專利名稱：：雞傳染性支氣管炎抗體免疫膠體金快速檢測試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于免疫應(yīng)用領(lǐng)域，涉及動(dòng)物分子生物學(xué)、免疫學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域。具體的講,本發(fā)明屬于一種快速檢測雞傳染性支氣管炎病毒抗體的試劑盒，主要是確定被檢雞是否感染過雞傳染性支氣管炎病毒或免疫過的雞體內(nèi)是否產(chǎn)生了相應(yīng)的抗體。
背景技術(shù)：
：眾所周知，禽流感、新城疫、法氏囊、傳染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎、雞毒霉形體病、馬立克、減蛋綜合癥等疫病是危害全球養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病。雞傳染性支氣管炎(Infectiousbronchitis,IB)是由(infectiousbronchitisvirus,IBV)引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病，能引起呼吸道、輸卵管、腎臟、腸道及腺胃等多種部位病變。該病呈全球性分布，雞不分年齡、性別和品種均易感，但主要侵害K4周齡的幼雞。它可導(dǎo)致雞的增重和飼料報(bào)酬降低，蛋的產(chǎn)量、質(zhì)量和孵化率下降，死亡率升高等，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，阻礙養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。雖然有疫苗進(jìn)行免疫接種，但免疫雞群仍頻頻發(fā)病，給我國養(yǎng)禽業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。而今，對雞傳染性支氣管炎的監(jiān)測和檢測仍停留在原有的經(jīng)典方法上，如瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(Agarosegelimmunodiffusion;AGID)、血凝抑制試驗(yàn)(Hemagglutinationinhibition;HI)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay;ELISA)、病毒中和試驗(yàn)(VirusNeutralizationTest;VNT)等，這些方法有的耗費(fèi)時(shí)間長(如瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)需24~48小時(shí)；血凝抑制試驗(yàn)需23小時(shí)；ELISA試驗(yàn)需35小時(shí)等)，有的需要昂貴的儀器設(shè)備和繁瑣的操作步驟，只能在實(shí)驗(yàn)室完成，不便于適時(shí)和快速診斷。免疫層析(immunochromatography)是出現(xiàn)于八十年代初期的一種獨(dú)特的免疫分析方法，該方法的核心技術(shù)是以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細(xì)管作用使樣品溶液在層析條上泳動(dòng)，并同時(shí)使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體(如抗原或抗體)發(fā)生高特異性、高親和性的免疫反應(yīng)。膠體金免疫層析分析(gold-immunochromatographyassay;GICA)是應(yīng)用膠體金標(biāo)記技術(shù)，以膠體金作為示蹤物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)(OsikowiczGetal.One-stepchromatographicimmunoassayforqualitativedeterminationofchoricogonadotropininurine.ClinChem.1990,36，1586)。層析過程中，金標(biāo)記物與事先固相化于層析材料(例如硝酸纖維素膜，即NC膜)上的抗原或抗體(檢測線，T線)發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)而被截留，進(jìn)一步富集，形成肉眼可見的紫紅色條帶，從而得到直觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，達(dá)到快速檢測的目的。這種方法對所使用的抗原抗體的要求較高，要求具有好的特異性和高純度。依據(jù)這種原理，己經(jīng)研制出了很多膠體金免疫層析快速檢測試紙條。在人醫(yī)應(yīng)用方面，國內(nèi)外已在激素、傳染病病原的抗原和抗體、性病病原、細(xì)菌、寄生蟲、腫瘤標(biāo)記物、心血管病標(biāo)志物、藥物以及其他一些蛋白質(zhì)等方面應(yīng)用了金標(biāo)免疫層析試紙條。