fmol重質(zhì)磷酸肽標(biāo)準(zhǔn)物。將所有數(shù)據(jù)用Pinpoint軟件（Thermo Scientific)處理并將結(jié)果以pg磷酸肽/yg總蛋白的形式報告。
[0211] 蛋白質(zhì)印記法
[0212] 在Laemmli緩沖液中制備處理過的細(xì)胞的溶解液并將10yg上樣到10%Nu-PAGE 凝膠（Invitrogen，UK)的每個泳道內(nèi)。展開樣品，直至考馬斯亮藍(lán)染料前沿在凝膠底部的 Icm內(nèi)。將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝基纖維素上并分別用總tau特異性抗體（多克隆兔抗人 tau,Dako,UK(cat#A0024))和磷酸化-蘇氨酸 231 特異性抗體（Tau(Phospho_Thr231)抗 體，SignalwayAntibody,USA(cat#11110))展開印記。在所有情況下，將結(jié)合的抗體用ECL RabbitIgG,HRP_Linked(來自驢）（GEHealthcare,UK(cat#NA934))進(jìn)行檢測。
[0213] 結(jié)果
[0214] 待測和參比化合物對SH-SY5Y-TMHT細(xì)朐的細(xì)朐存活率的影晌
[0215] 通過MTT試驗(yàn)在分化的SH-SY5Y-TMHT細(xì)胞中測定細(xì)胞存活率。待測和參比化合 物的使用濃度分別為〇. 05yM至10yM和0.IyM至IyM。處理6小時后評價細(xì)胞存活率。 圖1顯示了化合物324對SH-SY5Y-TMHT細(xì)胞的細(xì)胞存活率的影響，其中該圖以溶媒對照 (VC，白色條棒）的％的形式表示化合物324對SH-SY5Y-TMHT細(xì)胞的細(xì)胞存活率的影響。 統(tǒng)計學(xué)意義用*〈〇. 05, **〈0. 01，***〈0. 001表示并且通過One-WayANOVA測定。將來自兩 個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)表示為組平均+/-SEM(n= 8)。從圖1可以看出，化合物324以劑量依賴 的方式對SH-SY5Y-TMHT細(xì)胞的細(xì)胞存活率表現(xiàn)出保護(hù)作用，盡管該作用僅在10yM的濃度 下具有統(tǒng)計學(xué)意義。圖2顯示了化合物987對SH-SY5Y-TMHT細(xì)胞的細(xì)胞存活率的影響，其 中該圖以溶媒對照（VC，白色條棒）的％的形式表示化合物987對SH-SY5Y-TMHT細(xì)胞的細(xì) 胞存活率的影響。統(tǒng)計學(xué)意義用*〈〇. 05, #〈0. 01，*#〈0. 001表示并且通過One-WayANOVA 測定。將來自兩個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)表示為組平均+/-SEM(n= 8)。從圖2可以看出，化合物 987在較低和較高的濃度范圍內(nèi)降低了細(xì)胞存活率。在1和0. 5yM濃度下未觀察到細(xì)胞 毒性作用。圖3顯示了PF670462對SH-SY5Y-TMHT細(xì)胞的細(xì)胞存活率的影響，其中該圖以 溶媒對照（VC，白色條棒）的％的形式表示PF670462對SH-SY5Y-TMHT細(xì)胞的細(xì)胞存活率 的影響。統(tǒng)計學(xué)意義用*〈〇. 05, #〈0. 01，*#〈0. 001表示并通過One-WayANOVA測定。將 來自兩個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)表示為組平均+/-SEM(n= 8)。從圖3可以看出，參比化合物PF 670462僅在濃度0. 5yM下對SH-SY5Y-TMHT細(xì)胞的細(xì)胞存活率顯示出顯著的保護(hù)作用。
[0216] 處理后的SH-SY5Y-TMHT細(xì)朐的蛋白測宙
[0217] 利用標(biāo)準(zhǔn)BCA試驗(yàn)測定處理的SH-SY5Y-TMHT細(xì)胞的細(xì)胞溶解液的蛋白質(zhì)濃度。一 式兩份地測定所有樣品的蛋白質(zhì)量。樣品的蛋白濃度在預(yù)期的范圍內(nèi)（根據(jù)每個12-孔板 的細(xì)胞接種量，預(yù)期的蛋白濃度范圍為150 - 350yg/ml)。
[0218] 測宙化合物處理對特宙磷酸化位點(diǎn)的影晌
[0219] 質(zhì)譜試驗(yàn)
