專利名稱：用于治療腫瘤疾病的二氟谷氨酸與葉酸及抗葉酸的軛合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新穎的二氟谷氨酸與葉酸及抗葉酸的軛合物，用該類軛合物治療腫瘤疾病，以及涉及在制備該軛合物時所用的中間體。
葉酸及經(jīng)典的抗葉酸如MTX1是被葉酸聚谷氨酸合成酶，在細胞內轉化為聚(γ-谷氨?；?代謝物的。
因為已知葉酸聚谷氨酸是葉酸正常代謝獨特功能所必要的，且抗葉酸聚谷氨酸影響典型的抗葉酸如MTX的細胞毒作用，所以使葉酸聚谷氨酸合成酶成為研究葉酸的生物化學和生化藥理學中十分重要的酶。在此方面，該酶對蝶酰和谷氨酸底物的專一性問題得到了廣泛的研究。對蝶酰底物而言，雜環(huán)組份的結構可以有很大的變化，而到目前為止的所有文獻中都認為末端L-谷氨酸基是底物活性所絕對必需的。對進來的氨基酸有很嚴格的專一性，但并非十分絕對，L-高胱氨酸及D.L-赤-或D，L-蘇式-4-氟谷氨酸都可以作為有效的替代底物，但每種情況下，結合引起鏈的終止作用。用4-氟谷氨酸非對映異構體起鏈的終止作用表明，在γ-谷氨?；?受體部位，對L-谷氨酸有嚴格的專一性。
用〔3H〕谷氨酸和用氨甲喋呤(4-NH2-10-CH3PteGlu)或四氫葉酸做底物時，二氟谷氨酸是聚(γ-谷氨酰化作用)的強有力的、濃度依賴性的抑制劑。申請人已測得二氟谷氨酸是作為替代底物而起作用的，相反，以前特指的替代底物4-氟谷氨酸(McGuire及Coward，J.Bio.Chem.2606747(1985))，它不能終止聚谷氨酸鏈延長，而二氟谷氨酸促進鏈的延長。因此，當與有谷氨酸存在時的同樣的反應相比時，在二氟谷氨酸存在時，從〔H〕氨甲喋呤合成的產(chǎn)物中，含有1和2個另外的氨基酸殘基的比率非常高，特別明顯的是含另外2個氨基酸殘基的產(chǎn)物。加成率的增加不僅限于將二氟谷氨酸與內部的谷氨酸結合或與先前已結合上的二氟谷氨酸再連接起來的功能，因為谷氨酸結合到4-氨基-10-甲基Pt谷氨酸-γ-(3，3-二氟谷氨酸)上的比率也提高了。這些結果與二氟谷氨酸在引進氨基酸(谷氨酸類似物)或在γ-谷氨?；荏w種類的水平上，促進了聚(γ-谷氨酸)代謝物的合成相一致。因此，二氟谷氨酸是首選的谷氨酸類似物，用以促進由葉酸聚谷氨酸合成酶所催化的鏈的延長作用。
化合物3，3-二氟谷氨酸(F2Glu)用于制備它與某些葉酸和抗葉酸的具式Ⅰ的軛合物及其藥學上可接受的鹽類，
其中R1是-NH2，H或-CH3;
R2是-NH2或-OH;
R3是H，(C1-C4)烷基，烯丙基或炔丙基，且X，Y和Z各自獨立地為氮原子或CH基團;
本結構式1軛合物可用于治療腫瘤和牛皮癬。然而，化合物二氟谷氨酸及某些PABA-二氟谷氨酸是用于制備式1化合物的中間體。
本發(fā)明化合物中的二氟谷氨酸部分具有一個手性中心，因此，本發(fā)明化合物以一對立體化學異構體形式存在，而相應于天然構型L-谷氨酸的對映異構體是可取的，申請人認為兩個單獨的異構體以及該單獨異構體的混合物，包括外消旋混合物是在本發(fā)明范圍中的。除非另外指明，本申請書中化合物是兩個立體異構體的混合物。進一步地，當式1化合物中Z為CH基團，且R3不是氫原子時，該化合物有第二個手性部位，圍繞該第二個手性部位的立體化學構型并不重要，但是申請人再次打算將該分離的異構體和混合物包括在本發(fā)明的范圍之中。對第二個手性部位而言，異構體外消旋的混合物是可取的。