在獸醫(yī)應(yīng)用方面，例如在豬瘟、犬細(xì)小病毒病等方面也應(yīng)用了金標(biāo)免疫層析試紙條。在雞疫病診斷和檢測方面，中國發(fā)明專利(專利號ZL99101537.1),公開了一種畜禽疫病快速診斷試紙條的制備及應(yīng)用，但該發(fā)明的要點(diǎn)是針對畜禽疫病病原的檢測，并未涉及對雞傳染性支氣管炎抗體的診斷檢測。雞傳染性支氣管炎病毒抗體檢測試劑盒實(shí)用新型專利申請(申請?zhí)?2285790.7)為ELISA方法，且未公開其采用的生物材料樣品，也沒有提交用于專利程序的生物材料樣品的保藏，本領(lǐng)域的技術(shù)人員無法實(shí)施該發(fā)明并達(dá)到該發(fā)明所示的效果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)。其第一個(gè)目的是組裝一種用于雞傳染性支氣管炎抗體的試劑盒；第二個(gè)目的是本發(fā)明的試劑盒在雞傳染性支氣管炎抗體檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明的總體技術(shù)路線圖見圖1所示。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的-本發(fā)明的試劑盒是由盒體和包含在盒體內(nèi)的試紙卡、樣品稀釋液組成。試紙卡(結(jié)構(gòu)如圖2、3所示)是本發(fā)明的試劑盒的核心，由試紙條與測試卡組成。試紙條由吸收墊(4)、硝酸纖維素膜(3)、金標(biāo)墊(2)、樣品墊(1)的依次粘貼在不吸水的支撐薄片(7)上構(gòu)成。的金標(biāo)墊(2)上包被有膠體金標(biāo)記的抗雞IgGFc單克隆抗體(分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞系BDRPDP已經(jīng)公布在本申請人在先授權(quán)的專利文獻(xiàn)中，專利號ZL200510011521.8,該雜交瘤細(xì)胞系的已于2005年3月17日保藏在中國湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCNO:C200501);硝酸纖維素膜(3)上包被有雞傳染性支氣管炎核衣殼NP蛋白構(gòu)成的檢測線(T線)(5)和兔抗鼠IgG構(gòu)成的質(zhì)控線(C線)(6);將試紙條裝入測試卡(8)中構(gòu)成試紙卡。樣品稀釋液為2Mol/L氯化鈉溶液。所述硝酸纖維素膜(NC膜)、吸收墊、金標(biāo)墊、樣品墊、不吸水的支撐薄片均購自Millipore公司。所述親和層析柱購自AmershamBiosciences公司。本發(fā)明所述的重組NP蛋白，包含該蛋白的重組質(zhì)粒的表達(dá)菌大腸桿菌(￡sc/en'c/w'aco乃')BL21/pKG-NP已于2007年12月20日保藏在位于中國湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCNO:M207206。本發(fā)明的原理是選用親和層析純化的雞傳染性支氣管炎核衣殼NP蛋白作為檢測線，抗雞IgGFc片斷單克隆抗體作為膠體金標(biāo)記的抗體，利用間接法(ShyuRH等，Colloidalgold-basedimmunochromatographicassayfordetectionofrieinJToxicon2002，40(3):255-258)來檢測被檢材料中是否含有雞傳染性支氣管炎抗體。檢測時(shí)，樣品中所有的雞IgG分子的Fc片段先和金標(biāo)記抗雞IgGFc片段單克隆抗體結(jié)合，由于毛細(xì)管作用，反應(yīng)復(fù)合物沿包被膜向前泳動(dòng)，若樣品中有雞傳染性支氣管炎病毒的特異性抗體，到達(dá)檢測線時(shí)，遇到包被在硝酸纖維素膜上的重組蛋白，就會形成重組蛋白-抗體-金標(biāo)記單克隆抗體復(fù)合物，從而富集在檢測線上，形成特異性的紅色沉淀線；不是雞傳染性支氣管炎病毒的特異性抗體形成的抗體-金標(biāo)記單克隆抗體復(fù)合物則會通過檢測線，富集在質(zhì)控線上，形成紅色沉淀線，即判為陽性結(jié)果。若樣品中不含有雞傳染性支氣管炎病毒抗體，反應(yīng)復(fù)合物到達(dá)檢測線時(shí)，遇到捕獲抗原就不會形成重組蛋白-抗體-金標(biāo)記單克隆抗體復(fù)合物，反應(yīng)復(fù)合物通過檢測線，富集在質(zhì)控線上，形成紅色沉淀線，即判為陰性結(jié)果。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)之一是生物安全性高。本發(fā)明所涉及到的表達(dá)載體pGEX-KG是分子生物學(xué)中常用的表達(dá)載體，沒有生物危險(xiǎn)性，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的表達(dá)載體pKG-NP也沒有任何生物危險(xiǎn)性。