。
[0159] 生理鹽水溶液、葡萄糖或其它糖類溶液或二醇類諸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇 也可包括在內(nèi)。
[0160] 對(duì)于靜脈、皮膚或皮下注射或在患病部位注射，活性成分可以是胃腸外可接受的 水溶液形式，該溶液是無熱原的并且具有適當(dāng)?shù)腜H、等滲性和穩(wěn)定性。本領(lǐng)域的有關(guān)技術(shù)人 員能夠利用例如等滲溶媒諸如氯化鈉注射液、林格注射液、乳酸鈉林格注射液制備適當(dāng)?shù)?溶液。在需要時(shí)還包括防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其它添加劑。
[0161] 確信式（IB)化合物是酪蛋白激酶IS(CK1S)抑制劑。某些式（IB)化合物的抑 制活性大于5 %，特別是大于10 %、更特別是大于25 %、更特別是大于50 %，尤其是大于 75%，諸如大于90%。該化合物可用于治療神經(jīng)退行性疾病諸如Tau病變。Tau病變是特 在于神經(jīng)原纖維纏結(jié)或tau蛋白聚集的狀況。Tau病變是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知一類病癥， 包括阿爾茨海默氏病、17號(hào)染色體相關(guān)的額顳癡呆兼帕金森綜合征（FTDP-17)、進(jìn)行性核 上性麻痹（PSP)、匹克氏病、皮質(zhì)基底節(jié)變性、多系統(tǒng)萎縮（MSA)、伴有鐵聚集的神經(jīng)基底節(jié) 變性、I型（Hallervorden-Spatz)、嗜銀顆粒性癡呆、唐氏綜合癥、伴有媽化的彌散性神經(jīng) 原纖維纏結(jié)、拳擊員癡呆癥、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良癥、 Niemann-Pick病C型、漸進(jìn)型皮層下神經(jīng)膠質(zhì)增生J元蛋白腦淀粉樣血管病、僅纏結(jié)性老年 癡呆、腦炎后帕金森綜合征、亞急性硬化性全腦炎、克雅氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥/帕金 森癡呆復(fù)合征、伴有神經(jīng)原纖維纏結(jié)/癡呆的非-Guamanian運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病以及帕金森氏 病。細(xì)胞內(nèi)的tau沉積通常是神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)性的，并且是細(xì)絲狀的，與對(duì)照人腦中的 tau的磷酸化水平相比，通常是過度磷酸化的狀態(tài)。在AD的情況下，該過度磷酸化的tau通 常被稱作配對(duì)螺旋絲tau(PHF)tau，因?yàn)槠溲苌訮HF。在一種實(shí)施方案中，tau病變包括 阿爾茨海默氏病。
[0162] 本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了治療神經(jīng)退行性疾病諸如Tau病變的方法，該方法包 括施用治療有效量的式（IB)化合物。
[0163] 牛物學(xué)數(shù)據(jù)
[0164] I.CKl5抑制試駘
[0165] 可將本發(fā)明化合物根據(jù)US2010/0152157、EP1，636, 375 或Hanger等人（2007) J.Biol.Chem. 282, 23645-23654所述的試驗(yàn)方案測(cè)試對(duì)酪蛋白激酶IS(CK1S)的抑制。具 體的講，該試驗(yàn)按照以下方案進(jìn)行：
[0166] 反應(yīng)緩沖液：
[0167] 基礎(chǔ)反應(yīng)緩沖液；20mMH印es(pH7. 5)，IOmMMgCl2,ImMEGTA, 0? 02 % fcij35, 0. 02mg/mlBSA, 0.ImMNa3VO4, 2mMDIT, 1%DMS0。應(yīng)注意，將所需的輔助因子單獨(dú) 加入到每個(gè)激酶反應(yīng)液中。
