豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡及其制備方法和應(yīng)用。該試紙卡包括樣品吸收區(qū)、金標(biāo)探針區(qū)、固化抗體區(qū)、吸水區(qū)、底板和卡殼，樣品吸收區(qū)、金標(biāo)探針區(qū)、固化抗體區(qū)和吸水區(qū)依次粘貼于底板并相互重疊裝入卡殼內(nèi)。樣品吸收區(qū)包被有純化的豬繁殖與呼吸綜合征病毒；所述的金標(biāo)探針區(qū)包被有膠體金標(biāo)記的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體；固化抗體區(qū)依次有檢測線T包被有鼠抗豬IgM單克隆抗體，和對照線C包被有羊抗鼠IgG。本發(fā)明的試紙卡操作簡單、重復(fù)性好、靈敏度高，結(jié)果快速直觀、工藝簡單可大量制備，成本低廉，適合基層大批量現(xiàn)場檢測并可用于豬群PRRSV感染的早期診斷。
【專利說明】豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡及其制備方法和應(yīng)用
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一種檢測試紙卡及其制備方法，具體涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]豬繁殖與呼吸綜合征又稱藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的以高熱、成年豬繁殖障礙、仔豬呼吸障礙為特征的一種烈性傳染病，由于其具有高致病性和高死亡率，近年來病毒又不斷變異，嚴(yán)重危害著世界養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展。
[0004]本病的檢測方法較多，血清學(xué)檢測方法主要有ELISA和血清中和試驗(yàn)等，但這些方法存在操作復(fù)雜、需要專門儀器和人員、檢測時(shí)間長等缺點(diǎn)，而且，這些方法多檢測PRRSV抗原和IgG抗體，很少檢測IgM抗體，國外已有的檢測豬IgM抗體試劑盒不能檢測特定PRRSV的IgM抗體。
[0005]膠體金免疫層析方法是在免疫滲濾的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的快速檢測方法，該方法操作簡單、重復(fù)性好、靈敏度高，結(jié)果快速直觀、并可大量制備，工藝簡單、成本低廉，適合基層大批量現(xiàn)場檢測。豬繁殖與呼吸綜合征抗原和抗體的膠體金免疫層析檢測試紙已較多見，但仍沒有特異性檢測豬繁殖與呼吸綜合征IgM抗體的膠體金免疫層析檢測試紙。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的首要目的在于彌補(bǔ)現(xiàn)有檢測技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡。該檢測試紙卡將樣品吸收區(qū)純化的豬繁殖與呼吸綜合征病毒作為檢測抗原，特異性結(jié)合待檢血清中的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的IgM抗體，再結(jié)合膠體金標(biāo)記鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體，固化抗體區(qū)檢測線處包被的鼠抗豬IgM單克隆抗體進(jìn)行捕獲，利用夾心法進(jìn)行豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體的檢測。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供上述豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡的制備方法。
[0008]本發(fā)明的再一目的在于提供上述豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡在 豬群PRRSV早期感染診斷中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種豬繁殖與呼吸綜合征IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡，包括樣品吸收區(qū)、金標(biāo)探針區(qū)、固化抗體區(qū)、吸水區(qū)、底板和卡殼，樣品吸收區(qū)、金標(biāo)探針區(qū)、固化抗體區(qū)和吸水區(qū)依次粘貼于底板并相互重疊裝入卡殼內(nèi)；所述的樣品吸收區(qū)包被有純化的豬繁殖與呼吸綜合征病毒，其包被量優(yōu)選為10?50 μ g，所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒優(yōu)選為PRRSVNVDC-JXA1株；所述的金標(biāo)探針區(qū)包被有金標(biāo)探針,所述的金標(biāo)探針為膠體金標(biāo)記的鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體，其標(biāo)記量優(yōu)選為每毫升膠體金標(biāo)記I?30 μ g單抗，包被量優(yōu)選為10?50 μ L/cm ;固化抗體區(qū)依次有檢測線T和對照線C，檢測線T包被有鼠抗豬IgM單克隆抗體，包被量優(yōu)選為0.1?10 μ g/cm,對照線C包被有羊抗鼠IgG，包被量優(yōu)選為0.1?10 μ g/cm。