重組大腸桿菌BL21/pKG-NP是將表達(dá)載體pKG-NP轉(zhuǎn)化至分子生物學(xué)中常用的大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞后經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選獲得，也不具生物危險(xiǎn)性。本發(fā)明中的試紙條檢測線包被的是本發(fā)明制備的雞傳染性支氣管炎核衣殼NP蛋白，制備過程中不涉及雞傳染性支氣管炎活病毒，因此沒有雞傳染性支氣管炎活病毒逃逸、擴(kuò)散的潛在危險(xiǎn)。2、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)之二是生產(chǎn)成本低。本發(fā)明所提供的試劑盒所需的核心試劑是抗雞IgGFc單克隆抗體與雞傳染性支氣管炎核衣殼NP蛋白。抗雞IgGFc片段單克隆抗體可以通過將分泌抗雞IgGFc片斷的單克隆雜交瘤細(xì)胞系(專利號:ZL200510011521.8，保藏編號為CCTCCNO:C200501)注射Balb/C小鼠腹腔，誘生腹水，通過經(jīng)濟(jì)的辛酸-硫酸銨方法純化而大量獲得。NP蛋白可以通過重組大腸桿菌BL21/pKG-NP在體外得到大量的表達(dá)，適合大規(guī)模的生產(chǎn)。3、與已公開的用于雞傳染性支氣管炎抗體檢測的ELISA方法相比，本發(fā)明的試劑盒具有許多ELISA方法所不能比擬的優(yōu)點(diǎn)，如檢測快速(1015min);不需要任何特殊儀器、設(shè)備，可用于現(xiàn)場操作；操作簡便，只需一步反應(yīng)，不需由專業(yè)人員操作；檢測成本低；檢測過程中只需一種試劑(2Mol/LNaCl溶液)，對人體無危害，對環(huán)境無污染；儲存方便，對溫度要求不高，在4'C下有效保存期可達(dá)一年；在室溫下可保存六個(gè)月(表l)。_表l本發(fā)明的試劑盒與已公開的ELISA方法的比較_<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>圖h本發(fā)明的總體技術(shù)路線圖圖2:本發(fā)明試紙卡的側(cè)視圖，圖中l(wèi)樣品墊(樣品端)；2為金標(biāo)墊；3為硝酸纖維素膜(NC膜)；4為吸收墊(手柄端);5為檢測線，即T線；6為質(zhì)控線，即C線；7為不吸水的支撐薄片條；8為測試卡;9為加樣孔。圖3:本發(fā)明試紙卡的俯視圖，圖中1樣品墊(樣品端)；2為金標(biāo)墊；3為硝酸纖維素膜(NC膜)；4為吸收墊(手柄端);5為檢測線，即T線；6為質(zhì)控線，即C線；8為測試卡；9為加樣孔。圖4:發(fā)明試紙卡結(jié)果判定示意圖，圖中3為陽性結(jié)果++++;&性結(jié)果+++;0為陽性結(jié)果++;d為陽性結(jié)果+;e為陰性結(jié)果;f、g為試紙卡失效圖5:本發(fā)明涉及的NP重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒的物理構(gòu)建圖具體實(shí)施方式實(shí)施例l雞傳染性支氣管炎NP蛋白的制備所使用的分子生物學(xué)方法參見文獻(xiàn)薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主編(金冬雁等譯).分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.第二版，北京科學(xué)出版社，1992中提供的方法進(jìn)行。1、NP基因的克隆與測序本發(fā)明所涉及的NP基因是申請人所在的微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室用雞傳染性支氣管炎H52毒株克隆得到的，該基因的序列已在GeneBank數(shù)據(jù)庫中登錄，登錄號為DQ473615。該序列與已知序列有97%-99%的同源性。NP基因的克隆與測序具體方法是:用雞傳染性支氣管炎H52毒株(李中華，傳染性支氣管炎病毒纖突蛋白、核蛋白基因克隆、表達(dá)及其在抗體檢測中的初步應(yīng)用[D]，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006，中國知網(wǎng)，中國優(yōu)秀碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫http:〃dlib,edu.cnki.net/kns50/detai1.aspx7Q贈(zèng)ylD二85&CurRec=2)經(jīng)尿囊腔接種雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)于10日齡SPF雞胚，棄24小時(shí)前的死胚，收集24-36小時(shí)的雞胚尿囊液；4t:條件下4,000rpm離心30min，取上清；4'C條件下30,000rpm離心60min得到濃縮病毒。