專利名稱：：用于定量分析的質(zhì)量標簽的制作方法用于定量分析的質(zhì)量標簽相關(guān)申請本申請是2006年2月15日提交的美國申請No.ll/355，904的繼續(xù)申請，所述美國申請No.ll/355，904是2005年7月11日提交的美國申請No.11/179，060的部分繼續(xù)申請，所述美國申請No.ll/179，060要求2005年5月9日提交的美國申請No.60/679，183和2004年7月12日提交的美國申請No.60/587，138的優(yōu)先權(quán)。上述申請的全部教導在此通過引用并入本文。一般技術(shù)人員應當理解下述附圖僅用于舉例說明的目的。所述附圖并非旨在以任何方式限制本發(fā)明教導的范圍。附圖1A-1H顯示一組8個同量異位的(isobaric)質(zhì)量標簽(masstag)的結(jié)構(gòu)式，每個質(zhì)量標簽的分子量相同但是當向其施加解離能水平(dissociativeenergylevel)時其將斷裂得到不同分子量的信號離子。圖2A是用質(zhì)量標簽(32)烷基化的SEQIDNo.:l的QTRAPTM2000MS分析。圖2B是用質(zhì)量標簽(32)烷基化的SEQIDNo.:2的QTRAPTM2000MS分析。圖3A是用質(zhì)量標簽(32)烷基化的SEQIDNo.:l的QTRAPTM2000MS/MS分析。圖3B是用質(zhì)量標簽(32)烷基化的SEQIDNo.:2的QTRAPTM2000MS/MS分析。圖4A是利用4700蛋白質(zhì)組分析儀進行的對用質(zhì)量標簽(32)烷基化的SEQIDNo.:l的MS分析。圖4B是利用4700蛋白質(zhì)組分析儀進行的對用質(zhì)量標簽(32)烷基化的SEQIDNo.:3的MS分析。圖5A是利用4700蛋白質(zhì)組分析儀進行的對用質(zhì)量標簽(32)烷基化的SEQIDNo.:l的MS/MS分析。圖5B是利用4700蛋白質(zhì)組分析儀進行的對用質(zhì)量標簽(32)烷基化的SEQIDNo.:3的MS/MS分析。圖6A顯示在兩個樣品的QTRAPTM2000上進行的MRM試驗，其中一個樣品已經(jīng)用質(zhì)量標簽(32)烷基化，另一個已經(jīng)用質(zhì)量標簽(33)烷基化，其中用質(zhì)量標簽(32)標記的樣品與用質(zhì)量標簽(33)標記的樣品的比是1:0.05。圖6B顯示在兩個樣品的QTRAPTM2000上進行的MRM試驗，其中一個樣品已經(jīng)用質(zhì)量標簽(32)烷基化，另一個已經(jīng)用質(zhì)量標簽(33)烷基化，其中用質(zhì)量標簽(32)標記的樣品與用質(zhì)量標簽(33)標記的樣品的比是l:l。圖6C顯示在兩個樣品的QTRAP2000上進行的MRM試驗，其中一個樣品已經(jīng)用質(zhì)量標簽(32)烷基化，另一個已經(jīng)用質(zhì)量標簽(33)烷基化，其中用質(zhì)量標簽(32)標記的樣品與用質(zhì)量標簽(33)標記的樣品的比是1:10。圖7A-1和圖7A-2是利用4700蛋白質(zhì)組分析儀進行的圖6A中樣品的MS/MS模式的質(zhì)i普。圖7B-1和圖7B-2是利用4700蛋白質(zhì)組分析儀進行的圖6B中樣品的MS/MS模式的質(zhì)鐠。圖7C-1和圖7C-2是利用4700蛋白質(zhì)組分析儀進行的圖6C中樣品的MS/MS模式的質(zhì)i普。圖8以圖示方式說明活性酯的醇基或硫醇基的離去基團(LG)的示例性結(jié)構(gòu)式，其中G各自獨立地是O或S,典型地是O。圖9A-9B以圖示方式說明在一些實施方案中可包含于LK基團中的/-;dv部分。圖10以圖示方式說明用于胺的酰基化以在質(zhì)量標簽上形成反應活性基團的方案I和II。圖11以圖示方式說明質(zhì)量標簽(2)的合成。圖12以圖示方式說明質(zhì)量標簽(3)的合成。圖13以圖示方式說明質(zhì)量標簽(4)和(5)。圖14以圖示方式說明質(zhì)量標簽(6)、(7)和(8)的合成。圖15以圖示方式說明質(zhì)量標簽(9)、(10)和(11)的合成。圖16以圖示方式說明質(zhì)量標簽(12)的合成。圖17以圖示方式說明質(zhì)量標簽(14)和(15)。圖18以圖示方式說明合成質(zhì)量標簽(16)、(17)、(18)、(19)和(20)的一般方案。圖19以圖示方式說明質(zhì)量標簽(21)、(22)、(23)和(24)的合成。圖20以圖示方式說明質(zhì)量標簽(25)的合成。圖21以圖示方式說明質(zhì)量標簽(26)的合成。圖22以圖示方式說明質(zhì)量標簽(27)的合成。圖23以圖示方式說明質(zhì)量標簽(28)的合成。圖24以圖示方式說明FmocGly-Ser(Bzl-13C6)(29)的合成。圖25以圖示方式說明樹脂結(jié)合的質(zhì)量標簽(30)、(31)和(32)的合成。圖26以圖示方式說明含有胸腺嘧啶核苷堿基的標記試劑/質(zhì)量標簽(XX)((37a))的合成。圖27A以圖示方式說明合成6-甲基尿嘧咬的公知步驟，可由所述6-曱基尿嘧咬制備含有6-甲基尿嘧咬核苷堿基的標記試劑(質(zhì)量標簽)((37b))。圖27B以圖示方式說明可用于制備同位素富集形式的6-甲基尿嘧啶的多種可從商業(yè)渠道得到的同位素取代形式的乙酰乙酸乙酯。圖27C以圖示方式說明可用于制備同位素富集形式的6-甲基尿嘧啶中的多種可從商業(yè)渠道得到的同位素取代形式的脲。圖28A和28B以圖示方式說明可利用圖27B和27C中所示化合物與圖27A中所示步驟相組合進行制備的多種同位素富集形式的6-甲基尿嘧啶。用*標記的原子是重原子同位素。圖29A-E以圖示方式說明可利用圖26、27A、27B、27C中所示步驟和可從商業(yè)渠道得到的化合物以及圖28A和28B中所示同位素取代的6-甲基尿嘧啶進行制備的多種同位素編碼的標記試劑。圖30以圖示方式說明質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(38)和(39)的化學結(jié)構(gòu)。圖31以圖示方式i兌明質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(40)的化學結(jié)構(gòu)。圖32以圖示方式說明質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(41)的合成。圖33以圖示方式說明質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(42)的合成。圖34以圖示方式說明質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(43)的合成。圖35以圖示方式說明質(zhì)量標簽(44)和(45)的合成。圖36以圖示方式+兌明質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(46)的合成。圖37以圖示方式說明質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(47)和質(zhì)量標簽(48)的化學結(jié)構(gòu)。圖38以圖示方式說明質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(49)的合成。1引言本發(fā)明涉及利用質(zhì)量分析測定一種或多種分析物的方法、混合物、試劑盒和/或組合物。分析物可以是任何感興趣的分子。分析物的非限制性實例包括但不限于蛋白質(zhì)、肽、寡核苷酸、碳水化合物、脂質(zhì)、類固醇、氨基酸和小于1500道爾頓的小分子。標記試劑和被標記分析物可表示為下述通式化合物或其鹽形式和/或水合物形式RP-X-LK-Y-RGS'rS'tIw其中RG可以是與分析物反應的反應活性基團或所述反應活性基團與所述分析物的反應產(chǎn)物。因此，被標記分析物可具有下述通式RP-X-LK-Y-分析物所述化合物可附著到固相栽體上或用于通過s，將其連接到固相載體的結(jié)構(gòu)部分上。在下文中更詳細地描述變量RG、RP、X、LK、S，、r、t和Y。同分異構(gòu)或同量異位的標記試劑組可用于標記兩個或更多個不同樣品的分析物，其中對于每種不同的樣品而言，所述標記試劑可以不同并且其中所述標記試劑可包含獨特的報告物"RP"，所述報告物"RP"可與被標記分析物所來源的樣品相關(guān)聯(lián)。因此，即使是通過對混合標記不同樣品得到的反應產(chǎn)物而獲得的被標記分析物的復雜混合物進行分析，也能將比如報告基團的存在和/或量的信息可與樣品中分析物的存在和/或量(通常以濃度和/或量表示)關(guān)聯(lián)起來?？梢韵旅娴姆绞竭M行這些復雜樣品混合物的分析允許以多重方式測定相同樣品或多種樣品中的一種或多種分析物。因此，本發(fā)明的方法、混合物、試劑盒和/或組合物特別適合于復雜樣品混合物的多重分析。例如，它們可用于蛋白質(zhì)組'〃究中。2.定義Af;^^本說^并^^^，摔炎^7"迷定義,'W卓炎^眉^Mi語A摔逸舍復炎，并jg義之丼^。^任命T迷定乂^任^T岸它Jt妖f逸括為摩有軍W時任辨遽過參孝并入本Jt時義嵌J々戎廢時'，況下，摔"T迷定乂^^:本文所用的"分析物"指可測定的任何目標分子。分析物的非限制性實例可包括但不限于蛋白質(zhì)、肽、核苷酸、寡核苷酸(DNA或RNA)、碳水化合物、脂質(zhì)、類固醇、氨基酸和/或分子量小于1500道爾頓的其它小分子。分析物來源或含有分析物的樣品不受限制，因為它可來自任何來源。分析物可以是天然的或合成的。分析物來源或含有分析物的樣品的非限定性實例包括但不限于細胞或組織、或其培養(yǎng)物(或傳代培養(yǎng)物)。分析物來源的非限定性實例包括但不限于粗細胞裂解物或處理過的細胞裂解物(包括全細胞裂解物)、體液、組織提取物或細胞提取物。分析物來源的其它非限定性實例還包括但不限于來自分離方法(比如色語分離或電泳分離)的級分。體液包括但不限于血液、尿、糞便、脊髄液、腦液、羊水、淋巴液或來自腺分泌的流體。就處理的細胞裂解物而言，我們意指除了裂解細胞所需的處理外還處理細胞裂解物，從而對收集的物質(zhì)進行其它處理。例如，樣品可以是含有一種或多種分析物的細胞裂解物，所述分析物是利用蛋白水解酶處理粗細胞裂解物的總蛋白質(zhì)成分從而消化一種或多種前體蛋白質(zhì)而形成的肽。為避免疑惑，術(shù)語分析物可包括初始的分析物和由此得到的化合物，除非根據(jù)上下文旨在表示清楚相反的含義。例如，在一些實施方案中，術(shù)語分析物可用于蛋白質(zhì)以及通過消化所述蛋白質(zhì)而由此得到的肽。本文所用的"斷裂，，指共價鍵的斷裂。本文所用的"片私斷裂"("fragment")指斷裂產(chǎn)物(名詞)或引起裂解的操作(動詞)。公認的是原子或分子的質(zhì)量可以通常近似到最接近的整數(shù)原子質(zhì)量單位或最接近的原子質(zhì)量單位的十分之一或百分之一。本文所用的"總質(zhì)量"指一定范圍內(nèi)的絕對質(zhì)量以及近似質(zhì)量，其中使用的不同原子類型的同位素在質(zhì)量上;(艮接近，從而在平衡才艮告物(r印orter)和/或連接物(linker)部分的質(zhì)量方面它們在功能上是等價的(因此在同量異位或同分異構(gòu)標記試劑的組或試劑盒中報告物/連接物組合的總質(zhì)量相同)，而不論所用的不同同位素類型在質(zhì)量上非常小的差異是否可被檢測到。例如，氧的常見同位素的總質(zhì)量是16.0(實際質(zhì)量15.9949)和18.0(實際質(zhì)量17.9992)，碳的常見同位素的總質(zhì)量是12.0(實際質(zhì)量12.00000)和13.0(實際質(zhì)量13.00336)，氮的常見同位素的總質(zhì)量是14.0(實際質(zhì)量14.0031)和15.0(實際質(zhì)量15.0001)。當這些值為近似值時，本領域技術(shù)人員應當理解，如果在組中的一個報告物中使用180同位素，則在含有"0的組的不同報告物中，另外的2個質(zhì)量單位(超過總質(zhì)量為16.0的氧同位素的值)可通過例如在報告物中的其它地方引入兩個碳13C原子代替兩個12C原子、兩個15N原子代替兩個"N原子或甚至一個13C原子和一個15N原子代替12C和14N以補償180而得到補償。這樣，所述組的兩個不同報告物是功能質(zhì)量上是相等同的(即具有相同的總質(zhì)量)，因為在所述組或試劑盒的所有標記中，使用兩個"C原子(代替兩個"C原子)、兩個"N原子(代替兩個"N原子)、一個13C和一個15N(代替12C和"N)或一個180原子(代替一個160原子)實現(xiàn)質(zhì)量增加2個道爾頓，它們之間極小的實際質(zhì)量差異并不會對本分析性質(zhì)造成妨礙。這可參照圖1A-1H進行說明。在圖1A中，報告物/連接物組合(圖1A，不包括反應活性碘基團；化學式d^CsH2。N15！^06)具有2個15N原子和5個"C原子，總理論質(zhì)量為357.2213。相比較而言，圖1C中所示的報告物/連接物同量異位物(isobar)(化學式C1Q13C6H2QN215N06)具有1個"N原子和6個13C原子，總理論質(zhì)量為357.2279。圖1A和C中的化合物是除了重原子同位素含量以外在結(jié)構(gòu)上和化學上不能區(qū)別的同量異位物，盡管具有微小的絕對質(zhì)量差異(分別為質(zhì)量357.2213與質(zhì)量357.2279)。然而，為了本發(fā)明的目的，圖IA和IC中化合物的總質(zhì)量記為357.2，因為不論質(zhì)諳儀是否足夠靈敏而檢測到圖1A和1C中同量異位物絕對質(zhì)量的這種小差異，這都不會妨礙分析。由圖1A-1H可以清楚地得知，結(jié)構(gòu)內(nèi)相同重原子同位素的分布并不是建立同分異構(gòu)和/或同量異位的標記試劑組的唯一考慮因素?？蓪⒅卦油凰仡愋突旌弦垣@得所期望總質(zhì)量的同分異構(gòu)體或同量異位物。這樣，重原子同位素的選擇(組合)及其分布均可考慮用于制備可用于本發(fā)明實施方案的同分異構(gòu)和/或同量異位的標記試劑。本文所用的"同位素富集"指已經(jīng)通過合成富集了一種或多種重原子同位素(例如穩(wěn)定的同位素比如氘、13C、15N、180、"Cl或"Br)的化合物(例如標記試劑)。由于同位素富集并非100%有效，所以可存在這些化合物的富集程度更低些的雜質(zhì)，它們的質(zhì)量較小些。同樣，由于過量富集(不期望的富集)和天然的同位素豐度，可存在質(zhì)量更高些的雜質(zhì)。在一些實施方案中，每種被引入的重原子同位素可以至少80%的同位素純度存在。在一些實施方案中，每種被引入的重原子同位素可以至少93%的同位素純度存在。在一些實施方案中，每種被引入的重原子同位素可以至少96%的同位素純度存在。本文所用的"同位素化形式"("isotopologue")化合物具有相同的化學組成，但在同位素組成(同位素取代數(shù)目)上不同，例如甲烷同位素化形式CH4、CH3D和CH;jD2。本文所用的"同量異位的同位素化形式"化合物是具有相同化學組成、同位素組成不同但通過質(zhì)譜儀檢測具有相同總質(zhì)量的那些物質(zhì)(例如對于甲烷的同量異位同位素化形式"CH4、13CH3D和CH;tD2來說，每種的總質(zhì)量為18個原子質(zhì)量單位)。一些實施方案是可具有至少兩種同位素富集原子的同位素富集化合物。在多個實施方案中，所述同位素富集化合物可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個同位素富集原子?；衔锏幕瘜W結(jié)構(gòu)可由任何前述式來表示，其中變量如通常以及在本文所述的類和亞類中所定義。本文所用的"標記試劑"指適于標記待檢測的分析物的結(jié)構(gòu)部分。術(shù)語標記(label)與術(shù)語標簽(tag)和標志(mark)以及其它等價的術(shù)語和短語是同義的。例如，被標記分析物還可以指被標簽分析物或被標志分析物。因此，術(shù)語"標記，，("label")、"標簽"("tag")、"標志，，("mark")以及這些術(shù)語的衍生詞是可互換的并且指適于標記或已經(jīng)標記了待檢測分析物的結(jié)構(gòu)部分。本文所用的"質(zhì)量標簽，，指可通過將具有特定總質(zhì)量的基團添加到分析物上而用于標記或標志分析物的標記試劑。質(zhì)量標簽組包括兩個或多個質(zhì)量標簽，每個質(zhì)量標簽將具有相同質(zhì)量的基團添加到被標記的分析物上。然而，當將解離能施加到來自所述組中其它質(zhì)量標簽的具有不同質(zhì)量的信號離子時，質(zhì)量標簽組中的每個質(zhì)量標簽都將斷裂。為本^兌明書起見，質(zhì)量標簽和標記試劑是等同的術(shù)語。因此，質(zhì)量標簽組是標記試劑組的等同物。本文所用的"栽體"、"固相支持物"、"固相栽體"指標記試劑或分析物可被固定于其上的任何固相材料。固定可例如用于標記分析物或用于制備標記試劑，而不管標記是否發(fā)生在載體上。固相載體包括術(shù)語比如"樹脂"、"合成載體"、"固相"、"表面"、"膜"和/或"載體"。固相載體可由有機聚合物組成，比如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯(polyethyleneoxy)和聚丙烯酰胺以及其共聚物和接枝物。固相載體還可以是無機的，比如玻璃、二氧化珪、可控多孔玻璃(CPG)、或反相二氧化硅。固相載體的結(jié)構(gòu)可以是珠、球、粒子、顆粒、凝膠、膜或表面的形式。表面可以是平面的、基本平面的或非平面的。固相載體可以是多孔的或非多孔的，并且可具有膨脹特性或非膨脹特性。固相載體可以以孔(well)、坑(depression)或其它容器、器皿、結(jié)構(gòu)特征(feature)或位置(location)的形式而構(gòu)建。多個固相栽體可以設置為處于陣列的不同位置，對試劑的自動遞送是可尋址的，或通過檢測方法和/或設備尋址。本文所用的"庫，，是多種不同的化合物(例如標記試劑、質(zhì)量標簽、被標記分析物等)，通常是5、10、25、50、100、250或更多種不同的化合物。通常構(gòu)建庫以便于順序、隨機、和/或平行取得其中一個、多個和/或全部的所迷不同化合物。例如，多種不同化合物庫可以在相同的瓶中，或可被固定到一種或多種固相栽體上等。通常，庫可具有至少兩種不同的化合物，所述化合物被固定在例如物理上不同的栽體(例如珠、球、粒子、顆粒等)的不同位置上或被固定在相同載體上的可尋址位置上(例如以隨機或規(guī)則陣列形式被固定到固相載體上)。庫中的不同化合物可與其它化合物(例如一種或多種分析物可與標記試劑庫進行反應)相接觸或可被分析(例如被標記分析物的庫可被分析)等。例如，在一些實施方案中，庫可包含多種不同的標記試劑，其中每種不同的標26記試劑可以以規(guī)則陣列的形式被固定到固相載體的已知地址上。通過分別將分析物樣品點滴(接觸)到每種不同的被固定的標記試劑中，所述庫可用于利用特定標記試劑標記多種單獨的分析物樣品，從而產(chǎn)生多種被標記分析物。在另一個實例中，標記試劑的庫可具有被固定到多種固體粒子中每種上的不同標記試劑。可通過使每種固體粒子與不同分析物樣品相接觸而使用庫，從而將多種被標記分析物固定到固體粒子上。本文所用的"親和配體"指作為分子鑒別系統(tǒng)的成員的分子。本文所用的"分子鑒別系統(tǒng)"指至少兩種分子或復合物的系統(tǒng)，所述分子或復合物彼此具有高的分子鑒別能力和高的彼此特異性結(jié)合的能力。在一些實施方案中，所述結(jié)合是特異性的，并且所述親和配體是結(jié)合對的一部分。除非明確指明為共價鍵，術(shù)語"結(jié)合"包括共價和非共價結(jié)合。本文所用的"特異性結(jié)合"指當分子鑒別系統(tǒng)的親和配體與一種或多種其它分子或復合物結(jié)合時，具有足以區(qū)分所述分子或復合物與樣品的其它成分或雜質(zhì)的特異性。用于本發(fā)明的分子鑒別系統(tǒng)是常規(guī)的并且未在本文中詳細描述。用于制備和利用這樣的系統(tǒng)的技術(shù)是本領域眾所周知的,并且被示例在Tijssen，P.,的出版物"LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiologyPracticeandTheoriesofEnzymeImmunoassays"(1988)，eds.BurdonandKnippenberg,NewYork:Elsevier中，其全部教導被并入本文。分子鑒別系統(tǒng)的實例包括例如抗原/抗體、抗原/抗體片段、抗生物素蛋白/生物素、鏈霉抗生物素蛋白/生物素、蛋白質(zhì)A/Ig或凝集素/碳水化合物。本文所用的"天然同位素豐度"指基于自然界中一種或多種同位素的天然顯著水平，在化合物中發(fā)現(xiàn)的一種或多種同位素的含量(或分布)。例如，從活的植物材料中得到的天然化合物通常可含有約1.08%的"C(相對于"C而言)。本文所用的"絲酸"指由-NH-CHR、C(0)-所代表的基團，其中議#是氫、氘、脂脈波基團、取代的脂肪旒基團、芳香族基團或取代的芳香a團。"天然氨基酸"是在自然界中發(fā)現(xiàn)的。實例包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和組氨酸。在一些實施方案中，R"可以是天然氨基酸的側(cè)鏈。天然氨基酸側(cè)鏈的實例包括甲基(丙氨酸)、異丙基(纈氨酸)、叔丁基(異亮氨酸)、-CH2CH(-CH3)2(亮氨酸)、芐基(苯丙氨酸)、對羥基千基(酪氨酸)、-CH2-OH(絲氨酸)、-CHOHCH3(蘇氨酸)、-CHr3-丐l咮基(色氨酸)、-012<:0011(天冬氨酸)、-(:112(:112<:0011(谷氨酸)、-CH2C(0)NH2(天冬酖胺)、-CH2CH2C(0)NH2(谷氨酰胺)、-CH2SH(半胱氨酸)、-CH2CH2SCH3(蛋氨酸)、-(CH2)4NH2(賴氨酸)、-(CH2)3NH2(鳥氨酸)、-{(CH)2}4NHC(=NH)NH2(精氨酸)和-CHr3-咪唑基(組氨酸)。其它天然氨基酸的側(cè)鏈包括含有雜原子的官能團，例如醇(絲氨酸、酪氨酸、羥脯氨酸和蘇氨酸)、胺(賴氨酸、鳥氨酸、組氨酸和精氨酸)、硫醇(半胱氨酸)或羧酸(天冬氨酸和谷氨酸)。當含雜原子的官能團被修飾成包含保護基時，所述側(cè)鏈指氨基酸的"被保護的側(cè)鏈"。在一些實施方案中，RW是M酸的被保護的側(cè)鏈。合適的保護基的選擇取決于被保護的官能團、保護基所暴露的條件以及可存在于分子中的其它官能團。上述官能團的合適保護基是本領域^的，并且許多實例被描述在Greene和Wuts的"ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis",JohnWiley&Sons(1991)中。僅僅利用常規(guī)的試驗，普通技術(shù)人員可選擇合適的保護基用于公開的合成中(包括除了下述保護基以外的保護基)以及用于應用和除去保護基的條件。本文所用的"肽"指含有兩個或多個通過酰胺(肽)鍵連接在一起的氨基酸的聚合物。本文所用的術(shù)語"任選地取代的"和"取代的或未取代的"是等價的。本文所用的鹵素基團指-F、-Cl、-Br、或-I。本文所用的術(shù)語"烷基"指完全飽和的直鏈或支鏈的Q-C2。烴或環(huán)狀CVC20烴。當在本文中使用時，術(shù)語"烷基"指可被取代或未取代的基團。在一些實施方案中，烷基可以完全飽和的是直鏈或支鏈d-Q烴或環(huán)狀QrC6烴。本文所用的術(shù)語"亞烷基"指直鏈或支鏈的烷基鏈或者環(huán)狀烷基，其任選地被取代，并且具有至少兩個與至少兩個結(jié)構(gòu)部分相連接的連接點(例如(-CHr，亞甲基}、-{CH2CH2-，亞乙基}、、、\等，其中括號表示連接點)。當在本文中使用時，術(shù)語"亞烷基"指可被取代或未取代的基團。本文所用的"烯基"指具有一個或多個雙鍵的直鏈或支鏈的C2-C2。烴或環(huán)狀C3-C2。烴。當在本文中使用時，術(shù)語"烯基"指可被取代或未取代的基團。在一些實施方案中，烯基可以是具有一個或多個雙鍵的直鏈或支鏈的<:2-<:6烴或環(huán)狀<:3-<:6烴。本文所用的術(shù)語"亞烯基"指具有與至少兩個結(jié)構(gòu)部分相連接的兩個連接點的烯基。當在本文中使用時，術(shù)語"亞烯基"指可被取代或未取代的基團。本文所用的"g，，指具有一個或多個巻鍵的直鏈或支鏈的C2-C2Q烴或環(huán)狀CVC2o烴。當在本文中使用時，術(shù)語";fe^"指可被取代或未取代的基團。在一些實施方案中，生基可以是具有一個或多個巻鍵的的直鏈或支鏈的C2-C6烴或環(huán)狀C3-C6烴。本文所用的術(shù)語"亞g"指具有與至少兩個結(jié)構(gòu)部分相連接的兩個連接點的M。當在本文中使用時，術(shù)語"亞炔基，，指可被取代或未取代的基團。本文所用的術(shù)語"脂肪族"指上述定義的任何直鏈、支鏈、或環(huán)狀烷基、烯基、和M部分。當在本文中使用時，術(shù)語"脂肪族"指可被取代或未取代的基團。本文所用的術(shù)語"雜烷基，，指其中烷基鏈中的一個或多個亞甲基被雜原子比如-O-、-S-和-NR-替代的烷基。R可以是氫、氘、烷基、芳基、芳基烷基、烯基、炔基、雜芳基、雜芳基烷基、或雜環(huán)烷基。當在本文中使用時，術(shù)語"雜烷基"指可被取代或未取代的基團。本文所用的術(shù)語"雜亞烷基，，指具有式-K亞烷基-X，)r-亞烷基卜的基團，其中對于每次出現(xiàn)，X，是-O-、-NR-或-S-;r是l10的整數(shù)。當在本文中使用時，術(shù)語"雜亞M"指可被取代或未取代的基團。在一些實施方案中，r可以是l5的整數(shù)。本文所用的術(shù)語"氮雜亞:^，，指其中至少一個X，是-NR-的雜亞烷基。當在本文中使用時，術(shù)語"氮雜亞烷基，，指可被取代或未取代的基團。本文所用的術(shù)語"芳基"單獨使用或作為另一結(jié)構(gòu)部分(例如芳基烷基等)的一部分使用，指碳環(huán)芳基比如苯基。芳基還包括稠合多環(huán)芳香環(huán)系，其中碳環(huán)芳香環(huán)被稠合到另一個碳環(huán)芳香環(huán)(例如l-萘基、2-萘基、1-蒽基、2-蒽基等)上或其中碳環(huán)芳香環(huán)被稠合到一個或多個碳環(huán)非芳香環(huán)(例如四氫亞萘、茚滿等)上。本文所用的術(shù)語"芳基，，指可被取代或未取代的基團。本文所用的術(shù)語"亞芳基"指具有與至少兩個結(jié)構(gòu)部分相連接的至少兩個連接點的芳基(例如亞苯基等)。稠合到碳環(huán)非芳香環(huán)的亞芳基的連接點可以是芳香環(huán)、非芳香環(huán)。本文所用的術(shù)語"亞芳基"指可被取代或未取代的基團。本文所用的術(shù)語"芳基烷基"指通過亞烷基連接子與另一個結(jié)構(gòu)部分連接的芳基。本文所用的術(shù)語"芳基烷基"指可被取代或未取代的基團。本文所用的術(shù)語"芳基亞烷基"指具有至少兩個與至少兩個結(jié)構(gòu)部分相連接的連接點的芳基烷基。第二個連接點可以在芳香環(huán)或亞烷基上。本文所用的術(shù)語"芳基亞^4，，指可被取代或未取代的基團，當芳基亞烷基被取代時，取代基可以在所述芳基亞烷基的芳香環(huán)或亞烷基部分或同時在芳香環(huán)和亞烷基部分。本文所用的術(shù)語"雜芳基"指含有l(wèi)、2、3或4個雜原子的芳香雜環(huán)，所述雜原子獨立地選自氮、硫和氧。本文所用的術(shù)語"雜芳基"指可被取代或未取fC的基團。雜芳基可被稠合到一個或兩個環(huán)上，比如環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基。雜芳基與分子的連接點可以在雜芳基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基或芳基環(huán)上，并且雜芳基可以通過碳或雜原子相連接。雜芳基可以30是被取代的或未取代的。雜芳基的實例包括咪唑基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、"惡唑基、瘞唑基、異嗜、唑基、異噱哇基、瘞二喳基、嗝二喳基、吡咬基、嘧咬基、吡漆基、歧嚷基、壹啉基、異壹啉基、吲唑基、苯并^惡唑基、苯并異嚅哇基、苯并呋喃基、苯并噢哇基、中氮茚基(indolizinyl)、咪唑并吡咬基、吡哇基、三峻基、異噢喳基、嚅喳基、四唑基、苯并咪唑基、苯并瘞哇基、苯并異噻哇基、苯并噻二哇基、苯并哺二哇基、吲咮基、四氫吲^^基、氮雜吲啡:基、咪唑并吡U、喹唑啉基、嘌呤基、吡咯并2，3嘧^、吡咯并[3,41嘧^或苯并(b)蓬吩基，其中每個基團任選地被取代。本文所用的術(shù)語"雜亞芳基"指具有至少兩個與至少兩個結(jié)構(gòu)部分相連接的連接點的雜芳基。本文所用的術(shù)語"雜亞芳基"指可被取代或未取代的基團。本文所用的術(shù)語"氮雜亞芳基，，指其中一個雜原子是氮的雜亞芳基。氮雜亞芳基&可包含1、2或3個非氮雜原子，比如S和O。本文所用的術(shù)語"氮雜亞芳基"指可被取代或未取代的基團。本文所用的術(shù)語"雜芳基烷基"指通過亞烷基連接子與另一個結(jié)構(gòu)部分相連接的雜芳基。本文所用的術(shù)語"雜芳基烷基"指可被取代或未取代的基團。本文所用的術(shù)語"雜芳基亞烷基，，指具有與至少兩個結(jié)構(gòu)部分相連接的至少兩個連接點的雜芳基烷基。第二個連接點可以在雜芳環(huán)或亞烷基上。