光熱和光動(dòng)聯(lián)合抗腫瘤的以葉酸介導(dǎo)的金納米星為載體的藥物傳遞系統(tǒng)的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥，特別是一種光熱和光動(dòng)聯(lián)合抗腫瘤的以葉酸介導(dǎo)的金納米星為載體的藥物傳遞系統(tǒng)的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]光熱治療(Photo-thermal Therapy，PTT)是通過加熱的方法，改變腫瘤細(xì)胞所處環(huán)境，使腫瘤細(xì)胞變性、壞死，達(dá)到治療目的，例如，各種各樣的金納米結(jié)構(gòu)，包括金納米棒、納米殼、納米籠、空心的納米球，尤其是分支狀的金納米星，已被證明在近紅外區(qū)具有表面等離子共振特性，因而通過近紅外激光照射產(chǎn)生過高熱，從而殺死腫瘤細(xì)胞。
[0003]光動(dòng)力學(xué)治療(Photodynamic Therapy, I3DT)是利用腫瘤細(xì)胞選擇性吸收光敏劑，然后利用特定波長(zhǎng)的非熱激光照射病變部位，使腫瘤組織中的光敏劑發(fā)生劇烈的光化學(xué)反應(yīng)，從而選擇性消滅腫瘤細(xì)胞。它是一種無創(chuàng)或微創(chuàng)性、非產(chǎn)熱性的、利用光化學(xué)反應(yīng)引起靶組織和靶細(xì)胞破壞的治療方法。金納米星作為一種優(yōu)良的光敏劑可在近紅外光照射的情況下產(chǎn)生活性氧，包含過氧化物，如H2O2、單線態(tài)氧(Singlet Oxygen)、環(huán)氧化物(epoxide)等，且其在光照下產(chǎn)生活性氧為高度反應(yīng)性的，能夠表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，比如使細(xì)胞中的DNA斷裂，抑制細(xì)胞有絲分裂以及生長(zhǎng)，還可以抑制細(xì)胞蛋白水解酶的活性。由此推斷，金納米星可以用于深部腫瘤組織的光熱和光動(dòng)聯(lián)合治療。
[0004]金納米星因其易大量合成且比表面積大的優(yōu)勢(shì)，能夠提高包載藥物含量，同時(shí)，由于生物系統(tǒng)對(duì)700-1100nm范圍的近紅外光具有高度透過性，而金納米星在此范圍內(nèi)具有高吸收的特性，因此可以利用其在此范圍內(nèi)的光熱轉(zhuǎn)換特性對(duì)腫瘤進(jìn)行近紅外激光熱療。通過化學(xué)修飾金納米星載抗腫瘤藥形成多功能集一體即化學(xué)治療、近紅外熱療和光動(dòng)力學(xué)聯(lián)合治療的藥物傳遞系統(tǒng)是可能的。
[0005]由于金納米星在高鹽和某些生物分子(核酸、蛋白質(zhì)等)存在情況下易發(fā)生聚集和團(tuán)聚，穩(wěn)定性差。為提高金納米星的穩(wěn)定性和生物相容性，將巰基化的聚乙二醇和聚醚酰亞胺通過巰基和金形成的硫金鍵連接于金納米星表面。將水溶性的具有長(zhǎng)循環(huán)特性的聚乙二醇連接于金納米星表面，不但能夠利用空間位阻效果，改善金納米星穩(wěn)定性，延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，降低毒性，而且聚乙二醇攜帶的不同側(cè)鏈結(jié)構(gòu)為金納米星表面的靶向修飾提供了有效的修飾位點(diǎn)。另外，巰基化聚醚酰亞胺含有較多質(zhì)子化的多級(jí)氨的氮原子，能夠在酸性的溶酶體中大量捕獲質(zhì)子，導(dǎo)致溶酶體滲透性腫脹、破裂，進(jìn)而將內(nèi)吞的藥物迅速釋放到細(xì)胞質(zhì)，實(shí)現(xiàn)溶酶體逃逸。
