專(zhuān)利名稱：：雞毒霉形體抗體免疫膠體金快速檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于免疫應(yīng)用領(lǐng)域，涉及動(dòng)物分子生物學(xué)、免疫學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域。具體的講,本發(fā)明屬于雞毒霉形體抗體快速檢測(cè)試劑盒，分別用于雞血清中雞毒霉形體抗體的檢測(cè)，以確定被檢雞是否感染雞毒霉形體或免疫過(guò)的雞體內(nèi)是否產(chǎn)生了相應(yīng)的抗體。
背景技術(shù)：
：眾所周知，禽流感、新城疫、法氏囊、傳染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎、雞毒霉形體病、馬立克、減蛋綜合癥等疫病是危害全球養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病。雞毒霉形體(Mycoplasmagallisepticum)是一類(lèi)缺乏細(xì)胞壁、能獨(dú)立繁殖的最小的單細(xì)胞原核微生物，屬于原核生物中軟壁菌門(mén)軟皮體綱。主要引起雞的慢性呼吸道疾病，是養(yǎng)禽業(yè)相當(dāng)棘手的疾病問(wèn)題之一。主要引起呼吸道感染及免疫抑制，多年來(lái)一直在各類(lèi)雞群中廣泛存在，至今仍沒(méi)有有效的疫苗進(jìn)行防控，致使雞群長(zhǎng)期帶毒，常引起其他疫病的繼發(fā)感染，給我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)生產(chǎn)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)血清學(xué)調(diào)查，霉形體病在我國(guó)感染率很高，大部分雞群的感染率超過(guò)50%,有的甚至高達(dá)70%-90%，而且經(jīng)常繼發(fā)其它疾病，尤其是與大腸桿菌或新城疫、傳染性支氣管炎等病原并發(fā)感染，造成雞群大量死亡(王承宇，宣華.雞毒支原體病研究迸展.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，22(增刊)208-211)。而清除這種疫病的最有效的方法是淘汰帶毒雞群，保留健康不帶毒的雞群。要做到這一點(diǎn)，就要有一種快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法來(lái)確定感染雞群。而已有的研究中，沒(méi)有合適的快速檢測(cè)雞毒霉形體的新方法。如瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(Agarosegelimmunodiffusion;AGID)、血凝抑制試驗(yàn)(Hemagglutinationinhibition;HI)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay;ELISA)、血清平板凝集試驗(yàn)(serumplateagglutinationtest;SPA)等，這些方法有的耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)(如瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)需2448小時(shí)；血凝抑制試驗(yàn)需23小時(shí)；ELISA試驗(yàn)需35小時(shí)等)，有的需要昂貴的儀器設(shè)備和繁瑣的操作步驟，只能在實(shí)驗(yàn)室完成，不便于適時(shí)和快速診斷，血清平板凝集試驗(yàn)判定結(jié)果的時(shí)間比較短，但其主觀性比較強(qiáng)，沒(méi)有一定的經(jīng)驗(yàn)很難做出準(zhǔn)確的判定。免疫層析(immunochromatography)是出現(xiàn)于八十年代初期的一種獨(dú)特的免疫分析方法，該方法的核心技術(shù)是以條狀纖維層析材料為固相，通過(guò)毛細(xì)管作用使樣品溶液在層析條上泳動(dòng)，并同時(shí)使樣品中的待測(cè)物與層析材料上針對(duì)待測(cè)物的受體(如抗原或抗體)發(fā)生高特異性、高親和性的免疫反應(yīng)。膠體金免疫層析分析(gold-immunochromatographyassay;GICA)是應(yīng)用膠體金標(biāo)記技術(shù)，以膠體金作為示蹤物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)(OsikowiczGetal.One-stepchromatographicimmunoassayforqualitativedeterminationofchoricogonadotropininurine.ClinChem,19卯,36,1586)。層析過(guò)程中，金標(biāo)記物與事先固相化于層析材料(例如硝酸纖維素膜，即NC膜)上的抗原或抗體(檢測(cè)線)發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)而被截留，進(jìn)一步富集，形成肉眼可見(jiàn)的紫紅色條帶，從而得到直觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，達(dá)到快速檢測(cè)的目的。這種方法對(duì)所使用的抗原抗體的要求較高，要求具有好的特異性和高純度。依據(jù)這種原理，已經(jīng)研制出了很多膠體金免疫層析快速檢測(cè)試紙條。