本文所用的術(shù)語"雜芳基亞烷基"指可被取代或未取代的基團。當雜芳基亞烷基被取代時，取代基可以在所述雜芳基亞烷基的雜芳環(huán)或亞烷基部分上或同時在雜芳環(huán)和亞烷基部分上。本文所用的術(shù)語"雜環(huán)烷基"指含有一個或多個氧、氮或硫的非芳香環(huán)(例如嗎啉、哌啶、哌嚷、吡咯烷和硫代嗎啉)。本文所用的術(shù)語"雜環(huán)烷基"指可被取代或未取代的基團。本文所用的術(shù)語"雜環(huán)亞烷基"指具有至少兩個與至少兩個結(jié)構(gòu)部分相連接的連接點的雜環(huán)烷基。本文所用的術(shù)語"雜環(huán)亞烷基"指可祐^取代或未取^的基團。本文所用的術(shù)語"氮雜環(huán)亞烷基，，指其中一個雜原子是氮的雜環(huán)亞烷基。氮雜環(huán)亞烷^Ji可包含l、2或3個非氮雜原子，比如S和O。本文所用的術(shù)語"氮雜環(huán)亞烷基"指可被取代或未取代的基團。烷基、亞烷基、亞烯基、亞炔基、雜烷基、雜亞烷基、氮雜亞烷基、雜環(huán)烷基、雜環(huán)亞烷基、氮雜環(huán)亞烷基、芳基、亞芳基、芳基烷基、芳基亞烷基、雜芳基、雜亞芳基、氮雜亞芳基、雜芳基烷基和雜芳基亞烷基的合適取代基包括在用于以本發(fā)明的質(zhì)量標簽標記分析物的反應條件下穩(wěn)定的任何取代基。烷基、亞烷基、亞烯基、亞炔基、雜烷基、雜亞烷基、氮雜亞烷基、雜環(huán)烷基、雜環(huán)亞烷基、氮雜環(huán)亞烷基、芳基、亞芳基、芳基烷基、芳基亞烷基、雜芳基、雜亞芳基、氮雜亞芳基、雜芳基烷基和雜芳基亞烷基的取代基實例包氘、芳基(例如苯基)、芳基烷基(例如卡基)、硝基、氰基、鹵素(例如氟、氯、溴和碘)、烷基(例如曱基、乙基、異丙基、環(huán)己基等)、鹵代烷基(例如三氟甲基)、烷氧基(例如曱氧基、乙緣等)、羥基、-NRWRW、-NRwC(0)R°、-C(0)NRwRw、-C(0)Rw、-C(0)ORw，其中每個ir獨立地是氫、氘、烷基、芳基或芳基烷基，并且每次出現(xiàn)的R。獨立地;lj^基、芳基或芳基烷基。此外，芳基、亞芳基、雜芳基或雜亞芳基的取代基可以是包含親和配體的基團或包含固相栽體的基團。此外，烷基、亞烷基、雜烷基、雜亞烷基、氮雜亞烷基、雜環(huán)烷基、雜環(huán)亞烷基、氮雜環(huán)亞烷基、以及烯基、亞烯基、炔基、亞炔基、芳基烷基、芳基亞烷基、雜芳基烷基和雜芳基亞烷基的任何飽和部分還可被=0、=S、N-RW取代。當雜環(huán)烷基、雜環(huán)亞烷基、雜芳基、雜亞芳基、雜芳基烷基、或雜芳基亞烷基含有氮原子時，其可以是取代或未取代的。當雜芳基的芳香環(huán)中的氮原子具有取代基時，所述氮可以是季氮。脂肪族、非芳香雜環(huán)基、千基、芳基環(huán)碳和雜芳基環(huán)碳的合適取代基是那些基本上不影響所7〉開化合物的>^應活性基團的標記^^應的基團。合適的取代基的實例可包括氘、-OH、卣素(-F、-Cl、-Br、-1)、-CN、-N02、-ORa、-C(0)Ra、-OC(0)Ra、-C(0)ORa、-SRa、-C(S)Ra、-OC(S)Ra、-C(S)ORa、-C(0)SRa、-C(S)SRa、-S(0)Ra、-S02Ra、-S03Ra、-P02RaRb、-P03RaRb、-OP03RaRb、-N(RaRb)、-C(0)N(RaRb)、-C(0)NRaNRbS02Rc、-C(0)NRaS02Rc、-C(0)NRaCN、-S02N(RaRb)、-NRaS02Rc、-NRcC(0)Ra、-NRcC(0)ORa、-NRcC(0)N(RaRb)、-C(NRc)-N(RaRb)、-NRd-C(NRc)-N(RaRb)、-NRaN(RaRb)、-CRc=CRaRb、-C三CR3、=0、=S、=CRaRb、=NRa、=NORa、=NNRa、任選地取代的烷基、任選地取代的環(huán)烷基、任選地取代的脂肪族、任選地取代的環(huán)脂肪族、任選地取4戈的非芳香雜環(huán)、任選地取代的節(jié)基、任選地取代的芳基以及任選地取代的雜芳基，其中Ra-Rd各自獨立地是-H、氘(D)、或任選地取代的脂肪族、任選地取代的環(huán)脂肪族、任選地取代的非芳香雜環(huán)、任選地取代的爺基、任選地取代的芳基或任選地取代的雜芳基，優(yōu)選烷基、節(jié)M苯基。此外，-N(RaRb)作為一個整體可以是任選地被取代的雜環(huán)基。非芳香雜環(huán)基、節(jié)基或芳基還可具有脂肪族基團或取代的脂肪族基團作為取代基。取代的脂肪族基團還可具有非芳香族雜環(huán)、取代的非芳香族雜環(huán)、千基、取代的千基、芳基或取代的芳基作為取代基。取代的脂肪族、非芳香族雜環(huán)基團、取代的芳基或取代的節(jié)基可具有一個以上的取代基。具有與其它雜芳基環(huán)原子形成的三個共價鍵的雜芳基環(huán)氮原子的合適取代基包括-OH和低級烷氡基(優(yōu)選Cl-C4烷氡基)。具有與其它雜芳基環(huán)原子形成的三個共價鍵的取代的雜芳基環(huán)氮原子是帶正電荷的，其可收良陰離子如氯離子、溴離子、甲酸根、乙酸根等平衡。其它合適的反陰離子的實例在下面涉及可藥用鹽的部分中提供。具有與其它原子形成的兩個共價鍵的氮原子(例如具有與其它環(huán)原子形成的兩個共價鍵的雜芳基環(huán)氮原子)的合適取代基包括例如任選地取代的烷基、任選地取代的環(huán)烷基、任選地取代的脂肪族、任選地取代的環(huán)脂肪族、任選地取代的雜環(huán)、任選地取代的千基、任選地取代的芳基、任選地取代的雜芳基、隱CN、-N02、-ORa、-C(0)Ra、-OC(O)R3、-C(0)ORa、-SRa、-S(0)Ra、-S02Ra、-S03Ra、-N(RaRb)、-C(0)N(RaRb)、-C(0)NRaNRbS02Rc、-C(0)NRaS02Rc、-C(0)NRaCN、-S02N(RaRb)、S02N(RaRb)、-NRcC(0)Ra、-NRcC(0)ORa、-NRCC(O)N(RaRb)等。更典型地，具有與其它原子形成的兩個共價鍵的氮原子的取>[<基可以是烷基、取代的烷基(包括卣代烷基)、苯基、取代的苯基、-S(O)H烷基)、-S(O)rNH(烷基)和-S(0)rNH(烷基)2。含氮的雜芳基或非芳香雜環(huán)可被氧取代而形成N-氧化物，例如作為吡免基N-氧化物、哌免基N-氧化物等。本文所用的術(shù)語"鹽形式"包括化合物(標記試劑)的鹽、或化合物的鹽的混合物。此外，化合物的兩性離子形式也包括在術(shù)語"鹽形式"中。具有胺或其它堿性基團的質(zhì)量標簽的鹽可例如通過與合適的有機酸或無機酸(比如氯化氫、溴化氫、乙酸、高氯酸等)>^應而得到。含有季銨基團的化合物還可包含反陰離子比如氯離子、溴離子、碘離子、乙酸根、高氯酸根等。具有羧酸官能團或其它酸性官能團的化合物的鹽可通過使所述化合物與合適的堿(例如氫氧化物堿)反應而制得。因此，酸性官能團的鹽可具有反陽離子，比如鈉離子、鉀離子、鎂離子、鈣離子等。術(shù)語"水合物形式"包含化合物的任何水合狀態(tài)或化合物的一種以上水合狀態(tài)的混合物。例如，本發(fā)明的質(zhì)量標簽可以是半水合物、單水合物、二水合物等。3.
發(fā)明內(nèi)容概要反應活性基團用于所述方法、混合物、試劑盒和/或組合物的實施方案中的一種或多種標記試劑的變量"RG，，可以是反應活性基團，例如能與樣品的一種或多種JJI活性分析物進行反應的親電基團或親核基團，或所述反應活性基團與分析物的反應產(chǎn)物。所述反應活性基團可以^:預先存在的或其可在原位制備。在一些實施方案中，反應活性基團的原位制備可在不存在^^應活性分析物的情況下進行，在一些實施方案中，其可在存在反應活性分析物的情況下進行。例如，可利用水溶性的碳二亞胺(例如l-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；EDC)對羧酸基團進行原位修飾，從而制備可與親核基團比如胺基進行反應的親電基團。在一些實施方案中，用EDC對標記試劑的羧酸基團的活化可在存在含有胺(親核基團)的分析物的情況下進4亍。在一些實施方案中，還可在與EDC進行初始反應后加入含有胺(親核基團)的分析物。在一些實施方案中，可通過原位除去保護基而原位產(chǎn)生反應活，基團。因此，任何存在的或新'產(chǎn)生的可通過親核，，和混合物、試劑盒和/或組合物的實施方案中。當標記試劑的反應活性基團是親電基團時，其可與分析物的合適的親核基團進行反應。當標記試劑的反應活性基團是親核基團時，其可與分析物的合適的親電基團進行反應。多個合適的親核基團和親電基團對是已知的并常用于化學和生物化學領域中。含有可被偶聯(lián)到分析物(例如蛋白質(zhì)、肽、核苷酸、碳水化合物、，脂質(zhì),、類固醇或其它小于1:00道爾頓的小例被描述于thePierceLifeScience&AnalyticalResearchProductsCatalog&Handbook(aPerstorpBiotecCompany),Rockford,IL61105，USA中。其它合適的試劑是本領域中眾所周知的，并且可從許多其它供應商(比如Sigma-Aldrich)處購得。標記試劑的反應活性基團可以是胺反應活性基團。例如所述胺反應活性基團可以是活性酯。活性酯是肽合成中眾所周知的，并且指在肽合成常用的務降下容易與氛基酸的N-ct胺進行反應的某些酯。胺反應活性酯可以是N-羥基琥珀酰亞胺酯、N-鞋基磺基琥珀酰亞胺酯、五氟苯酯、2-硝基苯酯、4-硝基苯酯、2，4-二硝基苯酯或2,4-二卣代苯酯。圖8以圖示方式說明活性酯的醇基或硫醇基的離去基團(LG)示例性通式，其中每個G獨立地是O或S，但通常是O。所有這些基團是肽化學領域中公知的形成活性酯的醇基或硫醇基，其中所述醇基或硫醇基通過氨基酸的N-a胺與酯的g碳的反應而被置換。顯然，本文所述的任何合適的標記試劑/標簽試劑的活性酯(例如N-羥基琥珀酰亞胺酯)可利用眾所周知的步驟進行制備(參見GregT.Hermanson(1996)."TheChemistryofReactiveGroups"in"BioconjugateTechniques"Chapter2pages137-165，AcademicPress,(NewYork);也參見InnovationAndPerspectivesInSolidPhaseSynthesis,Editor:RogerEpton，SPCC(UK)Ltd,Birmingham,19卯)。形成嗎啉乙酸、喊咬乙酸、哌漆乙酸和N-取代哌溱乙酸化合物(是通式RP-X-LK-Y-RG的標記試劑的代表性實例)的活性酯的方法被描述于2004年1月27日提交的未決共有美國專利申請No.10/751,354中，為所有目的，該申請的全部教導在此通過引用并入本文。在一些實施方案中，標記試劑的反應活性基團可以是混合酸酐，因為已知混合酸酐能有效地與胺基反應從而形成酰胺鍵。標記試劑的反應活性基團可以是硫醇反應活性基團。例如，所述硫醇反應活性基團可以是馬來酰亞胺、烷基卣化物、a-卣代-?；姆蓟栈?a.k.a.?；x化物)。g化物和由素指氟、氯、溴或硤原子。在一些實施方案中，RG基團是I-(CH2)C(0)-。標記試劑的反應活性基團可以是羥基反應活性基團。例如，所述羥基反應活性基團可以是三苯曱基-卣化物或曱硅烷基-卣化物反應活性部分。所述三苯甲基-卣化物反應活性部分可以是取代的(例如Y-甲氡基三苯甲基、Y-二甲氧基三苯曱基、Y-三甲氧基三苯甲基等)或未取代的，其中Y在下文中定義。甲硅烷基反應活性部分可以是烷基取代的甲硅烷基卣化物，比如Y-二甲基甲硅烷基、Y-二三乙基甲硅烷基、Y-二丙基甲珪烷基、Y-二異丙基甲硅烷基等，其中Y在下文中定義。標記試劑的反應活性基團可以是親核基團。在一些實施方案中，RG基團是胺基、羥基、硫醇基或-NH-NH2-基團，更典型地是胺基、羥基或硫醇基。反應活性基團可以是能與分析物上胍基反應的基團。在一些實施方案中，RG基團是v\。'。反應活性基團可以是光反應活性基團。在一些實施方案中，RG基在一些實施方案中，本發(fā)明的標記試劑包含2個或更多個RG基團。因此，提供了式RP-X-LK-(Y-RG)y的標記試劑，其中y是l-3。在一些實施方案中，y是2。報告物部分用于所述方法、混合物、試劑盒和/或組合物的實施方案中的一種或多種標記試劑的報告物部分是具有可被檢測的獨特質(zhì)量(或質(zhì)荷比)的基團。因此，組中的每個寺艮告物都可具有獨特的總重量。不同的才艮告物可包含一種或多種重原子同位素以實現(xiàn)其獨特的質(zhì)量。例如，存在碳(12<:、13C和"C)、氮("N和"N)、氧(160和180)或氫(氫、氘和氚)的同位素并且可用于制備報告物部分的各種基團。穩(wěn)定的重原子同位素的實例包括13C、15N、180和氘。通^免試劑中出現(xiàn)180可降低標記試劑的成本并且可提高同位素純度。這些同位素的實例是非限定性的，因為其它的輕原子同位素和重原子同位素也可用于l艮告物中。適用于制M有輕原子同位素和重原子同位素的基本原材料可從多種商業(yè)來源得到，比如CambridgeIsotopeLaboratories、Andover、MA(見www.isotope.com中的名單或"basicstartingmaterials")和Isotec(Sigma隱Aldrich的一個分支W^)。CambridgeIsotopeLaboratories和Isotec還將按照^^托合成合同制備,斤期望的化合物。^#。獨特的報告物可與感興趣的樣品相關(guān)聯(lián)，從而利用含有所述報告物的標記試劑標記該樣品的一種或多種分析物。這樣有關(guān)才艮告物的信息可與有關(guān)該樣品的一種或所種分析物的信息相關(guān)。然而，當檢測報告物時，報告物并不需要與分析物物理地連接。而是可以在被標記分析物的離子斷裂從而產(chǎn)生子片段離子和可檢測的報告物之后，在例如串g量分析器的二級質(zhì)量分析中檢測報告物的獨特總質(zhì)量。所檢測的報告物可用于鑒定被檢測分析物所來源的樣品。此外，所述獨特報告物相對于其它報告物的量或相對于一個或多個校正標準物(例如用特定凈艮告物標記的分才斤物)的量可用于測定一種或多種樣品中分析物的相對量或絕對量(通常以濃度和/或量表示)。因此，特定樣品中一種或多種分析物的信息(比如量)可與用于標記每種特定樣品的報告物部分相關(guān)聯(lián)。當M—種或多種分析物進行鑒定時，該信息可與涉及不同報告物的信息相關(guān)聯(lián)，從而便于鑒定一種或多種樣品中每種被標記分析物并測定其量。報告物包含固定電荷或能被電離。因為報告物包含固定電荷或能被電離，所以標記試劑可被分離或用于標記鹽形式或兩性離子形式的反應活性分析物。報告物的電離便于其在質(zhì)鐠儀中的測定。因此，才艮告物可作為離子(有時稱為信號離子)而^L檢測到。當電離時，凈艮告物可包含一個或多個正電荷或負電荷。因此，報告物可包含一個或多個酸性基團或堿性基團，因為這樣的基團可容易地在質(zhì)*中電離。例如，報告物可包含一個或多個堿性氮原子(正電荷)或一個或多個可電離的酸性基團比如羧酸根、磺酸根或磷酸根(負電荷)。在一些實施方案中，報告物可包含取代或未取代的千基離子。37可選擇報告基因使得其在通常用于分析物分析的條件下基本上不進行亞斷裂(sub-fragment)?？蛇x擇報告物使得其在施加解離能以引起被標記分析物的至少一部分所選離子的X鍵和Y鍵在質(zhì)鐠儀中均斷裂的條件下基本上不進行亞斷裂。"基本上不進行亞斷裂"，意指在成功分析目標分析物時，難于或不可能以高于背景噪音的水平檢測到報告物的片段。可有意選棒報告物的總質(zhì)量，使之與尋求測定的分析物或任何所預計的分析物的片段的質(zhì)量相比是不同的。例如，當?shù)鞍踪|(zhì)或肽是分析物時，可選擇報告物的總質(zhì)量，使之與任何天然氨基酸或肽或其所預計的片段相比是不同的。這可便于分析物的測定，因為取決于分析物，沒有任何可能的具有完全相同質(zhì)量的樣品成分可增加任何分析結(jié)果的可信度。對于肽而言預計背景很少的質(zhì)量范圍的實例可見于表1。表1:用于選擇標記物片段離子m/z的可能"安靜區(qū)域"<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>才艮告物的總質(zhì)量可小于250道爾頓。這樣的小分子可容易地在二級質(zhì)量分析中測定，在所述二級質(zhì)量分析中不含有具有與一級質(zhì)量分析中完全相同質(zhì)量的其它樣品成分。在本文中，通常可在串^it譜儀中對在一級質(zhì)量分析中測定的所選離子進行二級質(zhì)量分析。因為可從一級質(zhì)量分析中特定地選擇出具有特定質(zhì)荷比的離子用于可能的斷裂和進一步的質(zhì)量分析，一M量分析中未被選擇的離子不再進行二M量分析，因此不會污染二級分析的譜。此外，質(zhì)鐠儀的靈敏度和檢測器的線性(為定量目的)在這樣的4^:量范圍內(nèi)可以相當穩(wěn)健。另外，在這樣的質(zhì)量范圍內(nèi)，質(zhì)語儀技術(shù)的目前狀況可允許小于1道爾頓的基線質(zhì)量分辨率。這些因素可證明其對改進本領域狀態(tài)是有用的。連接物部分取決于是否已經(jīng)與分析物發(fā)生反應，所述方法、混合物、試劑盒和/或組合物的實施方案所用的化合物中由LK、LK1、LK2、LK3、LK4、LK5活性基團連接起來。當X鍵和Y鍵均斷裂時，可選擇連接物以產(chǎn)生不帶電物質(zhì)(即當X鍵和Y鍵均斷裂時經(jīng)歷中性物丟失(neutralloss))。連接物可以是非常小的部分，比如氣基或疏代裝基。例如，連接物可包含至少一種重原子同位素并且包含下式9SNHNR1人人或其中每個W相同或不同，并且是含有1~8個^l子的烷基，所述烷基可任選地含有雜原子或取代或未取代的芳基，其中所述烷基和芳基的碳原子獨立地包含被連接的氫、氘和/或氟原子。連接物可以是較大的結(jié)構(gòu)部分，比如氨基酸或雜烷基。連接物可以是聚合物或生物聚合物(例如肽)。當被施加解離能水平時，連接物可以被設計成子片段(sub-fragment),包括亞斷裂從而產(chǎn)生連接物的一種或多種中性片段。在一些實施方案中，由連接物僅產(chǎn)生中性片段。圖9A-9B描述了,'-x/v部分(在一些實施方案中，其可被LK基團包含)。每個用波浪線結(jié)尾的鍵表示與報告物、載體、反應活性基團或分析物連接的點。連接物部分可包含一種或多種重原子同位素，使得其質(zhì)量補告物之間的總質(zhì)量差異。此外，對于混合物的每種被標記分析物而言或?qū)τ诮M和/或試劑盒的試劑而言，所述報告物-連接物組合的合計總質(zhì)量(即作為整體的總質(zhì)量)可以《一相同的。更具體而言，連接物部分可補償不同樣品中祐:標記分析物的報告擲之間的總質(zhì)量差異，其中報告物的獨特的總質(zhì)量與被標記分析物所來源的樣品相關(guān)，并且不管被標記分析物所來源的樣品如何，對于樣品混合物的每種被標記分析物而言，l艮告物-連接物組合的合計總質(zhì)量都是相同的。這樣，當被標記并且然后混合以產(chǎn)生樣品混合物時，兩個或更多個不同樣品中相同分析物的總質(zhì)量即可具有相同的總質(zhì)量。例如，被標記的分析物，或者用于標記分析物的組和/或試劑盒中的標記試劑(例如質(zhì)量標簽)可以是同分異構(gòu)體或同量異位物(isobar)。因此，如果由樣品混合物的初始質(zhì)量分析選擇在質(zhì)讒儀中特定質(zhì)荷比的離子(即所選離子，取自樣品混合物)，則來自組成樣品混合物的不同樣品的相同分析物再次出現(xiàn)在所選的離子中，其與樣品混合物中其各自的濃度和/或量成比例。因此，連接物不僅連接報告物與分析物，它還可用于補償獨特報告物部分的質(zhì)量差異，從而協(xié)調(diào)多個樣品的被標記分析物中報告物-連接物組合的總質(zhì)量。因為連接物可在標記試劑中起到報告物的質(zhì)量平衡物的作用，從而使得對于組或試劑盒中的所有試劑而言報告物-連接物組合的合計總質(zhì)量相同，所以連接物中的原子數(shù)越多，組和/或試劑盒中不同的同分異構(gòu)/同量異位的標記試劑的可能數(shù)量就越大。換言之，通常連接物包含的原子數(shù)越多，存在的潛在報告物-連接物組合數(shù)就越大，因為在連接物中大多數(shù)任何位置的同位素都可被取代，從而產(chǎn)生連接物部分的同分異構(gòu)體或同量異位物，其中連接物部分用于彌補報告物部分的質(zhì)量差異并因此產(chǎn)生報告物-連接物同分異構(gòu)體或同量異位物的組。這樣的標記試劑的不同組特別適于相同和/或不同樣品中分析物的多重分析。組和/或試劑盒中標記試劑的總數(shù)可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個。組或試劑盒中標記試劑的多樣性僅受到才艮告物和連接物部分的原子數(shù)、可獲得的用于取代輕同位素的重原子同位素和可通過合成摻入同位素的多種合成構(gòu)型的限制。然而，如上所述，多種同位素富集的基本原材料可容易地從制造商比如CambridgeIsotopeLaboratories和Isotec處得到。這樣的同位素富集的基本原材料可用在用于制備同量異位和同分異構(gòu)的標記試劑組的合成方法中，或者用于制備同位素富集的原材料，所述同位素富集的原材料可用在用于制備同量異位和同分異構(gòu)的標記試劑組的合成方法中。制備適用于標記試劑組中同量異位的標記試劑的一些實例可見于下述實施例部分。報告物-連接物組合本文所述的標記試劑包含通過X鍵連接的凈艮告物和連接物。如上所述，對于標記試劑的組和/或試劑盒中的每個成員而言，報告物-連接物組合的總質(zhì)量可以相同。此外，標記試劑的報告物-連接物組合的X鍵可被構(gòu)建成當被施加解離能水平時至少所選離子的一部分斷裂，從而從分析物中釋放出報告物。因此，報告物的總質(zhì)量(以m/z比表示)及其強度可直接在MS/MS分析中觀察到。報告物-連接物組合可包含組或試劑盒中多種標記試劑的相同或不同重原子同位素的多種組合。在科學文獻中，這有時^皮稱為編碼或同位素編碼。例如，Abersold等人公開了同位素編碼的親和標簽(isotopecodedaffinitytag,ICAT;參見WO00/11208)。一方面，Abersold等人的試劑不同于本發(fā)明的標記試劑，因為Abersold沒有教導兩種或更多種相同質(zhì)量的標記試劑，比如同分異構(gòu)的或同量異位的標記試劑。質(zhì)鐠忉質(zhì)譜(MS):可利用串M譜儀和其它能選擇并斷裂分子離子的質(zhì)脊義來實踐本發(fā)明的方法。串^t脊汊(以及在較小程度上的單^t譜儀)能根據(jù)分子離子的質(zhì)量-電荷(m/z)的比選擇并斷裂分子離子，然后記錄所得的片段(子)離子鐠。更具體而言，子片段離子(daughterfragmention)譜可通過給所選離子施加解離能水平(例如碰撞i秀發(fā)解離(CID))而產(chǎn)生。例如，可在一級質(zhì)量分析中選擇出對應于具有特定m/z比的被標記肽的離子并將其斷裂，在二級質(zhì)量分析中再分析?？蛇M行這樣的串聯(lián)質(zhì)量分析的代表性儀器包括但不限于磁性四區(qū)質(zhì)鐠儀(magneticfour-sector)、串聯(lián)飛行時間質(zhì)鐠儀、三重四極桿質(zhì)譜儀、離子阱質(zhì)譜儀和混合四極桿飛行時間(Q-TOF)質(zhì)i糾。這些類型的質(zhì)譜儀可與多種電離源聯(lián)合使用，所述電離源包括但不限于電噴霧電離(ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)。當分析物并非已具有固定電荷時，可利用電離源產(chǎn)生用于一級質(zhì)量分析的帶電物質(zhì)。其它的質(zhì)語儀器和斷裂方法包括MALDI-MS儀器中的源后衰變和利用MALDI-TOF(飛行時間)-TOFMS的高能CID。對于串^MHf^的最新綜述,請參見R.Aebersold和D.Goodlett,Mass5^"r麵e^vzTiiVW^附iV^O^/w.及ev.JW:269-295(2001)。還參見美國專利No.6,319,476(為所有目的，其內(nèi)容在此通過引用并入本文)中對TOF-TOF質(zhì)量分析技術(shù)的論述。利用解離能水平的斷裂公認的是，鍵可以因在質(zhì)譜儀中發(fā)生的過程而斷裂。此外，通過使離子經(jīng)歷解離能水平而可以在質(zhì)鐠儀中誘發(fā)鍵斷裂。例如，通5撞誘導解離(CID)可在質(zhì)鐠儀中產(chǎn)生解離能水平。質(zhì)語領域中普通技術(shù)人員應當了解用于施加引起斷裂的解離能水平的示例性技術(shù)包括但不限于光解離、電子捕獲和表面誘導解離。通過;並撞誘導解離來斷裂鍵的方法包括使所選離子的動能態(tài)升高到發(fā)生鍵斷裂的程度。例如，可通it^碰撞室中與惰性氣體(比如氮、氦或氬)碰撞而轉(zhuǎn)移動能?？赊D(zhuǎn)移給離子的動能量與允許i^^撞室的氣體分子數(shù)成比例。當存在的氣體分子越多時，可轉(zhuǎn)移給所選離子的動能量就越多，而當存在的氣體分子越少時，則越少的動能被轉(zhuǎn)移。因此，很清楚，可對質(zhì)譜儀中的解離能水平進行控制。還公認的是某些鍵較其它鍵更不穩(wěn)定。分析物或報告物-連接物部分中鍵的不穩(wěn)定性取決于所述分析物或所述才艮告物-連接物部分的性質(zhì)。因此，可調(diào)節(jié)解離能水平使得可以可檢測的方式斷裂分析物和/或標簽(例如報告物-連接物組合)。本領域技術(shù)人員應當理解如何對質(zhì)諳儀元件進行這樣的常規(guī)調(diào)整以達到合適水平的解離能，從而將至少部分被標記分析物的離子斷裂成離子化的報告物部分和子片段離子。例如，可將解離能施加給從一級質(zhì)量分析中選#^/分離的離子。在串^f鐠儀中，可向提取的離子施加解離能水平，然后將所述離子轉(zhuǎn)移到二級質(zhì)量分析器中。所選的離子可具有選定的質(zhì)荷比。所述質(zhì)荷比可在由質(zhì)*^的特性所決定的一定范圍的質(zhì)荷比內(nèi)。當使用碰撞誘導解離時，可通過使離子通it^並撞室(在那里可施加解離能從而產(chǎn)生片段離子)而將其從一級質(zhì)量分析器中轉(zhuǎn)移到二級質(zhì)量分析器中。例如，被送到二級質(zhì)量分析器用于分析的離子可包括所有的、一些或部分的剩余的(未斷裂的)所選離子、以及被標記分析物的報告物離子(信號離子)和子片段離子。利用計算機輔助數(shù)據(jù)庫分析的分析物測定在一些實施方案中，可基于通過與已知或"理論的"分析物的光語進行計算機輔助比較而分析的子離子(daughter-ion)斷裂模式來測定分析物。例如，在低能CIDM下斷裂的肽離子的子片段離子鐠可被認為是許多離散的斷裂事件的總和。普通命名法按照斷裂的酰胺鍵和鍵斷裂后保留電荷的肽片段來區(qū)分子片段離子。電荷保留在易斷裂酰胺鍵的N-末端側(cè)導致形成b-型離子。如果電荷保留在斷裂的酰胺鍵的C-末端側(cè)，那么片段離子稱為y-型離子。除了b-型和y-型離子外，CID質(zhì)鐠還可包含其它的診斷片段離子(子片段離子)。這些離子包括通過由谷氨酰胺、賴氨酸和精氨酸中性丟失氨(-17amu)或由含羥基的氨基酸比如絲氨酸和蘇氨酸失去水(-18amu)而產(chǎn)生的離子。已發(fā)現(xiàn)某些4l^酸在低能CID條件下比其它氨基酸更容易斷裂。這對于含有脯氨酸或天冬氨酸殘基的肽而言尤其明顯，并且在天冬氨酰-脯氨酸鍵上甚至更明顯(Mak,M.等，及fl/wV/CV附附"".Ma^5)^"ra附""837-842)(1998)。因此，Z畫pro二聚體或Z-asp二聚體的肽鍵相比于所有其它^酸二聚體組合之間的肽鍵將傾向于更不穩(wěn)定，其中Z是任何天然的氨基酸，pro是脯氨酸，asp是天冬氨酸。因此，對于肽和蛋白質(zhì)樣品而言，低能CID鐠在重疊b-和y-系列離子、來自相同肽的內(nèi)部片段離子、和銨根離子(immonium)以及其它中性丟失的離子中含有多余的序列特異性信息。解釋這樣的CID譜以從頭組裝母肽的JL^酸序列是具有挑戰(zhàn)性的并JL^C時的。鑒定肽序列的最重要的聯(lián)的計算機運算法則的開發(fā)。這樣的方法由程序比如SEQUEST(Eng，J.等/爿附.Maw5^"ra附.，5:976-989(1994))和MASCOT(Perkins,D.等￡/e"w/7/^MMS,M:3551-3567(1999))作為示例。簡而言之，實驗性肽CID譜(MS/MS語)與從蛋白質(zhì)或基因組序列數(shù)據(jù)庫中得到的肽序列計算產(chǎn)生的"理論"子片段離子譜相匹配或相關(guān)聯(lián)。所i^目匹配或相關(guān)聯(lián)U于MS/MS模式中子片段離子的所預測質(zhì)量和所觀察質(zhì)量之間的相似性。根據(jù)實驗性片段模式和"理論"片段模式的一致程度對潛在的匹配或相關(guān)性進行評分。對搜索給定肽M酸序列數(shù)據(jù)庫的限制是可區(qū)別的，以至于單一的肽CID譜即可足夠用于鑒定整個基因組或表達序列標簽(EST)數(shù)據(jù)庫中任何給定的蛋白質(zhì)。其他論述請參見Yates,J.R,Trends,76:5-8(2000)和Yates，J.R.，￡7醋—0聰、":893-900(1998)。因此，子片段離子的MS/MS鐠分析不僅可用于測定被標記分析物的分析物，其還可用于測定被檢測分析物所來源的分析物。例如，MS/MS分析中肽的鑒定可用于測定肽從中作為蛋白質(zhì)酶消化結(jié)果而斷裂下來的蛋白質(zhì)。預計這樣的分析可用于其它分析物，比如寡核苷酸。X鍵和Y鍵X是報告物原子和連接物原子之間的鍵。Y是連接物原子和反應活性基團或分析物(如果標記試劑已經(jīng)與反應活性分析物反應)的原子之間的鍵。