[0006]分子靶向治療是一種新的腫瘤治療手段，能夠特異性地作用于腫瘤發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用的靶分子，或者利用腫瘤高表達(dá)的受體，通過配體將偶聯(lián)的藥物靶向輸送到腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到治療腫瘤、減少全身毒副作用的目的。葉酸受體是可以介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞，將葉酸攝入真核細(xì)胞胞漿的一種高親和力受體，已經(jīng)作為腫瘤治療的一個(gè)分子靶點(diǎn)進(jìn)入臨床應(yīng)用研宄，其配體葉酸作為靶向配體，對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)的葉酸受體有高度親合性，而在絕大多數(shù)正常組織中幾乎不表達(dá)，同時(shí)經(jīng)過修飾的藥物載體，是一種特殊的靶向給藥系統(tǒng)，可以主動(dòng)的將藥物輸送至特異性位點(diǎn)。
[0007]在腫瘤藥物研宄中，利用熒光探針標(biāo)記藥物，可以直接在活體水平觀察到藥物對(duì)腫瘤是否靶向、最佳靶向時(shí)間以及藥物在動(dòng)物其他器官組織的積累，有利于研宄人員在最佳的時(shí)間，進(jìn)行組織分析。吲哚-5.5-菁-N-羥基琥珀酰亞胺、吲哚菁綠、酞菁等熒光探針不但能夠用于活體成像而且能夠吸收近紅外光，分子中的電子從基態(tài)躍迀至激態(tài)，隨后激發(fā)態(tài)的分子釋放出熱，具有熱療效果。常用于活體成像的熒光探針，大多數(shù)為傳統(tǒng)的有機(jī)染料分子，例如吲哚菁綠、酞菁、亞甲藍(lán)、羅丹明、異硫氰酸熒光素，而這些有機(jī)染料分子有著其本身的一些缺點(diǎn)，如光穩(wěn)定性差，靈敏度低和靶向性差等缺陷，因而限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。借助靶向納米粒載體可以克服上述缺陷，對(duì)腫瘤的診斷和靶向治療具有明顯優(yōu)勢(shì)。
[0008]阿霉素是一種廣譜的化療藥物，在臨床上常用于治療乳腺癌，兒童實(shí)體瘤，軟組織瘤，惡心淋巴癌等惡性腫瘤。近年來的臨床研宄發(fā)現(xiàn)，阿霉素在臨床應(yīng)用中已出現(xiàn)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，同時(shí)對(duì)于正常組織的細(xì)胞毒性限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。若長(zhǎng)期使用這類藥物最常見的毒性為損傷心肌，可誘發(fā)充血性心力衰竭。為克服以上不足，直接通過靜電吸附作用(Au-N)載阿霉素于金納米星表面可構(gòu)建以金納米星為載體靶向抗腫瘤的藥物傳遞系統(tǒng)。
[0009]目前構(gòu)建的以金納米星為載體靶向抗腫瘤的藥物傳遞系統(tǒng)，其作為熱敏劑和光敏劑在腫瘤聯(lián)合治療中的應(yīng)用尚未見報(bào)道，具有療效快、副作用小、方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，以金納米星為載體裝載近紅外熒光染料可以提高熒光染料的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)體內(nèi)成像時(shí)間，并通過載體系統(tǒng)賦予其靶向。與染料直接成像方法相比應(yīng)用范圍更廣，目前應(yīng)用主要集中在實(shí)驗(yàn)室的動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)階段。因此，研制具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和實(shí)際的臨床意義上的光熱和光動(dòng)聯(lián)合抗腫瘤的以葉酸介導(dǎo)的金納米星為載體的藥物傳遞系統(tǒng)是業(yè)內(nèi)所希望解決的技術(shù)冋題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種光熱和光動(dòng)聯(lián)合抗腫瘤的以葉酸介導(dǎo)的金納米星為載體的藥物傳遞系統(tǒng)的制備方法及應(yīng)用，可有效解決現(xiàn)有抗腫瘤藥物毒副作用大，生物相容性差，靶向性差的問題。