參照前述的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》.第二版，北京科學(xué)出版社，1992年報(bào)道的方法，用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水配制的磷酸緩沖液(即PBS，配方如下140mMNaCl，2.7mMKC1，10mMNa2HP04，1.8mMKH2P04，，pH7.2)溶解沉淀，分裝后-7CTC保存?zhèn)溆?。設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增NP基因。弓|物序列如下上游引物P1:5，ATGGCAAGCGGTAAAGCAG-3',下游引物P2:5，-CCGAGCTCTCAAAGTTCATTCTCTCC-3，，Pl含有5a附i/1位點(diǎn)和ATG起始密碼子，P2含有&cl位點(diǎn)和終止密碼子。兩引物之間包含有NP基因完整的閱讀框架。取適量病毒懸液提取RNA，按TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.2.1說明書中提供的方法，擴(kuò)增出DNA，采用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(E.Z.N.AGelExtractionKit)回收純化RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將回收的RT-PCR產(chǎn)物直接與購自TaKaRa公司的克隆載體pMD18-T進(jìn)行連接反應(yīng)，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到試劑盒(購自TaKaRa公司的商業(yè)試劑盒)中感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5a中，用a互補(bǔ)檢查轉(zhuǎn)化效果。挑取陽性克隆，采用堿裂解法(薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主編(金冬雁等譯).分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.第二版，北京科學(xué)出版社，1992版)提取重組質(zhì)粒DNA，并對重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pMD-NP，并送北京奧科生物技術(shù)公司進(jìn)行測序，然后將序列測定結(jié)果與GeneBank中的有關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性比較和分折。2、表達(dá)載體pKG-NP的構(gòu)建用5側(cè)沼和歷"^III雙酶切pMD-NP質(zhì)粒后，回收1.2kb左右的片段，然后將此片段與用同樣的酶酶切的AmershamBiosciences公司的表達(dá)載體pGEX-KG連接，構(gòu)建表達(dá)載體。重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化新鮮制備的DH5a感受態(tài)細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)化菌涂布含氨芐青霉素的LB瓊脂平板37'C培養(yǎng)過夜。挑數(shù)個(gè)單菌落培養(yǎng)過夜后用堿裂解法小量制備質(zhì)粒，進(jìn)行酶切分析和PCR擴(kuò)增鑒定。將得到的陽性克隆命名為pKG-NP。包含該重組質(zhì)粒pKG-NP的大腸桿菌(五w/zw/c/n'a)BL21/pKG-NP)保藏在位于中國湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日2007年12月20日；保藏編號CCTCCNO:M207206。對陽性克隆用堿裂解法大量制備質(zhì)粒DNA，并分裝凍存于-2(TC。重組表達(dá)質(zhì)粒pKG-NP構(gòu)建流程如圖5所示3、雞傳染性支氣管炎NP蛋白表達(dá)將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒pKG-NP轉(zhuǎn)入表達(dá)用大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞五^/^n'c/n'fl81^21(0￡3)(￡^/^/￡^'"^//81^21(0￡3)購自Stratagene公司)中，涂布到含有相應(yīng)抗生素(氨芐青霉素60pg/mL)的LB平皿上，37。C培養(yǎng)1618h，長出單菌落。挑取數(shù)個(gè)單菌落于加有相應(yīng)抗生素(氨芐青霉素60ng/mL)的3mLLB中培養(yǎng)過夜，進(jìn)行細(xì)菌活化。