哺乳動(dòng)物的環(huán)二核苷酸信號(hào)通路的藥物靶向的制作方法
【專利說明】晡乳動(dòng)物的環(huán)二核苷酸信號(hào)通路的藥物靶向
[0001] 本發(fā)明在由美國國立衛(wèi)生研究院（NIH)提供的基金編號(hào)ROI AI-093967的政府支 持下進(jìn)行。政府對(duì)本發(fā)明具有一定的權(quán)利。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞質(zhì)的DNA誘導(dǎo)I型干擾素和其它的細(xì)胞因子，其對(duì)于抗微生物防御是重要的， 但也可導(dǎo)致自身免疫。此DNA信號(hào)通路需要銜接蛋白STING和轉(zhuǎn)錄因子IRF3,但DNA傳感 (DNA sensing)的機(jī)制尚不清楚。本文中，本發(fā)明人報(bào)道了在存在DNA而沒有RNA的情況 下，哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)提取物在體外從ATP和GTP合成了環(huán)GMP-AMP (cGAMP)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞 的DNA轉(zhuǎn)染或DNA病毒感染也觸發(fā)cGAMP的產(chǎn)生。cGAMP結(jié)合STING，導(dǎo)致激活I(lǐng)RF3并誘 導(dǎo)干擾素0 (IFNP)。因此，cGAMP代表了后生動(dòng)物中的第一環(huán)二核苷酸，并且其作為響應(yīng) 細(xì)胞質(zhì)DNA而觸發(fā)干擾素產(chǎn)生的內(nèi)源第二信使起作用。
[0003] 通過生化分級(jí)和定量質(zhì)譜，本發(fā)明人還確定了 cGAMP合酶（cGAS)，其屬于核苷酸 轉(zhuǎn)移酶家族。cGAS的過表達(dá)激活轉(zhuǎn)錄因子IRF3并以STING-依賴的方式誘導(dǎo)IFNP。敲除 cGAS抑制了經(jīng)DNA轉(zhuǎn)染或DNA病毒感染的IRF3激活和IFNI3誘導(dǎo)。cGAS在細(xì)胞質(zhì)中結(jié) 合DNA并催化cGAMP合成。這些結(jié)果表明，cGAS是胞質(zhì)DNA傳感器，其通過產(chǎn)生第二信使 cGAMP誘導(dǎo)干擾素。
[0004] 本發(fā)明將這些發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于涉及環(huán)-GMP-AMP合酶（cGAS)和環(huán)-GMP-AMP (cGAMP)的 新方法和組合物，包括其在制劑（包括疫苗佐劑）、藥物篩選、治療方法和診斷中的用途。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了基于細(xì)胞的藥物篩選，這包括抑制cGAS的方法，其 包括將細(xì)胞或細(xì)胞提取物與有效量的外源性cGAS抑制劑相接觸，并檢測(cè)所獲得的合酶抑 制。在具體的實(shí)施方式中，通過環(huán)-GMP-AMP誘導(dǎo)的IRF3激活（二聚化或核轉(zhuǎn)位）、干擾素 產(chǎn)生或NF-kB激活來推理檢測(cè)所獲得的抑制。
[0006] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了治療方法，這包括抑制cGAS的方法，其包括將確 定的有需求的細(xì)胞與有效量的外源cGAS抑制劑相接觸。在具體的實(shí)施方式中，方法包括向 確定的有需求且包含所述細(xì)胞的哺乳動(dòng)物施用抑制劑，和/或抑制劑是小分子環(huán)化酶抑制 劑或是cGAS特異性shRNA或siRNA。
[0007] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了體外藥物篩選，這包括抑制cGAS的方法，其包括 將包含合酶、ATP、GTP的混合物與抑制劑在條件下相接觸，其中所述條件下抑制劑抑制了經(jīng) 合酶的ATP和GTP到環(huán)-GMP-AMP和無機(jī)焦磷酸的催化轉(zhuǎn)化，并檢測(cè)所獲得的合酶抑制。在 一個(gè)具體的實(shí)施方式中，混合物進(jìn)一步包括DNA并且轉(zhuǎn)化是DNA-依賴性的。在其它的實(shí)施 方式中，cGAS是組成型活性的。
