快速檢測大豆致敏蛋白β-conglycinin的膠體金免疫層析試紙及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速檢測大豆致敏蛋白0-conglycinin的膠體金免疫層析試紙 及制備方法，該試紙基于雙抗體夾心的原理檢測0 -conglycinin。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆中蛋白質(zhì)含量豐富，氨基酸組成平衡，且富含不飽和脂肪酸，是人體和動物體 重要的植物蛋白和植物油來源。由于其種植面積廣，產(chǎn)量大，長久以來一直被廣泛應(yīng)用于食 品和飼料的加工原料，然而，大豆也是聯(lián)合國糧農(nóng)組織認(rèn)定的8種最重要的食物過敏源之 一，據(jù)不完全統(tǒng)計，大豆會導(dǎo)致大約〇. 4%的兒童產(chǎn)生過敏反應(yīng)。這主要是因為大豆中含有 一系列過敏原，這些過敏原是大豆及其制品中能夠?qū)е氯嘶蛐笄葸^敏的蛋白質(zhì)或糖蛋白， 過敏原數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站在2014年1月更新的數(shù)據(jù)信息顯示，大豆中共存在38種過敏原，包括 大疏水蛋白（Glym1)、大外殼蛋白（Glym2)、大抑制蛋白（Glym3)、大球蛋白 (Glycinin)、伴大豆球蛋白（0-conglycinin)、大豆空泡蛋白（GlymBd30K)、胰蛋白 酶抑制因子等。其中0-conglycinin大豆中最主要的致敏蛋白之一，0-conglycinin是具 有較強(qiáng)熱穩(wěn)定性的致敏蛋白，直接加熱并不能徹底破壞其過敏原活性，可以引發(fā)人體包括 皮膚、腸胃、呼吸等方面的過敏反應(yīng)，并且大量的動物試驗研究也表明，0-conglycinin可 以導(dǎo)致犢牛、仔豬和鼠等幼齡動物發(fā)生過敏反應(yīng)，表現(xiàn)為腹瀉、生長性能下降甚至死亡。
[0003] 近幾年，食物過敏已逐漸成為世界范圍內(nèi)廣泛關(guān)注的食品安全問題，食品過敏原 容易在嬰幼兒和幼齡動物體內(nèi)引起IgE(ImmunoglobulinE)抗體介導(dǎo)的速發(fā)型（I型） 超敏反應(yīng)，從而導(dǎo)致腸內(nèi)組胺過量釋放等過敏性損傷。食物過敏問題已引起了各國食品 安全監(jiān)督管理部門的重視，一些發(fā)達(dá)國家為保護(hù)食物過敏人群，專門立法規(guī)定食品包裝上 要標(biāo)注食物過敏原，我國在2012年實施的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》（GB 7718-2011)中也推薦食品包裝上標(biāo)注致敏物質(zhì)。因此，針對食品過敏原的檢測技術(shù)就顯得 意義重大，可為食品安全提供重要的技術(shù)依據(jù)。
[0004] 大豆及其制品被廣泛應(yīng)用于食品和飼料加工領(lǐng)域，但是當(dāng)其存在于嬰幼兒食品以 及幼齡動物飼料中，就很可能會誘發(fā)過敏反應(yīng)。免疫層析試紙檢測方法具有成本低、快速、 便攜且易操作等優(yōu)點，可以用于大批量樣品的定性與定量檢測，在準(zhǔn)確性、靈敏度和特異性 上也能夠滿足要求，該法分析過程簡單，用作0 -conglycinin的檢測有獨特優(yōu)勢，是需要 優(yōu)先發(fā)展的檢測技術(shù)。但目前仍沒有關(guān)于大豆致敏蛋白0-conglycinin免疫層析試紙檢 測方法的報道，所以該方法將會成為未來大豆過敏原檢測方法的一個發(fā)展方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種特異、靈敏、簡便、 安全、快速檢測0-conglycinin的免疫層析試紙及其制備方法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案： 一種快速檢測0 -conglycinin的膠體金免疫層析試紙，底層為支撐層，中間層為吸附 層，保護(hù)層固定在吸附層上，吸附層從測試端依次為樣品墊、結(jié)合墊、纖維素膜和吸水墊。在 纖維素膜設(shè)有用0-conglycinin兔源多克隆抗體溶液噴點的檢測線以及用羊抗小鼠IgG 抗體或兔抗小鼠IgG抗體溶液噴點的質(zhì)控線；所述結(jié)合墊吸附有膠體金納米顆粒標(biāo)記的 0-conglycinin鼠源單克隆抗體。
[0007] 所述支撐層用不吸水的韌性材料制成；樣品墊用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙 烯膜或聚酯膜制成；結(jié)合墊用玻璃纖維棉、聚酯膜、醋酸纖維或尼龍膜制成；纖維素膜用硝 酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成；吸水墊用吸水濾紙或濾油紙制成。纖維素膜 上的隱形檢測線和隱形質(zhì)控線為平行排列的"II"直線式，或為其他類似印記。
[0008] 快速檢測0 -conglycinin的膠體金免疫層析試紙的制備方法：包括用膠 體金納米顆粒標(biāo)記的0 -conglycinin鼠源單克隆抗體(金標(biāo)單抗）制備結(jié)合墊，用 0 -conglycinin兔源多克隆抗體溶液噴點隱形檢測線，用羊抗小鼠IgG抗體或兔抗小鼠 IgG抗體溶液噴點隱形質(zhì)控線，然后在支撐層上黏貼樣品墊、結(jié)合墊、纖維素膜和吸水墊。在 所述樣品墊、結(jié)合墊及吸水墊上覆蓋有保護(hù)膜，在樣品墊與結(jié)合墊交界處對應(yīng)的保護(hù)膜上 噴點有樣品標(biāo)記線，最后加上保護(hù)層。
