人h-fabp膠體金檢測試紙及其制備方法
【專利摘要】一種人H-FABP膠體金檢測試紙的制備方法，包括膠體金顆粒的制備、金標(biāo)記抗體的制備、金標(biāo)結(jié)合物墊的制備、包被硝酸纖維素膜、樣品處理墊的制備及試紙的組裝等步驟，本發(fā)明主要通過對檢測試紙制備過程中的緩沖溶液體系進(jìn)行設(shè)計，解決了現(xiàn)有的檢測試紙存在的檢測時間長、特異性差以及經(jīng)濟(jì)成本高等問題。本發(fā)明還公開了一種人H-FABP膠體金檢測試紙及其應(yīng)用。
【專利說明】人H-FABP膠體金檢測試紙及其制備方法
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明涉及體外診斷醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，具體涉及一種人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(Heart-type Fatty Acid Binding Protein, H-FABP)膠體金檢測試紙及其制備方法。
【【背景技術(shù)】】
[0002]近年來心腦血管疾病特別是急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)成為了我國人群患病率極高，死亡率穩(wěn)居榜首的殺手。在治療的“黃金6h”內(nèi)使患者迅速進(jìn)入綠色治療通道，能夠大大降低致殘率和致死率。所以對于AMI準(zhǔn)確、快速的診斷具有重要的醫(yī)學(xué)意義。
[0003]H-FABP作為早期心肌診斷的一種小分子可溶性蛋白生化標(biāo)志物，它存在于心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)，含量豐富，當(dāng)心肌受損時，心肌細(xì)胞膜完整性被破壞，H-FABP可快進(jìn)入血液，在發(fā)病0-3h即可在血液中檢測到，3-6h達(dá)到峰值，12-24h恢復(fù)正常水平，其具有心肌特異性，在心肌中濃度約為骨骼肌的210倍，且正常人血液中含量極少(<5ng/ml)，所以H-FABP作為早期AMI的檢測指標(biāo)有其重要意義。[0004]目前H-FABP的檢測方法主要有放射免疫法、酶聯(lián)免疫法、光柵耦合傳感器技術(shù)、時間分辨免疫熒光測定法、快速乳膠微粒增強(qiáng)免疫比濁法、免疫傳感器技術(shù)等。雖然這些方法靈敏度高，特異性好，但是這些檢測方法需要特殊大型儀器，操作復(fù)雜、檢測時間較長，不利于社區(qū)基層醫(yī)院推廣利用。專利CN102298055A和CN102226811A公開了應(yīng)用免疫膠體金技術(shù)對H-FABP進(jìn)行檢測的相關(guān)技術(shù)，前者應(yīng)用金納米殼顆粒代替實心金顆粒作為標(biāo)記物，使檢測結(jié)果易于觀察，靈敏度< 7ng/ml，但是其制備工藝復(fù)雜，檢測時間長達(dá)15-30min。后者通過檢測尿液中的H-FABP，縮短了檢測時間，具有無創(chuàng)性、樣本無需處理的優(yōu)勢，但是其制備過程需用銀增強(qiáng)法，提高了經(jīng)濟(jì)成本。另一發(fā)面，H-FABP在尿液中出現(xiàn)時間晚于靜脈血，不利用患者快速進(jìn)入治療通道。因此，該等技術(shù)公開的膠體金檢測技術(shù)存在檢測時間長、診斷敏感度、特異性不好等問題。例如，梁曉芳等在其文章中指出，利用已上市H-FABP膠體金檢測產(chǎn)品診斷AMI的敏感度僅為86.27%，特異性為84.91% (梁曉芳，崔建國，李春堅等，心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白快速診斷試紙在急性心肌梗死患者中的應(yīng)用研究[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2009，29(8):1133-1137)。