含有2個羧酸片斷的式1化合物可以形成單或雙鹽，舉例說明，這些鹽包括堿金屬鹽，如鈉和鉀鹽;堿土金屬鹽，如鈣和鎂鹽;ⅢA族輕金屬鹽包括，鋁鹽;以及有機伯，仲，叔胺鹽，如三烷基胺，包括三乙胺，普魯卡因，二芐胺，1-乙烯胺，N，N′-二芐基乙二胺，二氫松香胺，N-(低級)烷基哌啶，以及其它任何合適的胺。鈉鹽是可取的。
式1化合物還能與任何無毒的有機或無機酸構或藥學上可接受的酸加成鹽。舉例說明，可構成合適鹽的無機酸有鹽酸，氫溴酸，硫酸和磷酸以及酸金屬鹽如正磷酸氫鈉鹽和硫酸氫鉀鹽。舉例說明可構成合適鹽的有機酸包括單，雙及三羧酸，例如醋酸，乙醇酸，乳酸，丙酮酸，丙二酸，琥珀酸，戊二酸，富馬酸，蘋果酸，酒石酸，檸檬酸，抗壞血酸，馬來酸，羥基馬來酸，苯甲酸，羥基苯甲酸，苯乙酸，肉桂酸，水楊酸，2-苯氧苯甲酸及磺酸如甲磺酸和2-羥基乙磺酸。鹽酸鹽是可取的。
從式2葉酸或抗葉酸衍生物的反應產(chǎn)物中除去保護基就能制得式Ⅰ化合物，
其中R1，R2，R3，X1，Y1，和Z定義同式1化合物中的定義。被合適保護的F2Glu衍生物，如具式3的叔-丁基酯衍生物，F(xiàn)2Glu(OtBu)2。
從胺和羧酸制備酰胺的任何一種合適的方法，可用不完成式2化合物與式3被保護的F2Glu衍生物的偶合反應。申請人是采用氰磷酸二乙酯使式2和3化合物偶合的。該反應按下列步驟進行，將合適的式2化合物溶液慢慢滴加到((EtO)2P(＝0)CN)溶液和酸清除劑如吡啶，或可取的三乙胺中。所得混合物在約0℃至約60℃下反應，較好地是在環(huán)境溫度中反應約1-10小時，較好地為約2-5小時，直至式2化合物基本上與氰磷酸酯反應為止。然后向該混合液中加入F2Glu(OtBu)2溶液，反應進行約24-100小時，一般是在約0℃-60℃下反應約72小時，較好地是在環(huán)境溫度下反應。分離出粗品，如用蒸發(fā)溶劑的方法，用水洗滌且干燥，該粗產(chǎn)物用三氟乙酸(純凈的)處理，以除去叔丁基酯保護基，分離出所需的式1化合物并純制之，如用柱層析。對上述所述偶合反應而言，合適的溶劑包括能溶解各種反應物且不干擾反應的溶劑，例如二甲基甲酰胺(DMF)較為可取。
式1化合物中當Z為氮原子時，可用另一個方法制備，即用式4對氨基苯甲酸(PABA)衍生物
其中R3同上述式1化合物的定義，與式3化合物，F(xiàn)2Glu(OtBu)2反應給出中間體式5化合物
5
其中R3同上述式1化合物中的定義。該偶合反應可按任何合適的方法步驟進行，例如用下述方法，McGuire，etal.，CancerResearch 1989，49，4517-4525;Galican et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1985，82，2598-2602;Piper and Montgomery，J.Org.Chem.，42(2)208-211(1977);Taylor，et al.，J.Med.Chem.28，913-921(1985);Taylor，et al.，J.Med.Chem.28，1517-1522(1985);Jones，et al.，J.Med Chem.32，847-852(1989).