在人醫(yī)應(yīng)用方面，國(guó)內(nèi)外已在激素、傳染病病原的抗原和抗體、性病病原、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、腫瘤標(biāo)記物、心血管病標(biāo)志物、藥物以及其他一些蛋白質(zhì)等方面應(yīng)用了金標(biāo)免疫層析試紙條。在獸醫(yī)應(yīng)用方面，例如在豬瘟、犬細(xì)小病毒病等方面也應(yīng)用了金標(biāo)免疫層析試紙條。在雞疫病診斷和檢測(cè)方面，中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利(專(zhuān)利號(hào)ZL99101537.1)，公開(kāi)了一種畜禽疫病快速診斷試紙條的制備及應(yīng)用，但該發(fā)明的要點(diǎn)是針對(duì)畜禽疫病病原的檢測(cè)，并未涉及對(duì)雞毒霉形體抗體的診斷檢測(cè)。圖1:本發(fā)明的總體技術(shù)路線圖圖2:本發(fā)明試紙卡的側(cè)視圖，圖中1樣品墊(樣品端)；2為金標(biāo)墊；3為硝酸纖維素膜(NC膜)；4為吸收墊(手柄端)；5為檢測(cè)線，即T線；6為質(zhì)控線，即C線；7為不吸水的支撐薄片條；8為測(cè)試卡；9為加樣孔。圖3:本發(fā)明試紙卡的俯視圖，圖中1樣品墊(樣品端)；2為金標(biāo)墊；3為硝酸纖維素膜(NC膜)；4為吸收墊(手柄端)；5為檢測(cè)線，即T線；6為質(zhì)控線，即C線；8為測(cè)試卡；9為加樣孔。圖4:發(fā)明試紙卡結(jié)果判定示意圖，圖中&為陽(yáng)性結(jié)果++++;15性結(jié)果+++;0為陽(yáng)性結(jié)果++;d為陽(yáng)性結(jié)果+;e為陰性結(jié)果；f、g為試紙卡失效圖5:本發(fā)明涉及的pMGA1.2重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒的物理構(gòu)建圖
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，其第一個(gè)目的是組裝一種用于檢測(cè)雞毒霉形體抗體的試劑盒。第二個(gè)目的是本發(fā)明的試劑盒在雞毒霉形體抗體檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明的總體技術(shù)路線圖見(jiàn)圖1所示。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的試劑盒是由盒體和包含在盒體內(nèi)的試紙卡、樣品稀釋液組成。試紙卡(結(jié)構(gòu)圖如圖2、3所示)是本發(fā)明的試劑盒的核心，由試紙條與測(cè)試卡組成。試紙條由吸收墊(4)、硝酸纖維素膜(3)、金標(biāo)墊(2)、樣品墊(1)的依次粘貼在不吸水的支撐薄片(7)上構(gòu)成。的金標(biāo)墊(2)上包被有膠體金標(biāo)記的抗雞IgGFc單克隆抗體(分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞系BDRPDP已經(jīng)公布在本申請(qǐng)人在先授權(quán)的專(zhuān)利文獻(xiàn)中，專(zhuān)利號(hào)ZL200510011521.8，該雜交瘤細(xì)胞系的己于2005年3月17日保藏在中國(guó)湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCCNO:C200501);硝酸纖維素膜(NC膜)(3)上分別包被有雞毒霉形體重組血凝素蛋白pMGA1.2蛋白構(gòu)成的檢測(cè)線(T線)(5)和兔抗鼠IgG構(gòu)成的質(zhì)控線(C線)(6);將試紙條裝入測(cè)試卡(8)中構(gòu)成試紙卡。樣品稀釋液為蒸餾水。所述硝酸纖維素膜、吸收墊、金標(biāo)墊、樣品墊、不吸水的支撐薄片均購(gòu)自Millipore公司。所述親和層析柱購(gòu)自AmershamBiosciences公司。本發(fā)明所述的重組pKG-pMGA1.2蛋白，是由大腸桿菌BL21/pKG-pMGA1.2所表達(dá)的，包含重組質(zhì)粒pKG-pMGA1.2的大腸桿菌(fsc力eric力iaco乃')BL21/pKG-pMGA1.2于2007年12月20日保藏在位于中國(guó)湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M207207)本發(fā)明的原理是選用親和層析純化的雞毒霉形體重組血凝素pMGA1.2蛋白作為檢測(cè)線，抗雞IgGFc片斷單克隆抗體作為膠體金標(biāo)記的抗體，利用間接法(ShyuRH等，Colloidalgold-basedimmunochromatographicassayfordetectionofricinJToxicon2002，40(3):255-258)來(lái)檢測(cè)被檢材料中是否含有雞毒霉形體抗體。檢測(cè)時(shí)，樣品中所有的雞IgG分子的Fc片段先和金標(biāo)記抗雞IgGFc片段單克隆抗體結(jié)合，由于毛細(xì)管作用，反應(yīng)復(fù)合物沿包被膜向前泳動(dòng)，若樣品中有抗雞毒霉形體的特異性抗體，到達(dá)檢測(cè)線時(shí)，遇到包被在硝酸纖維素膜上的重組蛋白，就會(huì)形成重組蛋白-抗體-金標(biāo)記單克隆抗體復(fù)合物，從而富集在檢測(cè)線上，形成特異性的紅色沉淀線；不是抗雞毒霉形體的抗體形成的抗體-金標(biāo)記單克隆抗體復(fù)合物則會(huì)通過(guò)檢測(cè)線，富集在質(zhì)控線上，形成紅色沉淀線，即判為陽(yáng)性結(jié)果。