此外，用于心肌類產(chǎn)品研發(fā)的主要生物原料即抗體對一般均采用進(jìn)口抗體，經(jīng)濟(jì)成本較高，導(dǎo)致終端產(chǎn)品價位偏高，不利于POCT在社區(qū)基層醫(yī)院的推廣應(yīng)用。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0005]本發(fā)明解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種人H-FABP膠體金檢測試紙，該檢測試紙具有檢測時間短、特異性好，經(jīng)濟(jì)成本低等優(yōu)點。
[0006]本發(fā)明還提供一種所述人H-FABP膠體金檢測試紙的制備方法。
[0007]本發(fā)明又提供一種所述人H-FABP膠體金檢測試紙在檢測人血液中H-FABP的應(yīng)用。[0008]本發(fā)明再提供一種所述人H-FABP膠體金檢測試紙在檢測人尿液中H-FABP的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:1.一種人H-FABP膠體金檢測試紙的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0010](I)膠體金顆粒的制備
[0011]利用檸檬酸三鈉還原法，采用磁力加熱攪拌器燒制顆粒均一的直徑約為40nm的膠體金顆粒，分光光度計測其最高峰在530±5nm，OD值在2.0 ± 0.2 ;
[0012](2)金標(biāo)記抗體的制備
[0013]利用碳酸鉀將制備好的膠體金溶液調(diào)節(jié)PH至7.5±0.05，再用雙蒸水或PBS稀釋標(biāo)記抗體至濃度為lmg/ml，然后逐滴加入攪拌的膠體金溶液中，保持?jǐn)嚢?0-15min，加10% BSA至終濃度為0.2%，封閉裸露金顆粒，繼續(xù)攪拌20-30min，4°C，4000r/min離心30min，利用緩沖溶液4重懸洗滌，再離心，重復(fù)2次，濃縮備用；緩沖溶液4由磷酸緩沖液和吐溫-20組成，其中磷酸緩沖溶液摩爾濃度為lO-lOOmM，吐溫-20質(zhì)量終濃度為
0.05% -0.1% ；
[0014](3)金標(biāo)結(jié)合物墊的制備
[0015]利用緩沖溶液I處理金標(biāo)結(jié)合物墊，在室溫、濕度< 20%的條件下過夜干燥備用，并使用噴膜儀將金標(biāo)記的標(biāo)記抗體噴于處理好的金標(biāo)結(jié)合物墊上并真空冷凍干燥備用；緩沖溶液I由Tris-Hcl、蔗糖、BSA、檸檬酸三鈉和曲拉通-100組成，其中Tris-Hcl摩爾濃度為lO-lOOmM，蔗糖質(zhì)量終濃度為3% -10 %，BSA質(zhì)量終濃度為I % _3%，檸檬酸三鈉質(zhì)量終濃度為0.5% -1.0%，曲拉通-100質(zhì)量終濃度為0.1% -0.5% ;
[0016](4)包被硝酸纖維素膜
[0017]將捕捉抗體和羊抗鼠分別用緩沖溶液3稀釋，使用劃膜儀劃膜包被于硝酸纖維素膜檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，37°C干燥48小時備用；緩沖溶液3由Tris-Hcl和蔗糖組成，其中Tris-Hcl摩爾濃度為lO-lOOmM，蔗糖質(zhì)量終濃度為1% -5% ;
[0018](5)樣品處理墊的制備
[0019]利用緩沖溶液2浸泡玻璃纖維樣品墊，在室溫、濕度< 20%的條件下過夜干燥，切割備用；緩沖溶液2由Tris-Hcl、BSA、聚乙烯吡咯烷酮、S16和吐溫-20組成，其中Tris-Hcl摩爾濃度為10-100mM，BSA質(zhì)量終濃度為0.5%-5%，聚乙烯吡咯烷酮質(zhì)量終濃度為0.5% -5%，S16質(zhì)量終濃度為0.05% -1.0%，吐溫-20質(zhì)量終濃度為0.01% -0.5% ;