[0008] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了體外藥物結(jié)合測(cè)定，這包括抑制cGAS結(jié)合到底物 或輔因子的方法，其包括將包含合酶和ATP或GTP的底物或DNA輔因子的混合物與抑制劑 在條件下相接觸，其中所述條件下抑制劑抑制了合酶到底物或輔因子的結(jié)合，并檢測(cè)所獲 得的結(jié)合抑制。
[0009] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了制備cGAMP的方法，所述方法包括在條件下形成 包含cGAS、ATP和GTP的混合物，其中所述條件下合酶催化轉(zhuǎn)換ATP和GTP到cGAMP，其中 合酶、ATP和GTP是預(yù)定義量的，或者方法進(jìn)一步包括分離或檢測(cè)所獲得的cGAMP的步驟。 在【具體實(shí)施方式】中，混合物進(jìn)一步包括DNA并且轉(zhuǎn)化是DNA-依賴性的。
[0010] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了檢測(cè)cGAMP水平、cGAS水平或cGAS突變的方法， 所述方法包括以下步驟：檢測(cè)來自人的樣品中的cGAMP水平、cGAS水平或cGAS突變，并基 于cGAMP水平、cGAS水平或cGAS突變將所述的人分配一個(gè)自身免疫性疾病度量；和任選地 向所述的人施用用于自身免疫性疾病的治療方法。
[0011] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了包含預(yù)定量的cGAMP的組合物，如進(jìn)一步包含針 對(duì)靶病原體的免疫原的疫苗，其中cGAMP提供了佐劑。在【具體實(shí)施方式】中，組合物不含其它 的環(huán)二核苷酸，和/或另外地，適合于作為佐劑或疫苗，例如無菌的，藥學(xué)上可接受的，以確 定的、預(yù)定的量、比率等，并且組合物可以是為單個(gè)使用量化的散裝或單位劑量。本發(fā)明還 提供了誘導(dǎo)或促進(jìn)免疫應(yīng)答的方法，包括向有需求的哺乳動(dòng)物施用有效量的此類組合物。 在【具體實(shí)施方式】中，給藥是粘膜（舌下或鼻內(nèi)）、肌內(nèi)或皮下給藥。
[0012] 本發(fā)明包括所列【具體實(shí)施方式】的所有組合。進(jìn)一步的實(shí)施方式和本發(fā)明的適用性 的全部范圍將因下文所給出的詳細(xì)描述而變得顯而易見。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，詳細(xì)描述和 具體實(shí)施例雖然表示了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但僅以說明的方式給出，這是因?yàn)楸景l(fā)明 的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改因這一詳細(xì)描述而對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言變得顯而 易見。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 本發(fā)明提供了涉及cGAS和cGAMP的方法和組合物，這包括其在制劑（包括疫苗佐 劑）、藥物篩選、治療方法和診斷中的用途。
[0014] 要點(diǎn)：2' 3' -cGAMP是哺乳動(dòng)物細(xì)胞所產(chǎn)生的內(nèi)源性第二信使；2' 3' -cGAMP是 STING的高親和配體；2' 3' -cGAMP是I型干擾素的強(qiáng)誘導(dǎo)物；2' 3' -cGAMP結(jié)合誘導(dǎo)了 STING 的構(gòu)象變化。