若樣品中不含有雞毒霉形體抗體，反應(yīng)復(fù)合物到達(dá)檢測(cè)線時(shí)，遇到捕獲抗原就不會(huì)形成重組蛋白-抗體-金標(biāo)記單克隆抗體復(fù)合物，反應(yīng)復(fù)合物通過(guò)檢測(cè)線，富集在質(zhì)控線上，形成紅色沉淀線，即判為陰性結(jié)果。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)之一是生物安全性高。本發(fā)明所涉及到的表達(dá)載體pGEX-KG是分子生物學(xué)中常用的表達(dá)載體，沒(méi)有生物危險(xiǎn)性，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的表達(dá)載體pKG-pMGAl.2也沒(méi)有任何生物危險(xiǎn)性。重組大腸桿菌BL21/pKG-pMGA1.2是將表達(dá)載體pKG-pMGA1.2轉(zhuǎn)化至分子生物學(xué)中常用的大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞后經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選獲得，也不具生物危險(xiǎn)性。本發(fā)明中的試紙條檢測(cè)線包被的是本發(fā)明制備的雞毒霉形體重組血凝素蛋白(pMGA1.2蛋白)，制備過(guò)程中不涉及雞毒霉形體活病毒，因此沒(méi)有雞毒霉形體活病毒逃逸、擴(kuò)散的潛在危險(xiǎn)。2、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)之二是生產(chǎn)成本低。本發(fā)明所提供的試劑盒所需的核心試劑是抗雞IgGFc段單克隆抗體與毒霉形體重組血凝素蛋白(pMGA1.2蛋白)。抗雞IgGFc單克隆抗體可以通過(guò)將分泌抗雞IgGFc片斷的單克隆雜交瘤細(xì)胞系(保藏編號(hào)為CCTCCNO:C200501)注射Balb/C小鼠腹腔，誘生腹水，通過(guò)經(jīng)濟(jì)的辛酸-硫酸銨方法純化而大量獲得。pMGA1.2蛋白可以通過(guò)重組大腸桿菌BL21/pKG-pMGA1.2在體外得到大量的表達(dá)，適合大規(guī)模的生產(chǎn)。3、與已公開(kāi)的用于雞毒霉形體抗體檢測(cè)的血清平板凝集試驗(yàn)(SPA)方法相比，本發(fā)明的試劑盒具有許多SPA方法所不能比擬的優(yōu)點(diǎn)，如靈敏度高，特異性好，結(jié)果容易判定；檢測(cè)過(guò)程中只需一種試劑(蒸餾水)，對(duì)人體無(wú)危害，對(duì)環(huán)境無(wú)污染；儲(chǔ)存方便，對(duì)溫度要求不高，在4。C下有效保存期可達(dá)一年；在室溫下可保存六個(gè)月(表l)。表1本發(fā)明的試劑盒與血清平板凝集試驗(yàn)(SPA)方法的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>具體實(shí)施方式實(shí)施例1雞毒霉形體pMGA1.2蛋白的制備所使用的分子生物學(xué)方法參見(jiàn)文獻(xiàn)薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主編(金冬雁等譯),分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.第二版，北京科學(xué)出版社，1992中提供的方法進(jìn)行。1、pMGA基因片段的PCR及克隆本發(fā)明所涉及的pMGA1.2基因是申請(qǐng)人從pMGA重組質(zhì)粒MgW17(Genbank登錄號(hào)為AF2753i2，質(zhì)粒的構(gòu)建見(jiàn)文獻(xiàn)翁長(zhǎng)江等雞毒霉形體HS株pMGA多基因族的研究，中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，23(2):149-152)自己亞克隆得到的。整個(gè)MgW17重組質(zhì)粒共計(jì)約10.6kb，含有的雞毒霉形體DNA片段為7434bp，其中包含有兩個(gè)完整的pMGA基因(pMGA1.2、pMGA1.3)和兩個(gè)不完整的pMGA基因的頭部(pMGAl.l)和尾部(pMGA1.4)(見(jiàn)圖--)。pMGA1.1基因位于整個(gè)片段的最前端，閱讀框的前半部分被切除，剩下的后半部序列在l-720bp，共720bp，終止密碼為T(mén)AA;本研究準(zhǔn)備克隆的pMGA1.2基因的閱讀框在1040-3010bp處，全長(zhǎng)1971bp，起始密碼為GTG，終止密碼為T(mén)AA，編碼656個(gè)氨基酸；編碼色氨酸的TGA密碼分別位于1928、2111和2489處，考慮到跨膜區(qū)內(nèi)疏水性氨基酸及其相臨近的膜內(nèi)、膜外氨基酸在黏附素抗原性上的相對(duì)不重要性以及對(duì)表達(dá)的不利影響，所以，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，申請(qǐng)人刪除了該基因氨基端的膜內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)以及脯氨酸間隔區(qū)序列共計(jì)161bp，從1201-3010共計(jì)1800bp，其中3個(gè)TGA密碼子將1800bp分解成700bp，216bp，381bp和538bp4個(gè)片段。