[0020](6)試紙的組裝
[0021]按樣品墊、金標(biāo)結(jié)合物墊、硝酸纖維素膜、吸水墊順序粘附于支撐底板上組裝試紙，并切割，包裝；
[0022]其中所述標(biāo)記抗體與捕捉抗體為二株可互相形成夾心配對的抗人H-FABP抗體。
[0023]進(jìn)一步地，所述的H-FABP為人血液中的H-FABP或人尿液中的H-FABP。
[0024]進(jìn)一步地，所述緩沖溶液4中磷酸緩沖溶液摩爾濃度為10mM，吐溫-20質(zhì)量終濃度為0.1 所述緩沖溶液I中TriS-Hcl摩爾濃度為10mM，蔗糖質(zhì)量終濃度為10%，BSA質(zhì)量終濃度為3%，檸檬酸三鈉質(zhì)量終濃度為0.5%,曲拉通-100質(zhì)量終濃度為0.5%;所述緩沖溶液3中Tris-Hcl摩爾濃度為10mM，蔗糖質(zhì)量終濃度為5% ;所述緩沖溶液2中Tris-Hcl摩爾濃度為lOOmM，BSA質(zhì)量終濃度為I %，聚乙烯吡咯烷酮質(zhì)量終濃度為1%，S16質(zhì)量終濃度為0.5%，吐溫-20質(zhì)量終濃度為0.05%。
[0025]進(jìn)一步地，所述支撐底板為PVC或PS板。
[0026]進(jìn)一步地，所述的金標(biāo)結(jié)合物墊為玻璃纖維或聚酯膜。
[0027]本發(fā)明還提供一種利用所述的制備方法制成的人H-FABP膠體金檢測試紙。
[0028]一種所述人H-FABP膠體金檢測試紙在檢測人血液中H-FABP的應(yīng)用。
[0029]一種所述人H-FABP膠體金檢測試紙在檢測人尿液中H-FABP的應(yīng)用。
[0030]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要有以下幾個方面:
[0031](I)本發(fā)明的試劑盒檢測速度快，可在IOmin左右判讀結(jié)果，縮短了樣本周轉(zhuǎn)時間。在緩沖溶液I中去掉通常所用聚乙二醇PEG-20000等大分子交聯(lián)穩(wěn)定劑，添加適量的檸檬酸三鈉鹽，使被標(biāo)記蛋白與膠體金易于形成穩(wěn)定狀態(tài)，同時使標(biāo)記復(fù)合物能夠迅速復(fù)溶釋放。這是因為:PEG等作為一種大分子物質(zhì)，一方面可以用來封閉未被目標(biāo)蛋白完全包被的裸露的金顆粒，另一方面可以穩(wěn)定膠體懸液的形成。但是由于其分子量較大，使金標(biāo)記復(fù)合物極易發(fā)生交聯(lián)作用，同時也使目標(biāo)蛋白與膠體金顆粒結(jié)合的空間位阻變大，影響膠體金標(biāo)記效果，使之成為導(dǎo)致金標(biāo)記復(fù)合物在層析過程中出現(xiàn)二次釋放或釋放速度較慢、釋放不均勻、死金等現(xiàn)象的重要原因之一，從而最終影響試劑靈敏度性能。本發(fā)明專利通過去掉緩沖溶液I中大分子物質(zhì)，添加適量的檸檬酸三鈉鹽，增加緩沖溶液I的離子濃度，可以改變膠體金顆粒的zeta電位,對zeta電位擴(kuò)散層起到擴(kuò)充作用。當(dāng)離子強(qiáng)度達(dá)到一定濃度范圍時，達(dá)到標(biāo)記最佳狀態(tài)，所以改善了標(biāo)記效果，促進(jìn)金標(biāo)復(fù)合物快速釋放，縮短檢測時間，但靈敏度沒有降低反而有所提高，達(dá)到6ng/ml。
[0032](2)本發(fā)明試劑盒特異性強(qiáng)。利用常規(guī)血源性和免疫類因子以及其他心肌類標(biāo)志物和8種不同型FABP等交叉干擾性物質(zhì)測試本發(fā)明試劑盒均未發(fā)現(xiàn)交叉干擾現(xiàn)象，同時測試65份血清標(biāo)本，只出現(xiàn)I例假陰性。這是因為有些樣品非常具有粘性(例如血清)，它會使流速減慢，當(dāng)檢測體系中沒有足夠的活性物質(zhì)來使金標(biāo)沿著檢測帶移動時，膠體金顆粒會粘附在包被抗體帶上對結(jié)果產(chǎn)生干擾，影響診斷的特異性。本發(fā)明專利通過對樣品墊處理液即緩沖溶液2中的表面活性劑種類和使用量等的優(yōu)化選擇，減少了檢測中交叉干擾現(xiàn)象，優(yōu)化了展層效果，提高了試劑的特異性性能指標(biāo)。