[0168] 反應(yīng)方法：
[0169] 1.在新制備的上述基礎(chǔ)反應(yīng)緩沖液中制備所示的底物
[0170] 2.將任何所需的輔助因子加入到底物溶液中
[0171] 3.將所示的激酶加入到底物溶液中并輕輕混合
[0172] 4.將化合物的DMSO溶液加入到激酶反應(yīng)混合物中
[0173] 5.將33P-ATP (最終的比活性0. 01 y Ci/y 1)加入到反應(yīng)混合物中以引發(fā)反應(yīng)
[0174] 6.將激酶反應(yīng)液在室溫下保溫120min
[0175] 7.將反應(yīng)液點(diǎn)到P81離子交換紙（Whatman#3698_915)上
[0176] 8?用0? 75 %磷酸充分洗滌過濾器
[0177] 激酶信息：
[0178] CKld-Genbank登錄號(hào)NP_620693
[0179] 重組人全長構(gòu)建體。GST-標(biāo)記，在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。
[0180] 試驗(yàn)中的終濃度=4nM
[0181] 底物：CKltide
[0182] 底物序列：[KRRRAL[pS]VASLPGL]
[0183] 試驗(yàn)中最終的底物濃度=20yM
[0184] 應(yīng)注意，不向反應(yīng)混合物中添加額外的輔助因子。
[0185]化合物 30、288、314、324-325、336、374、391、405、615-616、626、705、740、753-754、 756、759、770、784、808、819、833、844、847、869、872、875、933、952、955、969、987、990 和 999 在CKlS抑制試驗(yàn)中進(jìn)行了測(cè)試并且表現(xiàn)出大于5%的抑制活性。
[0186] 尤其是化合物324-325、405、754、847、952、987、990和999表現(xiàn)出大于50%的抑制 活性。
[0187] 化合物324、952、987、990和999表現(xiàn)出大于90 %的抑制活性。
[0188] 2.測(cè)宙化合物對(duì)Ckld-介導(dǎo)的Tau磷酸化的影晌
[0189] Tau蛋白的體內(nèi)磷酸化非常復(fù)雜，涉及多種推定的蛋白激酶。普遍認(rèn)為，激酶 GSK3b和CDK5在PHFTau(在阿爾茨海默氏病的神經(jīng)原纖維纏結(jié)中發(fā)現(xiàn)的致病形式）的生 成中起重要作用。最近，已經(jīng)有越來越多的證據(jù)支持其它激酶尤其是CKlS在體內(nèi)Tau過 度磷酸化中的作用。Hanger等人 2007(J.Biol.Chem. 282, 23645-23654)在人的PHFTau 中確定了 37個(gè)磷酸化位點(diǎn)，并且能夠利用重組的tau和各種純化的激酶制劑在體外重述這 些。這些研宄證實(shí)，某些位點(diǎn)只被CKlS磷酸化，并且某些其它位點(diǎn)需要CKlS和其它激酶， 其中CKlS提供上游磷酸化以使目標(biāo)位點(diǎn)可被第二種激酶利用。因此，為了評(píng)價(jià)候選化合 物是否能夠直接地或通過阻斷其啟動(dòng)其它激酶來選擇性地抑制CKlS活性，已經(jīng)進(jìn)行了多 種不同的篩選。在W02005/001114中提供了這些篩選的一般概念。
[0190] 為了測(cè)定推定CKlS抑制劑對(duì)CKlS-介導(dǎo)的磷酸化水平的影響，進(jìn)行選擇的反應(yīng) 監(jiān)測(cè)試驗(yàn)，該試驗(yàn)提供在Tau的轉(zhuǎn)基因人和內(nèi)源性鼠形式的特定位點(diǎn)上磷酸根占據(jù)的定量 相關(guān)測(cè)定。