為了表達(dá)出全序列，必須對(duì)3個(gè)TGA進(jìn)行點(diǎn)突變，因此，申請(qǐng)人首先分別擴(kuò)增出前后4個(gè)片段，經(jīng)兩兩整合成兩個(gè)大片段后，再重新將兩個(gè)大片段整合到原核表達(dá)載體中，從而構(gòu)建完整表達(dá)pMGA1.2基因的載體。根據(jù)MgW17中的pMGA1.2基因3個(gè)色氨酸編碼子"TGA"附近的核苷酸序列設(shè)計(jì)9條特異引物，由上海博雅生物技術(shù)公司合成并經(jīng)PAGE純化。引物序列如下.-引物引物序列引物起止序列片段大小(bp)下劃線備注0.0#5,-TCGGAATTCAACTTGAAGTGA-3，-12-4EcoRI1.0#1.1#1.2#1.3#1.4#1.5#1.6#1.7#5，-TTTGAATTCCTAGTGGTGGTATGA-CCAATTGGGAATTGTAGTTTCT-3'-CAATlTGG|AACTTCGCTCAAAGA-，-ACCGGTTGAAGGTCCGTAATAA-5'-ACCGGTTGGTTATACTTCCCT-3'162-179EcoRI700870掘Munl885德Munl2161050-1060cm011066-1087CfrlOI3811426-1447Nhel1441-1465Nhel5381966-1987Xhol5，-CGCTAGCCAAACTATAAGCACT-3，5，-GCTAGCGAIJXgglTCAACATTTATC-3'5'-GGCTCGAGGTTAGTAGTTTAATAG-3'說(shuō)明方框標(biāo)記出tga同義突變?yōu)閠gg以MgW17為模板，用引物0.0#和1.7弁進(jìn)行PCR，然后以該P(yáng)CR產(chǎn)物為模板用上述其他引物按以下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為10x反應(yīng)緩沖液IOW，dNTP2pl(10mM)，上游引物2[al(20pM)，下游引物2^1(20^M)，TaqDNA聚合酶1pi(5u/|al)，模板DNAlpl，去離子水82pl，共lOOiil。反應(yīng)條件為94。C變性4min;94。C變性30Sec，不同溫度退火30Sec，72'C延伸90Sec，共30個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10min。其中引物對(duì)0.0#和1.7#，1.0#和1.7#，1.0#和1.1#，1.2柳1.3#，1.4#和1.5#及1.6#和1.7#PCR時(shí)的退火溫度分別為51，51，50，52和51°C，擴(kuò)增的片段分別為pMGA1.2'，pMGA1.2，I，II，m和IV。取10(alPCR產(chǎn)物經(jīng)0.8o/。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后用DNA回收試劑盒E.Z.N.AGelExtractionKit回收目的片段。在16"條件下將純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)化到新制備的感受態(tài)DH5a中并涂布含IPTG、Xgal和Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37。C培養(yǎng)16-18h。將培養(yǎng)好的平皿4。C放置數(shù)小時(shí)后挑白斑進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)提質(zhì)粒進(jìn)行酶切和PCR鑒定。將鑒定的陽(yáng)性克隆pMD-I，pMD-II，pMD-III和pMD-IV中的I和II，III和IV利用特定酶進(jìn)行酶切后再T4連接酶整合為pMD-v(i+n)禾卩pmd-vi(in+iv)。2、表達(dá)載體pKG-pMGA1.2的構(gòu)建用五co/I和ATzoI雙酶切pMD-pMGA1.2，五coI和雙酶切含v的質(zhì)粒pMD-V,C々7仍和Wol雙酶切含VI的質(zhì)粒pMD-VI后，用E.Z.N.AGelExtractionKit回收分離并純化片段pMGA1.2、V和VI。在16'C條件下，用T4連接酶將回收的酶切片段與用和力ol雙酶切的AmershamBiosciences公司的表達(dá)載體pGEX-KG片段進(jìn)行連接過(guò)夜構(gòu)建表達(dá)載體。重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化新鮮制備的DH5a感受態(tài)細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)化菌涂布含氨芐青霉素的LB瓊脂平板37'C培養(yǎng)過(guò)夜。挑數(shù)個(gè)單菌落培養(yǎng)過(guò)夜后用堿裂解法小量制備質(zhì)粒，進(jìn)行酶切分析和pcr擴(kuò)增鑒定。將得到的陽(yáng)性克隆命名為pKG-pMGA1.2。包含該重組質(zhì)粒pKG-pMGA1.2的大腸桿菌(Esc/^n'c/n'aco//)BL21/pKG-pMGA1.2保藏在位于中國(guó)湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日2007年12月20日；保藏編號(hào)CCTCCNO:M207207。對(duì)陽(yáng)性克隆用常規(guī)的堿裂解法大量制備質(zhì)粒dna，并分裝凍存于-2(TC。重組表達(dá)質(zhì)粒pKG-pMGA1.2構(gòu)建流程如圖5所示。