可用于本發(fā)明實施方案中的多種標記試劑(即RP-X-LK-Y-RG)的X鍵和Y鍵在經(jīng)歷解離能水平時可以在至少一部分所選離子中斷裂。因此，可在質(zhì)譜儀中調(diào)節(jié)解離能水平，使得被標記分析物(即RP-X-LK-Y-分析物)的至少一部分所選離子中X鍵和Y鍵二者都斷裂。X鍵的斷裂將才艮告物從分析物釋放出來，使得I艮告物可獨立于分析物而^L檢測。Y鍵的斷裂取決于X鍵是否已經(jīng)斷裂。Y鍵可比X鍵更不穩(wěn)定。X鍵可比Y鍵更不穩(wěn)定。X鍵和Y鍵可以具有同樣的相對不穩(wěn)定性。在一些實施方案中，X鍵可比Y鍵更不穩(wěn)定。在一些實施方案中，X鍵斷裂而Y鍵則保持不變。在另一些實施方案中，X鍵斷裂并且Y鍵也斷裂。當目標分析物是蛋白質(zhì)或肽時，可根據(jù)酰胺(肽)鍵調(diào)節(jié)X鍵和Y鍵的相對不穩(wěn)定性。X鍵、Y鍵或X鍵和Y鍵二者與典型的酰胺(肽)鍵相比較可以更不穩(wěn)定、同樣不穩(wěn)定或更穩(wěn)定。例如，在解離能條件下，與Z-pro二聚體或Z-asp二聚體(其中Z是任何天然的絲酸，proAM氨酸和asp是天冬氨酸)的肽鍵相比，X鍵和/或Y鍵可能較不易于斷裂。在一些實施方案中，X鍵和Y鍵將在大約與典型的酰胺鍵相同的解離能水平下進行斷裂。在一些實施方案中，X鍵和Y鍵將在與典型的酰胺鍵相比更高的解離能水平下進行斷裂。在一些實施方案中，X鍵和Y鍵也可以Y鍵的斷裂導致X鍵斷裂的方式存在，反之亦然。這樣，X鍵和Y鍵可基本上同時斷裂，從而在二級質(zhì)量分析中沒有顯著量的分析物或其子片段離子包含部分標記物。"顯著量的分析物"意指小于25%并且優(yōu)選小于10%的可在MS/MS傳中,皮檢測到的部分標記分析物。因為在二^"量分析(MS/MS)的圖鐠方面分析物的被標記和未被標記的片段之間可存在清楚的區(qū)分，所以該特征可簡化從子片段離子鐠的計算機輔助分析中鑒別分析物。而且，在一些實施方案中，因為分析物的片段離子可被報告物/連接物部分全部標記或未標記(但不是部分地標記)，因此可能很少或沒有跨斷裂鍵的同位素分布而引起的子片段離子的質(zhì)量M，而這種質(zhì)量M在同位素存在于在二級質(zhì)量分析中常規(guī)檢測的部分被標記分析物的不穩(wěn)定單鍵的每一側(cè)上時是存在的。分析物的標記可通過使分析物的官能團與標記試劑的反應活性基團(RG)反應來標記分析物。如上所述，分析物上的官能團可以是親電基團或親核基團之一，并且標記試劑的官能團(即RG或反應活性基團)可以是親電基團或親核基團中的另一種。所述親電基團和親核基團可反應而在分析物與標記試劑之間形成共價連接。標記反應可發(fā)生在溶液中。在一些實施方案中，分析物或標記試劑之一可以是載體結(jié)合的。標記反應有時可在含水條件下進行。可選擇用于標記生物分子比如蛋白質(zhì)、肽、核苷酸和寡核苷酸的含水條件。標記反應有時可在有機溶劑或有機溶劑混合物中進行?？蛇x擇用于小分子分析物的有機溶劑。可在寬范圍內(nèi)使用水與一種或多種有機溶劑的混合物。例如，可制備水和約60%至約95%的一種或多種有機溶劑(v/v)的溶液并用于標記分析物。在一些實施方案中，可制備水和約65%至約80%的一種或多種有機溶劑(v/v)的溶液并用于標記分析物。有機溶劑的非限定性實例包括N，N，-二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈(ACN)和醇比如甲醇、乙醇、丙醇和/或丁醇。當進行標記及^應時，可調(diào)節(jié)pH。pH可在4-10的范圍內(nèi)。pH也可在該范圍之外。一般而言，可通過加入非親核性有M調(diào)節(jié)非含水反應的堿性。合適的堿的非限制性實例包括N-甲基嗎啉、三乙胺和N,N-二異丙基乙胺?；蛘?，可利用生物緩沖劑比如(N-[2-輕乙基哌嗪-N，-[2-乙磺酸)(HEPES)或4-嗎啉乙磺酸(MES)或無機緩沖劑比如碳酸鈉和/或碳酸氫鈉調(diào)節(jié)含水溶劑的pH。因為至少一個反應活性基團可以是親電性的，所以可理想地選擇緩沖劑以不含任何親核基團。本領域技術(shù)人員應當理解，借助常規(guī)實驗，可以采用能用于調(diào)節(jié)標記反應的pH的其它緩沖劑，從而方l更用標記試劑標記分析物。樣品處理在本發(fā)明的某些實施方案中，可在標記分析物之前以及之后處理樣品。處理可適用于整個樣品或其級分。處理可適用于樣品混合物或其級分。處理可用于減少樣品的復雜性或用于〗吏樣品處于更好的形式用于分^f。處理可有助于分析物的標記。處理可有助于樣品成分(例如被標記分析物)的分析.處理可簡化樣品的^作。處理可有助于前述兩種或更多種情況。例如，可利用酶處理樣品。所述酶可以是蛋白酶(以降解蛋白質(zhì)和肽)、核酸酶(以降解寡核苷酸)或一些其它酶?？蛇x擇具有同樣可清楚預測降解模式的酶。兩種或更多種蛋白酶和/或兩種或更多種核酸酶還可一起使用或與其它酶一起使用，從而降解樣品成分。例如，蛋白水解酶胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶，其斷開賴氨酸或精氨酸與非特異性氨基酸之間的肽鍵，從而產(chǎn)生含有胺末端(N-末端)和賴氨酸或精氛酸g末端氨基酸(C-末端)的肽。這樣由蛋白質(zhì)裂解而形成的肽是可預測的，并且其在胰蛋白酶消化的樣品中的存在和/或量可標志著其來源蛋白質(zhì)的存在和/或量。此外，肽的游離胺末端可以是便于其標記的良好的親核物。其它的示例性蛋白水解酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、ArgC、LysC、V8蛋白酶、AspN、鏈霉蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和羧肽酶C。例如，當用蛋白酶比如胰蛋白酶消化時，蛋白質(zhì)(例如蛋白質(zhì)Z)可能產(chǎn)生3種肽(例如肽B、C和D)。因此，已經(jīng)利用蛋白水解酶比如胰蛋白酶消化的樣品，當被分析證實含有肽B、C和D時，可認為該樣品起初含有蛋白質(zhì)Z。肽B、C和D的量也將與被消化樣品中蛋白質(zhì)Z的量相關(guān)聯(lián)。這樣，對樣品(或其級分)中一種或多種肽B、C和D的鑒定和/或量的任何測定可用于鑒定和/定量初始樣品(或其級分)中的蛋白質(zhì)Z。因為酶的活性是可預測的，所以可預測由已知序列的蛋白質(zhì)降解而產(chǎn)生的肽的序列。利用該信息，可形成"理論"肽信息。因此，對來自實際樣品質(zhì)語分析的子片段離子(如上所述)的計算機輔助分析中進行"理論"肽片段的測定可用于測定一種或多種未知樣品中的一種或多種肽或蛋白質(zhì)。一些情況下，樣品處理可包括處理待標記的一種或多種分析物的前體。例如，如果所述待標記的一種或多種分析物是源自被消化的蛋白質(zhì)的肽并且標記試劑(對于該實例而言)被選擇成與肽或肽分析物的胺基(例如賴氨酸的N-a-胺基和N-s-胺基)反應，則可以便于標記反應的方式處理樣品的蛋白質(zhì)(分析物前體分子)。在該實例中，蛋白質(zhì)可被還原劑(例如三[2-羧乙基I膦(TCEP))還原，然后通過與封閉試劑(例如曱烷硫代磺酸甲酯(MMTS))反應而封閉硫醇基。這樣，蛋白質(zhì)的硫醇基被封閉，因此不干擾分析物的胺與標記試劑之間的標記反應。本領域技術(shù)人員應當理解，可利用容易得到的試劑和可借助常規(guī)實驗調(diào)整的方案處理某些其它前體分子?？?，艮據(jù)待標記分^斤物和標記試劑的性質(zhì)精確選擇試劑和條件。在一些實施方案中，樣品處理可包括將一種或多種分析物的前體固定到固相載體上，不管是否已用標記試劑進行標記。在一些實施方案中，固定可有助于降低樣品復雜性。在一些實施方案中，固定可有助于分析物的標記。在一些實施方案中，固定可有助于分析物前體的標記。在一些實施方案中，固定可有助于選擇性標記具有某一特性的樣品成分級分(例如它們含有或缺少半胱氨酸部分)。所述固定可有助于上述兩種或更多種情況。分離在一些實施方案中，被標記分析物的樣品或樣品混合物的處理可包括分離?？蓪Ρ粯擞浕蛭幢粯擞浀姆治鑫铩⒈粯擞浕蛭幢粯擞浀姆治鑫锴绑w、或其級分進行一次或多次分離?？蓪碜怨滔嗖东@的一個或多個級分進行一次或多次分離?？蓪煞N或更多種上述物質(zhì)進4亍分離。例如，可制備來自不同樣品的含有被不同標記的分析物的樣品混合物。被不同標記意指每個標記物含有獨特的可被識別的特性(例如含有在MS/MS分析中產(chǎn)生獨特"信號離子，，的獨特的報告物部分)。為分析樣品混合物，可分離樣品混合物的成分并僅對樣品混合物的級分進行質(zhì)量分析。這樣，可實質(zhì)上降低分析的復雜性，因為可單個地分析被分離的分析物的質(zhì)量從而提高分析方法的靈敏度。當然，可對樣品混合物的一個或多個其它級分重復分析一次或多次，從而允許分析樣品混合物的所有級分。如果加入到樣品混合物中的每種樣品的量是已知的，則可使用被不同地標記的相同分析物在與其在樣品混合物中的豐度成比例的濃度或量下進行共洗脫的分離條件以測定含有樣品混合物的每種樣品中每種被標記分析物的量。因此，在一些實施方案中，對樣品混合物的分離可使分析簡化，而同時維持質(zhì)量分析(例如MS/MS分析)中所測信號與樣品混合物中被不同地標記的分析物的量之間的相關(guān)性?？衫蒙t進行分離。例如，可利用液相色譜/質(zhì)鐠(LC/MS)實現(xiàn)這樣的樣品分離和質(zhì)量分析。此外，可使用任何適于分離感興趣的分析物的色譜分離方法。例如，色鐠分離可以是正相色譜、反相色譜、離子交換色譜、尺寸排阻色譜或親和色譜?？蛇M行電泳分離?？墒褂玫碾娪痉蛛x技術(shù)的非限定性實例包括但不限于一維電泳分離、二維電泳分離和/或毛細管電泳分離。同量異位的標記試劑或標記試劑組可用于標記樣品的分析物。當進行分離步驟時同量異位的標記試劑是特別有用的，因為標記試劑組的同量異位的標記物在結(jié)構(gòu)上和化學上是不可區(qū)分的(并且可以在總質(zhì)量上是不可區(qū)分的，直到發(fā)生斷裂從分析物除去了報告物)。因此，用不同的同量異位標記物進行標記的相同組成的所有分析物都可以完全相同的方式進行色譜分離(即共洗脫)。因為它們在結(jié)構(gòu)上和化學上是不可區(qū)分的，所以來自分離過程的洗脫液可包含與樣品混合物中被標記分析物的量成比例的每種同量異位性標記分析物的量。此外，根據(jù)如何制備樣品混合物(樣品的某些部分、另外加入的任選成分(例如校正標準物)以制備樣品混合48物)的知識，可使樣品混合物中被標記分析物的量反過來與其所來源的樣品中被標記分析物的量相關(guān)聯(lián)。標記試劑還可以是同分異構(gòu)的。雖然同分異構(gòu)體有時可通過色語分離，但存在可操作分離過程以共洗脫所有被不同標記的相同分析物的情形(其為條件依賴性的)，其中存在于洗脫液中的所有被標記分析物的量與樣品混合物中的其濃度和/或量成比例。本文所用的同量異位物與同分異構(gòu)體的不同之處在于同量異位物是結(jié)構(gòu)上和化學上不可區(qū)分的相同總質(zhì)量的化合物(除了同位素含量和/或分布以外)(參見例如圖1)，而同分異構(gòu)體則是結(jié)構(gòu)上和/或化學上可區(qū)分的相同總質(zhì)量的化合物。工作流程在一些實施方案中，可在進行樣品處理步驟之前進行樣品的分析物的標記。在一些實施方案中，可在其它樣品處理步驟中進行分析物的標記。在一些實施方案中，分析物的標記是樣品處理的最后步驟和/或在緊接著制備樣品混合物之前進行分析物的標記。用蛋白質(zhì)組分析作為非限定性實例，存在至少幾個可能使用的工作流程。為幫助理解下面的論述，有時區(qū)分前體蛋白質(zhì)和分析物肽。然而，應當理解蛋白質(zhì)或肽中任一種或其二者皆可被認為是本文所述的分析物。在一種類型的工作流程中，前體蛋白質(zhì)可被消化成肽分析物，所述肽分析物然后可被標記試劑標記。在另一種類型的工作流程中，前體蛋白質(zhì)可被標記試劑標記然后被消化成標記的肽分析物。在另一種類型的工作流程中，前體蛋白質(zhì)可被捕獲到固相栽體上、被消化然后可標記載體結(jié)合的肽。任選地還可標記流過的肽(flowthroughpeptide)。在另一種類型的工作流程中，前體蛋白質(zhì)可被捕獲在固相栽體上、被標記然后載體結(jié)合的蛋白質(zhì)可被消化以產(chǎn)生被標記的肽。任選地還可分析流過的肽。不管工作流程如何,可在MS分析之前按照期望對被標記肽進行另外的樣品處理(例如分離步驟)?？傊稍谝呀?jīng)進行一次或多次分離和/或樣品處理步驟之前或之后標記分析物。本發(fā)明并不局限于在何時進行分析物的標記，只要可標記一種或多種樣品的分析物以及可由不同標記的樣品制備一種或多種樣品混合物即可。分析物的相對定量和絕對定量在一些實施方案中，對樣品混合物的不同標記的相同分析物進行相對定量是可能的。通過將在二級質(zhì)量分析中測定的報告物相對量(例如所記錄的峰的強度、面積和/或高度)進行比較，所述二級質(zhì)量分析是針對一級質(zhì)量分析中觀察到的選定被標記分析物進行的，有可能對不同標記的相同分析物進行相對定量。換句話說，當每個報告物可與用于制備樣品混合物的具體樣品的信息相關(guān)聯(lián)時，某報告物相對于二級質(zhì)量分析中所觀察到的其它報告物的相對量即是樣品混合物中該分析物的相對量。當合并而形成樣品混合物的成分已知時，可基于針對一級質(zhì)量分析中所選的被標記分析物的離子觀察到的報告物的相對量倒算用于制備樣品混合物的每種樣品中分析物的相對量?？蓪σ患壻|(zhì)量分析中觀察到的所有不同標記分析物重復進行該方法。這樣，可測定用于制備樣品混合物的每個不同樣品中每種^J[活性分析物的相對量(通常以濃度和/或量表示)。在一些實施方案中，可測定分析物的絕對量。對于這些實施方案而言，可向樣品混合物中添加已知量的一種或多種不同標記的分析物(校正標準物)。校正標準物可以是被用于標記樣品混合物中分析物的標記物組中的同分異構(gòu)或同量異位標記物進行標記的所期望的分析物，只要與用于形成樣品混合物的任何樣品相比，用于校正標準物的報告物是獨特的即可。一到目對于樣品混合物中被不同標記的分析物的報告物相對量測定校正標準物的報告物的相對量，就可能計算樣品混合物中所有被不同標記的分析物的絕對量(通常以濃度和/或量表示)。這樣，基于如何制備樣品混合物的信息，還可測定每種被不同標記的分析物的絕對量(對于每種被不同標記的分析物而言，分析物所來源的樣品中含有校正標準物)。盡管前面說述，合適時，可針對報告物中任何天然存在的或人工制造的同位素的豐度對才艮告物離子(即信號離子)的強度(或面積或高度)進行校正。這些類型的校正的更完善的實例還可見于2003年11月26日提交的名稱為"MethodandApparatusForDe-ConvolutingAConvolutedSpectrum"的未決和共有的美國臨時專利申請No.60/524，844中。越謹慎精確定量每個報告物的強度，則初始樣品中分析物的相對定量和絕對定量就筒言之，利用這些方法，可以將與特定信號離子相關(guān)的增重質(zhì)量(upmass)和減重質(zhì)量(downmass)同位素峰的強度添加到與所述信號離子(即報告物)相關(guān)的主要強度峰上，使得可將所有強度適當?shù)貧w屬于正確的報告物。合適時，可推導出不與特定信號離子相關(guān)的峰強度。通過將所有峰強度分配給合適的信號離子，與信號離子相關(guān)的相對定量和絕對定量信息可以相當精確。越精確地將強度分配給正確的報告物，定量測定就可越精確。蛋白質(zhì)組分析本發(fā)明的方法、混合物、試劑盒和/或組合物可用于復雜分析，因為利用質(zhì)量分析技術(shù)可以快速和重復的方式使得樣品被多重化、分析和再分析。例如，可對樣品混合物分析一種或多種樣品中單個分析物的量?？蓽y定構(gòu)成樣品混合物的樣品中那些分析物的量(通常以濃度和/或量表示)。因為樣品處理和質(zhì)量分析可快速進行，所以這些方法可重復數(shù)次，這樣可檢測樣品混合物中多種不同標記的分析物相對于其在分析物所來源的樣品中的相對量和/或絕對量。有關(guān)這樣的快速多重分析的一種有利應用是在蛋白質(zhì)組分析領域中。蛋白質(zhì)組學視為針對生物學方法的結(jié)構(gòu)、功能和調(diào)控描述基因組序列中編碼信息的實驗性方法。這可通過由細胞或組織所表達的總蛋白質(zhì)成分的系統(tǒng)分析而實現(xiàn)。與本發(fā)明的方法、混合物、試劑盒和/或組合物的實施方案組合使用的質(zhì)譜法是用于這樣的總蛋白質(zhì)分析的一個可能工具。例如，利用一組4種同量異位標記試劑，可在一個實驗中得到4個時間點以測定蛋白質(zhì)表達的上調(diào)或下調(diào)，例如，基于生長細胞對特定刺激物的反應。還可進4亍較少的時間點而引入一個或兩個對照物。在所有情形下，可在單一多重實驗中測定蛋白質(zhì)表達的上調(diào)或下調(diào)(任選i^目對于對照物)。此外，由于處理是平行進行的，所以結(jié)果是直接可比的，因為不具有方案的輕微變化可影響結(jié)果的風險。4.本發(fā)明多個實施方案的描述多個實施方案包括下面部分所述的一種或多種試劑盒、陣列、庫、混合物、化合物、被標記分析物和方法。A.化合物說明書第35/104頁各實施方案中的每一種都可使用由結(jié)構(gòu)式r所代表的一種或多種化合物，或其鹽形式和/或7jc合物形式RP-X-U<-(Y-RG)mSVS'ti、v變量m可以是l3的整數(shù)，通常是l，這時所述化合物可由結(jié)構(gòu)式1#所代S',S',^針對每種化合物，上述結(jié)構(gòu)式中的變量可獨立地按下述進行選擇RG可以是親核基團或親電基團，或是分析物與親核基團或親電基團的^JL產(chǎn)物；r和t可以都是0，或r和t之一可以是l且另一個可以是O;當r和t之一是l時，S，可以是連接物，例如與固相栽體或親和配體偶聯(lián)的可斷開連接物；X和Y可以各自是鍵，其中X可與RP和LK中每一個的原子或任選的取代基偶聯(lián)從而使RP與LK連接，并且Y可以將LK的原子或任選的取代基與RG偶聯(lián)；RP和LK可以各自任選地和獨立地被取代，其中RP和LK可各自獨立地是雜芳基或雜環(huán)烷基，或被雜芳基或者雜環(huán)烷基取代或插入的直鏈或支鏈的脂肪族或雜脂肪疾基團；或者LK可以是連接部分，并且RP可以是叔胺、在環(huán)氮上與X鍵合的4-9元含氮雜芳基或雜環(huán)烷基、5-6元的芳基亞甲基、5-6元的雜芳基亞甲基或5-6元的雜環(huán)烷基。在一些實施方案中，上述值可滿足選自以下的一個或多個前提M:1)RP-X-LK-Y不是聚合物；2)RP和LK并不都含有哌溱基；RP和LK并不都選自氨基酸(比如天然氨基酸)、核苷酸、寡核苷酸、肽和蛋白質(zhì)；和3)當t是0時，基團RP不是含有環(huán)氮原子的任選地取代的5、6或7元雜環(huán)烷基，所述環(huán)氮原子與式-C(J)2-LK，-的取代或未被取代的結(jié)構(gòu)部分發(fā)生N誦烷基化使得LK，是誦C(O)誦、-C(S)國、國C(NH)國或-C(NRz)-，其中Rz是可任選地含有雜原子并含有1至8個碳原子的烷基或任選地取代的芳基，其中所述烷基和芳基的碳原子獨立地含有連接的氫、氘和/或氟原子，并且每個J可相同也可不同，并且是H、氘(D)、Rz、ORz、SRz、NHRz、N(Rz)2、氟、氯、溴或碘。在多個實施方案中，RG可以是由RG所代表的親核基團或親電基團，并且每個化合物可以是標記試劑；并且多個化合物可以是標記試劑試劑盒、標記試劑的庫等。在一些實施方案中，RG可指分析物與RG所限定的親核基團或親電基團的反應產(chǎn)物，其中每個化合物可以是被標記分析物。多個這樣的化合物可以是被標記分析物的混合物、被標記分析物的庫等。為精確參考這樣的實施方案中的某些描述，用-分析物表示分析物與RG所限定的親核基團或親電基團的反應產(chǎn)物。一些實施方案可以是由結(jié)構(gòu)式r或1#所代表的單個的同位素富集的化合物。在多個實施方案中，多個化合物可以是同位素富集的。同位素富集的化合物可富集了1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、高達15、高達20、高達25或更多個相同或不同的重原子同位素。一些實施方案可包括多個不同的化合物，例如兩個或更多個，其中所述多個化合物可以是例如試劑盒、庫、陣列、混合物等。在這樣的實施方案中，對于每個不同的化合物而言，RP和LK可以各自具有獨特的總質(zhì)量，可彌#傳個化合物的RP之間獨特的總質(zhì)量的差異，使M個化合物的RP和LK的合計總質(zhì)量可以相同。在一些實施方案中，兩個或更多個不同的化合物可以是同量異位的同分異構(gòu)體，其中化合物具有同分異構(gòu)的化學結(jié)構(gòu)但卻具有相同的總質(zhì)量。在一些實施方案中，兩個或不同的化53合物可以是同量異位的同位素化形式，其中所述化合物具有相同的化學結(jié)構(gòu)和相同的總質(zhì)量但卻具有不同的同位素組成，例如至少一個同量異位的同位素化形式是同位素富集的。在多個實施方案中，r和t之一可以是l，并且S，可以是與固相載體或親和配體偶聯(lián)的可斷開連接物。因此，當S，是固相載體時，多個實施方案可包括標記試劑的固相負栽的庫、被標記分析物的固相負載的庫等。在一些實施方案中，對于每個不同的化合物而言，由S，表示的可斷開連接物可在固相栽體上的單獨的陣列位置處與固相載體偶聯(lián)，所述固相載體含有聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚環(huán)氧乙烷、聚丙烯酰胺、玻璃、二氧化硅、可控多孔玻璃(CPG)或反相二氧化硅，基質(zhì)為凝膠、膜或表面的形式，由此試劑盒是不同化合物的陣列庫。在一些實施方案中，RG可以是親核基團或親電基團，由此試劑盒是標記試劑的陣列庫；或者RG可以是分析物與親核基團或親電基團的反應產(chǎn)物；由此試劑盒;l被標記分析物的陣列庫。在一些實施方案中，對于每個不同的化合物而言，由S，表示的可斷開連接物可在單獨的固相載體珠、球、粒子或顆粒上與固相栽體偶聯(lián)，所述固相載體^^有聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚環(huán)氧乙烷、聚丙烯酰胺、玻璃、二氧化硅、可控多孔玻璃(CPG)或反相二氧化硅，由此試劑盒是不同化合物的固相栽體庫。在一些實施方案中，RG可以是親核基團或親電基團，由此試劑盒是標記試劑的固相載體庫；或者RG可以是分析物與親核基團或親電基團的反應產(chǎn)物；由此試劑盒是被標記分析物的固相載體庫。在一些實施方案中，對于每個不同的化合物而言，由S，表示的可斷開連接物可與不同親和配體相偶聯(lián)，所述親和配體選自抗原、抗體、抗體片段、抗生物素蛋白、生物素、鏈霉抗生物素蛋白、蛋白質(zhì)A、凝集素和碳水化合物，由此試劑盒是親和配體庫。在一些實施方案中，RG可以是親核基團或親電基團，由此試劑盒是標記試劑的親和配體庫；或者RG可以是分析物與親核基團或親電基團的反應產(chǎn)物；由此試劑盒是被標記分析物的親和配體庫。在多個實施方案中，試劑盒、陣列、庫、被標記分析物混合物和方法中的化合物，以及同位素富集的化合物還可由結(jié)構(gòu)式I-S，至VI-S，或I至VI中之一或其同位素化形式代表FjP，-X-LK1-Y-RGS'rS',Kg,;RP2-X-LK2-Y-RGSVs、h一sRP3-X-LK3-Y-RGIIRP4-X-LK4-Y-RGSVs、IV_S,;RP5-X-LKS-Y-RGsvs'tv_s,;RPS-X-LK6-Y-RGi,IRP'-X-LK'-Y-RGI;RP2-X-LK2-Y-RGII;RP3-X-LK3-Y-RGIII;RP4-:X-LK4-Y-RGIV;RP5-X-LK5-Y-RGV;RP6-X-LK6-Y-RGVI變量r、s、S，、X，和X如上所述或進一步如下所述，并可符合上述相關(guān)前提^4K變量RP1、RP2、RP3、RP4、RP5、RP6、LK1、LK2、LK3、LK4、LKS和LK^在下面進行更詳細地描述，并且可符合上MRP-X-LK-Y及其變量RP/RP，和LK/LK，的相關(guān)前提條件。例如，對于可由結(jié)構(gòu)式V或V-S，代表的化合物而言，LKS可以是由結(jié)構(gòu)式E表示的連接部分(應當理解，在結(jié)構(gòu)中通過波浪線識別與標記試劑其余部分的連接點)RP5-X-LK5-Y-RGV,其中RP5可以是報告物基團RP(如上所定義)并且LKS可以是由結(jié)構(gòu)式E所代表的連接部分:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage56</formula>其中每個n獨立地可以是1~3的整數(shù)；并且每個R獨立地可以是H、D、烷基、雜烷基、芳基、雜芳基或卣素。在多個實施方案中，至少一個化合物可由結(jié)構(gòu)式D表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage56</formula>在另一個實例中，對于可由結(jié)構(gòu)式I或I-S，表示的化合物而言，RP1可以是由結(jié)構(gòu)式A所代表的報告物基團(應當理解，在結(jié)構(gòu)中通過波浪線表示與標記試劑其余部分的連接點)a環(huán)A可以是芳香性的；每個Z可以獨立地是CH、CW或N，前提是不超過2個Z基團是N;n可以是l或2，通常是2，這樣環(huán)A是6元環(huán)；每個R2可以獨立地選自定義部分中所述的合適取代基，或更通常可選自氫、氘、-OH、卣素、-CN、-N02、烷基、烯基、^l^、芳基、雜芳基、芳基烷基、雜芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、-議3或-1-113;每個W可以獨立地是氫、氘、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基或雜芳烷基；T可以是-O-、-NR4-、-S畫、誦C(O)-、-S(O)-、-S02-、-NR4C(0)-、C(0)NR4-、-NR4S02-、，S02NR4-、-C(O)O國、-OC(O)國、-NR4C(0)04-OC(0)NR4-;每個W獨立地是氫、氘、烷基、雜烷基、芳基或芳烷基；LK1是連接部分；X是報告物的原子和LKt之間的鍵；和Y是連接物的原子和RG的原子之間的鍵。在多個實施方案中，R^和LK^中至少一個可以同位素地富集一個或多個重原子同位素，例如RP1。在一些實施方案中，R^和LK^二者都可以各自同位素地富集一個或多個重原子同位素。在一些實施方案中，RP1和LW每一個各自含有至少兩個重原子同位素。在一些實施方案中，RP1和LK1中每一個各自含有至少三個重原子同位素。在一些實施方案中，n是2由此環(huán)A可以是6元環(huán)。在一些實施方案中，環(huán)A的鄰位或?qū)ξ恢腥我粋€Z基團可以是C-T-R3。在多個實施方案中，環(huán)A的鄰位或?qū)ξ恢腥我粋€Z基團可以是C-NHC(O)-R3或C-NHS02-R3，并且每個113可以獨立地是任選地取代的烷基。在一些實施方案中，n是2，并且每個Z獨立地是CH或CR2,因此Rpi可由結(jié)構(gòu)式A-l表示在一些實施方案中，式A中的至少一個原子是用重原子同位素進行同位素富集的。在一些實施方案中，LK^可包含氬基酸、肽、Cm亞烷基鏈，其中所述鏈的1~4個亞甲基單元獨立地被^J^酸、-O畫、國NR畫、-S-、陽C(O)畫、—S(O)誦、-S02-、國NRC(O)-、-C(O)NR畫、-NRS02—、-S02NR-、畫C(O)O-、-OC(O)隱、-NRC(O)O-、國OC(O)NR國或亞芳基、芳基亞烷基、亞雜烷基、亞雜環(huán)龍基、亞雜芳基或亞雜芳烷a代，其中每個R獨立地是氫、氘、或任選地取代的d-6烷基。M酸部分可以是甘氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、脯氨酸或鳥氨酸。在一些實施方案中，LK^可以是任選地取代的Cm亞烷基鏈，其中所述鏈的14個亞甲基單元可獨立地被-C(O)O-、-C(O)國、國O-、-NH畫、國C(O)NH隱、-S-、畫NH-、國S(O)-、-S02-或^J^酸取代，其中基團A的亞甲基單元a可以被-O-、-S-或-NH-代替。在一些實施方案中，LK1的亞甲基單元之一可被任選地取代的氮雜亞烷基、氮雜亞環(huán)烷基或氮雜亞芳^^取代。在多個實施方案中，至少一種化合物可由結(jié)構(gòu)式I-1所代表<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage60</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage61</formula>其中鄰近碳原子的符號"*"可表示該碳可以是13〔同位素，鄰近氮原子的符號"*"可表示該氮可以是15N同位素。在一些實施方案中，至少一種化合物可由結(jié)構(gòu)式I-10所代表在多個實施方案中，至少一種化合物可由選自下面的結(jié)構(gòu)式所代表:其中R8可以是價鍵、亞烷基或畫(CH2)s-(0-CH2CH2)p-(CH2)s-;p可以是l、2、3或4;并且每個s可以獨立地是O、1、2或3。