將過夜培養(yǎng)物按比例l:50稀釋入新鮮的LB培養(yǎng)基中，37'C中振蕩培養(yǎng)(250300rpm)到OD600-0.50.8時(shí)，加入終濃度為lmmol/L異丙基硫代-e-D-半乳糖苷(IPTG)，繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)3h。4"條件下8,000rpm離心15min，收集細(xì)菌。細(xì)菌用0.01MpH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次后離心，反復(fù)快速凍融34次，用適量緩沖液STE(配方100.0mmol/LNaCl，10.0mmol/LTris-Cl，1.0mmol/LEDTApH8.0)重懸。用大超聲頭，設(shè)定功率400瓦、20個(gè)循環(huán)和破碎5秒、間隔10秒，在冰浴中超聲破碎lmin。4。C條件下12,000rpm離心15min，棄沉淀，將上清對0.01MpH7.2PBS進(jìn)行充分透析后濃縮至體積為5mL，按蛋白純化柱(GlutathioneSepharose4BHiTrapaffinitycolumns,AmershamBiosciences公司產(chǎn)品)說明書提供的程序進(jìn)fi^親和層析純化，得到純化的NP蛋白。該蛋白可用于制備檢測雞傳染性支氣管炎病毒抗體的試劑。實(shí)施例2兔抗鼠IgG抗體的制備1、Balb/C小鼠IgG的提取IgG的提取和純化按沈關(guān)心等(沈關(guān)心等，現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(第二版)[M]，湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2002)等所述方法進(jìn)行取IO.OmL健康Balb/C小鼠血清與等量生理鹽水混合后，逐滴加入飽和(NH4)2S04溶液20.0mL，使成50。/。飽和度的(NH4)2S04溶液。4。C靜置30min后取出；4。C下3,000r/min離心30min，棄上清，沉淀中加20.0mL生理鹽水；待沉淀溶解后，緩慢加入10.0mL飽和(NH4)2S04溶液，使成33%飽和度的(NH4)2S(V溶液。4。C放置30min后取出；4。C下3,000r/min離心30min。棄上清，沉淀重復(fù)進(jìn)行上述操作后，將沉淀溶于l.OmL生理鹽水(原血清量體積的1/10)，裝入透析袋內(nèi)用生理鹽水透析除鹽。用2XBaCl2溶液檢測(NH4)2S04是否已被透析完全。透析完全后，蛋白溶液用聚乙二醇(PEG)-20,000濃縮至適當(dāng)體積，4'C下12,000r/min離心10min，取上清，測定蛋白質(zhì)含量，即得到粗提的Balb/C小鼠IgG。2、Balb/C小鼠IgG的純化根據(jù)樣品的種類與容積及所選擇的層析柱來確定所選葡聚糖凝膠的種類和柱床的體積。柱床的體積按如下公式計(jì)算Vt=7ir2h(Vt—柱床的體積；7T—圓周率；r一半徑；h—柱床高)根據(jù)樣品的種類，本發(fā)明用葡聚糖凝膠(SephadexG-200)作為層析材料。純化的具體過程如下稱取3.0gSephadexG-200倒入數(shù)倍體積的蒸餾水中混合均勻，置室溫浸泡3d，每天換蒸餾水2次，慢慢將上層含漂浮顆粒的部分倒掉后，再加入原體積的蒸餾水，凝膠浸泡好后置4'C冰箱保存?zhèn)溆?。將潔凈的層析柱垂直固定于?shí)驗(yàn)架上，加少量洗脫液(0.01mol/L,pH7.2PBS)，檢查出液管的通暢性，合格后，關(guān)閉出液口。從4'C冰箱取出浸泡好的SephadexG-200,平衡至室溫后灌裝層析柱。在裝好的層析柱凝膠上輕輕放上與柱內(nèi)徑相當(dāng)?shù)臑V紙片，0.01mol/LpH7.2的磷酸緩沖液(即PBS，配方如下140mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNa2HP04，1.8mMKH2P04，pH7.2)平衡過夜，在凝膠的上方留出lcm2cm高的液層，準(zhǔn)備加樣。加樣時(shí)，將凝膠上方的液層放出，待剛露出濾紙片時(shí)，立即關(guān)閉出液口。用滴管吸取樣品，在接近濾紙?zhí)幯毓鼙诹飨?，取少許生理鹽水沖洗樣品瓶，將洗液加入，最后用洗脫液清洗管壁。打開出液口，在樣品全部進(jìn)入柱床且剛出現(xiàn)濾紙時(shí)，立即加入洗脫液，使柱床上部形成5cm10cm厚的液層。樣品上柱后，不時(shí)以20%磺基水楊酸液檢測洗出液，當(dāng)洗出液出現(xiàn)輕微乳濁反應(yīng)時(shí)，立即用已經(jīng)編號的1.5mLEP管收集洗出液，每管lmL，直至洗出液用20%磺基水楊酸檢測不出渾濁時(shí)結(jié)束收集。結(jié)束收集后，用紫外分光光度計(jì)測定每管流出液中蛋白質(zhì)含量，以EP管編號為橫坐標(biāo)，管內(nèi)流出液蛋白質(zhì)含量為縱坐標(biāo)繪制曲線圖，根據(jù)蛋白濃度分布收集所需溶液，裝入透析袋中，PEG-20,000濃縮至適當(dāng)體積。