一種基于聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測低效率基因組編輯的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明具體涉及一種基于聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測低效率基因組編輯的方法及 其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因組定點編輯技術(shù)無論是在生物學(xué)基礎(chǔ)研宄，還是諸如基因治療、生物反應(yīng)器 等生物相關(guān)產(chǎn)業(yè)中都具有巨大的應(yīng)用前景。近年來，隨著大量物種基因組測序工作的完成， 以及人工核酸內(nèi)切酶（Engineered endonuclease，EEN)的出現(xiàn)，基因組編輯技術(shù)飛速發(fā)展， 逐漸成為科研工作者選擇性編輯基因組和研宄基因功能的必備工具。
[0003] 鋅指核酸內(nèi)切酶（zinc finger endonuclease，ZFN)是第一代人工核酸內(nèi)切酶， ZFN是將鋅指蛋白與核酸內(nèi)切酶Fok I融合形成的核酸內(nèi)切酶。到目前為止，ZFN已相 對比較成熟并成功應(yīng)用于大鼠、小鼠、豬、牛等動物。但是，要設(shè)計并構(gòu)建出一個切割活性 高、特異性好的ZFNs工作量很大，而且很多基因序列中可能難以找到合適的ZFN靶點，其 技術(shù)專利被少數(shù)幾家商業(yè)公司控制，使用成本很高，效率相對較低，這些因素大大限制了 ZFNs的推廣。隨之，第二代人工核酸酶--類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease, TALENs)出現(xiàn)，由于 TALEN 與 ZFN 相比構(gòu)建相對 較為簡單，編輯效率高，成本低，特異性更高而受到科研工作者的青睞，并迅速應(yīng)用于小 鼠、斑馬魚、豬和牛等動物。2013年，一種全新的人工核酸內(nèi)切酶，即第三代人工核酸內(nèi) 切酶一(clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) / CRISPR-associated (Cas) 9, CRISPR/Cas9)出現(xiàn)，與前兩代人工核酸內(nèi)切酶相比，CRISPR/ Cas9制作更為簡單，成本更低，作用效率更高。
[0004] 上述三種人工核酸內(nèi)切酶各有優(yōu)缺點，但是其作用機(jī)制基本一致，即通過特異識 別目的DNA序列，對靶標(biāo)位置的DNA鏈進(jìn)行精確切割，從而形成雙鏈斷裂（double-strand breaks, DSB)，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)源性的修復(fù)機(jī)制，通過非同源末端連接修復(fù)（non-homologous end joining, NHEJ)或者同源重組修復(fù)（homologous recombination, HR)對切 口進(jìn)行修復(fù)。 在修復(fù)過程中，有可能出現(xiàn)片段的刪除或者插入、堿基替換、點突變等定點修飾，所以修復(fù) 的結(jié)果可能呈多態(tài)性。
[0005] 人工核酸內(nèi)切酶的種類、設(shè)計、轉(zhuǎn)染方式、載體形式以及其他實驗條件均會對其工 作效率產(chǎn)生很大影響。目前，人工核酸內(nèi)切酶編輯效率的檢測主要有以下幾種方法：（1)限 制性內(nèi)切酶酶切檢測法，即如果在靶位點之間的Spacer存在某個限制性內(nèi)切酶的酶切位 點，那么該位點在被人工核酸內(nèi)切酶切割修復(fù)后就會遭到破壞，而無法被原有的限制性內(nèi) 切酶切開。這種方法的優(yōu)點是廉價、簡單、快捷，但其缺點也顯而易見，即如果Spacer處沒 有合適的限制性內(nèi)切酶位點，該方法將無法使用。另外，如果人工核酸酶發(fā)揮了作用，但是 突變位點不在限制性內(nèi)切酶所識別的序列，該方法也無法檢測，從而造成檢測到的突變率 比實際值偏低。