空腸彎曲菌免疫膠體金快速檢測試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種空腸彎曲菌，具體來說是一種空腸彎曲 菌免疫膠體金快速檢測試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002] 空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni enteritis)是 1973 年 Butzler 等自腹瀉病 人糞便中分離出來，目前已認識其為人類腹瀉的主要致病菌之一?？漳c彎曲菌腸炎的發(fā)病 率在發(fā)達國家超過細菌性痢疾，在發(fā)展中國家發(fā)病率幾乎等同于細菌性痢疾。本菌作為重 要的食源性致病菌，隨著食物進入腸道后在含微量氧環(huán)境下迅速繁殖，主要侵犯空腸、回腸 和結(jié)腸，侵襲腸粘膜，造成充血及出血性損傷，近年來觀察到有些菌株能產(chǎn)生類似霍亂腸毒 素，引起腸腔內(nèi)液體分泌增加。
[0003] 目前空腸彎曲菌的檢測主要依賴于國標所規(guī)定的生化鑒定，其缺點是操作繁瑣、 檢測周期較長，無法適應(yīng)大量的樣品篩查。免疫學(xué)檢測是近年來出現(xiàn)的最快速、準確、穩(wěn)定 的快速檢測手段，但國內(nèi)外目前尚無可運用于檢測實踐的快速檢測產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種空腸彎曲菌免疫膠體金快速 檢測試紙條，所述的這種空腸彎曲菌免疫膠體金快速檢測試紙條解決了現(xiàn)有技術(shù)中檢測空 腸彎曲菌操作復(fù)雜，周期長的技術(shù)問題。
[0005] 本發(fā)明提供了一種空腸彎曲菌免疫膠體金快速檢測試紙條，包括樣品墊、金標墊、 硝酸纖維素膜和吸收墊，所述的樣品墊和所述的金標墊緊密相連，所述的金標墊和所述的 硝酸纖維素膜緊密相連，所述的硝酸纖維素膜和所述的吸水墊緊密相連，所述的纖維素膜 上遠離金標墊的一端設(shè)置質(zhì)控線，在質(zhì)控線和金標墊之間的纖維素膜上設(shè)置檢測線，其中， 在所述的金標墊上設(shè)置有與膠體金耦聯(lián)的單克隆抗體，所述的與膠體金耦聯(lián)的單克隆抗體 由保藏號為CGMCC NO. 8457的雜交瘤細胞株分泌產(chǎn)生，所述的檢測線由單克隆抗體構(gòu)成，所 述的檢測線的單克隆抗體由保藏號為CGMCC NO. 8766的雜交瘤細胞株分泌產(chǎn)生。
[0006] 進一步的，所述的質(zhì)控線由羊抗兔抗體或者羊抗鼠抗體組成。
[0007] 進一步的，在所述的與膠體金耦聯(lián)的單克隆抗體中，單克隆抗體與膠體金的質(zhì)量 體積比為12 μ g: lmL。
[0008] 進一步的，檢測線上單克隆抗體的濃度彡20 μ g/mL。
[0009] 進一步的，所述的試紙條背面可設(shè)置一個起支撐作用的背板。
[0010] 進一步的，所述的試紙條裝入一個盒體中，所述的盒體對應(yīng)于樣品墊的部位設(shè)有 檢測孔，對應(yīng)于檢測線和質(zhì)控線的部位設(shè)有觀測窗。
[0011] 本發(fā)明還提供了上述空腸彎曲菌免疫膠體金快速檢測試紙條在檢測食品空腸彎 曲菌中的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0012] 圖1是本發(fā)明實施例中空腸彎曲菌的免疫膠體金檢測試紙條的單抗SDS-PAGE電 泳圖；
[0013] 圖2是本發(fā)明實施例中空腸彎曲菌的免疫膠體金檢測試紙條的各抗體偶聯(lián)膠體 金pH結(jié)果；
[0014] 圖3是本發(fā)明實施例中空腸彎曲菌的免疫膠體金檢測試紙條的各抗體偶聯(lián)膠體 金結(jié)合量結(jié)果；
[0015] 圖4是本發(fā)明實施例中空腸彎曲菌的免疫膠體金檢測試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0016] 圖5是本發(fā)明實施例中空腸彎曲菌的免疫膠體金檢測試紙條的不同抗體組合結(jié) 果；
[0017] 圖6是本發(fā)明實施例中空腸彎曲菌的免疫膠體金檢測試紙條的膠體金試紙條靈 敏度結(jié)果；
[0018] 圖7是本發(fā)明實施例中空腸彎曲菌的免疫膠體金檢測試紙條的膠體金試紙條交 叉反應(yīng)結(jié)果；
[0019] 圖8是本發(fā)明實施例中空腸彎曲菌的免疫膠體金檢測試紙條的模擬帶菌結(jié)果。
【具體實施方式】
[0020] 本發(fā)明的檢測原理與結(jié)果判斷過程為：若樣本中有待測細菌，測定時樣品處理液 加在樣品墊上，樣品處理液按樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水墊的方向移動，流經(jīng)金標 墊時，使金標墊上的與膠體金耦聯(lián)的單克隆抗體復(fù)溶，并帶動其向硝酸纖維素膜、吸水墊移 動，與膠體金耦聯(lián)的單克隆抗體可與樣品中的細菌結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，此免疫復(fù)合物流 至檢測線時，即被檢測線的單克隆抗體所捕獲，形成細菌+金標抗體+抗體的復(fù)合體，在硝 酸纖維素膜上的檢測線位置顯出紅色檢測線條；此免疫復(fù)合物流經(jīng)質(zhì)控線時，即被質(zhì)控線 的固相抗體所捕獲，在硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線位置顯出紅色質(zhì)控線條。陽性標本既顯示 檢測線，又顯示質(zhì)控線；陰性標本沒有檢測線，僅顯示質(zhì)控線。