在一些實施方案中，所述化合物可由結(jié)構(gòu)式II或II-S，所代表，其中Rpz可以是由結(jié)構(gòu)式B所代表的報告物基團環(huán)B可以是非芳香性的；n可以是l或2;每個W可以獨立地是O、S或NR,在一些實施方案中，結(jié)構(gòu)式II中的每個W可以是O或其同位素；每個W，可以獨立地是CH2、CHR2、C(R2)2、C(O)、S(O)、S(0)2或C=N-R4;Q可以是CH或CR2;每個R2可以獨立地選自定義中所述的合適取代基，或更通常可選自氫、氘、陽OH、g素、-CN、-N02、烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳基烷基、雜芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、-113或-1-113;每個W可以獨立地是氫、氘、或任選地取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基或雜芳烷基;t可以是-o國、畫nr4畫、-s-、-c(o)國、-s(o)-、-so2-、-nr4c(o)-、-c(o)nr4-、-NR4s02-、-s02NR4-、-c(O)O畫、-OC(O)陽、陽NR4c(0)0畫或醒OC(0)NR4國；每個W可以獨立地是氫、氘、烷基、雜烷基、芳基或芳烷基；LK^可以是連接部分；X可以是報告物的原子和LK^之間的鍵；和y可以是連接物的原子和rg的原子之間的鍵。在一些實施方案中，至少一個w部分是o，至少一個w，部分是chr2。在多個實施方案中，m^和li^中至少一個可以被一種或多種重原子同位素進行同位素富集，例如rp2。在一些實施方案中，1^2和1^2二者可以各自被一種或多種重原子同位素進行同位素富集。在一些實施方案中，RP2和lk"中每一個含有至少兩種重原子同位素。在一些實施方案中，RP2和lk^中每一個含有至少三種重原子同位素。在多個實施方案中，可按照lk1的多個實施方案定義lk2。在一些實施方案中，所述報告物基團是式B，其中n是2并且每個w都是o。因此提供式b-1的報告物基團其中每個W如上述所定義并且如本文中所定義。在一些實施方案中，所述報告物基團是式B,其中n是l并且每個W是O。因此提供式B-2的報告物基團<formula>formulaseeoriginaldocumentpage65</formula>其中每個W如上述所定義并且如本文中所定義。在一些實施方案中，所述化合物可由結(jié)構(gòu)式II-d所代表<formula>formulaseeoriginaldocumentpage65</formula>在一些實施方案中，所述化合物可由結(jié)構(gòu)式II-e所代表:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage65</formula>在一些實施方案中，RP1中的至少一個原子被重原子同位素進行同位素富集。在多個實施方案中，所述化合物可由結(jié)構(gòu)式III或III-S，所代表，其中Rps可以是由結(jié)構(gòu)式C所代表的凈艮告物基團:rx和Ry可以各自獨立地選自烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳基烷基、雜芳基烷基或雜烷基，其中RX和Ry的合適的任選取代基可獨立地選自定義中所述的合適取代基，或更通?？蛇x自氫、氘、-OH、鹵素、-CN、-N02、烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳基烷基、雜芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、-R3、-t-R3、核糖、脫氧核糖或磷酸酯，或者w和Ry可一起形成環(huán)c，環(huán)c，可以是任選地取代的雜芳基或雜環(huán)烷基，其中環(huán)c的合適的任選取代基可以獨立地選自定義中所述的合適取代基，或更通常可選自氫、氘、畫OH、卣素、-CN、-N02、烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳基烷基、雜芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)絲、國R3、畫t-R3、核糖、脫氧核糖或磷酸酯；每個RS可以獨立地是氫、氘、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基或雜芳烷基；t可以是膽o畫、-nr4-、-s國、陽c(o)-、-s(o)畫、-so2-、-nr4c(o)-、-c(o)nr4-、-NR4S02-、-S02NR4-、國C(O)O誦、畫OC(O)畫、-議4<:(0)0-或曙0<:(0)114-;每個R"獨立地是氫、氘、烷基、雜烷基、芳基或芳烷基；Lf可以是連接部分，前M當RX和Ry—起形成環(huán)C，時，則連接RX和Ry的環(huán)氮與除了取代的或未取代的式-C(JVLK，-部分以外的基團相連接，使得LK，是-C(O)-、-C(S)濕、醫(yī)C(NH)陽或-C(NRz)畫，其中Rz是含有1~8個碳原子并可任選地含有雜原子的烷基或任選地取代的芳基，其中所述烷基和芳基的碳原子獨立地含有連接的氫、氘和/或氟原子，J相同或不同并且是H、氖(D)、Rz、ORz、SRz、NHRz、N(Rz)2、氟、氯、溴或碘；X可以是報告物的原子和LK^之間的鍵；和Y可以是連接物的原子和RG的原子之間的鍵。在多個實施方案中，RP3和LK3中至少之一可以被一種或多種重原子同位素進行同位素富集，例如RP3。在一些實施方案中，RpS和LI^二者可以各自被一種或多種重原子同位素進行同位素富集。在一些實施方案中，每個RP3和LK3各自含有至少兩種重原子同位素。在一些實施方案中，每個RP3和LK3各自含有至少三種重原子同位素。在一些實施方案中，LKS是符合以下條件的連接部分當RX和Ry一起形成環(huán)C時，則LK可以是除了-C(J)2C(0)-，-C(J)2C(S)-、-C(J)2=NH-或-C(J)2-NR、以外的基團，其中每個J可以獨立地是氫、氘、R4、OR4、SR4、NHR"或N(R4)2。在多個實施方案中，可按照LK^的多個實施方案定義LK3。在一些實施方案中，報告物基團是式C，其中Ri和Ry—起形成環(huán)C，。因此提供式C"的報告物基團其中q是06，并且環(huán)C如上述和本文中所定義。在一些實施方案中，才艮告物基團可以由C表示，其中環(huán)C，，是雜環(huán)烷基并且q是2、3或4。因此，提供式C-1的報告物基團在一些實施方案中，式C-1中至少一種原子被重原子同位素進行同位素富集。在一些實施方案中，式C-1中至少一種原子被兩種重原子同位素進行同位素富集。在一些實施方案中，報告物基團c的上述結(jié)構(gòu)需要連接物不是通過X鍵與氮原子發(fā)生N-烷基化的取代或未取代的乙酸部分。在一些實施方案中，所述化合物可由結(jié)構(gòu)式III-c所代表其中q可以是06的整數(shù)，并且LK可含有g(shù)。在一些實施方案中，化合物可由選自下面的結(jié)構(gòu)式所4義表:5和m-2在多個實施方案中，RP可包含任選地取代的哌溱基，并且LK可以68是芳基或環(huán)烷基、或被芳基或環(huán)烷基取代或插入的直鏈或支鏈的脂肪族或雜脂肪^&團。而且，對于可由結(jié)構(gòu)式VI或VI-S，所代表的化合物而言，RP6或LK6中至少之一可含有任選地取代的核^、或被任選地取代的核>^^取代或插入的直鏈或支鏈的脂肪族或雜脂肪族基團。Rp6和LK6的任選取^(^可獨立地選自氫、氘、-OH、鹵素、-CN、-N02、烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳基烷基、雜芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、-R3、-T-R3、核糖、脫氧核糖或磷酸酯；每個RS可以獨立地是氫、氘、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基或雜芳覽基；T可以是-O畫、-NR4-、國S畫、-C(O)國、-S(O)-、-S02-、-NR4C(0)-、國C(0)NR4—、-NR4S02-、-S02NR4-、師C(O)O-、誦OC(O)-、-NR4C(0)04-OC(0)NR4-;每個W獨立地是氫、氘、烷基、雜烷基、芳基、或芳烷基；X是報告物的原子和LK^之間的鍵；和Y是連接物的原子和RG的原子之間的鍵，其中RP6和LK6至少之一可被一種或多種重原子同位素進行同位素富集；前提是如果RP6是雜環(huán)烷基，則所述雜環(huán)烷基不是含有環(huán)氮原子的5、6或7元雜環(huán)烷基，所述環(huán)氮原子被取代或未取代的式-C(J)rLK，-部分所N-烷基化使得LK，是-C(O)-、-C(S)匪、-C(NH)國或-C(NRz)-，其中Rz是可任選地含有雜原子并含有18個碳原子的烷基或任選地取代的芳基，其中所述烷基和芳基的碳原子獨立地含有連接的氫、氘和/或氟原子，J相同或不同并且是H、氘(D)、Rz、ORz、SRz、NHRz、N(Rz)2、氟、氯、溴或碘。而且，對于可由結(jié)構(gòu)式IV或IV-S，所代表的化合物而言，RP"和LK4可各自獨立地是雜芳基或雜環(huán)烷基、或被雜芳基或雜環(huán)烷基取代或插入的直鏈或支鏈的脂肪族或雜脂肪泉基團，其中RP4和LK4的合適的任選取代基可獨立地選自定義中所述的合適取代基，或更通?？蛇x自氫、氘、-OH、鹵素、-CN、-N02、烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳基烷基、雜芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、-R3、-T-R3、核糖、脫氧核糖或磷酸酯；每個W可以獨立地是氫、氘、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基或雜芳烷基；T可以是麗O-、-NR4-、-S-、-C(O)-、誦S(O)隱、-S02-、-NR4C(0)-、-C(0)NR4-、-NR4S02-、-S02NR4-、誦C(O)O-、-OC(O)國、-NR4C(0)0-或-OC(0)NR4-;每個R"可以獨立地是氫、氖、烷基、芳基或芳烷基；X可以是報告物的原子和LK"之間的鍵；和Y可以是連接物的原子和RG的原子之間的鍵。在多個實施方案中，RP4和LK^中至少之一可以被一種或多種重原子同位素進行同位素富集，例如RP4。在一些實施方案中，RP"和LK"二者可以各自被一種或多種重原子同位素進行同位素富集。在一些實施方案中，RP4和LK4中每一個4、有至少兩種重原子同位素。在一些實施方案中，處4和1^4中每一個各自含有至少三種重原子同位素。在多個實施方案中，RP-和LK^中的雜芳基或雜環(huán)烷基可各自獨立地選自任選地取代的咪哇基、呋喃基、吡咯基、嚷吩基、嚅唑基、噻喳基、異嚅哇基、異瘞唑基、瘞二唑基、嚅二哇基、吡梵基、嘧梵基、吡嗪^基、峻嚷基、查啉基、異壹啉基、吲嗤基、苯并^惡唑基、苯并異喏、哇基、苯并呋喃基、苯并逸哇基、中氮茚基(indolizinyl)、咪唑并吡咬基、吡哇基、三哇基、異噻唑基、噹峻基、四哇基、苯并咪哇基、苯并瘞哇基、苯并異噻喳基、苯并瘞二哇基、苯并嚅二哇基、吲咮基、四氫吲哚基、氮雜吲咮基、咪唑并吡梵基、喹唑啉基、噪呤基、吡咯并[2,3嘧梵基、吡咯并[3,4嘧咬基、苯并(b)瘞吩基、嗎啉基、哌咬基、哌秦基、吡咯烷基和硫代嗎啉基。在多個實施方案中，處4或LK"中至少之一可以包含任選地取代的哌,基、或被哌漆基取代或插入的直鏈或支鏈的脂肪族或雜脂肪波基團，或在一些實施方案中，RP4可以是任選地取代的哌噪基，例如N-曱基哌溱基。在多個實施方案中，RP4或LK4中至少之一可以包含任選地取代的核堿基(例如任選地取代的嘌呤基或嘧哽基)、或被任選地取代的核M取代或插入的直鏈或支鏈的脂肪族或雜脂肪波基團。在一些實施方案中，LK"可以是任選地取代的核堿基，或被任選地取代的核磁基取代或插入的直鏈或支鏈的脂肪族或雜脂肪波基團。所述核堿基，例如LK"中的核堿基，可任選地被9H-嘌呤-6-胺、2-絲-lH-嘌呤-6(9H)-酮、4-絲嘧咬-2(lH)-酮、5-甲基嘧咬-2,4(lH,3H)國二酮等取代。所述核威基可以是取代的或未被取代的。在多個實施方案中，所述化合物可由選自以下的結(jié)構(gòu)式所代表<formula>formulaseeoriginaldocumentpage71</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage72</formula>上述橫穿過環(huán)所畫的M示該鍵可與該環(huán)中任何可取代的原子相連接；橫穿過兩個環(huán)所畫的鍵表示可與那兩個環(huán)中任何一個環(huán)的任何可取代的原子相連接的鍵?；鶊FR5可以是-C(J)rC(O)-、國C(JVC(S)畫、畫C(J)2國C(NH)畫或畫C(J)2-C(NRZ)-，其中Rz是可任選地含有雜原子并含有1~8個碳原子的M或任選地取代的芳基，其中所述烷基和芳基的碳原子獨立地含有連接的氫、氘和/或氟原子；每個J相同或不同并且是H、氘(D)、Rz、ORz、SRz、NHRz、N(Rz)2、氟、氯、溴或碘。116和117可各自獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳基烷基、雜芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、-R3、-T-R3、核糖、脫氧核糖或磷酸酯，其中每個113可以獨立地是氫、氘、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基或雜芳烷基。R8和R9可各自獨立地是H、氘(D)、氟、氯、溴、缺或鹵代烷基(例如CF3基團)。在一些實施方案中，所述化合物可以是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage73</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage74</formula>B.方法根據(jù)本發(fā)明的方法，可利用使分析物與公開的化合物反應來標記待檢測分析物，所述公開的化合物例如由結(jié)構(gòu)式I-S'至IV-S，或I至IV之一所代表的化合物，其中RG是作為親核基團或親電基團的反應活性基團。可通過質(zhì)量分析測定被標記分析物、分析物本身、所述分析物的一個或多個片段和/或標記物的片段。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法可用于分析相同樣品中不同的分析物以及兩種或更多種不同樣品中相同和/或不同分析物的多重分析。兩種或更多種樣品可相混合形成樣品混合物。在多重分析中，標記試劑可用于確定分析物來自樣品混合物中的哪個樣品。可測定每種混合而形成樣品混合物的兩種或更多種樣品中每一種內(nèi)的分析物的絕對量和/或相對量(相對于不同樣品中的相同分析物而言)(通常以濃度或量表示)。此外，對分析物片段(例如子片段離子)的質(zhì)量分析可用于鑒定分析物和/或分析物前體，比如在分析物前體分子被降解的情況下。所述方法的一個特性在于可利用獨特的標記物對來自不同樣品的分析物進行差異性同位素標記(即同位素編碼)這一事實，所述獨特的標記物在化學上是同分異構(gòu)的或同量異位的(具有相等的質(zhì)量)并且可鑒定分析物所來源的樣品。所述#皮差異性標記的分析物在質(zhì)"#^的MS模式下是不可辨別的，因為它們都具有相同的(總)質(zhì)荷比。此外，當經(jīng)歷解離能水平時，比如通過碰撞誘導解離(CID)，所述標記物可斷開而產(chǎn)生可在質(zhì)譜儀中通過質(zhì)量(質(zhì)荷比)進行解析的獨特的報告物。質(zhì)譜中所觀察到的報告物的相對量可與樣品混合物中被標記分析物的相對量相關(guān)聯(lián)，并且意味著可與分析物所來源的樣品中分析物的量相關(guān)聯(lián)。因此，才艮告物(即信號離子)的相對強度可用于測量合并而形成樣品混合物的兩種或更多種不同樣品中分析物的相對量。如果將每種分析物(對其而言期望進行絕對定量)的校正標準物摻入到樣品混合物中，則可根據(jù)報告物的信息，推導出兩種或更多種樣品中分析物的絕對量(通常以濃度和/或量表示)。例如，分析物可以是利用酶消化反應處理樣品進行蛋白質(zhì)降解而產(chǎn)生的肽?？衫玫鞍姿饷?例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、ArgC、LysC、V8蛋白酶、AspN、鏈霉蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶C)處理樣品而實現(xiàn)蛋白質(zhì)降解。通過測定樣品混合物中肽的身份和含量并鑒定肽所來源的樣品，任選地與來自所述樣品的其它肽的測定相結(jié)合，可相對于75其所來源的樣品而鑒定和/或定量所述被降解肽的前體蛋白質(zhì)。由于該方法允許對一種以上樣品(即來自樣品混合物)中的一種或多種蛋白質(zhì)進行多重測定，因此其是一種多重方法。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，包括使所述兩種或更多種樣品中的每種(每種樣品含有一種或多種反應活性分析物)與標記試劑組中的不同標記試劑反應，其中所述組中的不同標記試劑各自包含式RP-X-LK-Y-RG。因此，通過分析物的親核基團或親電基團分別與不同標記試劑的親電或親核的反應活性基團(RG)反應，每種樣品的一種或多種分析物被"RP-X-LK-Y-"部分所標記。所述標記方法可產(chǎn)生兩種或更多種被差異性標記的樣品，所述樣品各自^^有一種或多種^L標記分析物。所述組的標記試劑可以是同分異構(gòu)的或同量異位的。每種標記試劑的報告物可與每種被標記分析物所來源的樣品一起被鑒定，并因此用于鑒定每種被標記分析物所來源的樣品。RGU應活性基團，其特性已在前面描述過。RP是報告物部分，其特性也已在前面描述過。對于所述組的每種試劑而言，每種報告物的總質(zhì)量可以是不同的。LK是連接物部分，其特性已在前面描述過。連接物的總質(zhì)量可補償不同標記試劑的才艮告物之間的總質(zhì)量差異，4吏得對于所述組的每種試劑的報告物-連接物組合的合計總質(zhì)量相同。X是報告物的原子與連接物的原子之間的鍵。Y是連接物的原子與反應活性基團的原子之間的鍵(或者與分析物^^應后，Y是連接物的原子與分析物的原子之間的鍵)。當在質(zhì)i碧儀中經(jīng)歷解離能水平時，至少部分被標記分析物中的X鍵和Y鍵斷裂。X鍵和Y鍵的特性已在前面描述過。一旦每種樣品的分析物被該樣品的獨特的標記試劑所標記，則所述兩種或更多種被不同標記的樣品或其部分可混合而產(chǎn)生樣品混合物。當希望定量時，可記錄組合而產(chǎn)生樣品混合物的每種樣品的體積和/或量。每種樣品相對于樣品混合物總樣品體積和/或量的的體積和/或量可用于確定對于檢測來自樣品混合物的分析的每種樣品中被檢測分析物的量(通常以濃度和/或量表示)而言所必需的比例。因此，樣品混合物可包含復雜的混合物，其中通it^每種所述兩種或更多種樣品中分析物的量進行相對定量或絕對定量(在還向樣品混合物中添加校正標準物的情況下)，可鑒定和/或定量相同和/或不同分析物的相對量?？蓪旌衔飸霉忡?支術(shù)，其中可利用一級質(zhì)量分析器對樣品混合物或其級分進行一級質(zhì)量分析。然后可從一級質(zhì)量分析中選擇特定質(zhì)荷比的離子。然后可對所選離子施加解離能7jC平(例如碰撞誘發(fā)解離(CID))從而引起所選離子的斷裂。通過給被標記分析物的具有特定質(zhì)荷比的所選離子施加解離能水平，至少可將部分所選離子中的X鍵和/或Y鍵斷裂。X鍵和Y鍵二者的斷裂可引起報告物-連接物部分的斷裂并引起從分析物中釋放帶電荷的或電離的報告物。經(jīng)歷解離能水平的離子還可引起分析物的斷裂，從而產(chǎn)生分析物的子片段離子。然后離子(剩余的所選離子、子片段離子和帶電荷的或電離的報告物)或其級分可直接導入到二級質(zhì)量分析器中?？蓪λx離子或其片段進行二級質(zhì)量分析。二級質(zhì)量分析可測定以所選質(zhì)荷比存在的每個獨特報告物的總質(zhì)量(或m/z)和相對量以及樣品混合物的至少一種反應分析物的子片段離子的總質(zhì)量。對于以所選質(zhì)荷比存在的每種分析物而言，子片段離子可用于鑒定以所選質(zhì)荷比存在的分析物。例如，可按照之前所述的名稱為"利用計算機輔助數(shù)據(jù)庫分析的分析物測定"部分進行該分析。在一些實施方案中，所述方法的某些步驟可重復一次或多次。例如，在一些實施方案中，來自一級質(zhì)謙分析的所選質(zhì)荷比的離子(不同于任何之前所選的質(zhì)荷比)可被施加解離能水平進行處理從而形成至少一些所選離子的電離的報告物部分和電離的子片段離子，如前所述?？蓪λx離子、電離的報告物部分和子片段離子或其級分進行二級質(zhì)量分析。還可測定二級質(zhì)量分析中每種報告物部分的總質(zhì)量和相對量以及子片段離子的總質(zhì)量。這樣，可得到信息，用于鑒定和定量來自一級質(zhì)量分析的一種或多種其它分析物。在一些實施方案中，整個方法可重復一次或多次。例如，當樣品混合物已被分級(例如通過色譜或電泳分離)時，可重復所述方法一次或多次。通it^每種樣品重復該方法，可分析全部的整個樣品混合物。預計在一些實施方案中，整個方法可被重復一次或多次，并且在每次這些重復中，某些步驟還可被重復一次或多次，比如如上所述的。這樣，可以盡最大可能地探討和測定樣品混合物的含量。質(zhì)i普領域的普通技術(shù)人員應當理解，可在串^tt鐠儀中進行一級和二^t量分析。適于進行串^tt量分析的儀器如前所述。雖然串^鐠儀是優(yōu)逸的，但可使用單M脊仗。例如，可通過錐孔電壓斷裂(cone-voltagefragmentation)誘發(fā)分析物斷裂，之后利用單級四級桿質(zhì)脊義或飛行時間質(zhì)^^t所得片段進行質(zhì)量分析。在其它實例中，可使用激光源使分析物經(jīng)歷解離能水平并在源后分解之后記錄在飛行時間質(zhì)譜儀或串聯(lián)飛行時間(TOF-TOF)質(zhì)a中所得的片段。應當理解，在一些實施方案中，帶有單一分析器的儀器可進行一級和二級質(zhì)量分析。根據(jù)前面公開的多重方法，在一些實施方案中，與分析物的鍵(例如肽骨架中的酰胺(肽)鍵)的斷^目比，X鍵的斷裂可能更容易或更不容易，或基本上相等。在一些實施方案中，與分析物的鍵(例如肽骨架中的酰胺(肽)鍵)的斷裂相比，Y鍵可能更容易或更不容易斷裂。在一些實施方案中，在X鍵和Y鍵斷裂之后，所述組的每種試劑的連接物在電荷上是中性的(即連接物斷裂而產(chǎn)生中性質(zhì)量丟失，并因此在MS/MS光鐠中觀察不到)。在一些實施方案中，在標記試劑組內(nèi)、混合物的被標記分析物或試劑盒的標記試劑內(nèi)，X鍵和Y鍵的位置不變。在一些實施方案中，在用于斷裂分析物(例如肽骨架中的酰胺(肽)鍵)的條件下，所述組的每種試劑的報告物基本上不進行亞斷裂。在一些實施方案中，X鍵與Y鍵相比不容易斷裂。在一些實施方案中，Y鍵與X鍵相比較不容易斷裂。在一些實施方案中，X鍵和Y鍵的不穩(wěn)定性大約相同，或以其它方式選擇X鍵和Y鍵使得X鍵或Y鍵中之一的斷裂導致X鍵或Y鍵中另一個的斷裂。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括使兩種或更多種樣品(每種樣品含有一種或多種分析物)與不同的標記試劑反應從而產(chǎn)生各自含有一種或多種被標記分析物的兩種或更多種被不同標記的樣品，以及混合兩種或更多種^L不同標記的樣品或其部分、和任選地一種或多種校正標準物從而產(chǎn)生混合物，所述混合物包含被本文中所述的標記試劑標記的分析物。在一些實施方案中，用標記試劑標記用于產(chǎn)生混合物的每種樣品，所述標記試劑含有可用于鑒定分析物并定量分析物在混合物和/或分析物所來源的^"品中的相對量或絕對量的獨特寺艮告物。在多個實施方案中，標記試劑或"同量異位的質(zhì)量標簽"可由任何結(jié)構(gòu)式I"、1#、I-S，至IV-S，或I至IV所代表，通常由I至IV之一所代表，其中RG代表親核基團或親電基團，并且其余變量的定義如上面對化合物78所述。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括使兩種或更多種樣品(每種樣品含有一種或多種反應分析物)與同量異位的質(zhì)量標簽組反應從而產(chǎn)生各自含有一種或多種被標記分析物的兩種或更多種被不同標記的樣品，以及混合兩種或更多種被不同標記的樣品或其部分、和任選地一種或多種校正標準物從而產(chǎn)生樣品混合物。一旦標記試劑與反應分析物進行反應，Y鍵將連接連接物與分析物；RP(在各式分別由RP1、RP2、RP3、RP4、RP5和處6表示)和LK(在各式分別由LK1、LK2、LK3、LK4、1^5和1^6表示)中至少之一可被一種或多種重原子同位素進行同位素富集;當同量異位的質(zhì)量標簽與分析物反應時，每個質(zhì)量標簽可將相同的質(zhì)量加到分析物中；并且當發(fā)生斷裂時，每個同量異位的質(zhì)量標簽的RP(在各式分別由RP1、RP2、RP3、RP4、Rps和Rps表示)可產(chǎn)生具有與所述組中其它同量異位質(zhì)量標簽的信號離子不同的質(zhì)量的信號離子。根據(jù)一些實施方案，來自樣品的分析物可與固相載體反應(每種樣品與不同的固相載體反應，并因此與不同的報告物反應)，不與反應活性基團反應的樣品的樹脂結(jié)合成分任選地可被洗去。然后可在使可斷開連接而從栽體釋;^出報告物-連接物-分析物復合物?？稍诳蓴嚅_連接物的斷開條件下類似地處理每種載體，從而得到兩種或更多種不同的樣品(每種樣品含有一種或多種被標記分析物)，其中可通過與其所連接的獨特報告物鑒定和/或定量與特定樣品相關(guān)聯(lián)的被標記分析物。然后可將所收集的樣品混合而形成樣品混合物，如前所述。例如，用于前述方法中的所述組的每個不同標記試劑可與固相栽體相結(jié)合?？衫脦追N方法中的任何方法制M有標記試劑的栽體(見下述實施例部分)。在一些實施方案中，同量異位質(zhì)量標簽的氨基、羥基或巰基可與合適栽體的可斷開連接物反應。所述可斷開連接物可以是"空間位阻的可斷開連接物"?？蓴嚅_連接物的斷開將從栽體釋放出被標記分析物?？臻g位阻的固相栽體的非限定性實例包括三苯甲基氯樹脂(trityl國Cl，Novabiochem,P/N01-64-0074)、2匪氯三苯曱基氯樹脂(Novabiochem，P/N01-64-0021)、DHPP(Bachem，P/NQ隱1755)、MBHA(AppliedBiosystemsP/N400377)、4-甲基三苯甲基氯樹脂(Novabiochem，P/N01-64-0075)、4國甲氧基三苯甲基氯樹脂(Novabiochem,P/N01-64-0076)、羥基畫(2國氯苯基)甲基-PS(Hydroxy國(2-chlorophnyl)methyl國PS))(Novabiochem,P/N01-64-0345)、Rink酸樹脂(NovabiochemP/Ns01-64-0380,01-64-0202)、NovaSynTGT醇樹脂(Novabiochem,P/N01-64-0074)。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法還可包括在進行樣品的分析物的標記之前，利用至少一種酶消化每種樣品以部分或完全降解樣品成分，如上文標題為"樣品處理"的部分所詳細描述的。例如，所述酶可以是蛋白酶(以降解蛋白質(zhì)和肽)或核酸酶(以降解寡核苷酸)。所述酶還可一起使用從而降解樣品成分。所述酶可以是蛋白水解酶比如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、ArgC、LysC、V8蛋白酶、AspN、鏈霉蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶C。在一些實施方案中，所述方法還可包括在進行一級質(zhì)量分析之前分離樣品混合物，如上文標題為"分離"的部分所詳細描述的。這樣，可僅對樣品混合物的級分進行一級質(zhì)量分析?？衫萌魏畏蛛x方法進行分離，包括通過色譜或電泳。例如，液相色鐠/質(zhì)鐠(LC/MS)可用于實現(xiàn)這樣的樣品分離，之后進行質(zhì)量分析。此外，可使用適于分離感興趣分析物的任何色譜分離方法。合適的色譜和電泳分離方法的非限定性實例如前所述。在另一些實施方案中，本發(fā)明的方法可包括酶處理降解樣品成分和分離步驟二者。如前所述，可通過分析子片段離子的總質(zhì)量來測定與所選離子相關(guān)的分析物。一種這樣的測定方法被描述于名稱為"利用計算機輔助數(shù)據(jù)庫分析的分析物測定"的部分中。一旦已確定分析物，有關(guān)二級質(zhì)量分析中每種報告物部分的總質(zhì)量和相對量以及子片段離子總質(zhì)量的信息即為確定有關(guān)樣品混合物的其它信息提供基礎?？衫觅|(zhì)譜中的峰強度確定才艮告物的量。在一些實施方案中，可通過分析利用質(zhì)譜儀得到的報告物(信號離子)信號的峰高或峰寬而測定報告物的量。因為每個樣品可被不同的標記試劑標記并且每種標記試劑可包含可與特定樣品相關(guān)聯(lián)的獨特報告物，所以二級質(zhì)量分析中不同報告物的測定鑒定了所選分析物的離子來源于何種樣品。當發(fā)現(xiàn)多種報告物時(例如根據(jù)本發(fā)明的多重法)，可相對于其它報告物測定每種報告物的相對量。因為所檢測的每種報告物的相對量與樣品混合物中分析物的相對量相關(guān)，所以可確定組合而形成樣品混合物的每種樣品中分析物的相對量(通常以濃度和/或量表示)。合適時，如上文在名稱為"分析物的相對定量和絕對定量，，的部分中所討論的，可針對天然或人工產(chǎn)生的同位素豐度對與報告物相關(guān)的峰強度進行校正。