改良凝膠電泳檢測血清前β1高密度脂蛋白的方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地說，是改良凝膠電泳檢測血清前β 1高密度脂 蛋白的方法和應用。
【背景技術】
[0002] 血清前β 1高密度脂蛋白（prei3 1-HDL)是一種新生的HDL，在膽固醇逆轉運過 程中發(fā)揮著重要功能，具有抗動脈粥樣硬化的作用。但是令人費解的是，臨床資料顯示 prei3 I-HDL在冠心病患者中的含量顯著升高，而不是負相關的關系。問題的關鍵在于方法 學存在缺陷，以往應用的梯度凝膠電泳（GGE)是以線性濃度梯度為基礎，結果不能區(qū)分游 離的載脂蛋白Apo A1，因此不能準確檢測pre β 1-HDL。
[0003] 以往線性GGE應用于二維凝膠電泳，聯(lián)合免疫印跡技術檢測pre β 1-HDL。美國波 士頓Tufts大學的Asztalos建立的方法發(fā)表于1993年，后來廣為所用。經Boston Heart Diagnostics公司開發(fā)用于Boston Heart HDL Map')的核心技術。20余年來該項技術的應 用帶來經濟效益，同時影響本領域學術界對pre β I-HDL的認識，以致成為本行業(yè)內公認的 經典。然而，2014年Miyazaki報道兩維電泳技術檢測的pre β I-HDL實質是一種游離的Apo Al單體。顯而易見，因為無法區(qū)分游離的Apo Α1，該項技術存在致命缺陷，長期以來對于 pre β I-HDL的認識一直存在概念上的混淆，導致錯誤地認為具有保護作用的pre β I-HDL 的含量在冠心病患者中反而顯著升高。另外，線性梯度的凝膠（如2%-36%)在制備中 需要特殊的混合裝置，穩(wěn)定性也不如非線性梯度的設置。實施電泳時間往往要24h。定量 方法應用 1251，需要嚴格的放射性實驗條件。由此可見，工序復雜，操作耗時，且無法避免放 射性問題，成為該法難以克服的缺點。參考：http://www. bostonheartdiagnostics. com/ science-portfolio-map-test. php〇

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對現有技術中的不足，提供非線性梯度凝膠和/或蘇丹黑B染 色液在精準分離和定量分析血清prei3 I-HDL中的應用。
[0005] 本發(fā)明的第二個目的是，提供一種精準分離和定量分析血清pre β I-HDL的方法。
[0006] 為實現上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是：非線性梯度凝膠和/或蘇丹黑B染色 液在精準分離和定量分析血清pre β I-HDL中的應用，所述的非線性梯度凝膠是由三段濃 度依次為3. 0%、3. 6%和7.0%的聚丙烯酰胺凝膠共同組成，所述的蘇丹黑B染色液中蘇丹 黑B的濃度為0. 5-1. Ow/ν%，溶劑異丙醇和乙二醇的體積比為4:1。
[0007] 所述的非線性梯度凝膠分別作為一維非線性梯度管狀凝膠體系和二維非線性梯 度平板凝膠體系分離血清pre β I-HDL的電泳介質，所述的一維非線性梯度管狀凝膠體系 分離蘇丹黑B預染色的血清pre β 1-HDL。
[0008] 為實現上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是：一種精準分離和定量分析血 清pre β I-HDL的方法，采用非線性梯度凝膠精準分離和定量分析血清pre β 1-HDL，其中非 線性梯度凝膠是由三段濃度依次為3. 0%、3. 6%和7. 0%的聚丙烯酰胺凝膠共同組成。
[0009] 所述的非線性梯度凝膠分別作為一維非線性梯度管狀凝膠體系和二維非線性梯 度平板凝膠體系分離血清pre β I-HDL的電泳介質。
[0010] 采用一維非線性梯度管狀凝膠體系分離蘇丹黑B預染色的血清pre β 1-HDL，所述 的蘇丹黑B染色液中蘇丹黑B的濃度為0. 5-1. Ow/v %，溶劑異丙醇和乙二醇的體積比為 4:1〇
[0011] 所述的三段濃度依次為3. 0%、3. 6%和7. 0 %的聚丙烯酰胺凝膠作為分離膠，對 應的膠層高度分別為7mm、40mm和45mm，誤差范圍為± 3mm，三層分離膠的總高度為82mm，誤 差范圍± 5mm。
[0012] 所述的非線性梯度凝膠在一維管狀凝膠體系中的規(guī)格為內徑6_8mm，外徑 8-10mm，非線性梯度凝膠在二維平板凝膠體系中的規(guī)格為厚度為2-3mm，寬度為60-80mm。