[0011]本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，將金納米星表面通過共價(jià)鍵連接上具有反應(yīng)活性的氨基和羧基后，再通過酰胺反應(yīng)連接靶向分子，得到主動(dòng)靶向的金納米星溶液；再通過靶向化合物末端的氨基和近紅外熒光探針進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，得到具有葉酸靶向和近紅外熒光成像的金納米星溶液；然后再直接通過靜電吸附作用負(fù)載抗腫瘤藥物阿霉素于金納米星表面，即得到葉酸介導(dǎo)的多功能金納米星用于光熱和光動(dòng)聯(lián)合抗腫瘤的藥物傳遞系統(tǒng)，阿霉素和金納米星的質(zhì)量比為1.5?3:1，具體制備方法如下:
(I)制備氨基化的金納米星:在18?25°C，300?720r/min的磁力攪拌條件下，加入濃度為50 μ g/mL的金納米星溶液10?20 mL，然后加入濃度為0.1?10.0 mg/mL的氨基化合物I?5mL，進(jìn)行避光攪拌反應(yīng)6?12 h，再10000 rpm高速離心30min，然后用超純水復(fù)溶得到氨基化金納米星溶液；
所述的氨基化合物為NH2-PEG2000-SH和PE1-SH中的一種或者兩種混合物； (2)制備具有靶向性的金納米星:分別稱取葉酸15?20mg、N，N’- 二環(huán)己基碳酰亞胺10?15mg、N_輕基琥泊酰亞胺7.5?10.5mg，然后依次加入2.5?5.0 mL反應(yīng)溶液中，混勾溶解，再進(jìn)行活化羧基，即在40?50°C、300?720r/min下避光磁力攪拌反應(yīng)8?24h，然后將所得溶液10000 rpm高速離心30min得沉淀，沉淀用超純水復(fù)溶，加入步驟(I)制備的氨基化金納米星溶液中進(jìn)行?；磻?yīng)，室溫避光攪拌反應(yīng)12?24h，再10000 rpm高速離心30min，去除游離的小分子，得到末端含有氨基的葉酸靶向金納米星溶液；
所述的反應(yīng)溶液是二甲基亞砜、磷酸鹽緩沖液(中性)和丙酮中的一種；
(3)制備具有近紅外熒光成像和靶向性的金納米星溶液:取0.01?2 mg熒光探針溶解于0.01?I mL的反應(yīng)溶劑中，加入步驟(2)制備的葉酸靶向金納米星溶液中進(jìn)行酰胺反應(yīng)，室溫避光攪拌反應(yīng)12?24h，再1000rpm超速離心30min得沉淀，沉淀用超純水0.01?ImL復(fù)溶，得到以金納米星為載體具有靶向性和近紅外熒光成像的抗腫瘤藥物傳遞系統(tǒng)；
所述的熒光探針是吲哚-5-菁(簡(jiǎn)寫為cy5 )、吲哚-5.5-菁(簡(jiǎn)寫為cy5.5 )和吲哚-5.5-菁-N-羥基琥珀酰亞胺(簡(jiǎn)寫為cy5.5-NHS)中的一種；
所述的反應(yīng)溶劑是二甲基亞砜、磷酸鹽緩沖液和丙酮中的一種；
(4)制備負(fù)載阿霉素的金納米星溶液:將步驟(3)制備的具有近紅外熒光成像的靶向金納米星溶液經(jīng)干燥得粉末，將粉末和阿霉素以質(zhì)量比1: 1.5?3.0依次加到10?40 mL的反應(yīng)溶劑中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，超聲溶解，在18?25°C下300-720r/min避光攪拌反應(yīng)24?48h，得混合溶液，再將得到的混合溶液以1000rpm超速離心30min (去掉未反應(yīng)的阿霉素和二甲基亞砜)，得沉淀，沉淀用超純水復(fù)溶，干燥即得光熱和光動(dòng)聯(lián)合抗腫瘤的以葉酸介導(dǎo)的金納米星為載體的藥物傳遞系統(tǒng)；
所述的干燥為冷凍干燥、真空干燥和烘干中的一種。
[0012]上述制備的光熱和光動(dòng)聯(lián)合抗腫瘤的以葉酸介導(dǎo)的金納米星為載體的藥物傳遞系統(tǒng)在制備主動(dòng)靶向抗腫瘤藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體中的應(yīng)用，或在制備抗腫瘤光動(dòng)力或光熱治療的熱敏劑中的應(yīng)用，或在制備近紅外激光照射下，觸發(fā)化學(xué)藥物靶向快速釋放于腫瘤組織藥物中的應(yīng)用，或制備用于光熱和光動(dòng)聯(lián)合抗腫瘤的藥物傳遞系統(tǒng)在制備生物體