[0191] PhosphoTauSRMV2試驗(yàn)在5個(gè)最常用的Tau研宄位點(diǎn)上測(cè)定總的tau和相對(duì)磷 酸化水平，并且從ProteomeSciencespic(Cobham,England)得到。在V2試驗(yàn)中沒有一個(gè) 位點(diǎn)是僅能被CKlS磷酸化的，并且一種可能性是，通過該方法測(cè)定的化合物誘導(dǎo)的對(duì)磷 酸化的抑制可能是通過其它激酶諸如GSK3b和/或CDK5的混雜抑制來實(shí)現(xiàn)的。為了解決 該限制，ProteomeSciences開發(fā)了V3試驗(yàn)，該試驗(yàn)除了測(cè)定四個(gè)其它已被證實(shí)在體外被 至少一個(gè)除了CKl8之外的其它Tau激酶磷酸化的位點(diǎn)之外，還測(cè)定總的tau和兩個(gè)僅能 被CKlS磷酸化的位點(diǎn)。表1列出了各個(gè)被覆蓋的位點(diǎn)以及在Hanger等人（2007)中所報(bào) 道的候選的Tau激酶。
[0192] 表I:Tau磷酸化SRMV2和V3試驗(yàn)覆蓋的Tau磷酸化位點(diǎn)
[0193]
[0195] 基于人2N4Rtau的編號(hào)。
[0196] *_CKld的專屬位點(diǎn)
[0197] SH-SY5Y-TMHT細(xì)朐系
[0198] SH-SY5Y-TMHT細(xì)胞系（JSWLifeSciences,Graz,Austria)代表tau病變的體外 模型。細(xì)胞系通過用含有全長人2N4RTau亞型（其帶有兩個(gè)常見病相關(guān)性突變（V337M/ R406W))的載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人神經(jīng)母細(xì)胞瘤衍生的SH-SY5Y細(xì)胞系來產(chǎn)生。在最近的研宄 (Flunkert等人2011提交，Loeffler等人2011提交）中，SH-SY5Y-TMHT細(xì)胞系和帶有相 同的人類轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞系均顯示出表達(dá)高水平的人Tau，其在多個(gè)抗原表位被 過度磷酸化，而這些抗原表位之前已被證實(shí)在包括阿爾茨海默氏病在內(nèi)的各種人類Tau病 變中被磷酸化。此外，在接觸不同激酶抑制劑、包括JNK-抑制劑SP600125和CKl抑制劑 IC261的SH-SY5Y-TMHT細(xì)胞中，Tau在關(guān)鍵致病位點(diǎn)的磷酸化水平以與靶向激酶的已知的 位點(diǎn)特異性相一致的方式減少。因此，SH-SY5Y-TMHT細(xì)胞系非常適于新的Tau激酶抑制劑 的篩選。
[0199] 在SH-SY5Y-TMHT細(xì)朐中篩詵化合物
[0200] 將SH-SY5Y-TMHT細(xì)胞在培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基，10 %FCS, 1 %NEAA, 1 %L-谷氨酰 胺，100yg/ml慶大霉素，300yg/ml遺傳霉素G-418)中培養(yǎng)2天直至80-90%融合。然 后將細(xì)胞在補(bǔ)充有10UM維甲酸（RA)的培養(yǎng)基中分化7天，每2至3天更換培養(yǎng)基。將分 化的細(xì)胞分別以每孔1.25XIO6和8X10 5個(gè)細(xì)胞的密度接種到6孔板和96孔板上。在 分化后的第8天，將待測(cè)化合物、參照化合物和溶媒對(duì)照物加入到培養(yǎng)基中。與化合物接觸 6小時(shí)后，將一個(gè)板的細(xì)胞進(jìn)行MTT試驗(yàn)以評(píng)價(jià)待測(cè)化合物和參照化合物對(duì)細(xì)胞存活率的 影響。將剩余的孔用冷的PBS洗滌一次并在300ylRIPA-緩沖液[50mMTrispH7. 4,1% 吣111(161^?40,0.25%脫氧膽酸鈉，1501111恥(：1，11111￡014，11^似?，11^原礬酸鈉，801111 磷酸甘油，補(bǔ)充有新鮮加入的蛋白酶（Calbiochem)和磷酸酶（Sigma)抑制劑合劑]中收 獲。將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到I. 5ml試管中并在冰上超聲溶解。取出20y1等分試樣以確定蛋 白濃度（BCA試驗(yàn)）。隨后將溶解液快速冷凍并儲(chǔ)存在-80°C下直至使用。