式5中間體隨后與式6溴甲基衍生物縮合，
其中R1，R2，X及Y同上述式1化合物中定義，生成叔丁氧基保護的化合物，該化合物經(jīng)水解除去叔丁氧保護基，如用三氟乙酸法，生成所需的式1化合物。該反應可按下列步驟進行，將式5和6化合物及二甲基乙酰胺(Me2NAc)混合物反應約2-12小時，較好地為約4小時，反應溫度約25℃-80℃，較好為50-55℃左右，而后在環(huán)境溫度下將該混合物靜置約6-24小時，較好為約12小時。然后減壓除去Me2NAc，將粗品置于冰浴中用三氟乙酸處理，加酸后，讓反應混合物升溫至室溫。在靜置約1-6小時后，一般為約4小時后，減壓除去三氟乙酸，給出所需的式1產(chǎn)物的粗品，該產(chǎn)物可用層析法(DEAE-纖維素，NH4HCO3梯度洗脫)純制，該縮合反應更全面的描述，見于前一段中提到的文獻內。
特定封閉基團的選擇和利用是本領域內的普通專家熟知的。通常選擇封閉基團應根據(jù)下列原則，它們能夠在隨后的合成步驟中有效地保護氨基或羥基，并能在不引起所需產(chǎn)物降解的條件下很容易地脫去。合適的羥基保護基團有C1-C6-烷基，四氫吡喃基，甲氧甲基，甲氧乙氧甲基，叔丁基，苯甲酰基和三苯甲基。術語C1-C6烷基指一至六個碳原子的直鏈或支鏈或環(huán)狀構型的飽和烴基。苯甲?；难苌锟捎晌唇?jīng)保護的化合物與苯甲酰氯在吡啶存在下進行反應制得。合適的氨基保護基團有苯甲?；?，甲酰基，乙?；?，三氟乙酰基，鄰苯二甲?；?，甲苯磺酰基，苯磺?；?，芐氧羰基，取代的芐氧羰基(例如對氯，對溴，對硝基，對甲氧基，鄰氯，2，4-二氯以及2，6-二氯衍生物)，叔丁氧羰基(BOC)，叔戊氧羰基，異丙氧羰基，2-(對-聯(lián)苯基)-異丙氧羰基，烯丙氧羰基，環(huán)戊氧羰基，環(huán)己氧羰基，金剛烷氧羰基，苯硫羰基以及三苯甲基。較好的氨基保護化合物包括有苯甲?；苌?，其可通過未保護化合物與苯甲酰氯反應制得，此外還有乙酰衍生物，其可通過未保護化合物與乙酸酐反應制得。
本發(fā)明提供了一種治療腫瘤疾病患者的方法，其包括給予患者治療上有效抗腫瘤劑量的式Ⅰ化合物。通過給予腫瘤疾病患者治療有效抗腫瘤劑量的式Ⅰ化合物，即可獲得抗腫瘤效果。術語“患者”是指熱血動物，如靈長目動物，包括人類，羊，馬，牛，豬，狗，貓，大鼠和小鼠。
這里所用的術語“腫瘤疾病”是指一種非正常的狀態(tài)或情況，其特點是增生細胞生長迅速或為腫瘤。根據(jù)本領域專家的熟知并樂于采用的標準實驗室實驗技術和方法，以及與其它已知有效的化合物相比較發(fā)現(xiàn)，式Ⅰ化合物用于治療腫瘤患者是很有效的，這種疾病通?？捎萌~酸或抗葉酸類化合物來治療，如氨甲喋呤，氨喋呤，5，10-二去氮雜葉酸及甲酰四氫葉酸。這類腫瘤包括有白血病，包括(但并不限于)急性淋巴胚細胞癌，慢性淋巴細胞癌，急性骨髓胚細胞癌以及慢性骨髓細胞癌;癌瘤，包括(但并不限于)子宮頸癌，食管癌，胃癌，小腸癌，結腸癌和肺癌;肉瘤，包括(但不限于)骨癌，骨肉瘤，脂肪瘤，脂肪肉瘤，血管瘤和血管肉瘤;黑色瘤，包括無黑色素瘤及黑色素瘤;以及混合型腫瘤，如癌肉瘤，淋巴組織型瘤，網(wǎng)狀濾泡癌，細胞肉瘤和Hodgkins病。當然，本領域內的專家會認識到并不是每一種式Ⅰ化合物都可以有效地治療各種腫瘤疾病，如何選擇最合適的化合物(不治療疾病)是在本領域專家能力范圍之內的，并且進行選擇時還應考慮各種因素，包括對標準動物腫瘤模型的結果評價。一般來講，式Ⅰ化合物在治療通常應用葉酸或抗葉酸來治療的腫瘤疾病方面是很有效的。本發(fā)明化合物可望比那些非葉酸或抗葉酸軛合物更具有效性和選擇性。據(jù)信，本發(fā)明化合物增加的效力將來自于化合物促進谷?；溠娱L的傾向，因而可引起細胞內有毒性的葉酸和抗葉酸的蓄積。