[0010]所述的樣品吸收區(qū)的材料為聚酯纖維膜；所述的金標(biāo)探針區(qū)的材料為玻璃纖維膜；所述的固化抗體區(qū)的材料為硝酸纖維素膜；所述的吸水區(qū)的材料為吸水濾紙；所述的底板的材料為聚乙烯板；所述的卡殼為帶可視窗和樣品孔的塑料卡殼。
[0011]上述豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡的制備方法，包括如下步驟:將純化的豬繁殖與呼吸綜合征病毒包被于聚酯纖維膜上；將膠體金標(biāo)記的鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體噴涂于玻璃纖維膜上；將鼠抗豬IgM單克隆抗體包被于硝酸纖維素膜檢測線T處，將羊抗小鼠IgG包被于硝酸纖維素膜對照線C處；將聚酯纖維膜、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜和吸水濾紙組裝到聚乙烯板上，裝入卡殼內(nèi)，得到豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡。
[0012]優(yōu)選的，所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡的制備方法，包括如下步驟:
(I)純化的PRRSV抗原的制備:將PRRSVNVDC-JXA1株于Marc-145細(xì)胞上擴(kuò)增培養(yǎng)，收獲的全毒經(jīng)凍融、超聲破碎，離心取上清；上清經(jīng)超濾濃縮，蔗糖梯度離心純化后-40°C保存，作為樣品吸收區(qū)包被用抗原。
[0013](2)膠體金標(biāo)記鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體:取半徑為20?40nm濃度為0.01%的膠體金20mL調(diào)pH值為8.2?9.5，加入鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體20?600 μ g，在攪拌條件下使其結(jié)合，加BSA作為穩(wěn)定劑，且使得BSA終濃度為0.1?10%，離心除去未結(jié)合的鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體和未穩(wěn)定的膠體金顆粒以及凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀用2mL 0.0lM pH值為7.4的PBS溶解，即為膠體金標(biāo)記鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體的復(fù)合物。
[0014](3)聚酯纖維膜的制備:將上述純化的PRRSV抗原10?50 μ g用0.0lM pH值為
7.4的PBS溶解后均勻包被于聚酯纖維膜上，烘干。
[0015](4)玻璃纖維膜的制備:將上述膠體金標(biāo)記鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體的復(fù)合物噴涂于玻璃纖維膜上，10?50 μ L/cm,凍干。
[0016](5)硝酸纖維素膜的制備:檢測線T包被鼠抗豬IgM單克隆抗體，包被量為0.1?10 μ g/cm,對照線C包被羊抗鼠IgG,包被量為0.1?10 μ g/cm。
[0017](6)試紙卡制備:將聚酯纖維膜、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜和吸水濾紙依次相互重疊組裝到聚乙烯板上，用切條機(jī)切成4mm寬試紙，裝入卡殼內(nèi)，即得到豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡。
[0018]上述豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡可用于豬群PRRSV早期感染診斷中，所述的早期感染包括疫苗接種或自然感染或其組合。其使用方法包括如下步驟:將待檢血清樣品3?4滴用ImL 0.0lM pH值為7.4的PBS稀釋后滴于樣品孔中4?5滴，10?15min判定結(jié)果，對照線C出現(xiàn)紅色表明試紙卡有效，對照線C和檢測線T均出現(xiàn)紅色，表明樣品IgM抗體為陽性，僅對照線C出現(xiàn)紅色，表明樣品IgM抗體為陰性。
[0019]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果:
(I)檢測準(zhǔn)確率和特異性高:本發(fā)明試紙卡與其他豬易感病原抗體沒有交叉反應(yīng)，檢測敏感性與ELISA相當(dāng)。
[0020](2)檢測快速:檢測時(shí)間只需10?15分鐘，滿足基層以及現(xiàn)場檢測的需要。
[0021](3)攜帶方便，操作簡便，結(jié)果直觀易辨:本發(fā)明不需要其它儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員，適合各級獸醫(yī)院、大小豬場及個(gè)人使用。
[0022](4)試紙卡在常溫下即可保存，保存期可達(dá)I年，且重復(fù)性良好。