3、雞毒霉形體pMGA1.2蛋白的表達(dá)將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒pKG-pMGAl.2轉(zhuǎn)入表達(dá)用大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞5w/^n'c/n'flco/iBL21(DE3)(Esc/^r油aco/iBL21(DE3)購(gòu)自Stratagene公司)中，涂布到含有抗生素(氨芐青霉素60pg/mL)的LB平皿上，37。C培養(yǎng)1618h，長(zhǎng)出單菌落。挑取數(shù)個(gè)單菌落于加有抗生素(氨芐青霉素60pg/mL)的3mLLB中培養(yǎng)過(guò)夜，進(jìn)行細(xì)菌活化。將過(guò)夜培養(yǎng)物按比例l:50稀釋入新鮮的LB培養(yǎng)基中，37'C中振蕩培養(yǎng)(250300rpm)至UOD600=0.50.8時(shí)，加入終濃度為lmmol/L異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(IPTG)，繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)3h。4'C條件下8,000rpm離心15min，收集細(xì)菌。細(xì)菌用0.01MpH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS，配方如下140mMNaCl，2.7mMKC1，lOmMNa2HP04，1.8mMKH2P04，pH7.2)洗滌一次后離心，反復(fù)快速凍融34次，用適量緩沖液STE(配方100.0mmol/LNaCl，10,0mmol/LTris-Cl，1.0mmol/LEDTApH8.0)重懸。用大超聲頭，設(shè)定功率400瓦、20個(gè)循環(huán)和破碎5秒、間隔10秒，在冰浴中超聲破碎lmin。4。C條件下12,000rpm離心15min，棄沉淀，將上清對(duì)0.01MpH7.2PBS進(jìn)行充分透析后濃縮至體積為5mL，按蛋白純化柱(GlutathioneSepharose4BHiTrapaffinitycolumns,AmershamBiosciences公司產(chǎn)品)說(shuō)明書(shū)提供的程序進(jìn)行親和層析純化，得到純化的pMGA1.2蛋白。該蛋白可用于制備檢測(cè)雞毒霉形體抗體的試劑。實(shí)施例2兔抗鼠IgG抗體的制備1、Balb/C小鼠IgG的提取IgG的提取和純化按沈關(guān)心等(沈關(guān)心等，現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(第二版)[M]，湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2002)等所述方法進(jìn)行取IO.OmL健康Balb/C小鼠血清與等量生理鹽水混合后，逐滴加入飽和(NH4)2S04溶液20.0mL，使成50%飽和度的(1^14)2804溶液。4。C靜置30min后取出；4。C下3,000r/min離心30min，棄上清，沉淀中加20.0mL生理鹽水；待沉淀溶解后，緩慢加入10.0mL飽和(NH4)2S04溶液，使成33%飽和度的(NHU)2S04溶液。4。C放置30min后取出；4。C下3,000r/min離心30min。棄上清，沉淀重復(fù)進(jìn)行上述操作后，將沉淀溶于l.OmL生理鹽水(原血清量體積的1/10)，裝入透析袋內(nèi)用生理鹽水透析除鹽。用2XBaCl2溶液檢測(cè)(NH4)2S04是否己被透析完全。透析完全后，蛋白溶液用聚乙二醇(PEG)-20,000濃縮至適當(dāng)體積，4"下12，000r/min離心10min，取上清，測(cè)定蛋白質(zhì)含量，即得到粗提的Balb/C小鼠IgG。2、Balb/C小鼠IgG的純化根據(jù)樣品的種類(lèi)與容積及所選擇的層析柱來(lái)確定所選葡聚糖凝膠的種類(lèi)和柱床的體積。柱床的體積按如下公式計(jì)算Vt二兀r211(Vt—柱床的體積；兀一圓周率；r一半徑；h—柱床高)根據(jù)樣品的種類(lèi)，本發(fā)明用葡聚糖凝膠(SephadexG-200)作為層析材料。純化的具體過(guò)程如下稱取3.0gSephadexG-200倒入數(shù)倍體積的蒸餾水中混合均勻，置室溫浸泡3d，每天換蒸餾水2次，慢慢將上層含漂浮顆粒的部分倒掉后，再加入原體積的蒸餾水，凝膠浸泡好后置4'C冰箱保存?zhèn)溆?。將潔凈的層析柱垂直固定于?shí)驗(yàn)架上，加少量洗脫液(0.01mol/L,pH7.2PBS)，檢査出液管的通暢性，合格后，關(guān)閉出液口。從4'C冰箱取出浸泡好的SephadexG-200，平衡至室溫后灌裝層析柱。在裝好的層析柱凝膠上輕輕放上與柱內(nèi)徑相當(dāng)?shù)臑V紙片，0.01mol/LpH7.2的PBS平衡過(guò)夜，在凝膠的上方留出lcm2cm高的液層，準(zhǔn)備加樣。加樣時(shí)，將凝膠上方的液層放出，待剛露出濾紙片時(shí)，立即關(guān)閉出液口。用滴管吸取樣品，在接近濾紙?zhí)幯毓鼙诹飨?，取少許生理鹽水沖洗樣品瓶，將洗液加入，最后用洗脫液清洗管壁。打開(kāi)出液口，在樣品全部進(jìn)入柱床且剛出現(xiàn)濾紙時(shí)，立即加入洗脫液，使柱床上部形成5cm10cm厚的液層。樣品上柱后，不時(shí)以20%磺基水楊酸液檢測(cè)洗出液，當(dāng)洗出液出現(xiàn)輕微乳濁反應(yīng)時(shí)，立即用已經(jīng)編號(hào)的1.5mLEP管收集洗出液，每管lmL，直至洗出液用20%磺基水楊酸檢測(cè)不出渾濁時(shí)結(jié)束收集。