術語“抗腫瘤效果”和術語“治療腫瘤疾病”是指控制腫瘤的生長或增殖，或者是指延長患者的存活時間(與缺乏這種治療時相比)。借助于減慢，干擾，抑制或使其停止生長，增殖或轉移等手段來達到控制腫瘤生長或增殖的目的。因此術語“治療腫瘤疾病”并不表明徹底消除腫瘤疾病。可以相信，如能夠明顯延長患者的存活期，超出了病人自身感到的有益的效果，則說明腫瘤的生長已經(jīng)得到了控制。
在有效治療受上述腫瘤疾病折磨的患者時，具式Ⅰ的化合物能以任何可使化合物的生物利用程度達到有效治療腫瘤劑量的劑型或方式給藥，包括口服和非腸道途徑。例如，具式Ⅰ化合物可經(jīng)口服，局部表面，皮下，肌肉內，靜脈，皮膚，鼻內，直腸等途徑給藥。最常選用的是口服給藥。本領域內的專家可根據(jù)所選化合物的特性，待治療的病況，病情嚴重程度以及其它有關情況，很容易地選擇合適的劑型和方式給藥。
在此，術語“治療上有效抗腫瘤劑量”是指具式Ⅰ化合物可提供有效腫瘤作用的量。通過熟知技術的使用以及對相類似情況下結果的觀察，本領域內的專家，如診斷醫(yī)師可以很容易地決定治療上有效的抗腫瘤劑量。在確定治療上有效的抗腫瘤劑量時，以下一些因素(但并不限于此)是常被診斷醫(yī)師們考慮的，其包括哺乳動物的物種;大小;年齡，一般健康狀況;有否特殊疾病;病情的程度或嚴重性;個體患者的反應;給予的特定化合物;給藥方式;所給予制劑的生物利用度特性;所選擇的劑量規(guī)定;其它伴用藥的使用以及其它有關的情況。
具式Ⅰ化合物的治療上有效抗腫瘤的劑量從約0.1mg/kg/天至約500mg/kg/天變化。較好的劑量范圍是約1-20mg/kg/天。這些有效劑量范圍是針對口服給藥而言的，但對于非腸道給藥來說也是適用的。通常較好的給藥是每日1-4次，每次活性化合物的含量為5-100mg。
氨甲蝶呤以及其它葉酸和抗葉酸制劑也可用來治療牛皮癬，該病是以表皮細胞的增殖速度增加為特點的。具式Ⅰ的化合物可望成為一種新的治療牛皮癬的制劑，其作用機理與其它藥物相同?？鼓[瘤劑量與抗牛皮癬劑量是相同的，所不同的是當具式Ⅰ化合物用于治療牛皮癬時，多采用表面局部給藥。
化合物既可以單獨給藥，也可以藥物組合物的形式給藥，上述藥物組合物是與藥學上可接受的載體或賦形劑相結合的，其比例和性質可通過所選化合物的溶解度及化學性質，所選擇的給藥途徑以及標準制藥過程來決定。為使具式Ⅰ的化合物有效，其可配成并以它們藥學上可接受的酸加成鹽的形式給藥，以達到穩(wěn)定，便于結晶和增加溶解度等目的。
具式Ⅰ化合物可作為組合物提供，其包含可檢測劑量具式Ⅰ化合物，與一種或多種惰性載體形成的混合物。這些組合物是很有用的，例如作為檢測標準，使原料藥的運輸更方便，或作為藥用組合物。具式Ⅰ化合物的可檢測量是指用標準的檢測程序和技術很容易測定出來的量，上述程序及技術是本領域內的專家熟知并樂于采用的。具式Ⅰ化合物可檢測量通常在大約0.001%-75%組合物重量這個范圍內變化。惰性載體可以是任何不降解或與具式Ⅰ化合物不發(fā)生共價反應的物質。合適的惰性載體的例子有水;緩沖水溶液，例如那些常用于高壓液相色譜(HPLC)分析中的溶液;有機溶劑，如乙腈，乙酸乙酯，己烷等;以及藥學上可接受的載體和賦形劑。這些組合物是通過將式Ⅰ化合物與惰性載體用本領域內熟知和樂于采用的技術和方法相混合來制備的。