[0013] 所述的一維非線性梯度管狀凝膠體系分離蘇丹黑B預染色的血清pre β 1-HDL，電 泳緩沖液為5mM Tris和38. 4mM甘氨酸，電泳條件為100V，2. 5h，電泳后將迀移距離原點 65-75mm處孤立的染色區(qū)帶定義為preP I-HDL ;所述的二維非線性梯度平板凝膠體系分離 血清pre β 1-HDL，電泳緩沖液為5mM Tris和38. 4mM甘氨酸，電泳條件為100V，3. 5h，電泳 后將pre β泳道上迀移距離原點65_75mm處印跡區(qū)帶定義為pre β I-HDL和游離的Apo Al 多聚體，迀移距離原點80-90mm處印跡區(qū)帶定義為游離的Apo Al單體。
[0014] 所述的二維非線性梯度平板凝膠體系分離血清pre β 1-HDL，電泳前在加樣區(qū)加入 少量酚紅溶液作為電泳指示劑。
[0015] 所述的一維非線性梯度管狀凝膠體系分離蘇丹黑B預染色的血清pre β 1-HDL，采 用光密度掃描定量，以空白凝膠掃描值為統(tǒng)一參比，計算出prei3 I-HDL占血脂總體的百分 含量；二維非線性梯度平板凝膠體系分離血清pre β 1-HDL、游離的Apo Al單體和多聚體， 采用免疫印跡、化學發(fā)光和膠片成像技術進行定性，在同一批內比較其相對含量。
[0016] 本發(fā)明優(yōu)點在于：
[0017] 1、本發(fā)明建立了一維非線性GGE的方法，采用三段濃度分別為3. O %、3. 6 %和 7. 0%的聚丙烯酰胺凝膠作為電泳介質，清晰地將蘇丹黑B染色的血清分離出一種特殊的 HDL 亞類，即 pre β 1-HDL ;
[0018] 2、本發(fā)明還建立了二維非線性GGE的方法，能夠非常清晰地將pre β I-HDL和游離 的Apo Al分離開；
[0019] 3、本發(fā)明的非線性濃度梯度獨立分層的制備過程簡單易行，不需要特殊混合裝 置；實施電泳僅需< 3. 5h ;定量方法無需放射性物質。本發(fā)明建立的非線性GGE能夠精準 檢測pre β 1-HDL，在性能上具有明顯的優(yōu)越性，并且是目前唯一可行的方法。
【附圖說明】
[0020] 圖1. 一維非線性GGE-親脂性SBB染色圖譜。Α: -維非線性梯度管狀凝膠的示意 圖。Β:重復性實驗結果。pre β I-HDL的電泳迀移距離原點70mm，呈現清晰的SBB染色區(qū) 帶。相同血樣檢測prei3 I-HDL的變異系數是2. 31%，說明該法有很好的重復性。C:臨床 血樣一維非線性GGE-親脂性SBB染色圖譜。pre β I-HDL在新生兒臍帶血中含量豐富，而在 急性心?；颊吆虲ETP變異者中的含量低于健康成人。D:電泳掃描圖譜。
[0021] 圖2.二維非線性GGE-免疫印跡圖譜。A:二維非線性梯度平板凝膠的制備示意 圖。B:二維電泳后血清中含有Apo Al顆粒的免疫印跡圖譜。在preP泳道上電泳迀移大 約70mm的區(qū)帶為pre β I-HDL (包含Apo Al多聚體），電泳迀移大約85mm的區(qū)帶為游離的 Apo Al單體，清晰可見孤立的印跡區(qū)帶。新生兒血樣的圖譜表現較成人復雜。C:二維非線 性GGE-免疫印跡示意圖。箭頭表示一向（ID)和二向（2D)的電泳方向。
[0022] 圖3. pre β I-HDL的實驗論證：顆粒密度和體外衍變。A:超速離心分離血清HDL。 Β:從超速離心后不同密度范圍取樣，經SBB染色后進行一維非線性GGE。pref3 I-HDL出現 在I. 210g/ml的密度液中，電泳迀移70mm。C:二維非線性GGE-免疫印跡圖譜，preP I-HDL 同樣出現在1.210g/ml的密度液中，迀移位置同樣在70mm處。D:DTNB體外抑制實驗。正常 血清體外37°C水浴6h后，pre β I-HDL的含量逐漸減少，這種顆粒的衍變能夠被DTNB完全 抑制。因為DTNB是卵磷脂膽固醇酰基轉移酶的抑制劑，能夠有效抑制新生的pre β I-HDL 向大顆粒HDL衍變，所以結果進一步說明，這種電泳迀移70mm且能夠被親脂性SBB染色的 孤立電泳區(qū)帶實質上是pre β 1-HDL。
[0023] 圖4. pre β I-HDL的實驗論證：顆粒大小和化學構成。Α:血清HDL的電子顯微 圖譜。箭頭所指為prei3 1-HDL。B:血清HDL的Apo Al和膽固醇的相對重量比，其中在 pre β I-HDL的比值最高。
[0024] 圖5. pre β I-HDL的實驗論證：臨床病例對照圖譜。Α-Β:急性心?；颊吆徒】祵?照血清的典型二維非線性GGE-免疫印跡圖譜。急性心?；颊遬re β I-HDL的含量較健康對 照明顯減少。因為prei3 I-HDL具有抗動脈粥樣硬化保護作用，所以這樣的結果順理成章。 C = Tangier病患者和健康對照血清的一維非線性GGE-親脂性