更具體而言，當組合而形成樣品混合物的每種樣品的體積和/或量已知時，可基于所檢測的每種報告物的相對量而計算每種樣品中分析物的相對量(通常以濃度和/或量表示)?？蓪哂胁煌|(zhì)荷比的所選離子重復進行該分析一次或多次，從而得到組合而形成樣品混合物的每種樣品中一種或多種其它分析物的相對量。合適時，可針對天然或人工產(chǎn)生的同位素豐度對與報告物相關(guān)的峰強度和進行校正。當含有與分析物相連接的獨特報告物的校正標準物(具有所選的質(zhì)荷比)以已知量(通常以濃度和/或量表示)被加入到樣品混合物中時，與所述校正標準物相關(guān)的獨特報告物的量可用于測定組合而形成樣品混合物的每種樣品中分析物的絕對量(通常以濃度和/或量表示)。這是可能的，因為與校正標準物的報告物相關(guān)的分析物的量是已知的，并且對于與所選離子相關(guān)的^L標記分析物而言，所有其它凈艮告物的相對量可^L測定。因為對于每種獨特的報告物(包括校正標準物的報告物)而言，所測的報告物的相對量和與組合而形成樣品混合物的每種樣品相關(guān)的分析物的量成比例，故可基于根據(jù)用于產(chǎn)生樣品混合物的配方而計算的比例來測定每種樣品中分析物的絕對量(通常以濃度和/或量表示)。合適時，可針對天然存或人工產(chǎn)生的同位素豐度對與報告物相關(guān)的峰強度進行校正?？蓪哂胁煌|(zhì)荷比的所選離子重復進行該分析一次或多次，從而得到組合而形成樣品混合物的每種樣品中一種或多種其它分析物的絕對量。合適時，可針對天然或人工產(chǎn)生的同位素豐度對與報告物相關(guān)的峰強度進行校正。在一些實施方案中，可利用消化和/或分離步驟實施該方法。在一些81實施方案中，可重復包含或不包含所述消化和/或分離步驟的方法的步驟一次或多次，從而鑒定和/或定量樣品中一種或多種其它分析物或所述兩種或更多種樣品(包括用栽體結(jié)合的標記試劑標記的樣品)中每種樣品內(nèi)的一種或多種分析物。取決于樣品混合物中是否存在針對特定分析物的校正標準物，定量可以是相對于其它被標記分析物的，或其可以是絕對的。這樣的分析方法可特別適用于復雜性質(zhì)的多重樣品的蛋白質(zhì)組分析，尤其是在一級質(zhì)量分析之前進行被標記分析物的預分離(例如液相色譜或電泳分離)的情況下。在一些實施方案中，分析物可以是樣品或樣品混合物中的肽。樣品或樣品混合物中的肽的分析可用于測定樣品或樣品混合物中可鑒別蛋白質(zhì)的量(通常以濃度和/或量表示)，其中可在一級質(zhì)量分析之前降解一種或多種樣品中的蛋白質(zhì)。此外，可為進行測定的目的而比較來自不同樣品的信息，比如用于比較對細胞中蛋白質(zhì)的量的影響，所述細胞與不同濃度的可影響細胞生長的物質(zhì)一起進行了孵育。其它非限定性實例可包括比較患病的和健康組織或細胞培養(yǎng)物的表達蛋白質(zhì)成分。這可包括在利用感染劑比如細菌或病毒進行感染或其它疾病狀態(tài)比如癌癥后比較細胞、組織或生物流體中的表達蛋白質(zhì)水平。在其它實例中，可進行蛋白質(zhì)濃度隨時間變化(時間-進程)的研究以檢測藥物處理對細胞或組織的表達蛋白質(zhì)成分的影響。在又一些實例中，隨時間釆集的不同樣品的信息可用于檢測和監(jiān)測作為疾病(例如癌癥)或感染結(jié)果的組織、器官或生物流體中特定蛋白質(zhì)的濃度。在一些實施方案中，分析物可以是樣品或樣品混合物中的核酸片段。有關(guān)核酸片段的信息可用于測定樣品或樣品混合物中可鑒定的核酸分子的量(通常以濃度和/或量表示)，其中在一級質(zhì)量分析之前降解樣品。此外，可為進行上述測定的目的而比較來自不同樣品的信息。c混合物在一些實施方案中，本發(fā)明涉及混合物(例如樣品混合物)。所述混合物可包含至少兩種被不同標記的分析物，其中所述兩種被標記分析物中的每種可來自不同的樣品并且包含式RP-X-LK-Y-分析物。對于每個不同的標記物而言，混合物的一些被標記分析物可以相同，一些被標記分析物可以不同。所述原子、結(jié)構(gòu)部分或X鍵、Y鍵、RP和LK如前所述并且乂^開了其特征?？赏ㄟ^混合兩個或多個標記>^應的所有或部分產(chǎn)物而形成混合物，其中每個標記反應使用通式RP-X-LK-Y-RG的不同標記試劑，其中所述原子、結(jié)構(gòu)部分或X鍵、Y鍵、RP、LK和RG如前所述并且公開了其特征。標記試劑可以是同位素編碼的同分異構(gòu)的或同量異位的標記試劑。每種不同標記試劑的獨特的才艮告物可表示所述兩種或更多種被標記分析物中每一種來自哪個標記反應。標記試劑可以是同分異構(gòu)的或同量異位的。因此，混合物的兩種或更多種被標記分析物可以是同分異構(gòu)的或同量異位的?；旌衔锟梢允侨魏紊鲜龇椒ㄖ兴_的樣品混合物。與那些方法相關(guān)的標記試劑和被標記分析物的特征如前所述。混合物的分析物可以是肽。混合物的分析物可以是蛋白質(zhì)。混合物的分析物可以是肽和蛋白質(zhì)?；旌衔锏姆治鑫锟梢允呛怂岱肿印；旌衔锏姆治鑫锟梢允翘妓衔铩；旌衔锏姆治鑫锟梢証J旨質(zhì)。混合物的分析物可以是類固醇?；旌衔锏姆治鑫锟梢允切∮?500道爾頓的小分子?；旌衔锏姆治鑫锟梢园瑑煞N或更多種分析物類型。分析物類型可以例如選自肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、碳水化合物、脂質(zhì)、類固醇和/或小于1500道爾頓的小分子。在多個實施方案中，本發(fā)明的混合物包含至少兩種被標記分析物，其中至少一種被標記分析物來自組合形成混合物的其它被標記分析物的不同樣品。例如，分析物可以是蛋白質(zhì)、肽、核苷酸、碳水化合物、脂質(zhì)、類固醇或小于1500道爾頓的小分子。在多個實施方案中，被標記分析物可以由任何結(jié)構(gòu)式r、1#、I-S，至VI-S，或I至VI所代表，通常由I至VI之一所代表，其中RG代表親核基團或親電基團與分析物的反應產(chǎn)物，例如被標記分析物可由下述式的化合物之一或由其鹽形式和/或水合物形式代表P-X-LK-(Y-分析物〉mS'rS',RP-X-LK-Y-分析物S'rS',FjP，-X-LK^Y-分析物S'rS',Rp2-X-LK2-Y-分析物Rp3-X-LK3-Y-分析物S'rS'iRp4-X-LK4-Y-分析物S'rS'tRpS-X-LK5-Y-分析物s'rs'tRp6-X-LK6-Y-分析物svs'trp^x-lkLy-分析物Rp2-X-LK2-Y-分析物RP、X-LK、Y-分析物RP4-X-LK4-Y-分析物RP5-X-LK5-Y-分析物RpS-X-LK、Y-分析物其中變量如上所定義。通常RP/LK(或RPVLK1、RP2/LK2、RP3/LK3、RP4/LK4、RpS/LKS或RP"LK6)中至少之一可被一種或多種重原子同位素進行同位素富集；并且每種被標記分析物的基團RP-X-LK-(或RP、X-LK1-、RP2-X-LK2-、RP3-X-LK3-、RP4-X-LK4-、RP5-X-LK5-、RP6-X-LK6-)可具有相同的質(zhì)量。通過標記試劑與分析物的反應加入到分析物中的結(jié)構(gòu)部分斷裂后，每種被標記分析物的RP可產(chǎn)生信號離子，所述信號離子可鑒別分析物所來源的樣品。因此，所述信號離子的強度與混合物中分析物的量以及#>入而形成樣品混合物的初始樣品中分析物的量相關(guān)。在一些實施方案中，RP和LK中每一個包含至少兩種重原子同位素。在一些實施方案中，RP和LK中每一個包含至少三種重原子同位素。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括使兩種或更多種樣品(每種樣品含有一種或多種^J[分析物)與標記試劑組或"同量異位的質(zhì)量標簽"組反應，從而產(chǎn)生各自含有一種或多種被標記分析物的兩種或更多種被不同標記的樣品，以及混合兩種或更多種被不同標記的樣品或其部分，以及任選地一種或多種校正標準物從而產(chǎn)生樣品混合物。一旦使標記試劑與反應活性分析物反應，Y鍵即可連接連接物與分析物；RP(在各式中分別由RP1、RP2、RP3、RP4、RpS和Rp6表示)和LK(在各式中分別由LK1、LK2、LK3、LK4、1^5和0^6表示)中至少之一(例如RP)可被一種或多種重原子同位素進行同位素富集；當同量異位的質(zhì)量標簽與分析物反應時，每種質(zhì)量標簽可將相同的質(zhì)量加到分析物中；并且裂解后，每種同量異位質(zhì)量標簽的RP(在各式中分別由RP1、RP2、RP3、RP4、Rps和Rp6表示)可產(chǎn)生與所述組中其它同量異位質(zhì)量標簽的信號離子的質(zhì)量不同的信號離子?？捎糜诟鶕?jù)上述方法標記分4斤物的示例性化合物(例如質(zhì)量標簽/標記試劑)之前已在標題"化合物"項下進行了論述。D.試劑盒在多個實施方案中，本發(fā)明的試劑盒可包含一種或多種標記試劑或"同量異位的質(zhì)量標簽"，其中至少一種可由結(jié)構(gòu)式r、1#、I-S，至VI-S，或I至VI中的任何一個或其鹽形式和/或水合物形式所代表，通常由I至VI之一所代表，其中RG代表親核基團或親電基團，其中其余變量如上所定義。所選用于試劑盒中的化合物通常是"同位素編碼的"。"同位素編碼的"意指對所述試劑盒的每種化合物中同位素的分布進行選擇，而產(chǎn)生對于每種不同化合物(即標記試劑)而言包含獨特質(zhì)量的報告物。通常，報告物基團和連接物基團(例如多個式中的RP/LK、RPVLK1、RP2/LK2、RP3/LK3、RP4/LK4、RP5/LK5或RP6/LK6)中至少之一可被一種或多種重原子同位素進行同位素富集；并且每種被標記分析物的基團RP-X-LK-(或RP、X-LK、、RP2-X-LK2-、RP3-X-LK3-、RP4-X-LK4-、RpS-X-LKS-或RP、X-LK、)可具有相同的質(zhì)量。通常，當裂解時，每種被標記分析物的RP可產(chǎn)生具有與所述試劑盒中其它同量異位質(zhì)量標簽的信85號離子不同的質(zhì)量的信號離子。同樣，公開了標記試劑的其它特性。例如，標記試劑可用于相同樣品中或兩種或更多種不同樣品中一種或多種分析物的多重分析。所述試劑盒的每種同量異位的標記試劑(即質(zhì)量標簽)被一種或多種重原子同位素進行同位素富集(編碼)。標記試劑可被同位素地富集以包含兩個或多個重原子同位素。標記試劑可被同位素富集以包含三種或更多種重原子同位素。標記試劑可被同位素富集以包含四種或更多種重原子同位素。在一些實施方案中，至少一種重原子同位素可被摻入到標記試劑的羰基或硫代羰基中，并且至少一種其它重原子同位素可^L摻入到標記試劑的報告物基團中。標記試劑包含含有固定電荷或可電離的報告物基團。因此，所迷報告物基團可包括易于電離的堿性或酸性部分。在一些實施方案中，所述報告物可以是含有羧酸、磺酸或磷酸基團的化合物。因此，在一些實施方案中，所述標記試劑可以其鹽形式進行分離。在一些實施方案中，標記試劑可包含氣基或硫代n連接物。包含g或硫代n連接物的標記試劑可以活性酯形式用于分^f物的標記。在活性酯中，醇基形成離去基團(LG)，例如，在一些實施方案中，所述離去基團示于圖9中。在一些實施方案中，活性酯可以是N-羥基琥珀酰亞胺酯。實施例才艮據(jù)下述實施例，還可進一步理解本教導的各方面，所述實施例不應被解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例中所用的縮寫的定義如下HMI代表六亞甲基亞胺，Pbf代表2，2，4，6，7-五甲基-二氫苯并呋喃-5-磺^LioFmoc代表9-芴基甲！U^J^Trt代表三苯甲基，Mpe代表3-曱基-戊-3-基，HATU代表0-(7-氮雜苯并三唑-l-基)-N，N，N，，N，-四甲基脲六氟磷酸鹽，NMP代表1-甲基-2-他咯烷酮，F(xiàn)mocOSu代表(9-芴基甲IUJtiJlJ0琥珀酰亞胺，DMAP代表4-二甲基氨基吡啶，THF代表四氫呋喃，HBTU代表O-(苯并三唑-l-基)-N，N，N，，N，畫四曱基脲六氟磷酸鹽，以及HOBT代表1-羥基苯并三唑水合物。進行胺的?；栽谫|(zhì)量標簽上產(chǎn)生反應活性基團的一般方案圖10以圖示方式說明了進行胺的酰化以在適于與半胱氨酸氛基酸的巰基反應的質(zhì)量標簽上產(chǎn)生反應活性基團的方案I和方案II。方案I:將相應的胺(l-400nmol)溶解在碳酸氫鈉(0.2M)水溶液和乙腈(v/v2:l或l:1)中。通備所述胺的濃度范圍在約0.01至約0.1M的范圍內(nèi)。加入溶于乙腈中的;^M戈乙酸N-羥基琥珀酰亞胺(約0.4M，相對于游離胺而言過量約IO倍)并同時旋渦反應混合物。室溫下?lián)u動混合物約10分鐘至約30分鐘。產(chǎn)物用HPLC進行純化，并用質(zhì)譜(MS)進行確認。方案II:室溫下將溶于CH2Cl2(3mL)中的^f戈乙酸酐(0.74g，2.1mmol)加入到含有N，N-二異丙基乙胺(DIEA，1.9mmol)的相應的胺(1.9mmol)的攪拌溶液中。室溫下，進一步攪拌反應溶液1.5至3小時，然后在二氯甲烷和水之間進行分配。將有機層用無水Na2S04干燥，真空下濃縮，并用硅膠快速色鐠進行純化。將產(chǎn)物用NMR和/或MS進行表征。根據(jù)方案II將可通過商業(yè)渠道得到的3,4-二甲氧基芐基敏Aldrich)?；孕纬少|(zhì)量標簽(1)。NMR(CDC13):53.72(s，2H)，3.90(s,6H),4.60(d，2H)，6.61(d，2H)，7.28(t,1H).MS中的[M+印+:336.0，計算值；336.0，實測值。II.質(zhì)量標簽(2)的合成圖11以圖示方式說明了質(zhì)量標簽(2)的合成。將4-氨基-千胺(Aldrich，1mmol)、琳R乙酸N-羥基琥珀酰亞胺(Pierce,1mmol)和N，N-二異丙基乙胺(DIEA，100nL)在二氯甲烷(10mL)中混合并在室質(zhì)量標簽(標記試劑)的合成I.質(zhì)量標簽(1)的合成溫下攪拌l小時。減壓除去溶劑。將產(chǎn)物用M柱色i瞽進行純化，用正己烷、乙酸乙酯(20%-60%)進行洗脫得到4-IL^-N-碘代乙酰芐胺(收率62.2%)。^NMR(MeOD):7.1(d，2H),6.75(d，2H)，4.21(s，2H)，3.65(s,2H)。MS中的[M+H+:291.0，計算值；291.0,實測值。將4-tJ^-N-碘代乙酰節(jié)胺(0.172mmol)、乙酸酐(0.2ml)和DIEA(0.2ml)在乙腈(3ml)中攪拌1.5小時。減壓蒸發(fā)溶劑。在二氯甲烷和水之間分配殘留物。將有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾并真空濃縮。將褐色剩余物用硅膠柱色鐠進行純化，用二氯甲烷和甲醇進行洗脫得到產(chǎn)物質(zhì)量標簽(2)(35mg，收率61%)。MS中的[M+Hl+:333.0，計算值；333.0，實測值。III.質(zhì)量標簽(3)的合成圖12以圖示方式i兌明了質(zhì)量標簽(3)的合成。向N-Boc-卩-叔丁基-a-琥珀酰亞胺基-天冬氨酸(Boc-Asp(But)誦OSu)(Bacchem,0.1mmol)與DMF(1ml)的混合物中加入六亞甲基亞胺(Aldrich，0.4mmol)。加入另外的DMF(2ml)。室溫下?lián)u動混合物2小時形成Boc-Asp(But)-HMI。將Boc-Asp(But)-HMI用制備性HPLC進行純化并用MS進行表征(M+H+:371.3,計算值；371.1,實測值)。室溫下通過將Boc-Asp(But)-HMI暴露于二氯甲烷(O.lml)和三氟乙酸(TFA，O.lml)的溶液中20分鐘而對Boc保護的胺基脫保護。40'C下真空蒸發(fā)溶劑至干。然后根據(jù)方案I將游離胺?；玫劫|(zhì)量標簽(3)([M+H+:383.0,計算值；383.0，實測值)。IV.質(zhì)量標簽(4)和質(zhì)量標簽(5)的合成圖13以圖示方式說明了質(zhì)量標簽(4)和(5)的合成。利用方案I通過酰化可從商業(yè)渠道得到的O-千基絲氨酸的胺基而制得質(zhì)量標簽U)。(MS中的[M+H]+:364.0，計算值；364.0，實測值)。利用方案I通過?；蓮纳虡I(yè)渠道得到的S-(對甲基千基)半胱氨酸的胺基而制得質(zhì)量標簽(5)。(MS中的[M+Hl+:394.0，計算值；394.0,實測值)。V.質(zhì)量標簽(6)、(7)和(8)的合成圖14以圖示方式說明了質(zhì)量標簽(6)、(7)和(8)的合成。A.質(zhì)量標簽(6)的合成用冰7JC浴冷卻BocNH-OH(1-2mmol)的DMF(2-4ml)溶液。加入氫化鈉(1.5-2倍當量于BocNH-OH)。在氫氣停止放出后，加入芐基溴(Aldrich，1倍當量于BocNH-R-OH)同時旋渦混合物。室溫下?lián)u動混合物5小時。離心后，將產(chǎn)物BocNH-O(Bzl)用制備性HPLC進行純化并用MS進行表征。室溫下通過將BocNH-O(Bzl)暴露于4-8ml25%TFA的二氯甲烷溶液中30分鐘以對Boc保護的胺基脫保護。將脫保護的化合物NH2-0(Bzl)用水芊取兩次，然后用制備性HPLC進行純化或者在蒸發(fā)溶劑后直接用在?；磻?。根據(jù)方案I將NH2-0(Bzl)?；蕴峁┵|(zhì)量標簽(6)(M+H+:292.0,計算值；292.0，實測值)。B.質(zhì)量標簽(7)的合成用水水浴冷卻BocNH-CH2CH2-OH(1-2mmol)的DMF(2-4ml)溶液。加入氫化鈉(1.5-2倍當量于BocNH-CH2CH2-OH)。在氫氣停止放出后，加入千基溴(Aldrich,1倍當量于BocNH-CH2CH2-OH)同時旋渦混合物。室溫下?lián)u動混合物5小時。離心后，將產(chǎn)物BocNH-CH2CH2-0(Bzl)用制備性HPLC進行純化并用MS進行表征。室溫下通過將BocNH-CH2CH2-0(Bzl)暴露于4-8ml25%TFA的二氯甲烷溶液中30分鐘以對Boc保護的胺基脫保護。將脫保護的化合物NHrCH2CH2-0(Bzl)用水萃取兩次，然后用制備性HPLC進行純化或者在蒸發(fā)溶劑后直接用在酰化反應中。根據(jù)方案I將NH2-CH2CHrO(Bzl)?；蕴峁┵|(zhì)量標紛7X[M+H+:320.0,計算值；320.0，實測值)。C.質(zhì)量標簽(8)的合成用冰水浴冷卻BocNH-(CH2)5-OH(1-2mmol)的DMF(2匿4ml)溶液。加入氫化鈉(1.5-2倍當量于BocNH-(CH2)5-OH)。在氫氣停止放出后，加入芐基溴(Aldrich，1倍當量于BocNH-(CH2)5-OH)并同時旋渦混合物。室溫下?lián)u動混合物5小時。離心后，將產(chǎn)物BocNH-(CH2)5-0(Bzl)用制備性HPLC進行純化并用MS進行表征。室溫下通過將BocNH-(CH2)s-0(Bzl)暴露于4-8ml25%三氟乙酸的二氯曱烷溶液中30分鐘以對Boc保護的胺基脫保護。將脫保護的化合物NHHCH2)s-0(Bzl)用水萃取兩次，然后用制備性HPLC進行純化或者在蒸發(fā)溶劑后直接用在跣化反應中。根據(jù)方案I將NHr(CH2)5-0(Bzl)?；蕴峁┵|(zhì)量標簽(8)(M+H]+:362.1，計算值；362.2,實測值)。VI.質(zhì)量標簽(9)、(10)和(11)的合成圖15以圖示方式說明了質(zhì)量標簽(9)、(10)和(11)的合成。A.質(zhì)量標簽(9)的合成將FmocGly(AppliedBiosystems，1mmol)、N，N，N，，N，國四甲基(琥珀酰亞胺)-脲四氟硼酸鹽(TSTU，AdvancedChemTech，1mmol)和N，N誦二異丙基乙胺(DIEA,Aldrich，2mmol)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(DMF，Burdick&Jackson,6ml)中。室溫下?lián)u動混合物半小時。蒸發(fā)溶劑形成FmocGly-OSu，其直接用于以下步驟中。向溶于DMF(0.8ml)和0.2M碳酸氫鈉的水溶液(2.8ml)中的L-絲氨酸(Bzl)(NovaBiochem,0.4mmol)加入溶于DMF(2.4ml)的FmocGly-OSu(0.4mmol)并同時旋渦。室溫下?lián)u動混合物20分鐘。將化合物FmocGly-Ser(Bzl)用制備性HPLC進行純化并用MS進行表征(M+Hl+:475.2，計算值；475.2，實測值)。室溫下將FmocGly-Ser(Bzl)(0.17mmol)暴露于4ml20%艱咬的DMF溶液中15分鐘以除去Fmoc保護基。40'C下真空蒸發(fā)溶劑。將殘留物用制備性HPLC進行純化，將化合物Gly-Ser(Bzl)用MS進行表征([M+H+:253.1，計算值；253.2，實測值)。90將溶于DMF(0.48ml)的FmocGly-OSu(0.08mmol)加入到溶于DMF(2.6ml)和0.2M碳酸氫鈉的水溶液(0.26ml)中的化合物Gly-Ser(Bzl)中并同時旋渦。室溫下?lián)u動混合物20分鐘。將所形成的化合物FmocGly-Gly-Ser(Bzl)用制備性HPLC進行純化并用MS進行表征([M+H+:532.2，計算值；532.2，實測值)。室溫下將FmocGly-Gly-Ser(Bzl)(0.5mg)暴露于0.2ml20%派咬的DMF溶液中l(wèi)O分鐘以除去Fmoc保護基。40。C下真空蒸發(fā)溶劑至干。根據(jù)方案I將脫保護的胺?；蕴峁┵|(zhì)量標簽(9)(質(zhì)譜中的M+H+:478.0，計算值;478.0，實測值)。B.質(zhì)量標簽(10)的合成根據(jù)A部分制備Gly-Ser(Bzl),并根據(jù)方案I進行?；蕴峁┵|(zhì)量標簽(10)([M+H+:421.0，計算值;421.0，實測值)。C.質(zhì)量標簽(11)的合成將FmocGly畫Ser(Bzl)(0.01mmol)、TSTU(0.02mmol)、和DIEA(0.02mmol)溶解在DMF(O.lml)中。室溫下?lián)u動混合物40分鐘，然后轉(zhuǎn)移到甘氨酸(O.lmmol)和碳酸氫鈉(0.2mmol)的在水溶液(0.05ml)中并同時旋渦。室溫下?lián)u動混合物30分鐘，將產(chǎn)物FmocGly-Ser(Bzl)-Gly用半制備性HPLC進行純化并用MS進行表征([M+H+:532.2,計算值;532.2，實測值)。將FmocGly誦Ser(Bzl)陽Gly(1mg)暴露于0.2ml20%旅咬的DMF溶液中l(wèi)O分鐘以除去Fmoc保護基。40。C下真空蒸發(fā)溶劑后，根據(jù)方案I將脫保護的胺?；蕴峁┵|(zhì)量標簽(11)([M+H+:478.0,計算值;478.0,實測值)。VII.質(zhì)量標簽(12)的合成圖16以圖示方式說明了質(zhì)量標簽(12)的合成。將FmocGly(1mmol)、TSTU(1mmol)和DIEA(1.5mmol)溶解在DMF(5ml)中。室溫下?lián)u動混合物40分鐘，然后轉(zhuǎn)移到甘氨酸(4mmo1)溶于5ml0.2M碳酸氫鈉水溶液的溶液中并同時旋渦。室溫下?lián)u動混合物20分鐘，將產(chǎn)物FmocGly-Gly用制備性HPLC進行純^ft并用MS進行表征([M+H+:355.2,計算值；355.2，實測值)。將BocNH-O(Bzl)(有關(guān)制備請參見V.A.部分和圖14)(0.2mmol)暴露于5ml25%TFA的二氯甲烷溶液中30分鐘以除去Boc保護基而形成NH2-0(Bzl)。將NHrO(Bzl)用水萃取，用制備性HPLC進行純化并用MS進行&([M+H+:124.1,計算值;124.2，實測值)。將FmocGly-Gly(0.02mmol)、TSTU(0.02mmol)和DIEA(0.03mmol)溶解在DMF(0.2ml)中。室溫下?lián)u動混合物40分鐘，然后轉(zhuǎn)移到NH2-0(Bzl)(2mg)溶于DMF(O.lml)和0.2M碳酸氳鈉水溶液(O.lml)的溶液中并同時旋渦。室溫下?lián)u動混合物20分鐘，將產(chǎn)物FmocGly-Gly國NH畫O(Bzl)用HPLC進行純化并用MS進行表征(M+H+:406.0，計算值；405.8，實測值)。室溫下將FmocGly-Gly-NH-O(BzI)暴露于0.2ml20%哌咬的DMF溶液中10分鐘以除去Fmoc保護基。蒸發(fā)所有溶劑后，根據(jù)方案I對脫保護的胺進行跣化以提供質(zhì)量標簽(12)([M+H+:406.0,計算值;405.8，實測值)。VIII.質(zhì)量標簽(13)的合成根據(jù)方案I將O-爺基酪氨酸?；蕴峁┵|(zhì)量標簽(13)(MS中的[M+H]+:440.0，計算值;440.2,實測值)。IX.質(zhì)量標簽(14)和(15)的合成圖17以圖示方式說明了質(zhì)量標簽(14)和(15)的合成。根據(jù)方案I將s-N-(千fLi^J+賴氨酸的a-胺基?；孕纬少|(zhì)量標簽(14)(MS中的[M+H+:435.0,計算值;435.0，實測值)。根據(jù)方案I將a-N-(爺lLiJliO-賴氨酸的s-胺基酏化以形成質(zhì)量標簽(15)(MS中的[M+H+:463.1，計算值;463.0,實測值)。X.用于合成質(zhì)量標簽(16)、(17)、(18)、(19)和(20)的一般方案圖18以圖示方式說明了用于合成質(zhì)量標簽(16)、(17)、(18)、(19)和(20)的一般方案。向溶于0.2M碳酸氫鈉水溶液(l-4ml)中的二胺(NH2-R，-NH2)(0.4-4mmo1)中加入溶于DMF(1-4ml)的氯甲酸千酯(AlfaAesar，0.1-2mmol)并同時旋渦。在圖18中定義了R，。氯甲酸芐酯與二胺的摩爾比是1:2-6。室溫下?lián)u動混合物5-20分鐘。將產(chǎn)物NHrR，-NH(Z)用制備性HPLC進行純化并用MS進行表征。然后利用方案I將單胺酰化以提供合適的質(zhì)量標簽。質(zhì)量標簽(16)(MS中的[M+H+:335.0,計算值；335.0，實測值)。質(zhì)量標簽(17)(MS中的M+H+:377.0，計算值；377.0,實測值)；質(zhì)量標簽(18)(MS中的[M+H]+:407.1，計算值；407.2,實測值)；質(zhì)量標簽(l9)(MS中的[M+H]+:451.1,計算值；451.0，實測值)；質(zhì)量標簽(20)(MS中的[M+H+:479.1，計算值；479.2，實測值)。XI.質(zhì)量標簽(21)、(22)、(23)和(24)的合成圖19以圖示方式說明了質(zhì)量標簽(21)、(22)、(23)和(24)的合成。A.質(zhì)量標簽(21)的合成將a-N-Fmoc個N-(爺氧基羰基)鳥氨酸(FmocOrn(Z))(AdvancedChemTech,0.25mmol)、TSTU(0.25mmol)和DIEA(0.375mmol)溶解在DMF(3mL)中。室溫下?lián)u動混合物1小時，然后轉(zhuǎn)移到lmmol甘氨酸和碳酸氫鈉的水溶液(3mL)中。室溫下?lián)u動混合物30-60分鐘，將產(chǎn)物FmocOrn(Z)-Gly用制備性HPLC進行純化并用MS進行表征(FmocOrn(Z)-Gly:[M+H+:546.2，計算值；546.4，實測值)。將FmocOrn(Z)-Gly(2mg)暴露于O.lmL20%艱咬的DMF溶液中10分鐘以除去Fmoc保護基。蒸發(fā)所有溶劑后，根據(jù)方案I將脫保護的胺?；园危┵|(zhì)量標簽(21)([M+H]+:492.1，計算值;492.0,實測值)。B.質(zhì)量標簽(22)的合成將a-N-Fmoc個N-(芐氧基羰基)鳥氨酸(FmocOrn(Z))(AdvancedChemTech，0.25mmol)、TSTU(0.25mmol)和DIEA(0.375mmol)溶解在DMF(3mL)中。室溫下?lián)u動混合物l小時，然后轉(zhuǎn)移到lmmolL-丙氨酸和碳酸氫鈉的水溶液(3mL)中。室溫下?lián)u動混合物30-60分鐘，將產(chǎn)物FmocOrn(Z)-Ala用制備性HPLC進行純化并用MS進行表征(FmocOrn(Z)-Ala:M+H+:560.2,計算值；560.2，實測值)。將FmocOrn(Z)-Ala(2mg)暴露于O.lmL20%哌咬的DMF溶液中10分鐘以除去Fmoc保護基。蒸發(fā)所有溶劑后，根據(jù)方案I將脫保護的胺?；蕴峁┵|(zhì)量標簽(22)([M+H+:506.1，計算值;505.8，實測值)。C.質(zhì)量標簽(23)的合成將FmocOrn(Z)-Gly(0.1mmol)、TSTU(0.2mmol)和DIEA(0.3mmol)溶解在DMF(1ml)中。室溫下?lián)u動混合物l小時，然后轉(zhuǎn)移到碳酸氬鈉(1.5mmol)和L醫(yī)丙氛酸(1mmol)的水溶液(1ml)中。室溫下?lián)u動混合物30分鐘，將產(chǎn)物FmocOrn(Z)-Gly-Ala用制備性HPLC進行純化并用MS進行表征([M+H]+:617.2,計算值;617.2，實測值)。將FmocOrn(Z)-Gly-Ala(2mg)暴露于O.lmL20%旅咬的DMF溶液中10分鐘以除去Fmoc保護基。蒸發(fā)所有溶劑后，根據(jù)方案I將脫保護的胺?；蕴峁┵|(zhì)量標簽(23)([M+H]+:563.1，計算值;563.2,實測值)。D.質(zhì)量標簽(24)的合成將FmocOrn(Z)-Ala(0.1mmol)、TSTU(0.2mmol)和DIEA(0.3mmol)溶解在DMF(1ml)中。室溫下?lián)u動混合物1小時，然后轉(zhuǎn)移到碳酸氫鈉(1.5mmol)和甘氨酸(1mmol)的水溶液(1ml)中。