[0021] 本發(fā)明的與膠體金耦聯(lián)的單克隆抗體由保藏號為CGMCC NO. 8457的雜交瘤細胞株 分泌產(chǎn)生，所述的檢測線的單克隆抗體由保藏號為CGMCC NO. 8766的雜交瘤細胞株分泌產(chǎn) 生。
[0022] 本發(fā)明包括具有與抗空腸彎曲菌單克隆抗體4C9E1G7H3、3G2D8H3G9的相應(yīng)氨基 酸序列的單克隆抗體，以及具有這些鏈的其他蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物。具 體地，本發(fā)明包括具有含超變區(qū)（互補決定區(qū)，CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì) 偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物（即免疫偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物），只要該超變區(qū)與本發(fā)明的輕鏈 和重鏈的超變區(qū)相同或至少90%同源性，較佳地至少95%同源性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所 知，免疫偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物包括：藥物、毒素、細胞因子（cytokine)、放射性核素、酶和 其他診斷或治療分子與抗空腸彎曲菌單克隆抗體或其片段結(jié)合的而形成的偶聯(lián)物。本發(fā)明 還包括與抗空腸彎曲菌單克隆抗體或其片段結(jié)合的細胞表面標記物或抗原。
[0023] 對于本發(fā)明的抗空腸彎曲菌單克隆抗體重鏈和輕鏈序列，可以用常規(guī)方法測定。 抗空腸彎曲菌單克隆抗體V鏈的超變區(qū)或互補決定區(qū)（complementarity determining region，⑶R)特別令人感興趣，因為它們中至少部分涉及結(jié)合抗原。因此，本發(fā)明包括那些 具有帶CDR的免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變鏈的分子，只要其CDR與抗空腸彎曲菌單克隆抗 體⑶R具有90%以上（較佳地95%以上）的同源性。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆抗體， 還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或（Fab '）2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈。
[0024] 本發(fā)明還提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。這些DNA分子的序列可以 用常規(guī)技術(shù)，利用雜交瘤細胞系（CGMCC No. 8457)或（CGMCC No. 8766)獲得。此外，還可將 輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。
[0025] -旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。
[0026] 此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通 過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
[0027] 目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白（或其片段，或其衍生 物）的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中己知的各種現(xiàn)有的DNA分子（或如載 體）和細胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
[0028] 本發(fā)明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體。這 些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質(zhì)。
[0029] 宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高 等真核細胞，如哺乳動物細胞。
[0030] 用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當宿主為原 核生物如出血性大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaClJi 處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使