[0033](3)用于本發(fā)明的主要生物原材料即抗體對使用量大大減少，直接降低了產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)成本，增加了產(chǎn)品的市場競爭力。通過優(yōu)化整個體系緩沖溶液的PH、離子強(qiáng)度和表面活性劑種類及用量等關(guān)鍵方面，使抗原抗體之間的免疫反應(yīng)性達(dá)到最佳狀態(tài)，層析效果最好，減少了主要生物材料即抗體對的使用量，直接降低了經(jīng)濟(jì)成本。現(xiàn)有行業(yè)內(nèi)常規(guī)用于標(biāo)記的抗體標(biāo)記量都在IOug左右，用于包被的包被抗體的包被濃度在1.0mg/m左右，有的甚至達(dá)到2.0mg/ml、2.5mg/ml,而本發(fā)明專利中提供的試劑盒標(biāo)記量為5ug,包被濃度為
0.2-0.5mg/ml，這大大降低了產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)成本，增強(qiáng)了產(chǎn)品的市場競爭力。這是因為抗原抗體之間的免疫反應(yīng)具有特異性、比例性和可逆性的特點的原因。特異性是由抗原決定簇和抗體分子的超變區(qū)之間空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性確定的，所以選擇合適的PH值和離子強(qiáng)度對于維持抗原抗體空間結(jié)構(gòu)具有重要作用；比例性是只有當(dāng)二者濃度比例適當(dāng)時才出現(xiàn)可見反應(yīng)，在抗原抗體比例相當(dāng)或抗原稍過剩的情況下，反應(yīng)最徹底，形成的免疫復(fù)合物沉淀最多、最大。而當(dāng)抗原抗體比例超過此范圍時，反應(yīng)速度和沉淀物量都會迅速降低甚至不出現(xiàn)抗原抗體反應(yīng)；可逆性是由于抗原抗體反應(yīng)是分子表面的非共價鍵結(jié)合，所形成的復(fù)合物并不牢固，可以隨時解離，溶液環(huán)境對其結(jié)合會有很大影響。所以通過優(yōu)化各體系配方，就可以使抗原抗體的反應(yīng)性達(dá)到最大化，即可實現(xiàn)檢測要求，而不需要使用大量抗體，造成浪費，增加成本。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0034]圖1為本發(fā)明檢測試紙的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0035]圖2為本發(fā)明檢測試紙的另一結(jié)構(gòu)示意圖。
【【具體實施方式】】
[0036]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
[0037]本發(fā)明檢測試紙采用雙抗體免疫夾心法檢測H-FABP，將待測樣品滴加到樣品墊上，樣品向上層析到金標(biāo)結(jié)合物墊，金標(biāo)抗體復(fù)溶隨樣品一起層析至檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，如果待測樣品里有H-FABP，在檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)將各出現(xiàn)一條紫紅色的線；反之，則只在質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)紫紅色線；也可能出現(xiàn)質(zhì)控區(qū)不出線，則視為試紙條失效。