[0023](5)本發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡采用膠體金標(biāo)記豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體作為探針，鼠抗豬IgM單克隆抗體包被硝酸纖維素膜，蔗糖梯度離心純化的PRRSVNVDC-JXA1株作為檢測抗原，夾心法特異性捕獲血清中PRRSV IgM抗體，建立了 PRRSV IgM抗體膠體金免疫層析檢測方法。除具有試紙卡檢測本身優(yōu)點(diǎn)外，又克服了抗原純化過程以及純度問題等導(dǎo)致的靈敏度低的缺點(diǎn)，顯著提高了檢測的特異性(特異性100%)和敏感性(靈敏度1:800)，可用于豬群PRRSV感染的早期快速診斷。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡的結(jié)構(gòu)示意圖；其中，I為吸水區(qū)，2為固化抗體區(qū),3為金標(biāo)探針區(qū),4為樣品吸收區(qū),5為底板,6為卡殼，7為檢測線T，8為對照線C。
[0025]圖2是試紙卡特異性試驗(yàn)結(jié)果圖；其中，從左至右為豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗免疫7日血清、豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染7日血清、豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體陰性血清、豬繁殖與呼吸綜合征疫苗免疫60天血清、豬偽狂犬病IgM抗體陽性血清、豬乙型腦炎IgM抗體陽性血清、豬瘟IgM抗體陽性血清、豬細(xì)小病毒IgM抗體陽性血清、豬圓環(huán)病毒病IgM抗體陽性血清。
[0026]圖3是試紙卡敏感性試驗(yàn)結(jié)果圖；其中，I?7:已知陽性樣品從1:50倍比稀釋至1:3200。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案做詳細(xì)描述和具體說明，但并不限制本發(fā)明實(shí)質(zhì)。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0028]實(shí)施例1
豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示，試紙卡內(nèi)試紙條水平面從左到右依次為吸水區(qū)1、固化抗體區(qū)2、金標(biāo)探針區(qū)3、樣品吸收區(qū)4，依次相互部分重疊組裝于底板5上切成4mm寬試紙條后裝入卡殼6內(nèi)即為豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡；吸水區(qū)1、固化抗體區(qū)2、金標(biāo)探針區(qū)
3、樣品吸收區(qū)4、底板5的材料分別為吸水濾紙、硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜、聚酯纖維膜和聚乙烯板，卡殼6為帶可視窗和樣品孔的塑料卡殼。固化抗體區(qū)2檢測線T 7處包被有鼠抗豬IgM單克隆抗體，包被量為3 μ g/cm,對照線C 8處包被有羊抗鼠IgG，包被量為5 μ g/cm ο金標(biāo)探針區(qū)3包被有膠體金標(biāo)記的鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體,標(biāo)記量為10 μ g單抗/mL膠體金,包被量為25 μ L金標(biāo)探針/cm ;樣品吸收區(qū)4包被有鹿糖梯度離心純化的PRRSVNVDC-JXA1株抗原，包被量為50 μ g。
[0029]上述豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡的制備方法如下:
(I)純化的PRRSV抗原的制備:將PRRSVNVDC-JXA1株于Marc-145細(xì)胞上擴(kuò)增培養(yǎng)，收獲的全毒經(jīng)凍融、超聲破碎，離心取上清；上清經(jīng)超濾濃縮，蔗糖梯度離心純化后-40°C保存，作為樣品吸收區(qū)包被用抗原。
[0030](2)膠體金標(biāo)記鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體的方法:取半徑為25nmpH值為9.0濃度為0.01%的膠體金25mL，加入鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體250 μ g，在攪拌條件下使其結(jié)合，加BSA至終濃度為10%，離心除去未結(jié)合的鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體和未穩(wěn)定的膠體金顆粒以及凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀用2mL 0.0lM pH值為7.4的PBS溶解，即為膠體金標(biāo)記鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體的復(fù)合物。
[0031](3)聚酯纖維膜的制備:將上述純化的PRRSV抗原50 μ g用0.0lM pH值為7.4的PBS溶解后均勻包被于聚酯纖維膜上，烘干。
[0032](4)玻璃纖維膜的制備:將上述膠體金標(biāo)記鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體的復(fù)合物按25 μ L金標(biāo)探針/cm噴涂于玻璃纖維膜上，凍干。