室溫下?lián)u動混合物30分鐘，將產(chǎn)物FmocOni(Z)-Ala-Gly用制備性HPLC進行純化并用MS進行表征([M+H+:617.2，計算值;617.2，實測值)。將FmocOrn(Z)-Ala-Gly(2mg)暴露于0.1mL20%嗛咬的DMF溶液中10分鐘。蒸發(fā)所有溶劑后，根據(jù)方案I將脫保護的胺酖化以提供質(zhì)量標簽(24)(M+H]+:563.1，計算值;563.2，實測值)。XII.質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽人[Glu1]-纖維蛋白肽B[Glu國Fib,SEQIDNo.:25GVNDNEEGFFSAR)，CAS#:103213-49-6利用標準的Fmoc-肽合成方案(Novabiochem目錄，2004-2005)在三苯甲基氯樹脂(P/N:Novabiochem,01-64-0074)上裝配所述肽。使用下述^J^酸衍生物Fmoc-Arg(Pbf)-OH(P/N:Novabiochem,04-12-1145)、Fmoc-Glu(C)tBu)國OH(P/N:Novabiochem,04-12-1020)、Fmoc畫Gly國OH(P/N:Novabiochem,04-12-1001)、Fmoc-Val-OH(P/N:Novabiochem,04-12-1039)、Fmoc-Asn(Trt)-OH(P/N:Novabiochem,04-12-1089)、Fmoc國Asp(Mpe)國OH(P/N:Bachem，B國3560)、Fmoc-Phe-OH(P/N:Novabiochem,04-12-1030)、Fmoc-SeifBu)畫OH(P/N:Novabiochem,04-12-1033)、Fmoc-Ala畫OH(P/N:Novabiochem,04-12-1006)。A.質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(38)的合成(參見圖30)將約10mgFmoc-Glu-Fib-三苯甲基氯樹脂用20%(v/v)哌啶的DMF溶液處理(2mLxl分鐘，過濾，然后2mLx5分鐘)、過濾并清洗(NMP)。將4-(Fmoc-氨基)苯甲酸(P/N:Bachem，B-3260;10倍當量于樹脂上Glu-Fib的量)用溶于NMP(~1mL)中的HATU(P/N:AppliedBiosystems4317033,9.5當量)和N，N-二異丙基乙胺(30當量)進行活化，加入到樹脂中并混合30分鐘。然后過濾樹脂，用NMP清洗，并斷開Fmoc基團。然后將艱喚乙酸-TFA鹽(10當量)用溶于NMP(~1.5mL)中的HATU(9.5當量)和N，N-二異丙基乙胺(60當量)進行活化，并加入到樹脂中。30分鐘后，用NMP清洗樹脂，之后用CH3CN清洗。利用95:5TFA-水(200^1，2小時)將綴合的M樹脂上斷開(和脫保護)并用Et20進行沉淀。利用MALDI-TOF(芥子酸介質(zhì)，計算值M+H^1843.8,實測值〖M+H+=1844.9)進行化合物(38)(參見圖30)的分析。進一步的質(zhì)鐠分析:在MALDI和電噴霧平臺上對質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(38)進行MS/MS分析。數(shù)據(jù)顯示質(zhì)量標簽是MALDI平臺的良好測試物，但在電噴霧平臺中的信號離子峰的強度則非常弱(數(shù)據(jù)未顯示)。用13C、15N和/或2H不同標記的氨基苯曱酸不能從商業(yè)渠道得到，95B.質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(39)的合成(參見圖30)將約10mgFmoc-Glu-Fib-三苯甲基氯樹脂用20%(v/v)嗛咬的DMF溶液進行處理(2mLxl分鐘，過濾，然后2mLx5分鐘)、過濾并清洗(NMP)。將4-(Fmoc-iJ^乙基)苯甲酸(P/N:Fhica,04062;IO倍當量于樹脂上Glu-Fib的量)用HATU(P/N:AppliedBiosystems4317033，9.5當量)和N，N-二異丙基乙胺(30當量)的NMP溶液(1mL)進行活化，加入到樹脂中并混合30分鐘。然后過濾樹脂，用NMP清洗，并裂解Fmoc基團。然后將哌漆乙酸-TFA鹽(10當量)用HATU(9.5當量)和N，N-二異丙基乙胺(60當量)的NMP溶液(~1.5mL)進行活化，并加入到樹脂中。30分鐘后，用NMP清洗樹脂，之后用CH3CN清洗。利用95:5TFA-水(200^L，2小時)將綴合的J!;U^樹脂上斷開(并脫保護)并用Et20進行沉淀。利用ES-MS進行化合物(39)的分析(直接注入水中，計算值[M+H+=1829.8,實測值[M+H廣-1829.9)(見圖30)。進一歩的質(zhì)語分析:在MALDI和電噴霧平臺上對質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(39)進行MS/MS分析。數(shù)據(jù)顯示質(zhì)量標簽是MALDI平臺的良好測試物但在電噴霧平臺中的信號離子峰的強度則非常弱(數(shù)據(jù)未顯示)。用13C、151\和/或211不同標記的#^苯曱酸不能從商業(yè)渠道得到，需J^成。C.質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(40)的合成(參見圖31)將約10mgFmoc-Glu-Fib-三苯甲基氯樹月旨用20%(v/v)艱啶的DMF溶液處理(2mLxl分鐘，過濾，然后2mLx5分鐘)、過濾并清洗(NMP)。將Fmoc-4-羧甲基旅噢(P/N:Chem-Impex,04960;10倍當量于樹脂上Glu-Fib的量)用溶于NMP(~1mL)中的HATU(P/N:AppliedBiosystems4317033,9.5當量)和N，N-二異丙基乙胺(30當量)進行活化，加入到樹脂中并混合30分鐘。然后過濾樹脂，用NMP清洗，并斷開Fmoc基團。然后將哌喚乙酸-TFA鹽(10當量)用溶于NMP(~1.5mL)中的HATU(9.5當量)和N,N-二異丙基乙胺(60當量)進行活化，并加入到樹脂中。30分鐘后，用NMP清洗樹脂，之后用CH3CN清洗。利用95:5TFA-水(200jil，2小時)將綴合的肽從樹脂上斷開(和脫保護)并用Et20進行沉淀。利用ES-MS進行化合物(40)(參見圖31)的分析(直接注入水中，計算值[]\1+11+=1836.9，實測值[1\1+11]+=1837.0)。進一步的質(zhì)譜分析:在MALDI和電噴霧平臺上對質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(40)進行MS/MS分析。數(shù)據(jù)顯示質(zhì)量標簽是MALDI和電噴霧平臺的良好測試物。肽的信號離子強度和斷裂方式與當前的fTRAQTM試劑N-甲基哌嗪乙酸相似(數(shù)據(jù)未顯示)。D.質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(41)的合成(參見圖32)化合物(41b):向胸腺嘧啶乙酸丙酯(41a)(可根據(jù)Alahiane,A.;Taourirte，M.;Rochdi，A.;Redwane，N.;Sebti,S.;Engels,J.W.;Lazrek,H.B.,"Buildingblocksforpolyamidenucleicacids:Facilesynthesisusingpotassiumfluoridedopednaturalphosphateasbasiccatalyst",iVMc/e仍iVfes，iV"c/eCVfes在iV"c/"V^"Vfc2003，22,109-114進4亍合成；1.33g，5.88mmol)和2畫Boc-0tJ0-溴乙烷(P/N:Fluka，17354，2.978g，13.29mmol)的DMF溶液(30mL)中加入固體形式的K2C03(3.4g，24.60mmol)并在環(huán)境溫度下攪拌20小時。此時的TLC分析顯示形成單一的產(chǎn)物(41b)(Rf=0.33,二氧化法&，1:1EtOAc-正己烷；UV254nm，通過以3%(w/v)茚三酮的EtOH溶液加熱使TLC顯色)。減壓除去DMF后，在EtOAc(350mL)和稀HC1(150mL，0.5M)之間分配所得的油。然后將EtOAc層用鹽水(100mLx2)清洗，以Na2S04干燥并濃縮得到無色油。利用快速色鐠(CombiFlash純化系統(tǒng)，120g柱，85mL/分鐘，270nm，0-5分鐘20%EtOAc的己烷溶液，然后80%EtOAc的己烷溶液，收集18mL級分，級分24-30含有純的產(chǎn)物)純化所述油得到2.02g(收率93%)產(chǎn)物(41b)。ES畫MS(直接注入MeOH中，計算值1\1+"&+=<:171127]\306+"3+=392.18，實測值[]\1+3]+=392.15)?；衔?41c):向化合物(41b)(1.10g,2.98mmol)的THF溶液(30mL)加入NaOH溶液(3.6mL，1M)并攪拌30分鐘。減壓除去溶劑，殘留物在環(huán)境溫度下用95%TFA的水溶液(20mL)處理1小時。減壓除去TFA-水，將由此得到的油溶解在飽和NaHC03(15mL,pH=8-9)溶液中并加入溶于丙酮(80mL)中的溶液形式的FmocOSu(1.20g，3.58mmol)。攪拌反應混合物19小時，此時TLC分析顯示形成單一的產(chǎn)物(41c)(Rf=0.22;二氧化>^1，9:1:0.01CH2Cl2-MeOH-AcOH,UV254nm，通過以3%(w/v)茚三酮的EtOH溶液加熱使TLC顯色)。然后濃縮反應混合物以除去丙酮，將由此得到的剩余物用水(100mL)進行稀釋。通過Et20(100mLx3)萃取以除去非極性雜質(zhì)。酸化(pH~1，HCl,1M)水層并用CH2C12(150mLx3)萃取。將<:112<:12層用Na2S04千燥并濃縮得到1.41g白色固體的產(chǎn)物(41c)(收率98%)。ES-MS(MeOH直接注入)計算值[1\1+3+=[(:241123]^306+~&+=472.15，實測值[M十Nar-472.09。將約lOmgFmoc-Glu-Fib-三苯曱基氯樹脂用20"/o(v/v)旅咬的DMF溶液處理(2mLxl分鐘，過濾，然后2mLx5分鐘)、過濾并清洗(NMP)。將化合物(41c)(10倍當量于樹脂上Glu-Fib的量)用HATU(P/N:AppliedBiosystems4317033，9.5當量)和N,N-二異丙基乙胺(30當量)的NMP溶液(~lmL)進行活化，加入到樹脂中并混合30分鐘。然后過濾樹脂，用NMP清洗，并裂解Fmoc基團。然后將p底,乙酸-TFA鹽(10當量)用溶于NMP(~1.5mL)中的HATU(9.5當量)和N，N-二異丙基乙胺(60當量)進行活化，并加入到樹脂中。30分鐘后，用NMP清洗樹脂，之后用CH3CN清洗。利用95:5TFA-水(200^L，2小時)將綴合的IU^樹月旨上斷開(和脫保護)并用Et20進行沉淀。利用ES-MS進行化合物(41)的分析(直接注入水中，計算值1\1+11+=1919.9,實測值[1\1+11+=1920.3)。進一步的質(zhì)謙分析:在MALDI和電噴霧平臺上對質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(41)進行MS/MS分析。數(shù)據(jù)顯示質(zhì)量標簽是MALDI和電噴霧平臺的良好測試物。信號離子強度強，并且觀察到了所預期的肽斷裂方式(數(shù)據(jù)未顯示)。E.質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(42)的合成(參見圖33)化合物(42b):向5-氟尿嘧咬(42a)(P/N:Oakwood，003241，0.5g,3.84mmol)和DMAP(46mg，0.384mmol)的乙腈溶液(25mL)中加入二碳酸二叔丁酯(P/N:Chem-Impex,00128，0.835g,3.84mmol)并在RT(RT代表室溫)下攪拌17小時。TLC分析顯示形成單一的產(chǎn)物N-l-Boc-5-氟尿嘧啶(42b)(R產(chǎn)0.86,二氧化歧板，7:3EtOAc-己烷，UV254nm，參考文獻Jaime隱Figueroa，S.;Zamilpa，A.;Guzman,A.;Morgans,D.J.，"N-3-AlkyIationofUracilandDerivativesviaN畫l-BocProtection",5^w^幼cOwi附簡/aiftVws,2001，37，3739-3746)。除去溶劑后得到的白色固體不需要進一步純化而用于下一步及^應中?；衔?42c):將化合物(42b)(3.84mmol)溶解在DMF(20mL)中并冷卻至0。C。向該溶液中加入固體形式的NaH(184mg，4.60mmol，60%，^tt在油中)并在RT下攪拌30分鐘。此時加入BrCH2COOMe(P/N:Acros，16955，0.437mL，4.60mmol)并在RT下攪拌反應混合物2小時。TLC分析顯示形成新的產(chǎn)物(R產(chǎn)0.64,二氧化>^1，1:1￡)入0己烷，UV254nm)。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去揮發(fā)物，并在EtOAc(250mL)和HC1(0.5M，lOOmL)之間分配所得的油。然后將EtOAc層用鹽水(100mLx2)清洗，Na2S04干燥并濃縮得到無色油。利用快速色鐠(CombiFlash純化系統(tǒng)，40g柱，40mL/分鐘，270nm，梯度25分鐘內(nèi)EtOAc在己烷中的增加為10-65%,收集18mL級分，級分15-25含有純的產(chǎn)物)純化所述油得到0.830g(收率71%)產(chǎn)物(42c)。ES-MS(直接注入MeOH中，計算值M+Na+=C12H15FN206+Na+=325.08，實測值[M+Na么325,12)?；衔?42d):將化合物(42c)(0.403mg,1.33mmol)用TFA-CH2C12(1:1,10mL)溶液處理15分鐘并除去揮發(fā)物以得到白色固體的化合物(42d)(0.250g，收率93%,Rf=0.40,二氧化^^L，1:1EtOAc-己烷，UV254nm)。ES-MS(直接注入MeOH中，計算值]\1+11+=[(:71171^204+11+=203.05，實測值[]\1+11+=203.09)?；衔?42e):向(42d)(0.250g,1.23mmol)和BrCH2CH2NHBoc(P/N:Fluka，17354，0.482g,2.15mmol)的DMF溶液(15mL)中加入固體形式的K2C03(0.509g，3.69mmol)并在RT下攪拌懸液23小時。TLC分析顯示形成單一的產(chǎn)物(42e)(R產(chǎn)0.28，二氧化>^，1:1EtOAc-己烷，UV254nm，通過用3%(w/v)茚三酮的EtOH溶液加熱使TLC顯色)。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑和揮發(fā)物后，在EtOAc(200mL)和稀HC1(100mL,pH=3-4)之間分配所得的油。然后將EtOAc層用鹽水(50mLx2)清洗，Na2S04干燥并濃縮得到無色油。利用快速色語(CombiFlash純化系統(tǒng)，40g柱，40mL/分鐘，270nm，梯度25分鐘內(nèi)EtOAc在己烷中的增加為40-60%,收集18mL級分，級分12-20含有純的產(chǎn)物)純化所述油得到0.382g(收率卯％)產(chǎn)物(42e)。ES-MS(直接注入MeOH中，計算值M+Na+=[C14H2()FN306+Na+1=368.12，實測值[M+Na+=368.23)?；衔?42f):將LiOHH20(55mg，1.32mmol的水溶液(2mL))加入到(42e)(0.226g，0.66mmol)溶于DMF(10mL)中的溶液中并攪拌20分鐘，此時TLC分析顯示甲酯已完全水解(Rf=0,二氧化硅板，l:lEtOAc-正己烷；UV254nm，通過用3%(w/v)茚三酮的EtOH溶液加熱使TLC顯色)。減壓除去揮發(fā)物并將殘留物在RT下用TFA-擬9:1，10mL)處理1小時。除去TFA-水后，將殘留物溶解在飽和NaHC03(30mL，pH=8-9)溶液中。然后將Fmoc-OSu(P/N:AdvanceChemTechRC8015,0.268g，0.79mmol，溶于丙酮(30mL)中)的溶液加入到水溶液中并在環(huán)境溫度下攪拌l小時。TLC分析顯示形成產(chǎn)物(42f)(R產(chǎn)0.20;二氧化硅板，9:1:0.01CH2Cl2-MeOH-AcOH，UV254nm,通過用3%(w/v)茚三酮的EtOH溶液加熱使TLC顯色)。然后濃縮反應混合物以除去丙酮，將由此得到的殘留物用水(150mL)進行稀釋。用Et20(100mLx2)萃取以除去非極性雜質(zhì)。酸化(pH1，HC1，1M)7JC層并用EtOAc(250mL)萃取。將EtOAc層用鹽水清洗(50mLx2),用Na2S04干燥并濃縮得到0.107g(3步總收率35%)無色粘性油的產(chǎn)物(42f)。ES-MS(MeOH直接注入)計算值[]\1+"3+=<:23112(^]\306+~3+=476.12，實測值[]\1+~8+=476.20。將約10mgFmoc-Glu-Fib-三苯甲基氯樹脂用20%(v/v)派咬的DMF溶液處理(2mLx1分鐘，過濾，然后2mLx5分鐘)、過濾并清洗(NMP)。將化合物(42f)(10倍當量于樹脂上Glu-Fib的量)用溶于NMP(1mL)中的HATU(P/N:AppliedBiosystems4317033，9.5當量)和N,N國二異丙基乙胺(30當量)進行活化，加入到樹脂中并混合30分鐘。然后過濾樹脂，用NMP清洗并斷開Fmoc基團。然后將派喚乙酸-TFA鹽(10當量)用溶于NMP(~1.5mL)中的HATU(9.5當量)和N，N-二異丙基乙胺(60當量)進行活化，并加入到樹脂中。30分鐘后，用NMP清洗樹脂，然后用CH3CN清洗。利用95:5TFA-水(200^L，2小時)將綴合的M樹脂上斷開(并脫保護)并用Et20進行沉淀。利用ES-MS進行化合物(42)的分析(直接注入水中，計算值[]\1+11]+=1923.8,實測值[M+H"^1924.0)。進一步的質(zhì)鐠分析:在MALDI和電噴霧平臺上對質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(42)進行MS/MS分析。數(shù)據(jù)顯示質(zhì)量標簽是MALDI和電噴霧平臺的良好測試物。信號離子強度強，并觀察到了所預期的肽斷裂方式(數(shù)據(jù)未顯示)。F.質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(43)的合成(參見圖34)化合物(43b):向(43a)(P/N:Oakwood,003333，1.0g，5.55mmol)和DMAP(67mg,0.55mmol)的乙腈溶液(40mL)中加入二碳酸二叔丁酯(P/N:Chem-Impex，00128，1.21g，5.55mmol)并在RT下攪拌2小時。TLC分析顯示形咸單一的產(chǎn)物(43b)(R產(chǎn)0.81,二氧化>^1,1:1EtOAc誦己烷，UV254nm，參考文獻Jaime-Figueroa，S.;Zamilpa，A.;Guzman，A.;Morgans,D.J.，"N-3-AlkylationofUracilandDerivativesviaN-l-BocProtection",爭汰"/c0附附Mw/cflri卿，2001,仏3739-3746)。除去溶劑后得到的白色固體不需要進一步純化而用于下一步及^應中?；衔?43c):將化合物(43b)(5.55mmol)溶解在DMF(35mL)中并冷卻至0。C。向該溶液中加入固體形式的NaH(267mg，6.66mmol，60%，^t在油中)并在RT下攪拌30分鐘。此時加入BrCH2COOtBu(P/N:Aldrich,124230，0.984mL，6.66mmol)并在RT下攪拌反應混合物1小時。TLC分析顯示形成一個主要的產(chǎn)物(43c)(R產(chǎn)0.60，二氧化珪板，1:4EtOAc-己烷，UV254nm)。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去揮發(fā)物，并在EtOAc(250mL)和HCl(0.5M,100mL)之間分配所得的油。然后將EtOAc層用鹽水(50mLx2)清洗，Na2S04干燥并濃縮得到無色油。利用快速色譜(CombiFlash純化系統(tǒng)，120g柱，85mL/分鐘，270nm，25%EtOAc的己烷溶液，收集18mL級分)純化所述油而得到0.528g(收率20%)產(chǎn)物(43c)。ES-MS(直接注入MeOH中，計算值[M2+Na]+=[C32H42F6N4012+Na+=811.26,實測值[1\12+"&+=811.42)?；衔?43d):將化合物(43c)(0.528g,1.34mmol)用TFA-CH2C12(1:9,15mL)溶液處理5分鐘并除去揮發(fā)物得到白色固體的化合物(43d)(0.3卯g，收率99%，Rf=0.22，二氧化>^1，1:4EtOAc-己烷，UV254nm)。ES曙MS(直接注入MeOH中，計算值M+Na^CuH!3F3N204+Na、317.07，實測值[M+Na、317.15)?；衔?43e):向(43d)(0.3卯g，1.32mmol)和BrCH2CH2NHBoc(P/N:Fluka，17354，1.112g,4.62mmol)的DMF溶液(15mL)中加入固體形式的K2C03(1.094g,7.92mmol)并且在RT下攪拌懸液23小時。TLC分析顯示形成單一的產(chǎn)物(Rf=0.70，二氧化v^L,1:1EtOAc-己烷，UV254nm，通過用3%(w/v)茚三酮的EtOH溶液加熱使TLC顯色)。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去揮發(fā)物，在EtOAc(200mL)和稀HCl(100mL,pH=3-4)之間分配所得的油。然后將EtOAc層用鹽水(50mLx2)清洗，Na2S04干燥并濃縮得到無色油。利用快速色諉(CombiFlash純化系統(tǒng)，40g柱，40mL/分鐘，270nm，35%EtOAc的己烷溶液，收集18mL級分，級分10-15含有純的產(chǎn)物)純化所述油得到0.256g(收率45%)產(chǎn)物(43e)。ES-MS(直接注入MeOH中，計算值[M+Na+=C18H26F3N3O6+NaI+=460.17，實測值M+Na^460.30)?；衔?43f):將化合物(43e)(0.256g，0.59mmol)用TFA-水(95:5，10mL)處理并攪拌l小時。減壓除去揮發(fā)物，將殘留物用Et20清洗。將由此所得的白色沉淀溶解在飽和NaHC03(30mL，pH=8-9)中。然后將Fmoc-OSu(P/N:AdvanceChemTechRC8015，0.239g，0.71mmol的丙酮溶液(2mL))的溶液加入到水溶液中并在環(huán)境溫度下攪拌1小時。TLC分析顯示形成產(chǎn)物(43f)(R產(chǎn)0.24;二氧化珪板，9:1:0.01CH2Cl2-MeOH-AcOH,UV254nm，通過以3%(w/v)茚三酮的EtOH溶液加熱使TLC顯色)。然后濃縮>^應混合物以除去丙酮，并將由此得到的殘留物用水(150mL)進行稀釋。用Et20(100mLx2)萃取以除去非極性雜質(zhì)。酸化(pH1，HCl，1M)水層并用EtOAc(250mLx2)萃取。將EtOAc層用Na2S04干燥并濃縮得到0.266g白色固體(43f)。ES-MS(MeOH直接注入)計算值]\1+3+=<:24112(^3]\306+~3+=526.12，實測值[M+Na十526.20。將約10mgFmoc-Glu-Fib-三苯曱基氯樹脂用20%(v/v)哌啶的DMF溶液處理(2mLxl分鐘，過濾，然后2mLx5分鐘)、過濾并清洗(NMP)。將化合物(43f)(10倍當量于樹脂上Glu-Fib的量)用溶于NMP(~1mL)中的HATU(P/N:AppliedBiosystems4317033，9.5當量)和N，N國二異丙基乙胺(30當量)進行活化，加入到樹脂中并混合30分鐘。然后過濾樹脂，用NMP清洗，并斷開Fmoc基團。然后將艱，秦乙酸-TFA鹽(10當量)用溶于NMP(1.5mL)中的HATU(9.5當量)和N，N-二異丙基乙胺(60當量)進行活化，并加入到樹脂中。30分鐘后，用NMP清洗樹脂，然后用CH3CN清洗。利用95:5TFA-水(200fiL，2小時)將綴合的^U^樹脂上斷開(和脫保護)并用Et20進行沉淀。利用ES-MS進行化合物(43)的分析(直接注入水中，計算值[M+H廣-1973.8，實測值M+H]^1974.0)。進一步的質(zhì)鐠分析:在MALDI和電噴霧平臺上對質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(43)進行MS/MS分析。lt據(jù)顯示質(zhì)量標簽是MALDI和電噴霧平臺的良好測試物。信號離子強度強，并且觀察到了所預期的肽斷裂方102式(數(shù)據(jù)未顯示)。G質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(46)的合成(參見圖36)化合物(46b):向O'C下的(46a)(P/N:Chem-Impex01343,2.73g,5.88mmol)的THF溶液(50mL)中加入BH3THF(14.7mL,1M)并使反應在RT下進行18小時。小的等分量(用MeOH淬滅)的TLC分析顯示形成新的產(chǎn)物和一些Boc脫保護的產(chǎn)物(Rf(46b)=0.50，二氧化#，1:1EtOAc-己烷，UV254nm,通過用3%(w/v)茚三酮的EtOH溶液加熱使TLC顯色，由TLC上強茚三酮陽性的基線斑點鑒定Boc脫保護的產(chǎn)物(與化合物(46a)不同))。用MeOH淬滅反應，加入J^1酸二叔丁酯(P/N:Chem-Impex，00128,1.28g，5.88mmol)并在RT下攪拌1小時。此時TLC分析顯示僅存在化合物(46b)。濃縮反應混合物，利用快速色譜(CombiFlash純化系統(tǒng)，120g柱，85mL/分鐘，270nm,0-15分鐘10%EtOAc的己烷溶液，然后60%EtOAc的己烷溶液，收集18mL級分)純化所述油得到2.12g(收率80%)產(chǎn)物(46b)。ES-MS(MeOH直接注入)計算值[]\1+~31+=[(:2711311^038+3+=472.19，實測值[]\1+3+=472.17?；衔?46c):在RT下，于4小時內(nèi)向(46b)(1.07g,2.38mmol)和CBr4(P/N:AWrichC11081,1.18g，3.57mmol)的CH;jCl2溶液(10mL)中加入PPh3溶液(P/N:AldrichT84409,0.685g，2.39mmol,溶于3mLCH2C12中)(使用注射泵)，添加完P(guān)Ph3后，再攪拌反應混合物1小時。TLC顯示形成主要產(chǎn)物(46c)R產(chǎn)0.50，二氧化樹良，1:4EtOAc-己烷，UV254nm，通過用3%(w/v)茚三酮的EtOH溶液加熱使TLC顯色)。減壓除去溶劑，利用快速色謝CombiFlash純化系統(tǒng)，120g柱，85mL/分鐘，270nm,0-5分鐘5%EtOAc的己烷溶液，然后20%EtOAc的己烷溶液，收集18mL級分)純化所述油得到0.6卯g(收率56%)產(chǎn)物(46c)。ES-MS(MeOH直接注入)計算值[M+Na+=[C27H30BrNO2S+NaI+=534.11，實測值+=534.06。化合物(46e):向(46c)(0.461g，O.卯mmol)和(46d)(0.244g，1.08mmol)的DMF(25mL)溶液中加入固體K2C03(0.372g,2.70mmol)并且在RT下攪拌68小時。TLC顯示存在產(chǎn)物(46e)(Rf=0.50，二氧化珪板，1:1EtOAc-己烷，UV254nm,通過用3%(w/v)茚三酮的EtOH溶液加熱使TLC顯色)、未反應的(46c)和(46d)。減壓除去DMF后，在EtOAc(200mL)和稀HCl(150mL,0.5M)之間分配所得的油。然后將EtOAc層用鹽水(50mLx2)清洗，Na2S04干燥并濃縮得到無色油。利用快速色謙(CombiFlash純化系統(tǒng)，40g柱，40mL/分鐘，265nm,0-1分鐘20%EtOAc的己烷溶液，然后1-10分鐘35%EtOAc的己烷溶液，然后50。/。EtOAc的己烷溶液，收集18mL級分，級分19-27含有純的產(chǎn)物)純化所述油得到0.200g(收率34%)產(chǎn)物(46e)。ES-MS(直接注入MeOH中，計算值[]\1+~31+=\3068+&+=680.28，實測值[]\1+&+=680.23)?；衔?46f):在RT下用TFA-CH2C12(9:1，10mL)處理化合物(46e)(0.200g，0.304mmol)30分鐘然后減壓除去TFA-CH2C12。將由此得到的黃色油與THF共蒸發(fā)直到所述油無色為止(硫醇基的再次三苯甲基化作用)。然后將油溶解在DMF(5mL)中并用N，N-二異丙基乙胺(P/N:Applied說osystems400136,pH9-10,濕pH試紙)磁z化。