4。C12,000r/min離心10min，收集上清，用紫外分光光度計(jì)測定經(jīng)過濃縮后的Balb/C小鼠IgG蛋白含量，置-2(TC凍存。3、家兔的免疫及兔抗Balb/C小鼠IgG的提取與純化選取體重在2.5kg左右的成年雄性健康家兔，用1和2中制備的抗原，首次免疫用弗氏完全佐劑乳化的Balb/C小鼠IgG，免疫劑量為2mglgG/只家兔，以后各次用弗氏不完全佐劑乳化的Balb/C小鼠IgG免疫。除首免與二免間隔3周外，其余每次免疫間隔10天，且每次免疫劑量中Balb/C小鼠IgG的含量較前一次高0.8mg，每次免疫途徑全部采用皮下多點(diǎn)注射。免疫3次后，采血檢測血清效價(jià)，當(dāng)血清AGID(瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(agargelimmunodiffusion,AGID)簡稱瓊擴(kuò)試驗(yàn))效價(jià)達(dá)到1:32時(shí)，再加強(qiáng)免疫1次，IO天后頸動(dòng)脈放血，分離血清，用于兔抗Balb/C小鼠IgG的提取。按照本實(shí)施例步驟1和步驟2的方法進(jìn)行兔抗Balb/C小鼠IgG的提取與純化。即可得到本發(fā)明所需高特異性、高效價(jià)的兔抗鼠IgG抗體。利用該抗體可作為本發(fā)明膠體金試紙卡的質(zhì)控線(C線)。實(shí)施例3硝酸纖維素膜的制備1、包被緩沖液的配制含3n/。甲醇的0.01MpH7.2PBS緩沖液為包被緩沖液，0.22p膜濾過，置4'C備用，有效期一周。1000ml3n/。甲醇的0.01MpH7.2PBS緩沖液配方NaC18g、KC10.2g、Na2HP04*12H202.9g、KH2P040.2g、甲醇30ml，雙蒸去離子水定容至1000ml。2、硝酸纖維素膜的制備用本實(shí)施例步驟1中的包被緩沖液將NP蛋白稀釋到50100pg/ml，調(diào)整機(jī)器，劃線為T線，即為檢測線，T線靠近金標(biāo)墊端，距金標(biāo)墊端約5mrn;用包被緩沖液將兔抗鼠IgG抗體稀釋到50100pg/ml，調(diào)整機(jī)器，劃線為C線，即為質(zhì)控線，C線靠近吸收墊，距吸收墊約3mm。兩線距離58mm，線應(yīng)細(xì)致、均勻。37t:烘干，封裝備用。實(shí)施例4膠體金、金標(biāo)記單克隆抗體的制備1、溶液的配制(1)氯金酸的配制用雙蒸去離子水溶解氯金酸，配成1%溶液，置(C備用，有效期四個(gè)月。1000mll。/o氯金酸溶液配方10g氯金酸；雙蒸去離子水定容至1000ml。(2)1%檸檬酸三鈉的配制用雙蒸去離子水溶解檸檬酸三鈉，配成1%溶液，0.22nm膜濾過，現(xiàn)配現(xiàn)用。(3)O.IM碳酸鉀的配制用雙蒸去離子水配制，0.22pm膜濾過，置4匸備用，有效期四個(gè)月。1000ml0.1M碳酸鉀溶液配方13.8g碳酸鉀；雙蒸去離子水定容至1000ml。(4)2%PEG-20000的配帝!j:用雙蒸去離子水配制，0.22pm膜濾過，置4。C備用，有效期四個(gè)月。1000ml20/。PEG-20000溶液配方20gPEG-20000;雙蒸去離子水定容至1000ml。(5)標(biāo)記洗滌保存液的配制2%牛血清白蛋白(BSA)、0.05%疊氮鈉(NaN3)、0.01MpH7.2PBS溶液，0.22pin膜濾過，置4。C備用，有效期四個(gè)月。1000ml標(biāo)記洗滌保存液配方20gBSA、0.5gNaN3、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。2膠體金的制備用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01%，置電爐煮沸，按每100ml0.01%氯金酸加入2mll。/。檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，直到液體呈亮紅色即停止加熱，冷卻至室溫后補(bǔ)足失水。制備好的膠體金外觀應(yīng)純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，有效期一周。3膠體金標(biāo)記單克隆抗體的制備用O.IM碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值至8.2，按810嗎抗體/ml膠體金加入抗雞IgGFc段單克隆抗體，磁力攪拌器混勻30min，攪拌下加入BSA至終濃度為1%，靜置1小時(shí)。13000rpm、4'C離心30min，棄上清，沉淀用標(biāo)記洗滌保存液洗滌兩次，用十分之一初始膠體金體積的標(biāo)記洗滌保存液將沉淀重懸，置4'C備用，有效期一周。實(shí)施例5金標(biāo)墊的制備1封閉液的配制2%BSA、0.5%Tween-20、0.05%NaN3、0.01MpH7.2PBS溶液，0.22nm微孔濾膜濾過，置4匸備用，有效期四個(gè)月。