[0033](5)硝酸纖維素膜的制備:檢測線T包被鼠抗豬IgM單克隆抗體，包被量為3 μ g/cm,對照線C包被羊抗鼠IgG,包被量為5 μ g/cm。
[0034](6)試紙卡制備:將聚酯纖維膜、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜和吸水濾紙組裝到聚乙烯板上，用切條機(jī)切成4mm寬試紙條，裝入卡殼內(nèi)，即得到豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡。
[0035]實(shí)施例2
除檢測線T 7包被抗豬IgM單克隆抗體的量為5 μ g/cm ;對照線C 8包被羊抗小鼠IgG的量為6 μ g/cm ;金標(biāo)探針區(qū)3包被的膠體金標(biāo)記的鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體的標(biāo)記量為8 μ g/mL,包被量為20 μ L金標(biāo)探針/cm,膠體金標(biāo)記鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體的方法:取半徑為40nm pH值為8.2濃度為0.01%的膠體金20mL，加入鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體160 μ g，在攪拌條件下使其結(jié)合，加BSA至終濃度為8%，離心除去未結(jié)合的鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體和未穩(wěn)定的膠體金顆粒以及凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀用2mL 0.0lM pH值為7.4的PBS溶解，即為膠體金標(biāo)記鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體的復(fù)合物外，其余與實(shí)施例1相同。
[0036]實(shí)施例3
上述豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡的使用方法:
將待檢血清樣品3?4滴用0.0lM pH值為7.4的PBS ImL稀釋后滴于樣品孔中4?5滴，10?15min判定結(jié)果，對照線C出現(xiàn)紅色表明試紙卡有效，對照線C和檢測線T均出現(xiàn)紅色，表明樣品IgM抗體為陽性，僅對照線C出現(xiàn)紅色，表明樣品IgM抗體為陰性。
[0037]實(shí)施例4本發(fā)明豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡的特異性和敏感性測試:
應(yīng)用實(shí)施例1和2制備的兩種豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡分別檢測已知的豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗免疫7日血清和豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染7日血清各一份，豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體陰性血清一份，豬繁殖與呼吸綜合征疫苗免疫60天血清一份，豬偽狂犬病IgM抗體陽性血清、豬乙型腦炎IgM抗體陽性血清、豬瘟IgM抗體陽性血清、豬細(xì)小病毒IgM抗體陽性血清、豬圓環(huán)病毒病IgM抗體陽性血清各一份。將待檢血清樣品3~4滴用ImL 0.01M pH值為7.4的PBS稀釋后滴于樣品孔中4~5滴，10~15min判定結(jié)果。結(jié)果表明(見圖2和表1):豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗免疫7日血清和豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染7日血清檢測結(jié)果為陽性，其它血清檢測結(jié)果為陰性，特異性良好；說明本發(fā)明試紙卡可用于包括豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗接種或自然感染或其組合早期感染的診斷。
[0038]表1本發(fā)明特異性檢測結(jié)果
樣品號I樣品名稱I檢測結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡，其特征在于:包括樣品吸收區(qū)、金標(biāo)探針區(qū)、固化抗體區(qū)、吸水區(qū)、底板和卡殼；樣品吸收區(qū)、金標(biāo)探針區(qū)、固化抗體區(qū)和吸水區(qū)依次粘貼于底板并相互重疊裝入卡殼內(nèi)；所述的樣品吸收區(qū)包被有純化的豬繁殖與呼吸綜合征病毒；所述的金標(biāo)探針區(qū)包被有金標(biāo)探針，所述的金標(biāo)探針為膠體金標(biāo)記的鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體；所述的固化抗體區(qū)依次有檢測線T和對照線C，所述的檢測線T包被有鼠抗豬IgM單克隆抗體，所述的對照線C包被有羊抗鼠IgG0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡，其特征在于:所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒為PRRSVNVDC-JXA1株，其包被量為10~50 