將N,N國二異丙基乙胺(0.206mL，1.19mmol)加入N-Me國哌漆乙酸2TFA(0.152g，0.395mmol)和HATU(AppliedBiosyslems，4317033，0.138g,0.364mmol)的DMF溶液(2mL)中；混合1分鐘并加入到上述Boc脫保護的(46c)的溶液中。1小時后，將^Ji混合物用HCl(1M)酸化，用鹽水(150mL)稀釋并用CH2C12(150mL)萃取。將二氯甲烷層用Na2S04干燥并濃縮得到0.207g白色泡沫的產(chǎn)物(46f)(98%)。ES-MS(直接注入MeOH中，計算值[1\1+11+=[(:391147&058+11+=698.33，實測值[]\1+11+=698.27)?；衔?46g):向(46f)(72mg，0.1mmol)溶于THF誦水(2:1，3ml)的溶液中加入NaOH溶液(0.20mL，1M)并混合30分鐘。利用TFA溶液(1M)將反應中和至pH=3并真空干燥得到產(chǎn)物(46g)。將約10mgFmoc-Glu-Fib-三苯甲基氯樹脂用20%(v/v)哌咬的DMF溶液處理(2mLx1分鐘，過濾，然后2mLx5分鐘)、過濾并清洗(NMP)。將化合物(46g)(10倍當量于樹脂上GIu-Fib的量)用溶于NMP(1mL)中的HATU(P/N:AppliedBiosystems4317033，9.5當量)和N，N-二異丙基乙胺(60當量)進行活化，加入到樹脂中并混合30分鐘。然后過濾樹脂，用NMP清洗，然后用CH3CN清洗。利用95:5TFA-水(200nL，2小時)將綴合的Jlb^樹脂上斷開(和脫保護)并用Et20進行沉淀。向產(chǎn)物肽(1:5CH3CN-水，0.60ml)的冰冷卻溶液中加入過甲酸溶液(0.6mL)并在0匸混合5分鐘(過甲酸(HCOOOH)溶液制備將4mLHCOOH(99%)+0.45mLH202(30%)+0.25mL水混合并使4^LRT下放置1小時)。ES-MS分析顯示存在所預期的氧化產(chǎn)物(46)。(計算值[M+HI+=2013.8，實測值1\1+11+=2013.7)。進一步的質(zhì)譜分析:在MALDI平臺上對質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(46)進行MS/MS分析。數(shù)據(jù)顯示質(zhì)量標簽是MALDI平臺的良好測試物(數(shù)據(jù)未顯示)。在MS分析(電噴霧)中，+3荷電物質(zhì)的量遠遠低于僅含有胸腺嘧咬核堿基的標簽的情形。當在MALDI平臺上分析時，在肽斷裂時該化合物僅給出"y，，離子系列(數(shù)據(jù)未顯示)-因此大大降低了用于分析的MS/MS鐠的復雜性。G質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(47)的合成(參見圖37)向>^基丙氨酸(P/N:TCIAmericaC0514，1g，5.90mmol)溶于NaHC03水溶液(pH=8-9,50mL)的溶液中加入Fmoc-OSu溶液(2.4g,7.08mmol，溶于150mL丙酮中)并在RT下攪拌18-19小時。減壓除去丙酮并用150mL水稀釋懸液。用Et20(100mLx3)萃取以除去非極性雜質(zhì)。用濃HC1將水層酸化至pH1，然后加入AmberliteIR-120-H樹脂(P/N:Aldrich216534,12g，1.9mmol/g-S03H基)，混合并過濾。凍干濾液得到2.52g白色吸濕性固體的Fmoc-磺基丙氨酸。ES-MS(直接注入水中)，負性模式，計算值M-Hr4Q8HrN07S-H]-3卯.06，實測值[M-H]:3卯.03。將約10mgFmoc-Glu-Fib-三苯甲基氯樹脂用20%(v/v)哌啶的DMF溶液處理(2mLx1分鐘，過濾，然后2mLx5分鐘)、過濾并清洗(NMP)。將Fmoc-磺基丙氨酸(10倍當量于樹脂上Glu-Fib的量)分別用溶于NMP(~lmL)中的HATU(P/N:AppliedBiosystems4317033，9.5當量)和N，N-二異丙基乙胺(30當量)溶液進行活化，加入到樹脂中并混合30分鐘。然后過濾樹脂，用NMP清洗，并斷開Fmoc基團。然后將派溱乙酸-TFA鹽(10當量)用溶于NMP(1.5mL)中的HATU(9.5當量)和N,N隱二異丙基乙胺(60當量)進行活化，并加入到樹脂中。30分鐘后，用NMP清洗樹脂，然后用CH3CN清洗。利用95:5TFA-水(200pL，2小時)將綴合的M樹脂上斷開(和脫保護)并用Et20進行沉淀。利用ES-MS進行化合物(47)的分析(直接注入水中，計算值[M+H、2070.9，實測值[M+H+=2071.8)。進一步的質(zhì)譜分析:在MALDI平臺上對質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(47)進行MS/MS分析。數(shù)據(jù)顯示質(zhì)量標簽是MALDI平臺的良好測試物(數(shù)據(jù)未顯示)。在MS分析(電噴霧)中，+3荷電物質(zhì)的量遠遠低于僅含有胸腺嘧咬核堿基的標簽的情形。當在MALDI平臺上分析時，在肽裂解時該化合物僅給出"y"離子系列(數(shù)據(jù)未顯示)-因此大大降低了用于分析的MS/MS色譜的復雜性。H.質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(49)的合成(參見圖38)向Br(CH2)3C02Et(P/N:Aldrich167118,0.645mL,4.5mmol)的EtOAc溶液(20mL)中加入l-甲基艱喚(P/N:Aldrich130001，1mL，9.0mmol)并攪拌過夜。過濾沉淀后，濃縮EtOAc層，利用快速色鐠(CombiFlash純化系統(tǒng)，12g珪膠柱，30mL/分鐘，20%甲醇的CH;jCl2溶液，收集18mL級分)純化由此所得的油產(chǎn)物(49a)。將產(chǎn)物(49a)溶解在水(4mL)中并在95。C加熱4小時。除去水后，將固體(49b)用THF清洗并真空干燥。ES-MS(直接注入水中，計算值[M+H+=[C9H18BrN202+H+=187.14，實測值[]\1+11+=187.18)。將約10mgFmoc-Glu-Fib-三苯甲基氯樹脂用20%(v/v)哌啶的DMF溶液處理(2mLx1分鐘，過濾，然后2mLx5分鐘)、過濾并清洗(NMP)。將化合物(49b)(10倍當量于樹脂上Glu-Fib的量)用溶于NMP(lmL)中的HATU(P/N:AppliedBiosystems4317033,9.5當量)和N，N-二異丙基乙胺(30當量，對于化合物21而言是60當量)進行活化，加入到樹脂中并混合30分鐘。然后過濾樹脂，用NMP清洗，然后用CH3CN清洗。利用95:5TFA-水(200^L，2小時)將綴合的肽從樹脂上斷開(和脫保護)并用Et20進行沉淀。利用ES-MS進行化合物(50)的分析(直接注入水中，計算值[]\1+11+=1738.8，實測值[M+Hr-1739.2)。進一步的質(zhì)譜分析:在MALDI和電噴霧平臺上對質(zhì)量標簽標記的Glu-Fib肽(49)進行MS/MS分析。數(shù)據(jù)顯示丙酸衍生物(49)可能是合適的測試物(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，接近的MS/MS模式的分析顯示存在一些其中部分標簽仍然是結(jié)合的肽片段?？赏ㄟ^摻入含有重原子同位素的原材料而將前述合成方法用于制備同位素編碼的標記試劑。下述實施例闡明了用于產(chǎn)生同位素編碼的同量異位標記試劑的多種方法。同量異位質(zhì)量標簽(標記試劑)的合成I.利用氘同位素進行同位素編碼的同量異位質(zhì)量標簽A.質(zhì)量標簽(25)的合成圖20以圖示方式說明了質(zhì)量標簽(25)的合成。將FmocSer(Bzl)(1mmol)、TSTU(1mmol)和DIEA(2mmol)溶解在DMF(6mL)中。室溫下?lián)u動混合物半小時。蒸發(fā)溶劑而形成FmocSer(Bzl)-OSu，其直接用于以下步驟。向甘氨酸(0.4mmol)溶于DMF(0.8ml)和0.2M碳酸氫鈉水溶液(2.8ml)的溶液中加入溶于DMF(2.4ml)中的Fmoc-Ser(Bzl)-OSu(0.4mmol)并同時渦旋。室溫下?lián)u動混合物20分鐘。將化合物FmocSer(Bzl)-Gly用制備性HPLC進行純化。將FmocSer(Bzl)-Gly(50mg)暴露于溶于DMF(5ml)的20%哌咬中10分鐘以除去Fmoc保護基。蒸發(fā)溶劑后，將產(chǎn)物Ser(Bzl)-Gly用制備性HPLC進行純化，并用MS進行表征([M+H]+:253.1，計算值；253.0，實測值)。將Fmoc甘氨酸-2，2-d2(ISOTEC,0.14mmol)、TSTU(0.21mmol)和DIEA(0.28mmol)溶解在DMF(1mL)中。室溫下?lián)u動混合物45分鐘，然后轉(zhuǎn)移到Ser(Bzl)-Gly(0.14mmol)溶于0.2M碳酸氯鈉水溶液(2ml)的溶液中。再加入DMF(1ml)。室溫下?lián)u動混合物20分鐘，將化合物FmocGly(d2)-Ser(Bzl)-Gly用制備性HPLC進行純化，并用MS進行表征([M+司+:534.2，計算值；534.2，實測值)。將FmocGly(d2)-Ser(Bzl)-Gly暴露于溶于DMF(5ml)的20%旅咬中15分鐘以除去Fmoc保護基。蒸發(fā)溶劑后，將產(chǎn)物Gly(d2)-Ser(Bzl)-Gly用制備性HPLC進行純化，并用MS進行表征(M+H+:312.1,計算值；312.0，實測值)。根據(jù)方案I將Gly(d2)-Ser(Bzl)-Gly?；蕴峁┵|(zhì)量標簽(25)([M+H]+:480.1，計算值；480.0，實測值)。B.質(zhì)量標簽(26)的合成圖21以圖示方式說明了質(zhì)量標簽(26)的合成。利用冰水浴冷卻Boc-L-Ser(NovaBichem，2mmol)的DMF溶液(4ml)。加入氫化鈉(Aldrich，6mmol)。在氫氣停止放出后，加入芐基-a，a糊d;j溴(ISOTEC，2mmo1)并同時渦旋。室溫下?lián)u動混合物5小時，將化合物BocSer(Bzl-d2)用制備性HPLC進行純化，并用MS進行表征([M+H+:298.2，計算值；298.2，實測值)。將BocSer(Bzl-d2)(0.4mmol)、TSTU(0.6mmol)和DIEA(0.8mmol)溶解在DMF(2mL)中。室溫下?lián)u動混合物l小時，然后逐滴轉(zhuǎn)移到甘氨酸(2mmol)溶于3mL1M碳酸氬鈉水溶液的溶液中。室溫下?lián)u動混合物30分鐘，將產(chǎn)物BocSer(Bzl-d2)-Gly用制備性HPLC進行純化，并用MS進行表征([M+H+:355.3，計算值；355.2,實測值)。室溫下，將BocSer(Bzl-d2)-Gly(64mg)溶于三氟乙酸(TFA，AppliedBiosystems，1ml)和二氯曱烷(2ml)的溶液中暴露30分鐘以除去Boc保護基。將混合物用水萃取兩次(每次1.5ml)。合并萃取物并用制備性HPLC進行純化。將產(chǎn)物Ser(Bzl-d2)-Gly用MS進行表征([M+H]+:255.1,計算值；255.2，實測值)。將FmocGly(0.3mmol)、TSTU(0.3mmol)和DIEA(0.45mmol)溶解在DMF(2mL)中。室溫下?lián)u動混合物1小時，然后逐滴轉(zhuǎn)移到Ser(Bzl-d2)-Gly溶于0.2M碳酸氫鈉水溶液(2ml)的溶液中。再加入DMF(lml)。室溫下?lián)u動混合物20分鐘，將產(chǎn)物FmocGly-Ser(Bzl-d2)-Gly用制備性HPLC進行純化，并用MS進行表征([M+H+:534.3，計算值；534.4，實測值)。將FmocGly-Ser(Bzl-d2)-Gly暴露于5ml20%旅咬的DMF溶液中10分鐘以除去Fmoc保護基。蒸發(fā)溶劑后，將產(chǎn)物Gly-Ser(Bzl-d2)-Gly用制備性HPLC進行純化，并用MS進行表征(M+H+:312.2，計算值；312.4，實測值)。根據(jù)方案I將Gly-Ser(Bzl-d2)-Gly?；蕴峁┵|(zhì)量標簽(26)([M+H]+:480.1，計算值；480.2,實測值)。II.利用12CV13C和"N/15N同位素編碼的同量異位質(zhì)量標簽A.質(zhì)量標簽(27)的合成圖22以圖示方式說明了質(zhì)量標簽(27)的合成。將FmocGly(13C2,15N)(ISOTEC，0.33mmol)、TSTU(0.66mmol)和DIEA(0.66mmol)溶解在DMF(2ml)中。皇溫下?lián)u動混合物40分鐘，然后逐滴轉(zhuǎn)移到L-絲氨酸(Bzl)(NovaBiochem，2mmol)溶于DIEA(4mmol)、DMSO(8ml)和水(2ml)的溶液中。室溫下?lián)u動混合物20分鐘，過濾后，將含有產(chǎn)物的濾液用制備性HPLC進行純化，將產(chǎn)物FmocGly(13C2，"N)畫Ser(Bzl)用MS進行表征(M+H+:478.2,計算值；478.2實測值)。將FmocGly(13C2，15N)-Ser(Bzl)、TSTU(0.6mmol)和DIEA(0.6mmol)溶解在DMF(2ml)中。室溫下?lián)u動混合物1小時，然后逐滴轉(zhuǎn)移到Gly(13C2，15N)(ISOTEC，lmmol)溶于水(2ml)和碳酸氫鈉(2mmol)的溶液+并同時渦旋。再加入DMF(4ml)。室溫下?lián)u動混合物30分鐘，離心后，將含有產(chǎn)物的上清液用制備性HPLC進行純化，將產(chǎn)物FmocGly(13C2，15N)-Ser(Bzl)-Gly(13C2,"N)用MS進行表征([M+H]+:538.2，計算值；538.2，實測值)。室溫下將FmocGly(13C2,15N)-Ser(Bzl)-Gly(13C2，15N)(4mg)暴露于0.2ml溶于DMF的20%嗛咬中10分鐘以除去Fmoc保護基。蒸發(fā)溶劑后，根據(jù)方案I將脫保護的胺酰化以提供質(zhì)量標簽(27)([M+H+:484.1,計算值；484.0，實測值)。B.質(zhì)量標簽(28)的合成圖23以圖示方式說明了質(zhì)量標簽(28)的合成。將Boc-L國Ser(NovaBiochem,5.82mmol)溶解在DMF(6ml)中并用水7JC浴冷卻。加入氫化鈉(17.46mmol)并同時渦旋。室溫下?lián)u動混合物15分鐘。當不再有氣體放出后，加入溴節(jié)(a-"C)(ISOTEC，2.91mmol)并同時渦旋。皇溫下?lián)u動混合物4小時，然后用制備性HPLC進行純化。將產(chǎn)物BocSer(Bzl-a-"C)用MS進行表征([M+H+:297.1，計算值；297.2，實測值)。109用10ml溶于二氯甲烷中的30。/oTFA將BocSer(Bzl-a-"C)(300mg)脫保護30分鐘，然后用水萃取兩次(每次3mL)。合并7jc層，并用制備性HPLC進行純化。將產(chǎn)物Ser(Bzl-ct-"C)用MS進行表征(M+H+:197.1，計算值；197.0，實測值)。將FmocGly(2-13C,15N)(ISOTEC,1mmol)、TSTU(2mmol)和DIEA(2mmol)溶解在DMF(3ml)中。室溫下?lián)u動混合物1小時，然后轉(zhuǎn)移到Ser(Bzl-a-"C)溶于3ml0.2M碳酸氫鈉的水溶液中并同時渦旋。室溫下?lián)u動混合物20分鐘,并用制備性HPLC進行純化，將產(chǎn)物FmocGly(2誦"C，15N)-Ser(Bzl畫a-"C)用MS進行表征([M+H+:478.2，計算值；478.2，實測值)。將FmocGly(2-13C，15N)-Ser(Bzl-a-13C)(0.021mmol)、TSTU(0.042mmol)和DIEA(0.042mmol)溶解在DMF(0.5ml)中。室溫下?lián)u動混合物l小時，轉(zhuǎn)移到甘氨酸("C2,"N)(ISOTEC，0.1mmol)溶于0.5ml0.2M碳酸氫鈉的水溶液中并在室溫下?lián)u動混合物20分鐘，用制備性HPLC進行純化，用MS對產(chǎn)物FmocGly(2國"C，15N)-Ser(Bzl-a-13C)-Gly(13C2,15N)進行表征([M+H+:538.2，計女值；538.0,實測值)。室溫下，用0.8ml溶于DMF中的20%哌咬將FmocGly(2-13C,15N)-Ser(Bzl-a-13C)-Gly(13C2，15N)(12mg)脫保護10分鐘，蒸發(fā)所有溶劑后，根據(jù)方案I將游離胺進行酖化以提供質(zhì)量標簽(28)([M+H1+:484.1，計算值；484.0，實測值)。含有同量異位質(zhì)量標簽的固相栽體^I.FmocGly-Ser(Bzl-"C6)的合成圖24以圖示方式說明了FmocGly-Ser(Bzl-13C6)(29)的合成按照與制備FmocGly(2-13C，15N)-Ser(Bzl-a-13C)(MS中的(M+H+:481.2,計算值；481.2，實測值)的步船目同的步驟制備所述化合物(參見利用重原子同位素進行同位素編碼的同量異位質(zhì)量標簽的合成，§IIB)。II.樹脂鍵合的質(zhì)量標簽的合成圖25以圖示方式說明了樹脂鍵合的同量異位的同位素編碼的質(zhì)量標簽(30)、(31)和(32)的合成。A.樹脂鍵合的同量異位同位素編碼的質(zhì)量標簽(30)的合成將1g濕的^J^PEGA樹脂(NovaBiochem，0.05mmol取代)用水、DMF、DCM、甲醇、DCM和DMF進行清洗。通常用每種溶劑清洗樹月旨兩次(每次約5ml)。將FmocPAL連接物(AppliedBiosystems，0.15mmol)、TSTU(0.15mmol)和DIEA(0.225)溶解^EDMF(1ml)中。室溫下?lián)u動混合物20分鐘，然后轉(zhuǎn)移到懸于約1mlDMF中的樹脂中。室溫下?lián)u動混合物1小時。過濾后，將樹脂用DMF、DCM、甲醇、DCM和DMF清洗兩次。將樹脂用5ml在DMF中的20%哌啶清洗一次，然后室溫下用5ml20%哌啶充分脫保護10分鐘。過濾后，將樹脂用DMF、DCM、甲醇、DCM和DMF清洗兩次。將FmocGly(13C2,15N)(ISOTEC,0.1mmol)、TSTU(0.1mmol)和DIEA(0.15mmol)溶解在DMF(1ml)中。室溫下?lián)u動混合物20分鐘，然后轉(zhuǎn)移到懸于約lmlDMF中的樹脂中。室溫下?lián)u動混合物2小時。過濾后，將樹脂用DMF、DCM、甲醇、DCM和DMF清洗兩次。將樹脂用5ml在DMF中的20%哌咬清洗一次，然后室溫下用5ml20%哌啶充分脫保護10分鐘。過濾后，將樹脂用DMF、DCM、甲醇、DCM和DMF清洗兩次。將FmocGly(13C2，15N)-Ser(Bzl)(0.1mmol)、HBTU/HOBT(AppliedBiosystems,0.1mmol)和DIEA(0.15mmol)溶解在DMF(1ml)中。室溫下?lián)u動混合物2小時。過濾后，將樹脂用DMF、DCM、甲醇、DCM和DMF清洗兩次。將樹脂用5ml在DMF中的20%艱咬清洗一次，然后室溫下用5ml20%派咬充分脫保護10分鐘。過濾后，將樹脂用DMF、DCM、曱醇、DCM和DMF清洗兩次。將>5^^乙酸(0.15mmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(0.15mmol)溶解在DMF(0.5ml)中。加入在DMF(0.5ml)中的DCC(Aldrich，0.15mmol)并同時渦旋。室溫下?lián)u動混合物l小時，過濾后，將溶^入到懸于含有碳酸氫鈉(0.15mmol)的1mlDMF中的樹脂中。室溫下?lián)u動混合物1小時。過濾后，將樹脂鍵合的質(zhì)量標簽(30)用水、DMF、DCM、甲醇、DCM、DMF和DCM清洗兩次。將樹脂鍵合的質(zhì)量標簽以等份分裝到管柱(cartridge)(MilliporeUFC30LG25)內(nèi)，用SpeedVac進行干燥，并儲存在水箱(-30'C)中以將來使用。每個管柱內(nèi)有約4mg干燥的樹脂鍵合的質(zhì)量標簽(30)。B.樹脂鍵合的同量異位的同位素編碼的質(zhì)量標簽(31)的合成除了FmocGly(13C2,15N)-Ser(Bzl)被替代為FmocGly(2-13C，"N)-Ser(Bzl-a，C)以外，用于合成樹脂鍵合的質(zhì)量標簽(31)的步驟與用于合成樹脂鍵合的質(zhì)量標簽(30)的步船目同。C.樹脂鍵合的同量異位的同位素編碼的質(zhì)量標簽(32)的合成除了FmocGly("C2/5N)和FmocGly("C2,N)-Ser(BzI)分別被替代為Fmoc甘氨酸和FmocGly-Ser(Bzl-"C6)以外，用于合成樹脂^:合的質(zhì)量標簽(31)的步驟與用于合成樹脂鍵合的質(zhì)量標簽(30)的步m目同。含有標記試劑的核堿基的合成圖26以圖示方式說明了從化合物(33)開始將核^(胸腺嘧啶)摻入到質(zhì)量標簽(36a)中，并通過中間化合物(34)和(35)繼續(xù)進行反應。進行該轉(zhuǎn)化的步驟描述如下化合物(34)的合成向胸腺嘧啶乙酸乙酯(33)(500mg，2.35mmol)和2曙Boc-(^J0國乙基溴(634mg，2.82mmol)的DMF溶液(50mL)中加入K2C03(974mg，7.05mmol)。將反應在環(huán)境溫度下攪拌18小時。薄層色鐠(TLC)分析顯示形成單一的產(chǎn)物(二氧化>^良，EtOAc溶劑；R產(chǎn)0.7;UV,茚三酮)。減壓除去DMF后，將產(chǎn)物用快速色鐠(ISCOCompanion純化系統(tǒng)；40gSiO;j柱，在260nm檢領ij,';j^J^=40mIV分鐘；0-7分鐘50%EtOAc的己坑溶液以除去未反應的2-Boc4i^)-乙基溴，然后100%EtOAc以洗脫產(chǎn)物)進行純化。ES-MS(直接注入曱醇中)([M+H+:356.18，計算值；356.18，實測值)。注意可根據(jù)"Buildingblocksforpolyamidenucleicadds:Facilesynthesisusingpotassiumfluoridedopednaturalphosphateasbasic112catalyst.Alahiane,A.;Taourirte，M.;Rochdi，A.;Redwane，N.;Sebti,S.;Engels,J.W.;Lazrek,H.B.Nucleosides,Nucleotides&NucleicAcids(2003),22(2)，109-114，，制備化合物(33)，為所有目的，將其全部教導通過引用并入本文?；衔?35)的合成當TLC分析顯示Boc脫保護完全時，在室溫下用溶于二氯甲烷(DCM)中的卯％TFA處理化合物(34)(465mg，1.3mmol)30分鐘。減壓除去TFA-DCM溶液，將由此得到的泡沫溶解在DMF(25mL)中。然后通過加入二異丙基乙胺中和溶液(用濕pH試紙檢查)。向該中性溶液中加入旅漆乙酸(206mg，1.3mmol)、HATU(494mg，1.3mmol)和二異丙基二乙胺(0.679mL，3.9mmol)溶于DMF(25ml)中的混合物。30分鐘后，TLC分析顯示形成產(chǎn)物(二氧化^良，EtOAc-MeOH(l:l)溶劑；Rf=0.2;UV，茚三酮)。減壓除去DMF后，將產(chǎn)物用快速色譜(ISCOCompanion純化系統(tǒng)；40gSi02柱，在260nm檢測，流速=40mL/分鐘；0畫1分鐘95%EtOAc的MeOH溶液，1-10分鐘50%EtOAc的MeOH溶液，10-30分鐘10%EtOAc的MeOH溶液)進行純化。ES-MS(直接注入水中)([M+H+396.22計算值，396.28實測值)?；衔?36a)的合成向化合物(35)(300mg，0.76mmol)的水溶液(20mL)中加入NaOH溶液(1.14mL，IN)。在環(huán)境溫度下攪拌溶液3小時。TLC分析顯示乙基酯完全水解。然后用TFA酸化反應混合物，然后減壓濃縮。由此得到的油直接使用而不需要進一步純化。ES-MS(直接注入水中)([M+Na+390.18計算值，3卯.40實測值)?；衔?37a)的合成可通過名稱為"反應活性基團"的部分中所述的眾所周知的方法制備含有反應活性基團RG的化合物(37a)。含有核堿基的其它標記試劑的制備和同位素編碼所述標記試劑的方法圖27A以圖示方式說明了用于以大于卯％的收率合成6-曱基尿嘧啶的乂/^p合成步驟。圖26中所列出的一般方法可用于將6-曱基尿嘧啶轉(zhuǎn)化為類似于化合物(36a)的異構(gòu)體(36b)，同樣，對于含有反應活性基團RG的化合物(37a)和(37b)也是如此。化合物(36a)和(37b)是通式RP-X-LK-Y-RG的化合物的實施方案，其中所述核M是連接物(LK)的成分，N-甲基p底溱是報告物(RP)的成分。圖27B和27C鑒別了可從商業(yè)渠道得到的同位素取代的原材料(CambridgeIsotopeLabs,AndoverMA)，所述原材料可用于制備圖27A中以圖示方式說明的同位素富集形式的6-甲基尿嘧啶。如圖所示，鄰近碳原子的符號"^"表示該碳是"C同位素，鄰近氮原子的符號"*"表示該氮是15N同位素。因此，利用公知的合成步驟和同位素取代的原材料可產(chǎn)生多種同位素取代的標記試劑及其前體。圖28A-28B以圖示方式說明了多種同位素富集形式的6-甲基尿嘧啶，所述6-甲基尿嘧咬可利用這些從商業(yè)渠道可得到的同位素取代的原材料和圖27A中以圖示方式說明的步驟制得。在圖28A和28B中，標號+1、+2、+3、+4、+5、+6和+7用于分另1]表示含有1、2、3、4、5、6和7個重原子同位素的6-甲基尿嘧咬形式。因為可利用任何不含重原子的同位素至多達7個重原子的同位素的那些原料來制備6-甲基尿嘧啶形式，所以有可能制備至少8種不同的同量異位的通式(37b)的標記試劑。圖28C中以圖示方式"^兌明了一些示例性的同位素編碼的標記試劑。注可根據(jù)以下文獻制備6-甲基尿嘧啶1.Donleavy，J.J.;Kise，M.A.6-MethylUracil,OrganicSyntheses,ColI.Vol.2，p.422;Vol.17，p.63;2.Jiang,Z.;Wang,Z.;Ma，D.;Zhou,Y.Improvedsynthesisof6-methyluracil.TongjiDaxueXuebao，ZiranKexueban，2003,31(2)，250-252:3.6-Methyluracil.SAIJIYOUSHIGEYA;MSHINAKATOSfflYOSHI(YodogawaPharmaceuticalCo.,Ltd.,Japan).Jpn.KokaiTokkyoKoho(1981),2pp.JP56139467;PatentwritteninJapanese.摘要RefluxingMeCOCH2C02Mewittiureaandp-MeC6H4S03Hinhexane6hwittiazeotropicremovalofH20gaveMe3-ureidocrotonate,whichwasheatedwith10%NaOH0.5hat95。togive92.6%6-methyluracil。III.用于一步固相iTPAQ的方案Af醋絲a.將蛋白質(zhì)樣品(50-100pg)溶解在50nl變性緩沖劑(0.2M的NH4HC03水溶液，含有8M脲和20mMCaCl2)中。b.向樣品溶液中加入2pi三[2-羧基乙基膦(TCEP，Sigma,50mM)并在37。C孵育1小時。c.加入lpi甲烷硫代磺酸甲酯(MMTS)試劑(Aldrich，200mM)并且旋渦樣品溶液10分鐘。d.將樣品溶液用0.1MNH4HCO3(1:1，50jil)進^#釋。e.向樣品溶液中加入2nlLysC(Wako,lpg/pl)并將樣品溶液在37'C孵育1小時以消化蛋白質(zhì)。f.用水(1:1，100nl)稀釋消化溶液。g.向消化溶液中加入10^(~5)胰蛋白酶(PromegaV5113,0.5ng/jil)并將消化溶液在37'C孵i4~6小時。h.向消化溶液中加入4filTCEP并將消化溶液在在37'C孵育1小時。必.《#處#標記*|爭應虞^^農(nóng)a.用50mMTris緩沖液(pH8)(3x300^1)清洗Millipore管柱中樹脂結(jié)合型同量異位的同位素編碼質(zhì)量標簽(UFC30LG25,如前制備的)。b.將蛋白質(zhì)消化溶液(~200nl)轉(zhuǎn)移到步驟a的預處理的管柱中。c.低速旋渦所述管柱3060分鐘。d.旋轉(zhuǎn)所述管柱以除去未結(jié)合的肽。通過HPLC分析濾液(以確定捕獲完成)。e.用0.1%TFA水溶液(3x300jil)清洗管柱中的樹脂。f.將樹脂在SpeedVac中進一步干燥。C.^#應#斧放被標記農(nóng)a.將200jilTFA(95%)和TIPS(Aldrich，5%)的裂解混合物(cleavagecocktail)加入到所述管柱中。b.使所述管柱在室溫下放置90分鐘。c.低速(6xlOOOg)旋轉(zhuǎn)所述管柱并且保留濾液。d.向所述管柱中加入額外的100pi0.1%TFA，并再次旋轉(zhuǎn)所述管柱，保留濾液。e.合并濾液并在SpeedVac中干燥而得到^^有質(zhì)量標記的肽的殘留物。利用MS和LC/MS/MS分析被同量異位的質(zhì)量標簽標記的肽質(zhì)量標簽(38)和(39)是一對被廣泛測試的質(zhì)量標簽。