1000ml封閉液配方20gBSA、0.5gNaN3、5mlTween-20、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。2金標(biāo)墊的制備將金標(biāo)墊浸泡于本實(shí)施例步驟l中的封閉液中30min后，于37'C烘干。然后將制備好的金標(biāo)記抗體均勻的鋪在金標(biāo)墊上，每毫升溶液鋪20平方厘米，冷凍千燥，封裝，置4'C備用。實(shí)施例6試紙條樣品墊的制備1封閉液的配制2%BSA、0.5%Tween-20、0.05%NaN3、0.01MpH7.2PBS溶液，0.22^n微孔濾膜濾過，置4t:備用，有效期四個(gè)月。1000ml封閉液配方20gBSA、0.5gNaN3、5mlTween-20、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。2樣品墊的制備將樣品墊浸泡于本實(shí)施例步驟l中的封閉液中30min后，于37'C烘干，封裝，置4"C備用。實(shí)施例7試紙卡的組裝將硝酸纖維素膜、吸收墊、玻璃纖維、樣品墊按圖依次層疊起來，切成3.6mm寬的小條，然后裝入測試卡。每十個(gè)一包，加入干燥劑，真空封裝。48'C保存，有效期一年；常溫保存，有效期6個(gè)月。實(shí)施例8快速檢測雞傳染性支氣管炎病毒抗體的試劑盒組成1快速檢測雞傳染性支氣管炎病毒抗體的試劑盒均包括①試紙卡一包(10個(gè)/包)②樣品稀釋液一瓶(10ml/瓶)2相關(guān)溶液的配制快速檢測雞傳染性支氣管炎病毒抗體的試劑盒的樣品稀釋液樣品稀釋液為2Mol/LNaCl溶液。配制方法117gNaCI，加蒸餾水定容至1000ml。實(shí)施例9本發(fā)明試劑盒的使用方法1樣品制備雞血清樣品的制備，將血清樣品用2Mol/L所氯化鈉溶液稀釋20倍。2檢測取出試劑盒，室溫平衡20分鐘；打開包裝袋，取出試紙卡，取100pl制備好的樣品滴入試紙卡的加樣孔中，1015分鐘內(nèi)判定結(jié)果。3結(jié)果判定如圖4所示，當(dāng)試紙卡出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質(zhì)控線，沒有出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色檢測線，結(jié)果判為陰性，記為"一"；當(dāng)試紙卡出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質(zhì)控線，同時(shí)也出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色檢測線，結(jié)果判為陽性，記為"+";檢測線顏色深度與被檢血清中的抗體效價(jià)呈正相關(guān)，顏色越深說明被檢測樣品的抗體效價(jià)越高;檢測線顏色濃厚，與質(zhì)控線顏色一致或接近時(shí)判為++++，顏色深度介于+與++++之間時(shí)酌情判++或+++。達(dá)到+及以上的顏色深度時(shí)，判為該份被檢血清的抗體為陽性。質(zhì)控線無條帶出現(xiàn)則判為檢測試紙卡失效。實(shí)施例10快速檢測雞傳染性法氏囊抗體的試劑盒穩(wěn)定性考核設(shè)計(jì)溫度2(TC、4°C設(shè)計(jì)時(shí)間0天、10天、20天、30天、2月、4月、6月、8月、10月、12月保存方法試紙卡真空封裝(忙存在4'C的冰箱內(nèi)或2(TC室溫中)考核指標(biāo)敏感性_表2本發(fā)明試劑盒試紙卡穩(wěn)定性測試結(jié)果_<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例11快速檢測雞傳染性支氣管炎抗體的試劑盒的制備及應(yīng)用1、快速檢測雞傳染性支氣管炎抗體的試劑盒的制備按實(shí)施例1-9的方法制備快速檢測雞傳染性支氣管炎抗體的試劑盒。2、速檢測雞傳染性支氣管炎抗體的試劑盒的應(yīng)用2.1雞標(biāo)準(zhǔn)血清的檢測①特異性試驗(yàn)分別將雞傳染性支氣管炎(IB)陽性血清、雞新城疫(ND)陽性血清、雞傳染性法氏囊(IBD)陽性血清(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)、雞禽流感病毒H5、H9亞型陽性血清(購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所)、按實(shí)施例9所述本發(fā)明方法(GICA)進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果見表3。表3顯示，本發(fā)明檢測試紙卡與標(biāo)準(zhǔn)的雞傳染性支氣管炎陽性血清試驗(yàn)后，質(zhì)控線及檢測線均出現(xiàn)明顯的紫紅色條帶；而與2Mol/L氯化鈉溶液(空白)、SPF雞陰性血清、雞新城疫(ND)、雞傳染性法氏囊(IBD)、禽流感(AI)等陽性血清試驗(yàn)后，檢測線不出現(xiàn)紫紅色條帶。這表明本發(fā)明試紙卡特異性高，與雞的其他呼吸道疫病病毒抗體無任何交叉反應(yīng)。