[0009] 該試紙利用了雙抗體夾心檢測抗原的原理，當(dāng)試紙測試端插入待測樣品溶液后， 待測溶液通過虹吸作用帶動待測0 -conglycinin及結(jié)合墊中的金標(biāo)單抗一起向纖維素 膜擴(kuò)散，并最終滲入手柄端的吸水材料層。在擴(kuò)散過程中，待測P-conglycinin可先與 金標(biāo)單抗相結(jié)合，進(jìn)而與纖維素膜上噴點的兔源多克隆抗體檢測線結(jié)合，金標(biāo)抗體和兔 源多克隆抗體分別與樣品中被檢測的0 -conglycinin分子上的不同抗原決定簇結(jié)合， 0 -conglycinin被夾在金標(biāo)單抗和兔源多克隆抗體之間，形成金標(biāo)單抗-抗原-兔源多抗 復(fù)合物，即雙抗體夾心模式，顯示紅色檢測印記"I"；纖維素膜上噴點的羊或兔抗小鼠IgG 抗體質(zhì)控線也可與金標(biāo)抗體結(jié)合，形成紅色質(zhì)控印記"I"，即兩條紅色印記"II"表示為 陽性；反之樣品溶液中無0 -conglycinin時，貝lj不能與金標(biāo)抗體結(jié)合，同樣也不能與纖維 素膜上噴點的兔源多克隆抗體檢測線結(jié)合，不顯示紅色檢測印記，而纖維素膜上噴點的羊 或兔抗小鼠IgG抗體質(zhì)控線可與金標(biāo)抗體結(jié)合，顯示紅色質(zhì)控線印記" | "，形成一條紅色 印記"I"表示為陰性。無論結(jié)果為陽性還是陰性，都會顯示紅色質(zhì)控印記，若不顯示則表 示試紙失效。
[0010] 本發(fā)明的積極有益效果： (1)特異性強(qiáng)，靈敏度高。本發(fā)明試紙以雙抗體夾心原理為基礎(chǔ)制備而成，兩種抗體分 別為膠體金納米顆粒標(biāo)記的鼠源單克隆抗體和兔源多克隆抗體。金標(biāo)抗體中金顆粒與抗體 分子之間無共價鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金標(biāo)記對抗體的特 異性及親和力影響很小，且具有較高的標(biāo)記率。因此，該試紙具有較強(qiáng)的特異性和較高的靈 敏度，可檢測100ng/mL的微量0-conglycinin〇
[0011] (2)簡便、快速。使用本發(fā)明試紙，無需其他任何試劑和儀器，可現(xiàn)場操作。只需將 試紙插入被檢樣品液中，l〇min后即可判定檢測結(jié)果。
[0012] (3)結(jié)果顯示形象、直觀、準(zhǔn)確。本發(fā)明試紙以顯示紅色印記" | 和"I"（或類 似性狀)作為檢測的陽性和陰性標(biāo)記，即在纖維素膜上顯示兩條紅色印記"II"（檢測線和 質(zhì)控線)，表示被檢樣品中含有P-conglycinin;顯示一條紅色印記" | "（質(zhì)控線)，表示被 檢樣品中不含0 -conglycinin。此結(jié)果可用肉眼直接觀測，判定形象、直觀、準(zhǔn)確，簡單明 了，不易出現(xiàn)假陽性和假陰性等人為誤判。
[0013] (6)節(jié)省費用。適用于進(jìn)行現(xiàn)場檢測，費用低廉，節(jié)省大量貴重儀器及設(shè)備費用。
[0014] (7)適用范圍廣，便于推廣應(yīng)用。本發(fā)明實現(xiàn)了基于雙抗體夾心的原理在快速檢 測0 -conglycinin膠體金免疫層析試紙中的應(yīng)用，該試紙操作簡便，能滿足不同層次人員 的需要，包括海關(guān)檢疫、衛(wèi)生檢疫、質(zhì)量監(jiān)測、農(nóng)畜產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)和飼料加工企業(yè)等。本發(fā)明 在保障食品安全、保護(hù)對于大豆過敏的消費者健康以及保障畜禽飼料安全等方面具有極其 重要的意義，將具有明顯的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
[0015] (8)本發(fā)明制備的單克隆抗體的特異性較好，采用間接競爭ELISA測定與常見食 物致敏蛋白的交叉反應(yīng)率進(jìn)行鑒定，這幾種常見食物致敏蛋白競爭物包括大豆凝集素、大 豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子、花生凝集素、雞卵清蛋白以及酪蛋白，以0-conglycinin的 半數(shù)抑制濃度（IC5。）與各競爭物的IC5。的百分比作為交叉反應(yīng)率，單克隆抗體與其他食物 致敏蛋白競爭物之間基本沒有交叉反應(yīng)，結(jié)果表明其對于0 -conglycinin具有良好的特 異性；同時通過Westernblot試驗對單克隆抗體的特異性進(jìn)行鑒定，試驗證明，所篩選的 雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體特異性強(qiáng)，與其他致敏蛋白無交叉反應(yīng)，能夠用于膠體金納 米顆粒的標(biāo)記，并能夠噴點結(jié)合墊進(jìn)而對樣品中的0 -conglycinin進(jìn)行特異識別。
【附圖說明】
[0016] 圖1為大豆致敏蛋白0-conglycinin鼠源單克隆抗體的特異性鑒定結(jié)果圖。
[0017] 圖2為本發(fā)明的免疫層析試紙的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0018] 圖3為本發(fā)明的免疫層析試紙的俯視結(jié)構(gòu)示意圖。
[0019] 圖中，1為支撐層，2為樣品墊，3為結(jié)合墊，4為纖維素膜，5為吸水墊，6