結(jié)束收集后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定每管流出液中蛋白質(zhì)含量，以EP管編號(hào)為橫坐標(biāo)，管內(nèi)流出液蛋白質(zhì)含量為縱坐標(biāo)繪制曲線圖，根據(jù)蛋白濃度分布收集所需溶液，裝入透析袋中，PEG-20,000濃縮至適當(dāng)體積。4。C12,000r/min離心10min,收集上清，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定經(jīng)過(guò)濃縮后的Balb/C小鼠IgG蛋白含量，置-20'C凍存。3、家兔的免疫及兔抗Balb/C小鼠IgG的提取與純化選取體重在2,5kg左右的成年雄性健康家兔，用1和2中制備的抗原，首次免疫用弗氏完全佐劑乳化的Balb/C小鼠IgG，免疫劑量為2mglgG/只家兔，以后各次用弗氏不完全佐劑乳化的Balb/C小鼠IgG免疫。除首免與二免間隔3周外，其余每次免疫間隔10天，且每次免疫劑量中Balb/C小鼠IgG的含量較前一次高0.8mg,每次免疫途徑全部采用皮下多點(diǎn)注射。免疫3次后，采血檢測(cè)血清效價(jià)，當(dāng)血清AGID(瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(agargelimmunodiffusion,AGID)簡(jiǎn)稱瓊擴(kuò)試驗(yàn))效價(jià)達(dá)到1:32時(shí)，再加強(qiáng)免疫l次，IO天后頸動(dòng)脈放血，分離血清，用于兔抗Balb/C小鼠IgG的提取。按照本實(shí)施例步驟1和步驟2的方法進(jìn)行兔抗Balb/C小鼠IgG的提取與純化。即可得到本發(fā)明所需高特異性、高效價(jià)的兔抗鼠IgG抗體。利用該抗體可作為本發(fā)明膠體金試紙卡的質(zhì)控線(C線)。實(shí)施例3硝酸纖維素膜的制備1包被緩沖液的配制含3%甲醇的0.01MpH7.2PBS緩沖液為包被緩沖液，0.22p膜濾過(guò)，置4'C備用，有效期一周。1000ml3。/o甲醇的0.01MpH7.2PBS緩沖液配方NaC18g、KC10.2g、Na2HP04'12H202.9g、KH2P040.2g、甲醇30ml，用雙蒸去離子水定容至1000ml。2硝酸纖維素膜的制備用本實(shí)施例步驟1中的包被緩沖液將pMGA1.2蛋白稀釋到5010(^g/ml，調(diào)整機(jī)器，劃線為T(mén)線，即為檢測(cè)線，T線靠近金標(biāo)墊端，距金標(biāo)墊端約5mm;用包被緩沖液將兔抗鼠IgG抗體稀釋到50100ng/ml,調(diào)整機(jī)器，劃線為C線，即為質(zhì)控線，C線靠近吸收墊，距吸收墊約3mm。兩線距離58mm，線應(yīng)細(xì)致、均勻。37t烘千，封裝備用。實(shí)施例4膠體金、金標(biāo)記單克隆抗體的制備1、溶液的配制(1)氯金酸的配制用雙蒸去離子水溶解氯金酸，配成1%溶液，置4"C備用，有效期四個(gè)月。1000mlin/。氯金酸溶液配方10g氯金酸；雙蒸去離子水定容至1000ml。(2)1%擰檬酸三鈉的配制用雙蒸去離子水溶解檸檬酸三鈉，配成1。/。溶液，0.22)Lim膜濾過(guò)，現(xiàn)配現(xiàn)用。(3)O.IM碳酸鉀的配制用雙蒸去離子水配制，0.22nm膜濾過(guò)，置4"C備用，有效期四個(gè)月。1000ml0.1M碳酸鉀溶液配方13.8g碳酸鉀；雙蒸去離子水定容至1000ml。(4)2%聚乙二醇(PEG)-20000的配制用雙蒸去離子水配制，0.22)am膜濾過(guò)，置4。C備用，有效期四個(gè)月。1000ml2y。PEG-20000溶液配方20gPEG-20000;雙蒸去離子水定容至1000ml。(5)標(biāo)記洗滌保存液的配制2%牛血清白蛋白(BSA)、0.05%疊氮鈉(NaN3)、0.01MpH7.2PBS溶液，0.22pm膜濾過(guò)，置4'C備用，有效期四個(gè)月。1000ml標(biāo)記洗滌保存液配方20gBSA、0.5gNaN3、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。2、膠體金的制備用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01%，置電爐煮沸，按每100ml0.01%氯金酸加入2mlP/。擰檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，直到液體呈亮紅色即停止加熱，冷卻至室溫后補(bǔ)足失水。制備好的膠體金外觀應(yīng)純凈、透亮、無(wú)沉淀和漂浮物，有效期一周。3、膠體金標(biāo)記單克隆抗體的制備用0.1M碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值至8.2，按810嗎抗體/ml膠體金加入抗雞IgGFc單克隆抗體，磁力攪拌器混勻30min,攪拌下加入BSA至終濃度為1%，靜置1小時(shí)。13000rpm、4。C離心30min，棄上清，沉淀用標(biāo)記洗滌保存液洗滌兩次，用十分之一初始膠體金體積的標(biāo)記洗滌保存液將沉淀重懸，置4'C備用，有效期一周。實(shí)施例5金標(biāo)墊的制備1封閉液的配制2%牛血清白蛋白BSA、0.5%Tween-20、0.05%NaN3、0.01MpH7.2PBS溶液，0.22pm微孔濾膜濾過(guò)，置4。C備用，有效期四個(gè)月。1000ml封閉液配方20gBSA、0.5gNaN3、5mlTween-20、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。2金標(biāo)墊的制備將金標(biāo)墊浸泡于本實(shí)施例步驟l中的封閉液中30min后，于37'C烘干。