[0015] 在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了基于細(xì)胞的藥物篩選，這包括抑制cGAS的方法，藥 物篩選包括將細(xì)胞或細(xì)胞提取物與有效量的外源性cGAS抑制劑相接觸，并檢測(cè)所獲得的 合酶抑制。合酶通常地是人或鼠cGAS，并且可以在融合蛋白中被截?cái)?、重組，或進(jìn)行其它修 改以適合分析。通常，方法是作為篩選分析進(jìn)行的，其中抑制劑是用于分析的候選抑制劑， 其可能來自文庫、先導(dǎo)化合物優(yōu)化等。例如通過cGAMP誘導(dǎo)的IRF3激活（二聚化或核轉(zhuǎn) 位）、干擾素產(chǎn)生或NF-kB激活直接或推理檢測(cè)抑制，通過例如質(zhì)譜、基于抗體的分析（例 如，ELISA、ALPHA、熒光偏振等）直接檢測(cè)cGAMP和其它產(chǎn)物。例如，可以通過q-RT-PCR測(cè) 量IFN RNA，通過非變性凝膠電泳測(cè)量IRF3二聚化。另外的合適的讀取包括ATP、GTP和焦 磷酸（PPi)的測(cè)量。
[0016] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了治療方法，這包括抑制cGAS的方法，治療方法包 括將確定的有需求的細(xì)胞與有效量的外源cGAS抑制劑相接觸。在具體的實(shí)施方式中，方法 包括向確定的有需求且包含所述細(xì)胞的哺乳動(dòng)物施用抑制劑，和/或抑制劑是小分子環(huán)化 酶抑制劑，或是cGAS特異性shRNA或siRNA，或其它的RNAi或反義RNA cGAS特異性抑制 劑。
[0017] 本發(fā)明人的數(shù)據(jù)表明，cGAS和cGAS-cGAMP途徑對(duì)于觸發(fā)針對(duì)自身和外源DNA的炎 癥反應(yīng)是重要的，因此cGAS抑制劑可用于降低相關(guān)自身免疫性疾病的病原性cGAS活性。類 似地，本發(fā)明人的數(shù)據(jù)表明，cGAS對(duì)于從正常細(xì)胞到癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化也是重要的，并且對(duì)于癌 細(xì)胞的生存和轉(zhuǎn)移也是重要的，因此cGAS抑制劑可用于降低相關(guān)的腫瘤性（neoplastic) 疾病的病原性cGAS活性。
[0018]目前用于狼瘡和其它自身免疫性疾病的治療方法涉及大劑量的免疫抑制劑，其具 有嚴(yán)重的副作用。雖然一種新的BAFF抗體（Benlysta)已被批準(zhǔn)用于治療狼瘡，但其只能 勉強(qiáng)有效。用小分子抑制劑（尤其是口服可用的那些）靶向cGAS提供了超過現(xiàn)有治療 方法的顯著的優(yōu)點(diǎn)。cGAS抑制劑靶向于狼瘡和其它自身免疫性疾病的根本原因，并為患 者提供了治療益處。此外，在自身免疫性病況如全身性紅斑狼瘡（SLE)、Sj6gren綜合征和 Aicardi-Goutiferes綜合征下，細(xì)胞溶質(zhì)的DNA先天免疫途徑是異常激活的，并且cGAS抑制 為這些疾病和其它自身免疫性疾病提供了一種合理的治療方法。
[0019] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了體外藥物篩選，這包括抑制cGAS的方法，藥物篩 選包括將包含合酶、ATP、GTP的混合物與抑制劑在條件下相接觸，其中所述條件下抑制劑抑 制了經(jīng)合酶的ATP和GTP到cGAMP和無機(jī)焦磷酸的催化轉(zhuǎn)化，并檢測(cè)所獲得的合酶抑制。 在具體的實(shí)施方式中，混合物進(jìn)一步包括DNA且轉(zhuǎn)化是DNA-依賴性的。在其它的實(shí)施方式 中，cGAS是組成型活性的。通常，方法是作為篩選分析進(jìn)行的，其中抑制劑是用于分析的候 選抑制劑，其可以來自文庫、先導(dǎo)化合物優(yōu)化等?；旌衔锟梢园诩?xì)胞或細(xì)胞提取物中， 或可以是無細(xì)胞的。
[0020] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了體外藥物結(jié)合測(cè)定，這包括抑制cGAS結(jié)合到底物 或輔因子的方法，藥物結(jié)合測(cè)定包括將包含合酶和ATP或GTP的底物或DNA輔因子的混合 物與抑制劑在條件下相接觸，其中所述條件下抑制劑抑制了合酶到底物或輔因子的結(jié)合， 并檢測(cè)所獲得的結(jié)合抑制。通常，方法是作為篩選分析進(jìn)行的，其中抑制劑是用于分析的候 選抑制劑，并且可以以各種合適的方式（包括固相免疫分析、熒光偏振分析等）來實(shí)現(xiàn)。
