研究。使用鄰苯二胺，通過顯色反應(yīng)，檢測(cè)第二POD-綴合的山羊-cc-雞IgG(H+L)(ROCKLAND)抗體的結(jié)合，并于492nm測(cè)定吸收。實(shí)施例8:包含修飾的H7基因的NDV載體的構(gòu)建在基本上與如上所述的那些類似的實(shí)驗(yàn)中，制備攜帶修飾的H7基因的NDV載體構(gòu)建體。來(lái)源于HPH7N1AIV分離物的插入物A/chicken/Italy/445/99，其序列在GenBank中以登錄號(hào)AJ5803537>開；也參見Veits，J，etal.2003(J.ofGen.Virol.，vol.84，p.3343)。H7基因插入到NDV載體中的F與HN基因之間，其旁鄰為來(lái)自HN基因的非編碼序列。H7HA基因的切割位點(diǎn)區(qū)之后，存在可能的基因末端序列。1195-1206核苷酸中的原始序列為atagaaaaaact,其編碼氨基酸IEKT,^皮突變成atagagaa￡act,仍然編碼IEKT。相較于未修飾的H7基因的表達(dá)，這導(dǎo)致了通過NDV栽體，修飾的H7序列穩(wěn)定和提高的表達(dá)與呈遞。權(quán)利要求1.一種生產(chǎn)帶有另外的轉(zhuǎn)錄單位的重組單股反鏈病毒目(Mononegavirales)病毒載體的方法，該轉(zhuǎn)錄單位包括與上游的單股反鏈病毒目病毒基因起始(GS)序列和下游的單股反鏈病毒目病毒基因末端(GE)序列可操作連接的外源基因，其特征在于該外源基因序列編碼一種蛋白，該蛋白包含至少3個(gè)堿性氨基酸的伸展序列，所述伸展序列由精氨酸(Arg)和/或賴氨酸(Lys)殘基組成，并包含至少1個(gè)賴氨酸，其中按照如下方式選擇外源基因的核苷酸序列，即以它不含有可被單股反鏈病毒目病毒的病毒聚合酶識(shí)別為基因末端(GE)序列的序列。2.權(quán)利要求l的方法，其特征在于通過定點(diǎn)誘變，對(duì)編碼所述至少3個(gè)堿性氨基酸的伸展序列的野生型外源基因序列的部分進(jìn)行突變，以消除可能被單股反鏈病毒目病毒的病毒聚合酶識(shí)別為基因末端(GE)序列的任何序列，以產(chǎn)生修飾的外源基因序列。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于在最初存在于野生型外源基因序列中的t/aGAAAA序列內(nèi)，引入至少一個(gè)突變，借此腺嘌呤伸展序列的"A"被另一個(gè)核苷酸取代。4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于突變是沉默的。5.根據(jù)權(quán)利要求3-4的方法，其特征在于至少一個(gè)aaa密碼子被aag密碼子取代。6.根據(jù)權(quán)利要求3-5的方法，其特征在于進(jìn)行至少2個(gè)點(diǎn)突變。7.根據(jù)權(quán)利要求3-6的方法，其特征在于至少2個(gè)aaa密碼子被aag密碼子取代。8.權(quán)利要求3-7的方法，其特征在于編碼序列agaagaaaaaaa被編碼序歹'Jaggaggaagaag取代。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8的方法，其特征在于單股反鏈病毒目病毒載體是新城疫病毒(NDV)載體，而且外源基因編碼致病性H5禽流感病毒的HA蛋白。10.—種帶有另外的轉(zhuǎn)錄單位的重組單股反鏈病毒目病毒載體，該轉(zhuǎn)錄單位包括與上游的單股反鏈病毒目病毒基因起始(GS)序列和下游的單股反鏈病毒目病毒基因末端(GE)序列可操作連接的外源基因，其特征在于該外源基因序列編碼一種蛋白，該蛋白包含至少3個(gè)堿性氨基酸的伸展序列，所述伸展序列由精氨酸(Arg)和/或賴氨酸(Lys)殘基組成，并包含至少l個(gè)賴氨酸，其外源基因不含有可被單股反鏈病毒目病毒的病毒聚合酶識(shí)別為基因末端(GE)序列的序列。11.根據(jù)權(quán)利要求10的重組單股反鏈病毒目病毒栽體，其特征在于外源基因編碼致病性禽流感病毒的血凝素(HA)蛋白，其中堿性氨基酸的伸展序列包含并排的至少2個(gè)賴氨酸，而且其中這些賴氨酸的至少一個(gè)由aag密碼子編石馬。12.根據(jù)權(quán)利要求10-11的重組病毒載體，其特征在于堿性氨基酸的伸展序列包含氨基酸序列ArgLysLys，其由核苷酸序列aggaagaag編碼13.—種抗微生物病原體的疫苗，其包含根據(jù)權(quán)利要求10-12的任一項(xiàng)的重組MV病毒載體和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。全文摘要本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)帶有另外的轉(zhuǎn)錄單位的重組單股反鏈病毒目病毒載體的方法，該轉(zhuǎn)錄單位包括與上游的單股反鏈病毒目病毒基因起始(GS)序列和下游的單股反鏈病毒目病毒基因末端(GE)序列可操作連接的外源基因，其特征在于該外源基因序列編碼一種蛋白，該蛋白包含至少3個(gè)堿性氨基酸的伸展序列，而且編碼這些氨基酸的密碼子的核苷酸序列不含有能被單股反鏈病毒目病毒的病毒聚合酶識(shí)別為基因末端(GE)序列的序列。文檔編號(hào)C07K14/11GK101421294SQ200780013584公開日2009年4月29日申請(qǐng)日期2007年3月15日優(yōu)先權(quán)日2006年3月15日發(fā)明者A·羅默-奧波多弗,J·維特斯申請(qǐng)人:英特威國(guó)際有限公司