更具體講，具式Ⅰ化合物可作為組合物提供，其含有治療上有效抗腫瘤劑量的式Ⅰ化合物，及一種或多種藥學上可接受的載體或賦劑。
該藥物組合物是用制藥領域中常用的方法制備的。載體或賦形劑可以是固體，半固體或液體物質，它們可以作為活性成份的載體或介質。合適的賦形劑是本領域中熟知的。藥物組合物可經(jīng)口服或非腸道應用，并可以片劑，膠囊，栓劑，溶液，懸浮液等劑型給予患者。
式Ⅰ化合物可經(jīng)口服給藥，例如，借助惰性稀釋劑或可食用載體。它們也可封于硬膠囊中或壓制成片劑。為了達到可口服給藥治療的目的，化合物可與賦形劑混合，以片劑，錠劑，膠囊，酏劑，懸浮液，糖漿劑，蠟劑及香口膠等形式給藥。這些制劑應至少含有4%的本發(fā)明化合物作為活性成份，但上述量可根據(jù)特殊的劑型變化，常規(guī)地大約為4%-70%單位重量。本發(fā)明化合物在組合物中的量以可獲得合適的劑量為宜。根據(jù)本發(fā)明，較好的組合物制劑可制成含有5.0-300mg本發(fā)明化合物的口服劑型。
片劑，藥片，膠囊，錠劑等也可含有一種或多種下列輔助劑粘接劑，如微晶纖維素，黃著膠或明膠;賦形劑，如淀粉或乳糖;崩解劑，如藻酸，淀粉羥乙酸鈉，玉米淀粉等;潤滑劑，如硬脂酸鎂或Sterotex;增滑劑，如膠體二氧化硅;增甜劑如蔗糖或糖精，或調味劑，如薄荷，水楊酸甲酯或橙子調味劑。當單位劑型為膠囊時，除上述類型的物質外，它還可以含有液體載體，如聚乙二醇或脂肪油。其它各種單位劑型可含有各種可改良單位劑量物理形式的物質，例如，包衣劑。因此，片劑或藥丸可用糖，紫膠，或其它腸包衣劑進行包衣。除了本發(fā)明化合物，糖漿劑可含有蔗糖作為增甜劑，其還可含有某些防腐劑，染料，色素和調味劑。用于制備各種藥物組合物的物質應為制藥純的，并在所用量情況下不產(chǎn)生毒性。
為達到非腸道給藥治療的目的，具式Ⅰ的化合物可制成溶液或懸浮液。這些制劑應至少含有0.1%的式Ⅰ化合物，但該量可在0.1-50%重量之間變化。這類組合物中本發(fā)明化合物的量以可獲得合適的劑量為宜。根據(jù)本發(fā)明，較好的組合物和制劑可制成含有5.0-100mg本發(fā)明化合物的非腸道劑型。
溶液或懸浮液可包括一種或多種下列輔助劑無菌稀釋液，如注射用水，鹽水，固定油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶劑;抗菌劑，如芐醇或對羥苯甲酸甲酯;抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉;螯合劑，如乙二胺四乙酸;緩沖劑，如乙酸鹽，檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及用于調節(jié)張力的試劑，如氯化鈉或葡萄糖。非腸道制劑可封于安瓿中，也可封于一次性注射器或玻璃或塑料制成的多劑量小瓶中。
作為結構上相關的化合物的任何基團(其具有特別普通的效用)，對于式1化合物來說，某些基團和構型，在它們的最終應用中是可取的。
申請人優(yōu)選那些化合物，其中R1和R2各為-NH2基團，X，Y和Z各為氮原子，且R3為甲基。申請人還優(yōu)選那些化合物，其中R1為-NH，R2為OH，R3為氫，X和Z各為-CH基團，且Y為氮原子。