[0021] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了制備cGAMP的方法，所述方法包括在條件下形成 包含cGAS、ATP和GTP的混合物，其中所述條件下合酶催化轉(zhuǎn)換ATP和GTP到cGAMP，其中 合酶、ATP和GTP是預(yù)定義量的，或者方法進(jìn)一步包括分離或檢測(cè)所獲得的cGAMP的步驟。 在【具體實(shí)施方式】中，混合物進(jìn)一步包括DNA并且轉(zhuǎn)化是DNA-依賴性的。
[0022] cGAS活性的病原性表達(dá)，尤其是作為過表達(dá)或突變的結(jié)果，與人類自身免疫性疾 病相關(guān)；因此，本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)cGAS水平或突變的方法和分析，尤其是作為用于 人類自身免疫性疾病的診斷工具。因此，在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了檢測(cè)cGAMP水平、 cGAS水平或cGAS突變的方法，所述方法包括以下步驟：檢測(cè)來自人的樣品中的cGAMP水 平、cGAS水平或cGAS突變，并基于cGAMP水平、cGAS水平或cGAS突變將所述的人分配一個(gè) 自身免疫性疾病的度量；和任選地向所述的人施用用于自身免疫性疾病的治療方法。
[0023] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了包含預(yù)定量的cGAMP的組合物，如進(jìn)一步包含針 對(duì)靶病原體的免疫原的疫苗，其中cGAMP提供了佐劑。在【具體實(shí)施方式】中，組合物基本上或 實(shí)質(zhì)上不含其它的環(huán)二核苷酸。本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)或促進(jìn)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包 括向有需求的哺乳動(dòng)物施用有效量的此類組合物。在【具體實(shí)施方式】中，給藥是粘膜（舌下 或鼻內(nèi)）、肌內(nèi)或皮下給藥。
[0024] 作為I型干擾素的強(qiáng)誘導(dǎo)物，cGAMP提供了合理的免疫佐劑。cGAMP可以用作疫苗 佐劑，尤其是粘膜疫苗，并且可以與免疫原配制并形成環(huán)-二-GMP和c-二-AMP作為疫苗佐 劑進(jìn)行遞送；參見，例如 Pedersen 等人，PLoS ONE, Nov 2011,6, 11，e26973;Ebensen 等人， Vaccine 29, 2011，5210-5220 ;Chen 等人，Vaccine 28, 2010, 3080-3085。實(shí)際上，cGAMP 佐 劑往往更有效，這是因?yàn)閏GAMP比c-二-GMP在誘導(dǎo)干擾素方面更有效。
[0025] 應(yīng)當(dāng)理解的是，本文所描述的實(shí)施例和實(shí)施方式僅用于說明的目的，并且考慮到 其各種修改或改變都對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員有暗示作用，它們均包括于本申請(qǐng)的精神和范圍以 及所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。所有本文引用的出版物、專利和專利申請(qǐng)（包括其中引用的） 通過引用以其整體出于所有目的并入本文。
[0026] 實(shí)施例
[0027] 實(shí)施例1.環(huán)-GMP-AMP在經(jīng)胞質(zhì)DNA的天然免疫信號(hào)中是內(nèi)源性第二信使
[0028] 對(duì)抗外源遺傳因素的宿主防御是活有機(jī)體的最基本的功能之一。真核細(xì)胞感知細(xì) 胞質(zhì)中存在自身或外源DNA，作為異物侵入的危險(xiǎn)信號(hào)或標(biāo)志（1)。DNA可以經(jīng)細(xì)菌或病毒 感染、轉(zhuǎn)染或在導(dǎo)致自身免疫性疾病如狼瘡的某些病理?xiàng)l件下從核或線粒體中"泄漏"而被 引入到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，胞質(zhì)DNA觸發(fā)I型干擾素（IFN)和通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白 STING(也稱為MITA、MPYS或ERIS)的其它細(xì)胞因子的產(chǎn)生（2)。