μ g0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡，其特征在于:所述的金標(biāo)探針的標(biāo)記量為I~30 μ g/mL,包被量為10~50 μ L/cm ；所述的鼠抗豬IgM單克隆抗體的包被量為0.1~10 μ g/cm ;所述的羊抗鼠IgG的包被量為0.1 ~10 μ g/cm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡，其特征在于 :所述的樣品吸收區(qū)的材料為聚酯纖維膜；所述的金標(biāo)探針區(qū)的材料為玻璃纖維膜；所述的固化抗體區(qū)的材料為硝酸纖維素膜；所述的吸水區(qū)的材料為吸水濾紙；所述的底板的材料為聚乙烯板；所述的卡殼為帶可視窗和樣品孔的塑料卡殼。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡的制備方法，其特征在于包括如下步驟:將純化的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原包被于聚酯纖維膜上；將膠體金標(biāo)記的鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體噴涂于玻璃纖維膜上；在硝酸纖維素膜檢測線T處包被鼠抗豬IgM單克隆抗體、對照線C處包被羊抗鼠IgG;將包被有純化的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原的聚酯纖維膜、包被有膠體金標(biāo)記的鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體的玻璃纖維膜、包被有檢測線T和對照線C的硝酸纖維素膜和吸水濾紙依次組裝聚乙烯板上，裝入卡殼內(nèi)，得到豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)純化的PRRSV抗原的制備:將PRRSVNVDC-JXA1株于Marc-145細(xì)胞上擴(kuò)增培養(yǎng)，收獲的全毒經(jīng)凍融、超聲破碎，離心取上清；上清經(jīng)超濾濃縮，蔗糖梯度離心純化后-40°C保存，作為樣品吸收區(qū)包被用抗原； (2)膠體金標(biāo)記鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體的方法:分別取半徑為20~40nm的膠體金20mL調(diào)pH值為8.2~9.5，加入鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體20~600 μ g，在攪拌條件下使其結(jié)合，加BSA作為穩(wěn)定劑，且使得BSA終濃度為0.1~10%，離心除去未結(jié)合的鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體和未穩(wěn)定的膠體金顆粒以及凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀用2mL 0.01M pH值為7.4的PBS溶解，即為膠體金標(biāo)記鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體的復(fù)合物； (3)聚酯纖維膜的制備:將上述純化的PRRSV抗原10~50μ g用0.01M pH值為7.4的PBS溶解后均勻包被于聚酯纖維膜上，烘干；(4)玻璃纖維膜的制備:將上述膠體金標(biāo)記鼠抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體的復(fù)合物噴涂于玻璃纖維膜上，10~50 μ L/cm,凍干； (5)硝酸纖維素膜的制備:檢測線T包被鼠抗豬IgM單克隆抗體，包被量為0.1~.10 μ g/cm,對照線C包被羊抗鼠IgG,包被量為0.1~10 μ g/cm ; (6)試紙卡制備:將聚酯纖維膜、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜和吸水濾紙依次相互重疊組裝到聚乙烯板上，用切條機(jī)切成4mm寬試紙，裝入卡殼內(nèi)，即得到豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡。
7.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡在豬群PRRSV早期感染診斷中的應(yīng)用，其特征在于:所述的早期感染包括疫苗接種或自然感染或其組合。
8.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒IgM抗體膠體金免疫層析檢測試紙卡的使用方法，其特征在于包括如下步驟:將待檢血清樣品3~4滴用ImL.0.01M pH值為7.4的PBS稀釋后滴于樣品孔中4~5滴，10~15min判定結(jié)果，對照線C出現(xiàn)紅色表明試紙卡有效，對照線C和檢測線T均出現(xiàn)紅色，表明樣品IgM抗體為陽性，僅對照線C出現(xiàn)紅色，表明樣品IgM抗體為陰性。
【文檔編號】G01N33/577GK103969440SQ201410227399
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月27日
【發(fā)明者】牟林琳, 劉潔, 李建, 漆世華, 朱薇, 溫文生, 謝紅玲, 馮釗 申請人:武漢中博生物股份有限公司