質(zhì)量標簽(38)和(39)具有下述結(jié)構(gòu)式(39)e可利用合適的同位素取代的原材料與任何公知的氨基酸合成方法來合成質(zhì)量標簽(38)和(39)，例如，可利用合適的同位素取代的原材料與圖25中所示的方法并結(jié)合從固相樹脂載體上釋放質(zhì)量標簽的斷開步驟。質(zhì)量標簽(38)和(39)二者的質(zhì)量為479.05Da，預計在經(jīng)歷解離能水平時會失去節(jié)基。然而，由于每個質(zhì)量標簽上氖取代基的放置，質(zhì)量標簽(38)將具有質(zhì)量為91.05Da的信號離子，質(zhì)量標簽(39)將具有質(zhì)量為93.07Da的信號離子。A.用質(zhì)量標簽(38)烷基化的肽的QTRAPTM2000分析將具有下述式的合成肽SEQIDNo.:1和SEQIDNo.:2的半胱氨酸氨基酸殘基用質(zhì)量標簽(38)烷J^化并且利用RP-HPLC進行純化SEQIDNo.:1IAVAAQNCYK、SEQIDNo.:2HYGGSVTGATCK:將純化的被標記肽以1的濃度在0.1%TFA中重構(gòu)。利用TurboIonSpray操作通過在QTRAP2000系統(tǒng)上的注入試驗(infusionexperiment)>生質(zhì)鐠。釆集總計0.5分鐘(40次掃描)。如圖2A和2B所示，被標記的SEQIDNos.:1和SEQIDNos.:2的分子離子的片段離子(失去91Da)百分率小(分別約為3%和10%)。在QTRAP2000的MS/MS模式中，被標記的SEQIDNos.:1和SEQIDNos.:2產(chǎn)生91Da的信號離子(分別見圖3A和3B)。它們的強^1A肽依賴性的并且通常至少約與銨離子的強度相同。在存在和強度方面，被標記肽的序列離子與相應的用琳K乙,基化的肽的那些離子是可比的。B.利用4700蛋白質(zhì)組分析儀分析用質(zhì)量標簽(38)或(39)烷基化的肽將SEQIDNo.:1和SEQIDNo.:3(DCGATWWLGHSER)用質(zhì)量標簽(38)烷基化，利用RP-HPLC進行純化，并且用0.1。/oTFA水溶液稀釋至100nL。將每種樣品(1jiL)與介質(zhì)(1|iL飽和溶液)混合，然后將每種混合物(1nL)裝載到MALDI板上用于分析。被標記的SEQIDNo.:1和SEQIDNo.:3的母離子分別為m/z1431.7和m/z1880.8。所述兩個肽都是穩(wěn)定的，并且在MS階段^M見察到由母離子引起的信號離子的丟失(參見圖4A和4B)。將CID氣體壓力設置在1x10-5托，被標記的SEQIDNo.:1產(chǎn)生的MS/MS鐠為m/z1431.7,而被標記SEQIDNo.:3產(chǎn)生的MS/MS鐠為m/z1880.8，總共釆集2000次掃描(參見圖5A和5B)。信號離子和序列離子如圖中所示。在MS/MS階段中信號離子的強Jbl肽依賴性的，并通常小于利用QTRAP2000得到的強度。然而，當CID增加時所述強度則可顯著增強(數(shù)據(jù)未顯示)。序列范圍與用碘代乙酸烷基化相應的肽所得的序列范圍一致。C.利用質(zhì)量標簽和QTRAPTM2000定量肽為評價樣品中蛋白質(zhì)表達的相對定量，制備了含有5種肽的2種樣品。5種肽的HPLC色鐠列在圖6A-C中。根據(jù)其保留時間從最早至最長，將這些肽命名為SEQIDNos.:1-5:SEQEDNo.:1IAVAAQNCYKSEQIDNo.:2IIYGGSVTGATCKSEQIDNo.:3DCGATWVVLGHSERSEQIDNo.:4VPADTEVVCAPPTAY1DFARSEQIDNo.:5VAHALSEGLGVIACIGEK將第一種樣品還原、用質(zhì)量標簽(38)烷基化、并用胰蛋白酶消化。第二種樣品含有與第一種樣品相同的5種肽，但是用質(zhì)量標簽(39)而不是質(zhì)量標簽(38)進行烷基化。將第一種樣品分等份(每份5皮摩爾)，并將每份與250飛摩爾至50皮摩爾的量的第二種樣品相組合。利用MRM掃描模式在QTRAPTM2000上通過LC-MS/MS實驗分析每種樣品混合物。在MS/MS中，用質(zhì)量標簽(38)標記的肽產(chǎn)生了91Da的信號離子，而用質(zhì)量標簽(39)標記的肽則產(chǎn)生了93Da的信號離子。在MRM實驗中，檢測到了特定分子離子向片段離子的躍遷。由于用2種不同的標簽將含有5種半胱氨酸的肽的每種樣品混合物烷基化，因此監(jiān)測到總共10種MRM過渡態(tài)(或?qū)?SEQIDNo.:1為716.5/91和716.5/93;SEQIDNo.:2為811.5/91和811.5/93;SEQIDNo.:3為628.5/91和628.5/93;SEQIDNo,:4為829.9/91和829.9/93以及SEQIDNo.:5為707.5/91和707.5/93。圖6中所述的光諳代表作為RPLC-保留時間函數(shù)的來自相應分子離子(即完整的肽離子)的特定片段離子(即91Da和93Da的離子)的豐度。由表1可見，所預計的比例與實驗得到的比例一致。動態(tài)范圍為1/0.05-1/10，跨度大于2個數(shù)量級。因為比例為1/0.1的來自質(zhì)量標簽(38)的91Da離子和比例為1/10的來自質(zhì)量標簽(39)的93Da離子仍然高于背景噪音，所以動態(tài)范圍可以是3個數(shù)量級或更多。D.利用質(zhì)量標簽和4700蛋白質(zhì)組分析儀定量肽制備上述來自C部分的樣品1和2的混合物。在所得混合物中，來自樣品1的肽的濃度被固定在0.2jiM。然后將每種(1)與介質(zhì)(1nL)混合，然后M種化混合物(1jiL)裝栽到MALDI板上并在4700蛋白質(zhì)組分析儀上進行分析。將CID設置在9x10-6，在每個MS/MS實驗中總共采集3000次掃描。91-離子和93-離子的峰面積強度用于計算實驗比例(參見表l)。動態(tài)范圍為1/0.05~1/10，跨度大于2個數(shù)量級。因為比例為1/0.1的來自質(zhì)量標簽(38)的91Da離子和比例為l/10的來自質(zhì)量標簽(39)的93Da離子仍然高于背景噪音，所以動態(tài)范圍可以是3個數(shù)量級或更多。對于相對定量而言，動態(tài)范圍為1個數(shù)量級的探針即可足夠，因為通常相對蛋白質(zhì)表達小于10倍。然而，對于絕對定量而言，需要大的動態(tài)范圍的探針。由于本發(fā)明的質(zhì)量標簽的動態(tài)范圍大于2個數(shù)量級，因此它們可用于蛋白質(zhì)的絕對定量以;M目對定量。<table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table>表l:利用QTRAPTM或4700蛋白質(zhì)分析儀對樣品中質(zhì)量標簽標記的蛋白質(zhì)的相對定量E.復雜蛋白質(zhì)混合物的分析用質(zhì)量標簽(38)或質(zhì)量標簽(39)將每種含有19種肽的兩種等同的蛋白質(zhì)混合物烷基化。因此，混合物中用質(zhì)量標簽(38)烷基化的肽將產(chǎn)生91Da的信號離子，而混合物中用質(zhì)量標簽(39)烷基化的肽則將產(chǎn)生93Da的信號離子。將所述兩種蛋白質(zhì)的混合物以1:1或1:2混合并利用QTRAPTM分析混合物以基于每個分子離子在MS/MS階段中信號離子(91/93)的比例測定每種樣品中每種肽的比例。由表2中的數(shù)據(jù)可見，1:1混合物和1:2混合物的實驗結(jié)果與所述19種肽中每一種的預計比例都相接近。肽肽序列(91/93)1:1比例的混合物(91/93)1:2比例的混合物BSA(aa223-228)CASIQK(S)EQIDNo.:6)1:1.071:2.04BSA(aa413-420)QNCDQFEK(SEQIDNo.:7)1:0.891:1.8BSA(aa460-468)CCTKPIESER(SEQIDMo.:8)1:0.861:2.2BSA(aa286-297)YICDNQDTISSK(SEQidNo.:9)1:0.731:1.96BSA(aa198-204)GACLLPK(SEQIDNo.:10)1:1.061:2.21BSA(aa387-399)DDPHACYSTVFDK(SEQIDNo.:l])1:1.071:1.44BSA(aa139-151)LKPDPNLCDEFK(SEQIDNo.:12)1:1.161:2.24BSA(aa508-523)RPCFSALTPDETYWK(SEQIDNo.:13)1:0.891:1.97轉(zhuǎn)鐵蛋白(aa27-37)WCAVSEHEATK(SEQIDNo.:14)1:1.01:1.5轉(zhuǎn)鐵蛋白(aa347-362)egtcpeap丁deck:pvk(SEQIDNo.:IS)1:1.281:2.44轉(zhuǎn)鐵蛋白(aaDDTVCLAK1:1.05I:1.7120<table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table>權(quán)利要求1.一種試劑盒，其包含至少兩種不同的由下式所代表的化合物或其鹽形式和/或水合物形式其中獨立地對各種不同化合物而言RG是親核基團或親電基團，或是分析物與親核基團或親電基團的反應產(chǎn)物；r是0～1的整數(shù)；S’是與固相載體或親和配體偶聯(lián)的可斷開連接物；X和Y各自是鍵，其中X偶聯(lián)RP和LK中每一個的原子或任選的取代基從而將RP與LK相連接，Y將LK的原子或任選的取代基與RG偶聯(lián)；RP和LK各自任選地并且獨立地被取代，其中RP是報告物基團并且LK是由結(jié)構(gòu)式E所代表的連接部分LK5其中每個n獨立地是1～3的整數(shù)，并且每個R獨立地是H、D、烷基、雜烷基、芳基、雜芳基、或鹵素基團；和每個化合物的RP具有獨特的總質(zhì)量，并且每個化合物的LK具有獨特的總質(zhì)量以補償每個化合物的RP之間的獨特總質(zhì)量的差異使得每個化合物的RP和LK的合計總質(zhì)量相同。2.權(quán)利要求1的試劑盒，其中RP是雜芳基、雜環(huán)烷基或被雜芳基或雜環(huán)烷基取代或插入的直鏈或支鏈的脂肪族或雜脂肪族基團。3.權(quán)利要求l的試劑盒，其中所述連接部分LKS是由下述結(jié)構(gòu)式所代表的基團或所述基團的同位素化形式4.權(quán)利要求l的試劑盒，其中所述化合物中的至少一種是或其同位素化形式。5.權(quán)利要求l的試劑盒，其中所述試劑盒的所有化合物是同量異位的。6.權(quán)利要求5的試劑盒，其中所述化合物是同量異位的同分異構(gòu)體。7.權(quán)利要求5的試劑盒，其中所述化合物是同量異位的同位素化形式。8.權(quán)利要求l的試劑盒，其中所述試劑盒的每個化合物都包含獨特的同位素編碼的報告物。9.權(quán)利要求1的試劑盒，其中RP包含任選地被取代的哌奉基，LK是芳基或環(huán)烷基，或被芳基或環(huán)烷基取代或插入的直鏈或支鏈的脂肪族或雜脂肪族基團。10.權(quán)利要求l的試劑盒，其中RG是親核基團或親電基團。11.權(quán)利要求10的試劑盒，其中RG是選自以下基團的親電基團N-羥基琥珀酰亞胺酯、N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯、五氟苯酯、2-硝基苯酯、4-硝基苯酯、2，4-二硝基苯酯或2，4-二卣代苯酯、混合酸酐、馬來酰亞胺、烷基卣、a-卣代-酰基的芳基卣化物、三苯曱基卣化物、以及曱硅烷基鹵化物。12.權(quán)利要求10的試劑盒，其中RG是選自以下基團的親核基團胺、羥基以及硫醇基。13.權(quán)利要求l的試劑盒，其中r是0。14.權(quán)利要求1的試劑盒，其中由S，所代表的所述可斷開連接物與所述固相載體偶聯(lián)。15.權(quán)利要求14的試劑盒，其中所迷試劑盒的每種不同的化合物被固定到載體上，所述載體是與固定任何其它不同化合物的栽體分開的。16.權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述試劑盒的每種不同化合物被固定在所述固相栽體的分開的陣列位置上，由此所述試劑盒是所述不同化合物的陣列庫。17.權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述固相栽體包含聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯、聚丙烯酰胺、玻璃、二氧化硅、可控多孔玻璃(CPG)或反相二氧化硅。18.權(quán)利要求17的試劑盒，其中RG是分析物與親核基團或親電基團的反應產(chǎn)物。19.權(quán)利要求1的試劑盒，其中RG是親核基團或親電基團與分析物的反應產(chǎn)物，并且所述分析物是蛋白質(zhì)、肽、核苷酸、寡核苷酸、脂質(zhì)、類固醇或小于1500道爾頓的小分子。20.權(quán)利要求l的試劑盒，其中當被施加解離能水平時，至少一部分化合物中的X鍵和Y鍵均發(fā)生斷裂。21.權(quán)利要求l的試劑盒，其中當被施加解離能水平時，至少一部分化合物中的RP發(fā)生亞斷裂。22.—種混合物，其包含多種由下式所代表的被標記分析物或其鹽形式和/或水合物形式其中獨立地對各種被標記分析物而言r是01的整數(shù)；S，是與固相栽體或親和配體偶聯(lián)的可斷開連接物；X和Y各自是鍵，其中X偶聯(lián)RP和LK中每一個的原子或任選的取代基從而將RP與LK相連接，Y將LK的原子或任選的取代基與-分析物偶聯(lián)；RP和LK各自任選地并且獨立地被取代，其中RP是報告物基團，LK是由結(jié)構(gòu)式E所代表的連接部分LK5:其中每個n獨立地是13的整數(shù)，并且每個R獨立地是H、D、烷基、雜烷基、芳基、雜芳基、或卣素基團；和每個被標記分析物的RP具有獨特的總質(zhì)量，并且每個被標記分析物的LK具有獨特的總質(zhì)量以補償每個被標記分析物的RP之間的獨特總質(zhì)量的差異，使得每個被標記分析物的RP和LK的合計總質(zhì)量相同。23.權(quán)利要求22的混合物，其中每個-分析物是蛋白質(zhì)、肽、核苷酸、寡核苷酸、碳水化合物、脂質(zhì)、類固醇、氨基酸或小于1500道爾頓的小分子。RP-X-LK-Y-分析物24.權(quán)利要求22的混合物，其中每個RP包含獨特的同位素編碼，所述同位素編碼識別所述分析物所來源的樣品。25.—種由下式所代表的同位素富集化合物或其鹽形式和/或水合物形式RP-X-LK畫Y陽RG，RG是親核基團或親電基團，或是分析物與親核基團或親電基團的反應產(chǎn)物；X和Y各自是鍵，其中X偶聯(lián)RP和LK中每一個的原子或任選的取代基從而將RP與LK相連接，Y將LK的原子或任選的取代基與RG偶聯(lián)；RP和LK各自任選地并且獨立地被取代，其中RP是報告物基團，LK是由結(jié)構(gòu)式E所代表的連接部分LKS:其中每個n獨立地是13的整數(shù)，并且每個R獨立地是H、D、烷基、雜烷基、芳基、雜芳基、或鹵素基團；和所述化合物的至少兩個原子用重原子同位素進行同位素富集。26.權(quán)利要求25的同位素富集化合物，其中RP和LK各自包含至少一個重原子同位素。27.權(quán)利要求25的同位素富集化合物，其中RP和LK各自包含至少兩個重原子同位素。28.權(quán)利要求25的同位素富集化合物，其中RP和LK各自包含至少三個重原子同位素。29.—種方法，包括a)使兩種或更多種各自含有一種或多種分析物的樣品與不同的標記試劑反應，從而產(chǎn)生各自含有一種或多種被標記分析物的兩種或更多種被不同標記的樣品，其中所述標記試劑由下式化合物或其鹽形式和/或水合物形式表示RP-X-LK-Y-RG其中獨立地對各種標記試劑而言RG是親核基團或親電基團；r是0~1的整數(shù)；S，是與固相栽體或親和配體偶聯(lián)的可斷開連接物；X和Y各自是鍵，其中X偶聯(lián)RP和LK中每一個的原子或任選的取代基從而將RP與LK相連接，Y將LK的原子或任選的取代基與RG偶聯(lián)；RP和LK各自任選地并且獨立地被取代，其中RP是才艮告物基團，LK是由結(jié)構(gòu)式E所代表的連接部分LK5:其中每個n獨立地是13的整數(shù)，并且每個R獨立地是H、D、烷基、雜烷基、芳基、雜芳基、或卣素基團；和每個被標記分析物的RP具有獨特的總質(zhì)量，并且每個被標記分析物的LK具有獨特的總質(zhì)量以補償每個被標記分析物的RP之間的獨特總質(zhì)量的差異，使得每個被標記分析物的RP和LK的合計總質(zhì)量相同;和b)混合兩種或更多種被標記的樣品或其一部分以及任選的一種或多種校正標準物從而產(chǎn)生混合物。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述兩種或更多種樣品是酶消化反應的產(chǎn)物。31.權(quán)利要求29的方法，其中每種樣品是分離過程的級分。32.權(quán)利要求29的方法，其中所述一種或多種分析物是蛋白質(zhì)、核酸分子、碳水化合物、脂質(zhì)、類固醇、氨基酸或小于1500道爾頓的小分子。33.權(quán)利要求29的方法，其中所述一種或多種分析物是肽。34.權(quán)利要求29的方法，其中所述一種或多種被不同標記的分析物各自包含獨特的報告物，所述報告物鑒別所述分析物所來源的樣品。35.權(quán)利要求29的方法，還包括c)對樣品混合物或其級分進行一級質(zhì)鐠分析；d)用解離能水平處理來自所述一級質(zhì)語分析的被標記分析物的具有所選質(zhì)荷比的所選離子，從而形成至少一些所選離子的信號離子和電離的子片段離子；和e)對所選離子、信號離子和子片段離子或其級分進行二級質(zhì)量分析。36.權(quán)利要求35的方法，還包括f)測定二級質(zhì)量分析中每種信號離子部分的總質(zhì)量和相對量以及子片段離子的總質(zhì)量。37.權(quán)利要求36的方法，還包括對具有不同的所選質(zhì)荷比的所選被標記分析物的離子重復進行步驟(d)至(f)一次或多次。38.權(quán)利要求36的方法，還包括重復步驟(c)至(f)一次或多次，每次用樣品混合物的不同級分。39.權(quán)利要求35的方法，其中所述報告物在用于測定分析物的條件下基本上不進行亞斷裂。40.權(quán)利要求35的方法，其中所述報告物在用于測定分析物的條件下進行亞斷裂。41.權(quán)利要求35的方法，其中通過分析子片段離子而鑒別與具有所選質(zhì)荷比的所選離子相關(guān)的被標記分析物。42.權(quán)利要求35的方法，其中相對于其它信號離子測定二級質(zhì)量分析中每個信號離子的相對量。43.權(quán)利要求42的方法，其中使與被鑒別分析物相關(guān)的每種信號離子的相對量與被加入而形成混合物的每種樣品的量相關(guān)聯(lián)，從而測定組合而形成所述混合物的所述兩種或更多種樣品中每種樣品內(nèi)分析物的相對量。44.權(quán)利要求43的方法，其中(i)所述混合物還包含已知量的至少一種用于被鑒別分析物的校正標準物，并且相對于與所述校正標準物相關(guān)的信號離子的量測定每種信號離子的絕對量；和(ii)相對于每種信號離子的量測定混合物的每種不同樣品中被鑒別分析物的絕對量。45.權(quán)利要求43的方法，還包括對具有不同的所選質(zhì)荷比的所選被標記分析物的離子重復進行步驟(d)至(f)一次或多次，從而鑒定和/或測定組合而形成混合物的所述兩種或更多種樣品中每種樣品內(nèi)一種或多種其它分析物的相對量。46.權(quán)利要求43的方法，還包括對具有不同的所選質(zhì)荷比的所選被標記分析物的離子重復進行步驟(d)至(f)一次或多次，從而鑒定和/或測定組合而形成混合物的所述兩種或更多種樣品中每種樣品內(nèi)一種或多種其它分析物的絕對量。47.—種試劑盒，其包含由結(jié)構(gòu)式VI所代表的化合物或其鹽形式和/或水合物形式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中Rpe和LK^各自獨立地是雜芳基或雜環(huán)烷基、或被雜芳基或雜環(huán)烷基取代或插入的直鏈或支鏈的脂肪族或雜脂肪族基團，其中RpS或LK^中至少之一含有任選地被取代的核堿基、或被任選地被取代的核堿基取代或插入的直鏈或支鏈的脂肪族或雜脂肪族基團；Rp6和lk6的任選取代基獨立地選自氫、氘、-oh、鹵素、-cn、-n02、烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳基烷基、雜芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、-r3、-t-r3、核糖、脫氧核糖或磷酸酯；每個W獨立地是氫、氘、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基或雜芳烷基；t是-o-、-nr4-、-s關(guān)、-c(o)-、-s(o)-、-so2-、-nr4c(o)-、-c(o)nr4-、-nr4s02-、-s02nr4-、-c(o)o陽、-oc(o)-、-nr4c(0)04-oc(0)nr4-;每個W獨立地是氫、氘、烷基、雜烷基、芳基、或芳烷基；x是報告物的原子和LK^之間的鍵；和y是連接物的原子和rg的原子之間的鍵，其中rp6和lk6中至少之一被一種或多種重原子同位素進行了同位素富集。48.權(quán)利要求47的試劑盒，其中僅LK^是核堿基。49.權(quán)利要求48的試劑盒，其中至少一種化合物由下述結(jié)構(gòu)式表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中x將RS和rm禹聯(lián)，y將r"和rg偶聯(lián)；rs是誦c(j)2-c(o)畫、-c(j)2-c(s)-、-<:(1)2-(:(]\11)-或-(:(<1)2-(:(1^)國，其中Rz是可任選地含有雜原子的含有1~8個碳原子的烷基或任選地被取代的芳基，其中所述烷基和芳基的碳原子獨立地含有連接的氫、氘和/或氟原子；以及每個J相同或不同，并且是H、氘(D)、Rz、ORz、SRz、NHRz、N(Rz)2、氟、氯、溴或碘；116和117各自獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳基烷基、雜芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、-R3、-T-R3、核糖、脫氧核糖或磷酸酯，其中每個113獨立地是氫、氘、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基、或雜芳烷基；以及RS和W各自獨立地是氫、氘、氟、氯、溴、碘或卣代烷基，前提是118和119不同時是氫。50.權(quán)利要求48的試劑盒，其中至少一種所述化合物是下述化合物或其同位素化形式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>51.權(quán)利要求l的試劑盒，其中至少一種化合物由結(jié)構(gòu)式I代表:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中:Rpi是由結(jié)構(gòu)式A所代表的報告物基團:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>其中，環(huán)A是芳香性的；每個Z獨立地是CH、CW或N,前提是不超過2個Z基團是N;ii是1或2j每個R2獨立地選自氫、氖、-OH、卣素、-CN、-N02、烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳基烷基、雜芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、-R3或-T-R3;每個RS獨立地是氫、氘、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基或雜芳烷基；TA-0—、一NR4—、—S—、一C(0)一、隱S(O)一、誦SOr、,NR4C(0)顯、國G(0)NR、、-NR4S02-、-S02NR4-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NR4C(0)(^-OC(0)NR4-;每個W獨立地是氫、氘、烷基、雜烷基、芳基、或芳烷基；LK1是連接部分LKS;X是報告物的原子和LK^之間的鍵；和Y是連接物的原子和RG的原子之間的鍵，其中R^和LK1中至少之一被一種或多種重原子同位素進行了同位素富集。52.權(quán)利要求51的試劑盒，其中環(huán)A是6元環(huán)。53.權(quán)利要求52的試劑盒，其中環(huán)A的鄰位或?qū)ξ坏腪基團是C-T-R3。54.權(quán)利要求53的試劑盒，其中環(huán)A的鄰位或?qū)ξ坏腪基團是C國NHC(O)-R3或C-NHS02-R3,并且每個R3獨立地是任選地被取代的烷基。55.權(quán)利要求51的試劑盒，其中RP可由結(jié)構(gòu)式A-l表示:56.權(quán)利要求l的試劑盒，其中至少一種化合物由結(jié)構(gòu)式II表示:環(huán)B是非芳香性的；n是l或2;每個W獨立地是O、S或NR、每個W，獨立地是CH2、CHR2、C(R2)2、C(0)或C-N-R4;Q是CH或CR2;Q是CH或CR2;每個R2獨立地選自氫、氘、-OH、鹵素、-CN、-N02、烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳基烷基、雜芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、-R3或畫T-R3;每個RS獨立地是氫、氘、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基、或雜芳烷基；TA一O-、—NR4—、—S—、國C(0)—、一S(O)一、S02—、-NR4C(0)—、—C(0)NR4—、RPzOC-LK2-Y-RG其中RP2是由結(jié)構(gòu)式B所代表的報告物基團-NR4S02-、-S02NR4-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NR4C(0)04-OC(0)NR4-;每個R"獨立地是氫、氘、烷基、雜烷基、芳基、或芳烷基；LK^是連接部分LK5;X是報告物的原子和LK^之間的鍵；和Y是連接物的原子和RG的原子之間的鍵，其中RP2和LK2中至少之一被一種或多種重原子同位素進行同位素富集。57.權(quán)利要求56的試劑盒，其中至少一種化合物由結(jié)構(gòu)式II-d所58.權(quán)利要求56的試劑盒，其中至少一種化合物由結(jié)構(gòu)式II-e所代表59.權(quán)利要求l的試劑盒，其中至少一種化合物由結(jié)構(gòu)式III所代表代表:其中Rps是由結(jié)構(gòu)式C所代表的報告物基團:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>其中,RX和Ry各自獨立地是烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳基烷基、雜芳基烷基或雜烷基，其中RX和Ry的任選取代基獨立地選自氫、氘、-OH、卣素、-CN、-N02、-R3、-T-R3、核糖、脫氧核糖或磷酸酯,或者Rx和Ry—起形成環(huán)C，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>環(huán)C，是雜芳基或雜環(huán)烷基，其中環(huán)C'的取代基獨立地是氫、氖、-OH、鹵素、-CN、-N02、烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳基烷基、雜芳基烷基、雜烷基、-R3、-T-R3、核糖、脫氧核糖或磷酸酯；每個RS獨立地是氫、氘、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基、雜芳基、或雜芳烷基；T、—NR4—、—S國、-G(O)國、隱S(0)—、-S02—、-NR4C(0)-、G(0)NR4—、-NR4S02-、-S02NR4-、-C(O)O-、國OC(O)誦、顯NR4c(0)0一或畫OC(0)NR4-;每個W獨立地是氫、氘、烷基、雜烷基、芳基、或芳烷基；LK3是連接部分LK5;X是報告物的原子和LK^之間的鍵；和Y是連接物的原子和RG的原子之間的鍵，其中Rps和LK3中至少之一被一種或多種重原子同位素進行了同位素富集。60.權(quán)利要求59的試劑盒，其中環(huán)C，由結(jié)構(gòu)式III-c所代表其中，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>III-C其中q是0~6的整數(shù)并且LK3包含羰基。全文摘要本發(fā)明涉及利用獨特的標記試劑或獨特的標記試劑組通過質(zhì)量分析測定分析物的方法、混合物、試劑盒和/或組合物。所述標記試劑可以是同分異構(gòu)的或同量異位的，并且可用于制備適于對被標記分析物進行多重分析的混合物。文檔編號C07D239/54GK101443664SQ200780013535公開日2009年5月27日申請日期2007年2月15日優(yōu)先權(quán)日2006年2月15日發(fā)明者嚴雄偉,喬·Y·拉姆,克里希納·G·烏帕德亞,奚國良,海倫娜·黃,蘇巴卡爾·戴伊,蘇巴西什·普爾卡亞斯塔,薩西·皮拉伊,袁保淼,袁詠蓮,達里爾·J·C·帕平申請人:阿普里拉股份有限公司