STING招募并激活胞質(zhì)激 酶IKK和TBK1，其分別激活轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和IRF3。然后NF-kB和IRF3進(jìn)入細(xì)胞核并 一起發(fā)揮作用以誘導(dǎo)IFN和其它細(xì)胞因子。DNA依賴性RNA聚合酶III已被證明是一種傳 感器，其檢測(cè)和轉(zhuǎn)錄富含AT的DNA如聚[dA :dT]到能夠刺激RIG-I途徑的RNA配體以誘導(dǎo) IFN(3,4)。然而，大多數(shù)DNA序列不激活RNA聚合酶III-RIG-I途徑。相反的，胞質(zhì)DNA以 序列獨(dú)立性方式激活STING-依賴性途徑。胞質(zhì)DNA如何激活STING途徑仍然難以理解。
[0029] 本發(fā)明人假設(shè)DNA結(jié)合并激活假定的胞質(zhì)DNA傳感器，其然后直接或間接地激活 STING，導(dǎo)致IRF3和NF-kB的激活。為了測(cè)試這一模型，本發(fā)明人使用鼠纖維肉瘤細(xì)胞系 L929(已知其以STING依賴性方式誘導(dǎo)干擾素(IFNP) (5))開發(fā)了體外互補(bǔ)分析。本發(fā) 明人使用穩(wěn)定表達(dá)抗STING的短發(fā)夾（sh)RNA的L929細(xì)胞系，使得DNA轉(zhuǎn)染僅激活STING 的上游因子（包括假定的DNA傳感器）。用不同類型的DNA轉(zhuǎn)染L929-shSTING細(xì)胞，然后 將這些細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)提取物與人單核細(xì)胞系THP1或鼠巨噬細(xì)胞系Raw264. 7相混合，將其 用產(chǎn)氣莢膜梭菌素〇(perfringolysin 0)(PF0)透化。PF0處理在質(zhì)膜上打孔（6)，允許細(xì) 胞質(zhì)擴(kuò)散進(jìn)出細(xì)胞，同時(shí)在細(xì)胞內(nèi)保留了包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（其包含STING)和高爾基體的細(xì)胞器 (7)。如果在DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中產(chǎn)生了 STING的上游激活物，則預(yù)期包含這種激活子的細(xì)胞 質(zhì)在PF0-透化的細(xì)胞中激活STING，導(dǎo)致IRF3的磷酸化和二聚化。
[0030] 轉(zhuǎn)染有已知為干擾素刺激性DNA(ISD)、聚[dA :dT]、富含GC的50個(gè)堿基對(duì)的 dsDNA(G:C50)、聚[dl :dC]或鯡魚睪丸DNA(HT-DNA)的 DNA序列的 L929-shSTING 細(xì)胞的細(xì) 胞質(zhì)提取物在透化的THP1細(xì)胞中激活I(lǐng)RF3,這表明此活性獨(dú)立于DNA序列。
[0031] 為了確定STING激活物是否是一種蛋白質(zhì)，本發(fā)明人在95°C孵育細(xì)胞質(zhì)提取物以 變性大多數(shù)蛋白質(zhì)，然后將"熱的上清液"與透化的THP1細(xì)胞孵育。意外的是，來自于ISD 或HT DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的熱的上清液引起了 IRF3的二聚化。此活性抵抗Benzonase (其降 解DNA和RNA)或蛋白酶K的處理。因此，STING激活物可能不是蛋白質(zhì)、DNA或RNA。
[0032] 為了測(cè)試DNA是否可以在體外刺激耐熱的STING激活物的產(chǎn)生，本發(fā)明人將HT DNA與L929-shSTING細(xì)胞質(zhì)提取物（S100)在存在ATP的情況下孵育。將反應(yīng)混合物加熱 至95°C使蛋白質(zhì)變性。引人注目的是，上清液與透化的Raw264. 7細(xì)胞的孵育導(dǎo)致了 IRF3 的二聚化。這一活性依賴于添加DNA到細(xì)胞質(zhì)提取物中。其它的DNA(包括聚[dA:dT]、聚 [dG :dC]和ISD)也在L929-shSTING細(xì)胞質(zhì)提取物中刺激了 STING的產(chǎn)生，而聚[I :C]和 單鏈RNA沒有活性。