_<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>結(jié)果_②敏感性試驗(yàn)將雞陽性血清(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)用常規(guī)血凝抑制(HI)沈關(guān)心,周汝麟.現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(第二版)[M]，湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2002檢測其血凝抑制價(jià)為1:16，進(jìn)行倍比稀釋。取100^tl稀釋好的樣品按本發(fā)明方法(GICA)進(jìn)行試驗(yàn)，當(dāng)雞傳染性支氣管炎標(biāo)準(zhǔn)陽性血清稀釋至1024倍時(shí)試紙卡仍判定為陽性。試驗(yàn)結(jié)果見表4。結(jié)果表明，本發(fā)明檢測試劑盒的靈敏度是血凝抑制法的64倍。表4本發(fā)明試劑盒對雞傳染性支氣管炎抗體檢測的敏感性試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.2送檢雞血清樣品的檢測從湖北的新洲、江夏及潛江等地的4個(gè)雞場共采集120份雞血清，按本發(fā)明方法(GICA)進(jìn)行試驗(yàn)，同時(shí)血凝抑制方法(HI)測定。結(jié)果見表5。表5顯示，本發(fā)明的方法檢出率41.67%(50/120)，HI方法檢出率為31.67%(38/120)，比本發(fā)明的方法檢出率低，是因?yàn)楸景l(fā)明的方法的敏感度比AGID高64倍(1024/16)，使得本發(fā)明方法陽性時(shí)而HI法陰性，者的符合率為76%(38/50，HI陽性/GICA陽性)。表5本發(fā)明的試劑盒樣品檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>盡管本發(fā)明的內(nèi)容是結(jié)合本實(shí)施例進(jìn)行說明，但是不能認(rèn)為是對本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在所附權(quán)利要求書限定的范圍內(nèi)對本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)或修飾，這些改動(dòng)或修飾形式同樣落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。權(quán)利要求1、一種適用于雞傳染性支氣管炎抗體的試劑盒，它包含盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的試紙卡和樣品稀釋液，其特征在于，其中的試紙卡由試紙條與測試卡組成；試紙條由吸收墊(4)、硝酸纖維素膜(3)、金標(biāo)墊(2)、樣品墊(1)依次粘貼在不吸水的支撐薄片(7)上構(gòu)成。所述的金標(biāo)墊(2)上包被有膠體金標(biāo)記的抗雞IgGFc片段單克隆抗體；所述的硝酸纖維素膜(3)上分別包被有雞傳染性支氣管炎核衣殼NP蛋白構(gòu)成的檢測線(5)和兔抗鼠IgG構(gòu)成的質(zhì)控線(6)；2Mol/L氯化鈉溶液。2、權(quán)利要求1中所述的試劑盒在檢測雞傳染性支氣管炎抗體中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于免疫應(yīng)用領(lǐng)域，涉及動(dòng)物分子生物學(xué)、免疫學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域。公開了一種用于雞傳染性支氣管炎抗體的試劑盒。該試劑盒包含盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的試紙卡和樣品稀釋液。其中的試紙卡是由樣品墊、吸收墊、包被有雞傳染性支氣管炎核衣殼NP重組蛋白作為檢測線和包被有抗鼠IgG作為質(zhì)控線的硝酸纖維素膜依次按吸收墊、硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊的順序粘貼在不吸水的支撐薄片上構(gòu)成。所述的試劑盒檢測抗體具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便和診斷快速的顯著優(yōu)點(diǎn)。文檔編號G01N33/577GK101196524SQ20071016910公開日2008年6月11日申請日期2007年12月29日優(yōu)先權(quán)日2007年12月29日發(fā)明者梅劉,張展英,張文通,張進(jìn)良,李自力,畢丁仁,政王,王喜亮,石德時(shí),肖運(yùn)才,胡思順,許青榮申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)