然后將制備好的金標(biāo)記抗體均勻的鋪在金標(biāo)墊上，每毫升溶液鋪20平方厘米，冷凍干燥，封裝，置4"C備用。實(shí)施例6試紙條樣品墊的制備1封閉液的配制2%牛血清白蛋白(BSA)、0.5%Tween陽(yáng)20、0.05%NaN3、0.01MpH7.2PBS溶液，0.22pm微孔濾膜濾過(guò)，置4"C備用，有效期四個(gè)月。1000ml封閉液配方20gBSA、0.5.NaN3、5mlTween-20、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。2樣品墊的制備將樣品墊浸泡于本實(shí)施例1中的封閉液中30min后，于37匸烘干，封裝，置4'C備用。實(shí)施例7試紙卡的組裝將硝酸纖維素膜、吸收墊、玻璃纖維、樣品墊按圖依次層疊起來(lái)，切成3.6mm寬的小條，然后裝入測(cè)試卡。每十個(gè)一包，加入干燥劑，真空封裝。48'C保存，有效期一年；常溫保存，有效期6個(gè)月。實(shí)施例81快速檢測(cè)雞毒霉形體抗體的試劑盒包括①試紙卡一包(10個(gè)/包)②樣品稀釋液一瓶(10ml/瓶)2相關(guān)溶液的配制快速檢測(cè)雞毒霉形體抗體的試劑盒的樣品稀釋液蒸餾水。實(shí)施例9本發(fā)明試劑盒的使用方法1.樣品制備雞血清樣品的制備，將血清樣品用蒸餾水稀釋20倍。2.檢領(lǐng)!l:取出試劑盒，室溫平衡20分鐘；打開(kāi)包裝袋，取出試紙卡，取100pl制備好的樣品滴入試紙卡的加樣孔中，10-15分鐘內(nèi)判定結(jié)果。3.結(jié)果判定如圖4所示，當(dāng)試紙卡出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紫紅色質(zhì)控線，沒(méi)有出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紫紅色檢測(cè)線，結(jié)果判為陰性，記為"一"；當(dāng)試紙卡出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紫紅色質(zhì)控線，同時(shí)也出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紫紅色檢測(cè)線，結(jié)果判為陽(yáng)性，記為"+";檢測(cè)線顏色深度與被檢血清中的抗體效價(jià)呈正相關(guān)，顏色越深說(shuō)明被檢測(cè)樣品的抗體效價(jià)越高；檢測(cè)線顏色濃厚，與質(zhì)控線顏色一致或接近時(shí)判為++++，顏色深度介于+與++++之間時(shí)酌情判++或+++。達(dá)到+及以上的顏色深度時(shí)，判為該份被檢血清的抗體為陽(yáng)性。質(zhì)控線無(wú)條帶出現(xiàn)則判為檢測(cè)試紙卡失效。實(shí)施例10快速檢測(cè)雞傳染性法氏囊抗體的試劑盒穩(wěn)定性考核設(shè)計(jì)溫度20°C、4°C設(shè)計(jì)時(shí)間0天、10天、20天、30天、2月、4月、6月、8月、10月、12月保存方法試紙卡真空封裝(貯存在4'C的冰箱內(nèi)或2(TC室溫中)考核指標(biāo)敏感性表2本發(fā)明試劑盒試紙卡穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果0天10天20天30天2月4月6月8月10月12月0。C1:10241:10241:10241:10241:10241:10241:10241:256I:641:1620'C1:10241:10241:10241:10241:1024h10241:256失效實(shí)施例11快速檢測(cè)雞毒霉形體抗體的試劑盒的制備及應(yīng)用1快速檢測(cè)雞毒霉形體抗體的試劑盒的制備按實(shí)施例1-9的方法制備快速檢測(cè)雞毒霉形體抗體的試劑盒。2速檢測(cè)雞毒霉形體抗體的試劑盒的應(yīng)用2.1雞標(biāo)準(zhǔn)血清的檢測(cè)①特異性試驗(yàn)分別將雞禽流感病毒H5、H9亞型陽(yáng)性血清(購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所)、雞新城疫(ND)陽(yáng)性血清、雞傳染性支氣管炎(IB)陽(yáng)性血清、雞傳染性法氏囊(IBD)陽(yáng)性血清(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)按本發(fā)明實(shí)施例9所述方法(GICA)進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表3。表3顯示，本發(fā)明檢測(cè)試紙卡與雞毒霉形體陽(yáng)性血清試驗(yàn)后，質(zhì)控線及檢測(cè)線均出現(xiàn)明顯的紫紅色條帶；而與蒸餾水(空白)、SPF雞陰性血清、雞新城疫(ND)、雞傳染性法氏囊(IBD)、雞傳染性支氣管炎(IB)等陽(yáng)性血清試驗(yàn)后，檢測(cè)線不出現(xiàn)紫紅色條帶。這表明本發(fā)明試紙卡特異性高，與雞的其他呼吸道疫病病毒抗體無(wú)任何交叉反應(yīng)。表3本發(fā)明的試劑盒對(duì)雞標(biāo)準(zhǔn)血清檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>②敏感性試驗(yàn)將雞毒霉形陽(yáng)性血清(購(gòu)自中國(guó)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?00(il稀釋好的樣品按本發(fā)明方法(GICA)進(jìn)行試驗(yàn)。