用透化的THP1細(xì)胞獲得了類似的結(jié)果。在透化的THP1細(xì)胞中敲降 STING去除了經(jīng)轉(zhuǎn)染到L929細(xì)胞的DNA或添加到L929細(xì)胞質(zhì)提取物的DNA所產(chǎn)生的耐熱 因子的IRF3的激活。對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明，STING的敲降抑制了 IRF3的激活以及在HT-DNA轉(zhuǎn)染 的THP1細(xì)胞中的IFNP和TNFa的誘導(dǎo)，但經(jīng)聚[I :C]轉(zhuǎn)染或仙臺(tái)病毒感染（已知其激活 RIG-I途徑）的IRF3的激活不受STING敲降的影響。本發(fā)明人還測(cè)試了數(shù)種細(xì)胞系的細(xì)胞 質(zhì)提取物產(chǎn)生耐熱STING激活物的能力。將HT-DNA與來自原代MEF細(xì)胞、小鼠骨髓衍生的 巨噬細(xì)胞（BMDM)和L929細(xì)胞的提取物孵育，導(dǎo)致產(chǎn)生了激活I(lǐng)RF3的耐熱因子。來自THP1 而不是HEK293T細(xì)胞的人類細(xì)胞提取物也能夠產(chǎn)生這種STING激活物。這些結(jié)果與本發(fā)明 人先前所發(fā)現(xiàn)的原代MEF、BMDM、L929和THP1細(xì)胞（而不是HEK293T細(xì)胞）具有STING依 賴性、RNA聚合酶III非依賴性通路以誘導(dǎo)I型干擾素⑶相一致。
[0033] 之后，本發(fā)明人使用多個(gè)層析步驟（包括STING-標(biāo)簽親和純化步驟）從L929 細(xì)胞提取物中純化耐熱的STING激活物。先前的研究已經(jīng)表明，細(xì)菌分子環(huán)-二-AMP 和環(huán)-二-GMP結(jié)合到STING并誘導(dǎo)I型干擾素（8,9)。然而，使用微型（nano)液相色 譜質(zhì)譜（微型-LC-MS)，本發(fā)明人沒有檢測(cè)到與所預(yù)期的c-二-GMP([M+H] + = 691)或 c-二-AMP([M+H] + = 659)相一致的MS或MS/MS譜。有趣的是，MS譜的深入研究揭示了具 有675. 1 (z = 1+)和338. 1 (z = 2+)的質(zhì)荷比（m/z)的兩個(gè)離子，其存在于活性部分但不 存在于背景譜中。這些m/z值（盡管質(zhì)譜儀（LTQ)的低質(zhì)量精度）相當(dāng)于c-二-GMP和 c-二-AMP的計(jì)算的平均m/z值（675 = [691+659]/2)。這一觀察表明，所檢測(cè)的離子是 c-二-GMP 和 c-二-AMP 的雜合體，即環(huán)-GMP-AMP (m/z = 675. 107, z = l+;m/z = 338. 057， z = 2+)。這種離子的碰撞誘導(dǎo)解離（CID)碎片（m/z = 338. 1，z = 2+)揭示了數(shù)個(gè)占優(yōu)勢(shì) 的具有所預(yù)期的產(chǎn)物離子c-GMP-AMP (cGAMP)的m/z值的離子。重要的是，使用選擇性反應(yīng) 監(jiān)測(cè)（SRM)的定量質(zhì)譜表明，來自C18柱的級(jí)分中代表cGAMP的離子豐度與其IRF3刺激活 性很好地相關(guān)聯(lián)。最近已在細(xì)菌弧菌（Vibro cholera)中鑒定了 cGAMP并顯示出在細(xì)菌趨 化性和定植中發(fā)揮作用（10)。然而，尚未報(bào)道cGAMP在真核細(xì)胞中存在或具有功能。
[0034] 為了驗(yàn)證耐熱STING激活物的身份，本發(fā)明人使用了高分辨率高精度質(zhì)譜儀（Q Exactive，Thermo)來進(jìn)行微型-LC-MS分析。細(xì)胞衍生的STING激活物具有675. 107 (z = 1+)和338. 057 (z = 2+)的m/z，其精確匹配cGAMP的理論值。為了進(jìn)一步表征cGAMP的結(jié) 構(gòu)和功能，本發(fā)明人開發(fā)了十步的單燒瓶方案以化學(xué)合成cGAMP。細(xì)胞衍生的STING激活物 的MS/MS譜與化學(xué)合成的cGAMP的譜相同。這些結(jié)果證實(shí)L929細(xì)胞產(chǎn)生cGAMP。