實例1N-〔4-(〔(2，4-二氨基-6-蝶啶基)甲基〕甲氨基)-苯甲?；?4，4-D-氟谷氨酸50-55℃下，將N-CH3PABA-F2Glu(OBu)2(0.201mmol)和2，4-二氨基蝶啶-6-溴甲基溴化氫鹽(75mg，0.223mmol)組成的混合物于Me2NAC(2.5ml)中一起攪拌4小時，然后于室溫下放置過夜。減壓蒸除Me2NAC，將粗品置于冰浴中，于攪拌下加入2ml三氟乙酸。10分鐘后，使反應混合物升溫至室溫，并繼續(xù)攪拌4小時，減壓蒸除三氟乙酸，得粗品。粗品經(jīng)DEAE-纖維素柱層析純化，以NH4HCO3進行梯度洗脫(15-600mM)。含所需產(chǎn)品的柱流出物經(jīng)冷凍干燥，得所需純品。
實例24-氨基-4-去氧-10-甲基蝶酰(D，L-赤，蘇-4，4-(二氟)谷氨酸)(1，R1，R2＝NH2;X，Y，Z＝N;R3＝CH3)在一個配有干燥管的15ml圓底燒瓶中放入2.5mlDMF，23ulEt3N(0.16mmol)和25ul(0.16mmol)氰磷酸酸二乙。向其中加入二氨基蝶酸酯(1，R1，R2＝NH2;X，Y，Z＝N;R3＝CH3)(0.16mmol)，混合物于室溫下攪拌3小時，再加入5ul(0.04mmol)氰磷酸二乙酯。將F2Glu(0.16mmol)溶于1mlDMF中，然后加到反應燒瓶中，繼續(xù)在室溫下攪拌72小時。減壓蒸除DMF，將殘渣溶于35mlCHCl3中，用1%的NH4OH(2×20ML)洗滌除去未反應的起始物。有機層用20ml水洗滌，Na2SO4干燥，減壓濃縮，得塊狀粗品。將此連結在一起的產(chǎn)品溶于純凈的TFA(3ml)中，并用TLC來監(jiān)測該脫酯化反應的進程。24小時后，于旋轉蒸發(fā)器上蒸除TFA，真空下將殘渣干燥。
將粗品溶于20mlH2O中，用稀NH4OH調PH至8，然后將樣品體積擴大到160ml，以使在上DEAE-纖維拄(Whafman DE-52)(30×1cm)前獲得足夠低的電導值。用100ml水洗滌該柱，再以175ml 15mM的NH4HCO3和175ml 500mM的NH4HCO3作洗脫液進行線性梯度洗脫，即得所需的具式Ⅰ的化合物。
實例3β，β-二氟谷氨酸雙-L-丁酯3a 2，2-二氟戊-4-烯酰胺將2，2-二氟戊-4-烯酸(27.2g，0.2mol)置于含有200ml己烷的三頸瓶中，該瓶配有回流冷凝器及N2導管，攪拌下向其中加入DMF(20滴，催化用)和草酰氯(20ml，0.23mol)。混合物于室溫下攪拌2小時，至無進一步的氣體放出。將溶液于冰/鹽浴中冷卻，用空Cacl2管(捕集燒瓶中吹出的固體物質)代替N2導管，并使NH3流通過燒瓶。在最初的劇烈反應平息后，再使氣流保持30分鐘。將混合物傾倒在水(11)和Et2O(0.51)中。用H2O和Et2O洗滌玻璃器皿，并將洗滌液加到混合物中，加入硅藻土，濾除不溶性物質。將兩相分離，Et2O相用鹽水洗滌一次，Na2SO4干燥并濃縮。水相用CH2cl2提取兩次。合并所得的提取物用鹽水洗滌一次，Na2SO4干燥，并與醚相殘渣合并，再濃縮。殘渣經(jīng)蒸餾得標題酰胺(20.6g，76%)，bp100-110℃/10托，其為淺黃色油狀物，冷卻后可固化，m.p.33-35℃。
1H NMR(CDCl3)δ7.0-6.0(2H，br.d)，5.75(1H，ddt，J＝18，9，6Hz)，5.3(2H，m)，2.87(2H，dt，J＝6，17Hz).19F NMR(δC6F6＝O)δ-56.0(t，J＝17Hz).