同時(shí)，用常規(guī)平板凝集(SPA)(沈關(guān)心，周汝麟.現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(第二版)[M],湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2002)測(cè)定MG標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清的效價(jià)(試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4)。結(jié)果表明，本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的靈敏度比平板凝集試驗(yàn)高128倍。表4本發(fā)明試劑盒與常規(guī)檢測(cè)方法對(duì)雞毒霉形體抗體檢測(cè)的敏感性試驗(yàn)結(jié)果_GICA檢測(cè)SPA檢測(cè)MG標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清1:10241:82.2送檢雞血清樣品的檢測(cè)從湖北、河南等地的3個(gè)雞場(chǎng)共采集120份雞血清，按本發(fā)明方法(GICA)進(jìn)行試驗(yàn)。同時(shí)，用常規(guī)平板凝集(SPA)測(cè)定效價(jià)。(結(jié)果見(jiàn)5)。表5顯示，GICA法檢出率為44.17。/。(53/120)，SPA法為24.17°/。(29/120)，二者的符合率為61.67%((18+56)/120，(SPA和GICA同為陽(yáng)性+SPA和GICA同為陰性)/總樣品數(shù))；SPA法檢出率為24.17%(29/120)，比GICA法檢出率低，是因?yàn)镚ICA法的敏感度比SPA高128倍(1024/8)，使得GICA法陽(yáng)性時(shí)而SPA法為陰性，二者的符合率為61.67%((18+56)/120，(SPA和GICA同為陽(yáng)性+SPA和GICA同為陰性y總樣品數(shù))。表5本發(fā)明的試劑盒與常規(guī)方法檢測(cè)效果的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>盡管本發(fā)明的內(nèi)容是結(jié)合本實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，但是不能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書(shū)限定。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在所附權(quán)利要求書(shū)限定的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)或修飾，這些改動(dòng)或修飾形式同樣落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。權(quán)利要求1、一種適用于檢測(cè)雞毒霉形體抗體的試劑盒，它包含盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的試紙卡和樣品稀釋液，其特征在于其中的試紙卡由試紙條與測(cè)試卡組成；試紙條由吸收墊(4)、硝酸纖維素膜(3)、金標(biāo)墊(2)、樣品墊(1)依次粘貼在不吸水的支撐薄片(7)上構(gòu)成。所述的金標(biāo)墊(2)上包被有膠體金標(biāo)記的抗雞IgGFc片段單克隆抗體；所述的硝酸纖維素膜(3)上分別包被有雞毒霉形體重組血凝素pMGA1.2蛋白構(gòu)成的檢測(cè)線(5)和兔抗鼠IgG構(gòu)成的質(zhì)控線(6)；所述的樣品稀釋液為蒸餾水。2、權(quán)利要求l中所述的試劑盒在檢測(cè)雞毒霉形體抗體中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于免疫應(yīng)用領(lǐng)域，涉及動(dòng)物分子生物學(xué)、免疫學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域。公開(kāi)了一種用于快速檢測(cè)雞毒霉形體抗體的試劑盒。該試劑盒包含盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的試紙卡和樣品稀釋液。其中的試紙卡是由樣品墊、吸收墊、分別包被有雞毒霉形體pMGA1.2重組蛋白作為檢測(cè)線和包被有抗鼠IgG作為質(zhì)控線的硝酸纖維素膜依次按吸收墊、硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊的順序粘貼在不吸水的支撐薄片上構(gòu)成。所述的試劑盒檢測(cè)相應(yīng)的抗體具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便和診斷快速的顯著優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)G01N33/577GK101196525SQ20071016910公開(kāi)日2008年6月11日申請(qǐng)日期2007年12月29日優(yōu)先權(quán)日2007年12月29日發(fā)明者梅劉,張展英,張文通,張進(jìn)良,李自力,畢丁仁,政王,王喜亮,石德時(shí),肖運(yùn)才,胡思順,許青榮申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)