[0038]請一并結(jié)合圖1和圖2所示，本發(fā)明檢測試紙包括設(shè)定在PVC或者PS支撐底板(未視出)上依次相連的樣品墊1、金標(biāo)結(jié)合物墊2、硝酸纖維素膜3、吸水墊4 ;在所述硝酸纖維素膜3上設(shè)有檢測抗體區(qū)T和質(zhì)控抗體區(qū)C ;在金標(biāo)結(jié)合物墊2上設(shè)有金標(biāo)抗體，所述的金標(biāo)結(jié)合物墊2可以為玻璃纖維或聚酯膜，所述樣品墊3為玻璃纖維，所述的金標(biāo)抗體為標(biāo)記抗體，檢測區(qū)抗體為捕捉抗體，所述標(biāo)記抗體與捕捉抗體為二株可相互配對形成夾心的抗人H-FABP單克隆抗體。所述樣品墊I位于支撐底板一端，該樣品墊21的一端位于金標(biāo)結(jié)合物墊2上，與金標(biāo)結(jié)合物墊2交錯重疊2mm ;所述金標(biāo)結(jié)合物墊2位于硝酸纖維素膜3上，與所述硝酸纖維素膜3交錯重疊2mm ;吸水墊4則在支撐底板的另一端，位于所述硝酸纖維素3上，與所述硝酸纖維素3交錯重疊2-3mm。
[0039]按如下配方配制本發(fā)明檢測試紙制備涉及的緩沖體系溶液:
[0040]
緩沖溶液l:Tris-HdIOmM-WOmM(摩爾濃度)
蔗糖3%-10% (質(zhì)量濃度)
+血清白蛋白(BSA+)1%-3% (質(zhì)量濃度)
檸檬酸三鈉0.5%-1.0% (質(zhì)量濃度)
雨拉通-1000.1%-0.5% (質(zhì)量濃度)
緩沖溶液21 Tris-H clI OMm-100mM(摩爾濃度)
BSA0.5%-5% (質(zhì)量濃度)
聚乙烯飛咯烷曬0.5%-5% (質(zhì)量濃度)
S160.05-1.0% (質(zhì)量濃度)
吐溫-20 (T-20)0,01%-0.5% (質(zhì)量濃度)
[0041][0042]緩沖溶液3:Tris-H clIOmM-1OOmM(摩爾濃度)
[0043]蔗糖1^-5^(質(zhì)量濃度)
[0044]緩沖溶液4:磷酸緩沖液IOmM-1OOmM (摩爾濃度)
[0045]吐溫-200.05% -0.1% (質(zhì)量濃度)
[0046]實施例1:H-FABP膠體金檢測試紙的制備
[0047]在本實施例中，按如下配方配制本發(fā)明檢測試紙制備涉及的緩沖體系溶液:
[0048]
【權(quán)利要求】
1.一種人H-FABP膠體金檢測試紙的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)膠體金顆粒的制備 利用檸檬酸三鈉還原法，采用磁力加熱攪拌器燒制顆粒均一的直徑約為40nm的膠體金顆粒，分光光度計測其最高峰在530±5nm，OD值在2.0±0.2 ； (2)金標(biāo)記抗體的制備 利用碳酸鉀將制備好的膠體金溶液調(diào)節(jié)PH至7.5±0.05，再用雙蒸水或PBS稀釋標(biāo)記抗體至濃度為lmg/ml，然后逐滴加入攪拌的膠體金溶液中，保持?jǐn)嚢?0-15min，加10% BSA至終濃度為0.2%封閉裸露金顆粒，繼續(xù)攪拌20-30min，4°C，4000r/min離心30min，利用緩沖溶液4重懸洗滌，再離心，重復(fù)2次，濃縮備用；緩沖溶液4由磷酸緩沖液和吐溫-20組成，其中磷酸緩沖溶液摩爾濃度為lO-lOOmM，吐溫-20質(zhì)量終濃度為0.05% -0.1% ； (3)金標(biāo)結(jié)合物墊的制備 利用緩沖溶液I處理金標(biāo)結(jié)合物墊，在室溫、濕度< 20%的條件下過夜干燥備用，并使用噴膜儀將金標(biāo)記的標(biāo)記抗體噴于處理好的金標(biāo)結(jié)合物墊上并真空冷凍干燥備用；緩沖溶液I由Tris-Hcl、蔗糖、BSA、檸檬酸三鈉和曲拉通-100組成，其中Tris-Hcl摩爾濃度為10-100mM，蔗糖質(zhì)量終濃度為3% -10 %，BSA質(zhì)量終濃度為1% _3%，檸檬酸三鈉質(zhì)量終濃度為0.5% -1.0%，曲拉通-100質(zhì)量終濃度為0.1% -0.5% ; (4)包被硝酸纖維素膜 將捕捉抗體和羊抗鼠分別用緩沖溶液3稀釋，使用劃膜儀劃膜包被于硝酸纖維素膜檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，37°C干燥48小時備用；緩沖溶液3由Tris-Hcl和蔗糖組成，其中Tris-Hcl摩爾濃度為lO-lOOmM，蔗糖質(zhì)量終濃度為1% -5% ; (5)樣品處理墊的制備 利用緩沖溶液2浸泡玻璃纖維樣品墊，在室溫、濕度< 20%的條件下過夜干燥，切割備用；緩沖溶液2由Tris-Hcl、BSA、聚乙烯吡咯烷酮、S16和吐溫-20組成，其中Tris-Hcl摩爾濃度為lO-lOOmM，BSA質(zhì)量終濃度為0.5 % -5 %，聚乙烯吡咯烷酮質(zhì)量終濃度為.0.5% _5%，S16質(zhì)量終濃度為0.05% -1.0%，吐溫-20質(zhì)量終濃度為0.01% -0.5% ； (6)試紙的組裝 按樣品墊、金標(biāo)結(jié)合物墊、硝酸纖維素膜、吸水墊順序粘附于支撐底板上組裝試紙，并切割，包裝； 其中所述標(biāo)記抗體與捕捉抗體為二株可互相形成夾心配對的抗人H-FABP抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的人H-FABP膠體金檢測試紙的制備方法，其特征在于，所述的H-FABP為人血液中的H-FABP或人尿液中的H-FABP。
3.如權(quán)利要求1所述的人H-FABP膠體金檢測試紙的制備方法，其特征在于，所述緩沖溶液4中磷酸緩沖溶液摩爾濃度為10禮，吐溫-20質(zhì)量終濃度為0.1 所述緩沖溶液I中Tris-Hcl摩爾濃度為10禮，蔗糖質(zhì)量終濃度為10%，BSA質(zhì)量終濃度為3%，檸檬酸三鈉質(zhì)量終濃度為0.5%，曲拉通-100質(zhì)量終濃度為0.5% ;所述緩沖溶液3中Tris-Hcl摩爾濃度為10mM，蔗糖質(zhì)量終濃度為5% ;所述緩沖溶液2中Tris-Hcl摩爾濃度為lOOmM，BSA質(zhì)量終濃度為1%，聚乙烯吡咯烷酮質(zhì)量終濃度為I %，S16質(zhì)量終濃度為0.5%，吐溫-20質(zhì)量終濃度為0.05%。
4.如權(quán)利要求1所述的人H-FABP膠體金檢測試紙的制備方法，其特征在于，所述支撐底板為PVC或PS板。
5.如權(quán)利要求1所述的人H-FABP膠體金檢測試紙的制備方法，其特征在于，所述的金標(biāo)結(jié)合物墊為玻璃纖維或聚酯膜。
6.—種如權(quán)利要求1-5中任一項所述的制備方法制成的人H-FABP膠體金檢測試紙。
7.如權(quán)利要求6所述的人H-FABP膠體金檢測試紙，其特征在于，所述樣品墊位于支撐底板一端，該樣品墊的一端位于金標(biāo)結(jié)合物墊上，與金標(biāo)結(jié)合物墊交錯重疊2mm ;所述金標(biāo)結(jié)合物墊位于硝酸纖維素膜上，與所述硝酸纖維素膜交錯重疊2mm ;吸水墊則在支撐底板的另一端，位于所述硝酸纖維素上，與所述硝酸纖維素交錯重疊2-3mm。
8.一種如權(quán)利要求6所述的人H-FABP膠體金檢測試紙在檢測人血液中H-FABP的應(yīng)用。
9.一種如權(quán)利要求6所述的人H-FABP膠體金檢測試紙在檢測人尿液中H-FABP的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/544GK103901216SQ201410163289
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月22日
【發(fā)明者】黃芳芳, 金巍, 李基
申請人:上?？迫A生物工程股份有限公司