元素分析理論值(C5H7F2NO)C，44.45;H，5.22;N，10.37。實測值C，42.03;H，4.74;N，9.33。
3b 2，2-二氟戊-4-烯醇腈在N氣保護并冰/鹽浴冷卻下，于1.5小時內向上述酰胺(3a)(20.6g，0.152mol)的干燥吡啶溶液(25ml，0.31mol)中滴加二氟乙酸酐(TFAA，23.5ml，0.166mol)。反應混合物變成固體后，使之在室溫下放置4小時。將燒瓶配上有N2保護的蒸餾裝置，然后將其置于油浴上(最終溫度可達130℃)。收集蒸餾物，可得17.7g無色油狀物，其在空氣中發(fā)煙，b.p70-80℃/760托。NMR分析表明蒸餾物的組份為腈∶TFAA∶吡啶＝80∶12∶8，因此腈的產(chǎn)量為0.116mol(76%)。
1H NMR(CDCl3)6.0-5.5(1H，m)，5.4(2H，m)，2.93(2H，dt，J＝6，15Hz).19F NMR(δC6F6＝O)δ-71.7(t，J＝15Hz).
3c 4，4-二氟辛-1，6-二烯-5-基胺鹽酸鹽將1-丙烯基溴化物(27.22g，0.225mol)的四氫呋喃溶液(225ml)加到鎂屑(5.47g，0.225mol)中，加入速度以保持混合物溫熱而不沸騰為宜，用此方法來制備丙烯基鎂溴化物。加完后，將混合物攪拌20分鐘，用THF(300ml)稀釋，并冷卻至-15℃。向此混合物中加入實例3b中制得的腈(0.116mmol)的THF(80ml)溶液，加入速度以使反應混合物的溫度保持在-15℃-10℃為宜?；旌衔镌诖藴囟确秶鷥壤^續(xù)攪拌1小時，然后冷卻至-40℃。將-40℃的NaBH4(6.4g，0.169mol)的甲醇冷溶液(650ml)和水(30ml)一次加入其中。移去冷卻溶，混合物再攪拌2小時，然后將其傾入6NHcl(800ml)中。在旋轉蒸發(fā)器上蒸去有機溶劑，水層用CH2cl2洗滌兩次，然后用NaOH小粒(需在冰浴下進行)將溶液堿化至PH＝10，并用Nacl進行飽和。向其中加入硅藻土，濾除沉淀的Mg(OH)2。固體殘渣用CH2cl2洗滌，濾液用CH2cl2提取三次，合并的提取物與殘渣洗滌物用Na SO干燥，過濾，經(jīng)Et2O/Hcl酸化，蒸發(fā)得標題胺鹽，其為灰黃色固體(3g)，到此為止該產(chǎn)品并未純化。
3d N-(t-叔丁氧羰基)-4，4-二氟辛-1，6-二烯-5-基胺將實例3c(35g)中的粗品鹽溶于水(200ml)和二噁烷(200ml)中，向其中加入固體KHCO3，使之對PH試紙呈中性，然后再加入KHCO3(12g，0.12mol)和二-叔丁基碳酸酯(34g，0.196mol)?；旌衔镉谑覝叵聰嚢柽^夜，然后用NaCL飽和。將兩相分離，水相用己烷(×3)提取，提取物與有機相合并，并用水洗滌(×3)。合并的水層洗滌物再用己烷提取一次。該提取物與有機相合并，用鹽水洗滌，Na2SO4干燥，濃縮。殘渣經(jīng)閃式柱層析純化(洗滌液CH2cl2/戊烷＝1/1)得標題氨基甲酸酯(19g，65%)，Rf＝0.29，其為油狀物，放置后固化。
1H NMR(CDCl3)δ6.0-5.5(2H，m);5.5-4.5(5H，m);2.67(2H，dt，J＝7，16Hz);1.73(3H，dd＊，J＝7，1Hz);1.47(9H，s).19F NMR(δC6F6＝0)δ-53.2(m).
3e β，β-二氟谷氨酸鹽酸鹽向冰浴冷卻的KMnO4(52.55g，0.33mol)水溶液(1.21)中加入實例3d中制得的氨基甲酸酯(10.95g，0.042mol)的AcOH(160ml)溶液?；旌衔镉谑覝叵聰嚢柽^夜，在此過程中有棕色固體沉出。向其中加入二硫化鈉使溶液脫色，然后加濃Hcl使溶液的PH值達到2。用EtO(3×500ml)提取該溶液，然后用Nacl飽和，再用EtO提取2次。合并有機組份，用鹽水洗滌并濃縮。殘渣用1NHcl(500ml)提取再濃縮。然后再用1NHcl提取殘渣，將混合物加熱，加入活性炭，將混合物攪拌10分鐘，過濾，過液蒸發(fā)至干。用熱的異丙醇提取殘渣，得粗品氨基酸(2.22g)。用EtOH進一步提取異丙醇不溶物來得到任何有用的物質。
19F NMR(D2OδCF3CO2H＝0)δ+23(ddt，J＝280，5，21Hz)，+27(ddt，J＝280，22，9Hz);+28(t);relative integrals 5∶5∶3.