[0220] SH-SY5Y-TMHT細(xì)胞溶解液的測定利用PhosphoTauSRM試驗(yàn)V2和V3進(jìn)行。當(dāng)將各 位點(diǎn)上磷酸化的相對水平與溶媒處理的對照的比值相比較時，用化合物324(給出了 10yM 時的數(shù)據(jù)）和化合物987 (給出了 10yM時的數(shù)據(jù)）處理的細(xì)胞中磷酸肽的水平明顯減少。 顯示在絲氨酸396上的磷酸化減少的例子如圖4所示。該圖顯示了CKld-選擇性化合物對 SH-SY5Y-TMHT細(xì)胞中的絲氨酸396磷酸化的質(zhì)譜測定。A組表示用溶媒對照（VC)或化合 物324 (T.I. 1_10yM)處理的細(xì)胞，B組表示用溶媒對照（VC)或化合物987 (T.I. 2_10yM) 處理的細(xì)胞。
[0221] 在與溶媒對照接觸的細(xì)胞中，約83%的Tau在S396磷酸化。用10yM化合物324 處理可將其降至38%，而用10yM化合物987處理可將pS396水平降低至24%。這些結(jié)果 證實(shí)了CKld選擇性試劑對pS396的抑制作用。
[0222] 蛋白質(zhì)印記試驗(yàn)
[0223] 通過蛋白質(zhì)印記法定量用溶媒對照、化合物394(10yM)、化合物987(10yM)和 PF670462 (5yM)處理的SH-SY5Y-TMHT細(xì)胞溶解液中在蘇氨酸231上的總Tau和磷酸化Tau 的量。圖5顯示了在用選擇性CKld抑制劑處理的SH-SY5Y-TMHT細(xì)胞中pT231(A組）和總 Tau(B組）水平的蛋白質(zhì)印記測定結(jié)果。如圖5所示，所有三種化合物均減少了Tau蛋白中 PT231的可檢測水平，而該抗原表位強(qiáng)烈地存在于溶媒處理的細(xì)胞中。除了用PF670462-處 理的溶解液（其似乎含有比其它物質(zhì)處理的溶解液略少的總Tau)之外，在制劑之間的可檢 測的總Tau水平?jīng)]有明顯差別。這些結(jié)果證實(shí)了CKld選擇性試劑對pT231的抑制作用。
【主權(quán)項】
1. 包含式（IB)化合物或其可藥用鹽或溶劑化物的藥物組合物：其中 "HetB"代表苯并p惡唑基； Z代表鍵； Rlb代表嘧啶基，其中1?113可被一個或多個（例如1、2或3個）R4b基團(tuán)取代；R4b代表鹵素、 (V6烷基、C^烯基、C^炔基、C3_8環(huán)烷基、鹵代CH烷基、羥基、CH烷氧基、-0-Ck烯基、鹵代 〇1_6烷氧基、-〇)011、-〇)-(： 1_6烷基、-〇)〇-(：1_6烷基、-〇)順2、-〇1 2-(：0順2、-順-(：1_6烷基、-順-(： 2_6 條基、-NH-CO-Ck烷基、-CO-NH-Ci_6烷基、-O-CH^CO-NH-Ck烷基、-Q^-Q^-CO-NH-Ck燒 基、-S-Ck烷基、-S0-CK烷基、-S0 2-(^_6烷基、-S0 2-NH2、烷基、KH2-C0-C2_6 條基、_S02-〇H、氛基、氛基、N02、= 0、-C〇-NH- (CH2) 2) -〇Me、-NH-C3_8環(huán)烷基、-CH2-C〇-NH-C3_8 環(huán)烷基、-co-雜環(huán)基、-co-雜芳基、-coo- (ch2) 2-雜環(huán)基、-ch2-芳基、-och2-芳基、-och2-雜 芳基、-CH2-〇-C〇-芳基、-o-芳基、-NH-C0-芳基、-NH-C0-雜芳基、-NH-C〇-CH2-芳基、-NH-芳 基、芳基或雜芳基基團(tuán)，其中所述的R4b的芳基、雜環(huán)基或雜芳基基團(tuán)可任選地被一個或多 個鹵素、Cm烷基、C:_6烷氧基、=S或羥基基團(tuán)取代，并且其中所述的R413的C:_6烷基或C2_6 烯基基團(tuán)可任選地被一個或多個羥基、氨基、氰基、(^6烷氧基、C0NH2或-C00-Ch烷基基團(tuán) 取代； m代表0至3的整數(shù)； 儼代表鹵素、鹵代C^烷基、C^烷基、C3_8環(huán)烷基、羥基、C^烷氧基、-S-C^烷 基、烷基、K2_6 炔基、氛基、氛基、N0 2、= 0、= 烷基、-C0NHp-CO-Ck 烷基、-COO-Ck烷基、-NH-Ch烷基、-NH-CO-Ch烷基、-NH-C0-CH=CH-CH2-N(Me)2、Ch烷 基、-CO-NH-Ch烷基、-CO-NH-CH(Me) -C00H、-S-CH2-C〇-N(Et) 2、-NH- (CH2) 2-0H、-NH- (CH2) 3_ 0H、-NH-CH(Et) -CH2-〇H、-C0-NH- (CH2) 3-0H、-CH(CH20H) 2或-S-CH2-CO-NH-CO-NH-Ch烷基， 其中所述的1^的Ch烷基基團(tuán)可任選地被一個或多個氰基或羥基基團(tuán)取代。2. 如權(quán)利要求1所定義的藥物組合物，其中1?413代表鹵素、羥基、-0-CH烯基、-C00-CH 烷基、-NH-Ck烷基、-S0 2-NH2、氛基、氛基、=0、-CH2-C0-NH-C3_8環(huán)烷基、-CH2-芳 基、-〇CH2-雜芳基、-0-芳基、-NH-C0-芳基、-NH-芳基或雜芳基基團(tuán)，其中所述的R4b的芳 基、雜環(huán)基或雜芳基基團(tuán)可任選地被個或多個鹵素、烷基、ck烷氧基、=S或羥基基 團(tuán)取代，并且其中所述的1^的C:_6烷基或C2_6烯基基團(tuán)可任選地被一個或多個羥基、氨基、 氰基、(^_ 6烷氧基、C0NH2或-C00-C^烷基基團(tuán)取代。