[0035] 定量RT-PCR和ELISA分析表明，化學(xué)合成的cGAMP在引入到細(xì)胞后在L929細(xì) 胞中誘導(dǎo)IFNPRNA和蛋白質(zhì)。滴定實(shí)驗(yàn)表明，即使?jié)舛鹊椭?0nM，cGAMP也強(qiáng)烈地誘導(dǎo) IFN0 RNA。實(shí)際上，基于ELISA分析，cGAMP在i秀導(dǎo)IFN0方面比c_二一GMP更強(qiáng)。cGAMP 還在激活I(lǐng)RF3方面比c-二-GMP和c-二-AMP更強(qiáng)。為了確定L929提取物是否包含可以 合成其它類型的能激活I(lǐng)RF3的二-核苷酸或寡核苷酸的酶，本發(fā)明人以不同組合測(cè)試了所 有四種核糖核苷酸。ATP和GTP都是支持IRF3的激活物的合成所必要且充分的，這進(jìn)一步 支持了L929包含從ATP和GTP合成cGAMP的酶。
[0036] 為了確定DNA病毒感染是否導(dǎo)致細(xì)胞中cGAMP的產(chǎn)生，本發(fā)明人用缺少ICP 34. 5 (已知在受感染的細(xì)胞中拮抗干擾素產(chǎn)生的病毒蛋白（11))的HSV-1感染L929細(xì)胞。 如DNA轉(zhuǎn)染一樣，HSV-1 A ICP34. 5感染導(dǎo)致L929細(xì)胞中IRF3的激活。來自轉(zhuǎn)染DNA或感 染病毒的細(xì)胞的細(xì)胞提取物包含可以在透化的Raw264. 7細(xì)胞中激活I(lǐng)RF3的耐熱因子。作 為對(duì)照，本發(fā)明人用水泡性口炎病毒株VSV-A M51-GFP (已知通過RIG-I通路引發(fā)強(qiáng)干擾素 產(chǎn)生的RNA病毒（12，13))感染L929細(xì)胞。與HSV-1相比，VSV感染的細(xì)胞在相同的體外 分析中不包含耐熱IRF3激活物，盡管VSV感染確實(shí)在L929細(xì)胞中誘導(dǎo)IRF3的激活。通過 反相HPLC富集并使用SRM通過微型-LC-MS定量HSV-1感染細(xì)胞中的耐熱因子。DNA轉(zhuǎn)染 的或HSV-1感染的細(xì)胞（而不是模擬處理的或VSV感染的細(xì)胞）產(chǎn)生了升高水平的cGAMP。 動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，DNA轉(zhuǎn)染到L929細(xì)胞后，在IRF3二聚化之前產(chǎn)生cGAMP且可以檢測(cè)到 IFNP誘導(dǎo)。為了測(cè)試DNA病毒是否可以在人細(xì)胞中誘導(dǎo)cGAMP產(chǎn)生，本發(fā)明人用HSV1或 牛痘病毒（VACV)感染THP1細(xì)胞。兩種病毒都在細(xì)胞中誘導(dǎo)了 IRF3的二聚化。重要的是， 這兩種病毒也都引發(fā)了激活I(lǐng)RF3的cGAMP的產(chǎn)生。總之，這些結(jié)果表明，在人和小鼠細(xì)胞 中的DNA轉(zhuǎn)染和DNA病毒感染產(chǎn)生了 cGAMP，其導(dǎo)致IRF3激活。
[0037] 為了確定cGAMP是否通過STING激活I(lǐng)RF3,本發(fā)明人進(jìn)行了三組實(shí)驗(yàn)。首先，本 發(fā)明人建立了穩(wěn)定表達(dá)STING的HEK293T細(xì)胞系，用cGAMP刺激這些細(xì)胞，然后通過定量 RT-PCR測(cè)量IFN0的誘導(dǎo)。HEK293T細(xì)胞不響應(yīng)cGAMP，這可能是由于在這些細(xì)胞中缺乏 STING表達(dá)或STING表達(dá)水平非常低。HEK293T細(xì)胞中STING的表達(dá)使得產(chǎn)生經(jīng)cGAMP的 高水平的IFN0的誘導(dǎo)。然而，DNA未刺激HEK293T/STING細(xì)胞以誘導(dǎo)IFN0，這與HEK293T 細(xì)胞缺少產(chǎn)生對(duì)DNA刺激的響應(yīng)的cGAMP相一致。相比之下，L929細(xì)胞誘導(dǎo)響應(yīng)經(jīng)cGAMP 或DNA的刺激的IFN0。HSV-1感染在L929中誘導(dǎo)IRF3二聚化，而HEK293T或HEK29T/ STING細(xì)胞則沒有，這表明cGAMP的產(chǎn)生對(duì)HSV-1在細(xì)胞中激活I(lǐng)RF3是重要的。實(shí)際上，來 自