3f β，β-二氟谷氨酸雙叔-丁酯將實例3e中制得的粗品酸(2.22g)懸浮于乙酸叔丁酯中(500ml)，然后加入HClO4(2.16ml，70%的水溶液，25mmol)?；旌衔镉谑覝叵聰嚢?8小時，用H2O(2×200ml)提取。合并的提取物用CH2cl2(2×100ml)洗滌，然后用4N的NaOH使之堿化至PH＝10。該溶液再用CH2cl2(3×100ml)提取。合并的提取物用鹽水洗滌，Na2SO4干燥，將體積濃縮至原來的1/3。此溶液無需純化即可用于下一步反應。蒸發(fā)得更加充分的樣品所顯示的核磁數(shù)據(jù)如下1H NMR(CDCl3)δ4.10(1H，t，J＝14Hz)，3.10(1H，t，J＝15Hz)，3.00(1H，t，J＝15Hz)，1.5(18H，2s);19F NMR(δC6F6＝O)δ-58.7(dt，J＝14，15Hz).
實例4β，β-二氟谷氨酸鹽酸鹽向實例3中所得的BOC-雙雙酯(300mg，0.76mmol)的干燥Et2O(10ml)溶液中加入飽和Et2O/Hcl(3ml)?；旌衔镉谑覝叵聰嚢?天(有Cacl2管保護)。收集白色沉淀固體，用Et2O洗滌。TLC及NMR分析表明酯鍵的斷裂是不完全的。用1NHCl(5ml)提取該物質，并在室溫下攪拌過夜。反應仍不完全，加入幾滴濃Hcl，將混合物攪拌3天。減壓蒸除水，殘渣經(jīng)與CCl4共沸蒸發(fā)干燥。用二異丙醚研磨二次，得一淺綠色粉未，收集并用P2O5干燥，得標題氨基酸(175mg，100%)。
1H NMR(D2O).Signals obscured by solvent.19F NMR(δ CF3CO2H＝O)δ+23(ddt，J＝280，5，21Hz)，+27(ddt，J＝280，22，9Hz).MS(CI，NH3)m/e 184(MH+，100%)，140(75%)，120(40%)，102(40%).Rf(HOAc/H2O/BuOH 1/1/3)0.19.
元素分析理論值(C5H7F2NO4.Hcl)C，27.35;H，3.67;N，6.38。實測值C，28.13;N，3.58;N，6.25。
權利要求
1.制備式I的含葉酸和抗葉酸的軛合物及其
藥用鹽的方法，其中，R1為-NH2，H，或-CH3；R2為-NH2或-OHR3為H，(C1-C4)烷基，X，Y和Z分別獨立地為氮原子或CH基團；該方法包括i)用氰化磷酸二乙酯(Eto)2P(=0)CN將式2
化合物(其中R1，R2，R3，X，Y，Z如上定義)與式3化合物偶聯(lián)，然后除去叔丁酯保護基；或ii)將式4化合物
其中R3如上定義，與式3化合物反應生成式5化合物，
其中R3如上定義，然后將式5化合物與式6化合物
其中R1，R2，X和Y如上定義，反應，所得叔丁氧基保護的化合物再水解脫保護，得所要的式I化合物。
2.制備用于治療腫瘤疾病的藥物組合物方法，該組合物包括作為活性成份的式Ⅰ化合物和藥用載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及某些葉酸及抗葉酸與二氟谷氨酸的軛合物，該軛合物在治療患有某些腫瘤疾病的病人時是十分有用的，這些腫瘤疾病包括有白血病，黑色素瘤，癌，肉瘤和混合的瘤。
文檔編號A61K31/505GK1055740SQ91102288
公開日1991年10月30日 申請日期1991年4月11日 優(yōu)先權日1990年4月12日
發(fā)明者菲利浦·貝, 漢斯·米切爾·考耳伯 申請人:默里爾多藥物公司