（2)將包括靶位點的片段PCR擴(kuò)增后TA克隆測序，根據(jù)測序結(jié)果計算編輯 效率和類型，該方法不受序列的限制，但是人工核酸酶的效率很低時，要準(zhǔn)確評價其活性并 篩選陽性單克隆細(xì)胞需要進(jìn)行大量的克隆、測序工作，工作量太大、成本太高。（3)基于可識 別錯配雙鏈的錯配內(nèi)切酶（主要采用Cel I內(nèi)切酶和T7E1兩種酶）檢測法，即在靶位點兩 側(cè)設(shè)計引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物回收純化后先高溫變性，再緩慢降溫復(fù)性，然后用Cel I或 者T7E1酶消化，如果靶位點處由于序列插入或者刪除而形成泡狀結(jié)構(gòu)即可被Cel I或者 ?7Ε1識別切割，該方法操作相對比較簡單，但是Cel I和T7E1酶均比較昂貴，如進(jìn)行大規(guī) 模檢測成本較高，另外該方法酶切后一般用瓊脂糖凝膠電泳檢測，靈敏度不高，如果人工核 酸酶的效率很低的時候，使用該方法無法檢測。除上述方法之外，還有體內(nèi)或者體外引入報 告基因法以及體外的SSA(single strand annealing)分析法等。
[0006] 在使用人工核酸內(nèi)切酶進(jìn)行基因組編輯過程中，篩選靶基因被正確編輯的單克隆 細(xì)胞是一項龐大的工作，尤其是在人工核酸內(nèi)切酶效率很低的時候，就更加困難。像ZFN這 樣的低效率人工核酸內(nèi)切酶，盡管Sigma公司描述其編輯效率可以達(dá)到1-20%，但是很多 實驗室在實際應(yīng)用過程中所獲得的數(shù)據(jù)卻遠(yuǎn)低于這一標(biāo)準(zhǔn)，例如劉杰等（2014)使用ZFN敲 除豬卵母細(xì)胞孤雌胚胎中MSTN基因，打靶效率為0.54%;任廣彩等（2014)利用ZFN對轉(zhuǎn)基 因豬成纖維細(xì)胞中的增強(qiáng)型綠色焚光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP) 基因進(jìn)行敲除，敲除效率最低為0.97%，最高的一組也僅為1.76% ;Watanabe等（2013)用 ZFN敲除豬胎兒成纖維細(xì)胞IL2RG基因的研宄中，打靶效率也只有0. 5%。即使TALEN或者 CRISPR/Cas9這類高效率的人工核酸內(nèi)切酶，也會由于靶基因序列的特殊性而出現(xiàn)效率很 低的情況，例如吳金青等（2015)利用CRISPR/Cas9對豬IGF2基因進(jìn)行敲除，由于該基因結(jié) 構(gòu)復(fù)雜、GC含量和甲基化程度高，編輯效率始終無法提高，最高也僅為9. 2%。在如此低的 編輯效率下，上述第一種和第三種方法由于靈敏度低而無法檢測，若采用上述第二種方法 需要進(jìn)行大量的克隆、測序才有可能篩到正確的單克隆細(xì)胞，工作量太大，實驗成本也將非 常尚。
[0007] 在人工核酸內(nèi)切酶技術(shù)快速發(fā)展，基因定點修飾技術(shù)已逐漸成為分子生物學(xué)實驗 室必備的實驗技術(shù)的形勢下，最大限度地提高人工核酸內(nèi)切酶編輯效率檢測技術(shù)的靈敏 度，并以此指導(dǎo)后續(xù)的單克隆篩選工作，提高實驗效率，降低實驗成本就顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是如何快速、簡單的檢測低效率基因編輯。
[0009] 為解決上述問題，本發(fā)明首先提供了一種基因編輯后的DNA產(chǎn)物的檢測方法。
[0010] 本發(fā)明提供的基因編輯后DNA的檢測方法包括如下步驟：
[0011] 1)將待測基因編輯后DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并將所述PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物變性、復(fù)性，得到雜交產(chǎn)物；
[0012] 所述待測基因編輯后DNA為將野生型DNA用人工核酸內(nèi)切酶編輯，得到由突變DNA 和未突變野生型DNA組成的待測基因編輯后DNA ;
[0013] 2)用聚丙烯酰胺凝膠電泳所述雜交產(chǎn)物，檢測電泳結(jié)果，根據(jù)分子量大小及構(gòu)象 差異，確定所述待測基因編輯后DNA中突變DNA和未突變野生型DNA，實現(xiàn)基因編輯后DNA 的檢測。