3. 如權(quán)利要求2所定義的藥物組合物，其中R4bR表鹵素（例如氟）、氨基或雜芳基（例 如吡啶基）。4. 如權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所定義的藥物組合物，其中R4b代表氨基。5. 如權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所定義的藥物組合物，其中R4b代表雜芳基（例如吡啶 基）。6. 如權(quán)利要求1至5中的任一項所定義的藥物組合物，其中m代表0至2的整數(shù)。7. 如權(quán)利要求6所定義的藥物組合物，其中m是0。8. 如權(quán)利要求1至7中的任一項所定義的藥物組合物，其中1?213代表鹵素、鹵 代(V6烷基、C^烷基、C3_8環(huán)烷基、羥基、C^烷氧基、-S-C^烷基、氨基、氰基、NO2、= (K-COM^-CO-Ck烷基、-C00-Ch烷基、Ch烷基、-CO-NH-Ch烷基或-CO-NH-CH(Me) -C00H， 其中所述的1^的C:_6烷基基團(tuán)可任選地被一個或多個氰基或羥基基團(tuán)取代。9. 如權(quán)利要求8所定義的藥物組合物，其中R2b代表氨基或-C0NH2。10. 如權(quán)利要求1所定義的藥物組合物，其中式（IB)化合物是5-(1，3_苯并惡 唑-2-基）-4-(吡啶-4-基）嘧啶-2-胺（化合物324)或其可藥用鹽或溶劑化物。11. 用于治療的前述權(quán)利要求任意一項所述的藥物組合物或權(quán)利要求1至10中的任一 項所定義的式（IB)化合物。12. 在神經(jīng)退行性疾病、諸如Tau病變的治療中用作酪蛋白激酶S(CK1S)抑制劑的權(quán) 利要求1至10中任一項所述的藥物組合物或權(quán)利要求1至10中的任一項所定義的式（IB) 化合物。13. 用于權(quán)利要求12所定義的用途的藥物組合物或化合物，其中的Tau病變選自阿 爾茨海默氏病、17號染色體相關(guān)的額顳癡呆兼帕金森綜合征（FTDP-17)、進(jìn)行性核上性 麻痹（PSP)、匹克氏病、皮質(zhì)基底節(jié)變性、多系統(tǒng)萎縮（MSA)、伴有鐵聚集的神經(jīng)基底節(jié)變 性、I型（Hallervorden-Spatz)、嗜銀顆粒性癡呆、唐氏綜合癥、伴有媽化的彌散性神經(jīng)原 纖維纏結(jié)、拳擊員癡呆癥、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良癥、 Niemann-Pick病C型、漸進(jìn)型皮層下神經(jīng)膠質(zhì)增生J元蛋白腦淀粉樣血管病、僅纏結(jié)性老年 癡呆、腦炎后帕金森綜合征、亞急性硬化性全腦炎、克雅氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥/帕金 森癡呆復(fù)合征、伴有神經(jīng)原纖維纏結(jié)/癡呆的非-Guamanian運(yùn)動神經(jīng)元疾病以及帕金森氏 病。14. 用于權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所定義的用途的藥物組合物或化合物，其中的Tau 病變包含阿爾茨海默氏病。15. 用于權(quán)利要求12至14中任意一項所定義的用途的藥物組合物或化合物，其中的化 合物是5- (1，3-苯并p惡唑-2-基）-4-(吡啶-4-基）嘧啶-2-胺（化合物324)或其可藥 用鹽或溶劑化物。
【專利摘要】本發(fā)明涉及包含酪蛋白激酶1δ(CK1δ)抑制劑的藥物組合物以及所述抑制劑在治療神經(jīng)退行性疾病諸如阿爾茨海默氏病中的用途。
【IPC分類】A61P21/00, A61K31/506, A61P25/28, A61P25/16
【公開號】CN104906103
【申請?zhí)枴緾N201510246272
【發(fā)明人】J·M·謝里丹, J·R·希爾, W·D·O·漢密爾頓, I·派克
【申請人】電泳有限公司
【公開日】2015年9月16日
【申請日】2011年12月14日
【公告號】CA2818903A1, CN103298460A, EP2651404A2, EP2651404B1, EP2651405A2, EP2835131A1, US20140018540, US20140031547, US20150209368, WO2012080727A2, WO2012080727A3, WO2012080727A4, WO2012080729A2, WO2012080729A3, WO2012080729A4