[0201] 如表2所示以一式三（四）份進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。
[0202] 表 2
[0203]
[0204] 細(xì)朐存活率測(cè)試
[0205] 為了測(cè)定化合物的活性，需要控制所有分子的潛在的細(xì)胞毒性。培養(yǎng)物的存活率 通過MTT試驗(yàn)確定。該試驗(yàn)?zāi)軌驕y(cè)定可將黃色的MTT還原成深藍(lán)色甲結(jié)晶的線粒體脫氫 酶活性。由于該反應(yīng)僅在活細(xì)胞內(nèi)催化，所以該試驗(yàn)可用于確定細(xì)胞存活率。將MTT溶液 以終濃度0. 5mg/ml加入到每個(gè)孔中。2小時(shí)后吸出包含MTT的培養(yǎng)基。將細(xì)胞溶解于3% SDS并將甲廳結(jié)晶溶于異丙醇/HC1。用板式讀數(shù)器在波長570nm處測(cè)定光密度。將細(xì)胞 存活率用光密度（OD)表達(dá)。以對(duì)照值的百分比的形式計(jì)算該數(shù)值。
[0206] 總蛋白含量的宙量測(cè)宙
[0207] 在評(píng)價(jià)具體的Tau磷酸化狀態(tài)之前，將各細(xì)胞溶解液中的總蛋白濃度利用標(biāo)準(zhǔn)的 BCA試驗(yàn)（PierceBiotechnology,Rockford,USA)測(cè)定。簡(jiǎn)單地講，在試驗(yàn)中根據(jù)制造商的 說明使用20y1細(xì)胞溶解液。
[0208] 總Tau和I磷酸仆,的Tau的定量泖丨定
[0209] 質(zhì)譜試驗(yàn)
[0210] 將來自分別用化合物324、化合物987、PF670462和相關(guān)的溶媒對(duì)照物處理的TMHT 細(xì)胞系的全細(xì)胞溶解液首先進(jìn)行一維的SDS-PAGE以純化蛋白質(zhì)級(jí)分?；贐CA試驗(yàn)結(jié) 果，在堆積凝膠上負(fù)載約IOOyg總蛋白。跑膠直至總蛋白含量在堆積凝膠中形成單一離 散帶。然后將各蛋白帶從凝膠中切下并用胰蛋白酶或Asp-N消化，然后分別用PhosphoTau SRM試驗(yàn)V2或V3分析。所有試驗(yàn)方法均利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（TSQVantage,Thermo Scientific,HemelHempstead,UK)定量臨床前材料中的磷酸化。在SRM分析之前，將磷酸 肽和臨床前樣品通過RP-色譜（XBridge柱，Waters,Manchester,UK)拆分，9分鐘內(nèi)的梯 度為0-30%ACN(緩沖液A;0? 1 %FA，緩沖液B;ACN，0? 1 %FA)。通過多次SRM轉(zhuǎn)換，利用 優(yōu)化的S鏡頭值和碰撞能量設(shè)置監(jiān)測(cè)每種肽和磷酸肽的輕質(zhì)和重質(zhì)形式。采用SRMLC峰 下的面積定量各細(xì)胞溶解液中存在的分析物的量，結(jié)果表示為參照重肽添加物信號(hào)的單一 點(diǎn)。還繪制了輕質(zhì)磷酸肽的11點(diǎn)校正曲線以確定試驗(yàn)特性（LOD，LOQ，精度和準(zhǔn)確度），在 曲線中的每一個(gè)點(diǎn)添加IOOfmol重質(zhì)磷酸肽。對(duì)于各個(gè)特定的tau群體，將各tau磷酸肽的 內(nèi)源性水平用其校準(zhǔn)曲線（在柱上0. 25-1000fmol)進(jìn)行定量。在進(jìn)行LC-SRM分析之前， 向各個(gè)tau群體中添加IOO