[0014] 上述方法中，所述待測基因編輯后DNA中，所述未突變野生型DNA的質(zhì)量百分含量 大于所述突變DNA的質(zhì)量百分含量。
[0015] 上述方法中，所述突變DNA為將野生型DNA缺失或突變多個寡核苷酸，其余寡核苷 酸不變得到的DNA。
[0016] 上述方法中，所述突變DNA的質(zhì)量百分含量是指【突變DNAA野生型DNA (或者突 變DNA和未突變的野生型DNA))】*100%。
[0017] 上述方法中，所述突變DNA的質(zhì)量百分含量具體為0. 1% -0. 45%。
[0018] 上述方法中，所述雜交產(chǎn)物中已經(jīng)被編輯后發(fā)生突變的DNA會產(chǎn)生泡狀結(jié)構(gòu)，未 被編輯的DNA則不產(chǎn)生泡狀結(jié)構(gòu)。
[0019] 上述方法中，所述人工核酸內(nèi)切酶為鋅指核酸內(nèi)切酶、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核 酸酶或 CRISPR/Cas9。
[0020] 上述方法中，所述人工核酸內(nèi)切酶為鋅指核酸內(nèi)切酶。
[0021] 上述方法中，所述野生型DNA為MSTN基因。
[0022] 上述方法中，將所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性、復(fù)性的方法為現(xiàn)有技術(shù)，具體可根據(jù)文 獻(xiàn)"Sanjana N E, Cong L, Zhou Y, et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. NATURE PROTOCOLS, 2012, 7(1): 171-193." 中的方法進(jìn) 行。
[0023] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了上述方法的用途。
[0024] 本發(fā)明提供了上述方法在從基因編輯后的DNA產(chǎn)物中篩選突變DNA中的應(yīng)用。
[0025] 本發(fā)明還提供了上述方法在從基因編輯后的克隆產(chǎn)物中篩選含有突變DNA克隆 中的應(yīng)用。
[0026] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種篩選基因編輯成功的單克隆的方法。
[0027] 本發(fā)明提供的篩選基因編輯成功的單克隆的方法包括如下步驟：
[0028] 1)將待測基因編輯后的克隆產(chǎn)物中的克隆分別提取DNA，并分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得 到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并將所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性、復(fù)性，得到雜交產(chǎn)物；
[0029] 2)用聚丙烯酰胺凝膠電泳所述雜交產(chǎn)物，檢測電泳結(jié)果，選取分子量大小及構(gòu)象 不同于野生型克隆的克隆，即為基因編輯成功的單克隆。
[0030] 上述方法中，所述待測基因編輯后的克隆產(chǎn)物是按照包括如下步驟的方法制備得 到的：將表達(dá)靶向目標(biāo)基因的人工核酸內(nèi)切酶轉(zhuǎn)入離體細(xì)胞中，進(jìn)行基因編輯，得到轉(zhuǎn)染后 細(xì)胞；將所述轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，得到待測基因編輯后的克隆產(chǎn)物。
[0031] 上述方法中，采用有限稀釋法將所述轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，得到待測基因編輯后 的克隆產(chǎn)物。
[0032] 上述方法中，所述轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)包括如下步驟：
[0033] 1)將所述轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72h，得到培