專利名稱：用kgf治療糖尿病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及應(yīng)用角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子治療或預(yù)防糖尿病發(fā)生。本發(fā)明背景角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)是上皮細(xì)胞特異性的生長(zhǎng)因子，是首先在人胚胎肺成纖維細(xì)胞細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基中鑒定的。Rubin等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86802-806(1989)。已經(jīng)在數(shù)種來(lái)源于不同發(fā)育階段的上皮組織的基質(zhì)成纖維細(xì)胞細(xì)胞系中檢測(cè)了KGF信使RNA的表達(dá)，在從正常成年腎和胃腸道器官提取的RNA中，KGF的轉(zhuǎn)錄本也很明顯。Finch等人，科學(xué)245752-755(1989)。KGF是從培養(yǎng)基中的成纖維細(xì)胞分泌而在體內(nèi)則是在真皮而不是表皮體內(nèi)表達(dá)，這一證據(jù)表明，KGF可能是角化細(xì)胞增殖的重要正常旁分泌效應(yīng)子。研究已經(jīng)表明在刺激組織培養(yǎng)基中初級(jí)或次級(jí)人角化細(xì)胞增殖方面，KGF的作用與EGF一樣強(qiáng) Marchese等人，細(xì)胞生理學(xué)雜志(J.Cell.Phys.144326-332(1990))。
在正常成年動(dòng)物的體外和體內(nèi)研究表明，在毛囊形態(tài)形成，肝細(xì)胞增殖，以及肺、乳腺、胰腺、胃、小腸和大腸上皮細(xì)胞增殖方面，KGF的作用有所不同。Panos等人，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.92969-977(19930)；Ulich等人，美國(guó)病理學(xué)雜志(Am.J.Path.144862-868(1994)；Yi等人美國(guó)病理學(xué)雜志(Am.J.Path.14580-85(1994))；以及Ulich等人，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.931298-1306(1993))。尚未詳細(xì)研究KGF在胚胎或新生兒發(fā)育中的作用，已經(jīng)有文獻(xiàn)表明KGF是新生小鼠精囊發(fā)育中的重要介導(dǎo)物。Alarid等人，P.N.A.S.911074-1078(1994)。
公開(kāi)的PCT專利申請(qǐng)WO 90/08771描述了從人胚胎成纖維細(xì)胞細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基中純化KGF，純化KGF的部分氨基酸序列，基因的克隆，以及在菌細(xì)胞中表達(dá)所述基因以產(chǎn)生有生物活性的重組KGF。前述的文獻(xiàn)公開(kāi)了可以用KGF或KGF樣多肽作為燒傷傷口的創(chuàng)傷愈合劑或刺激移植的角膜組織。事實(shí)上，已經(jīng)證明，當(dāng)將重組KGF局部應(yīng)用于大鼠耳或豬皮膚上外科手術(shù)誘發(fā)的傷口時(shí)，KGF可促進(jìn)上皮再生并使上皮厚度增加。Pierce等人，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.179831-840(1994))；和Staiano-Coico等人，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.178865-878(1993))。發(fā)明概述已經(jīng)發(fā)現(xiàn)KGF可用于治療稱為糖尿病的內(nèi)科病。


圖1是柱形圖，說(shuō)明在7天內(nèi)，每天以5mg/kg體重(mg/kg)的劑量皮下施用后，KGF在大鼠中的作用。在KGF治療開(kāi)始后2天，單次靜脈內(nèi)施用鏈脲菌素(55mg/kg)。在圖的右半側(cè)表示KGF治療的糖尿病大鼠，標(biāo)注為“Strep+KGF”。在其左右為三個(gè)對(duì)照組用氯化鈉溶液治療7天沒(méi)有糖尿病誘發(fā)(“NaCl”)，在鏈脲菌素誘發(fā)糖尿病之前或之后用氯化鈉溶液治療7天(“Strep”)，用KGF治療7天，沒(méi)有糖尿病誘發(fā)(“KGF”)。在縱軸上表示每分升以mg表示的未禁食的血葡萄糖水平，是在誘發(fā)糖尿病的第5天(即開(kāi)始KGF或氯化鈉治療后的第7天)測(cè)量的。每組有4只大鼠。
圖2是柱形圖，說(shuō)明根據(jù)與糖尿病有關(guān)的其它生理學(xué)測(cè)量數(shù)據(jù)，在相同大鼠模型中KGF的作用。在縱軸上左、右分別表示在KGF或氯化鈉治療的第7天的24小時(shí)內(nèi)排出的禁食尿葡萄糖水平(以mg/dl計(jì))和禁食排出的尿ml數(shù)。標(biāo)注(“NaCl”，“Strep”，“Strep+KGF”，“KGF”)與圖1中的意思相同。每組有4只大鼠。
圖3表示在誘發(fā)糖尿病后的8天期間，在相同糖尿病大鼠模型中，每天未禁食的血葡萄糖水平(以mg/dl計(jì))。在誘發(fā)糖尿病后一天開(kāi)始，一些動(dòng)物每天用KGF皮下給藥(3mg/kg)治療(Strep+KGF)，其余的用氯化鈉溶液進(jìn)行預(yù)治療和后治療(pre-and Post-treated)，作為對(duì)照(“Strep+NaCl”，)。還用氯化鈉治療的非糖尿病組的動(dòng)物(“NaCl”)作為另外的對(duì)照。每組有6只大鼠。
圖4表示在誘發(fā)糖尿病后的6天內(nèi)，在相同大鼠模型上，禁食條件下的尿葡萄糖水平(以mg/dl計(jì))，在這種情況下，從誘發(fā)疾病后的第2天開(kāi)始。KGF治療從誘發(fā)糖尿病后的1天開(kāi)始。圖中的符號(hào)意思與圖3中的相同。每組有6只大鼠。
圖5表示每24小時(shí)的尿排出量，以ml數(shù)表示，試驗(yàn)組與圖3和4中的試驗(yàn)組相同，在誘發(fā)糖尿病后的第2、5和8天測(cè)量。圖中的符號(hào)意思與圖3中的相同。每組有6只大鼠。
圖6表示在該試驗(yàn)中每組大鼠的平均水?dāng)z取量。大鼠飲水不限，將飲水量以24小時(shí)內(nèi)飲用的ml數(shù)表示。每組有6只大鼠。
圖7說(shuō)明KGF類似物對(duì)由鏈脲菌素誘發(fā)的Sprague-Dawley大鼠糖尿病的作用。
圖8是天然KGF的核苷酸(SEQ ID NO1)和氨基酸序列(SEQID NO2)(給編碼天然KGF的成熟形式的核苷酸用SEQ ID NO1的201-684位堿基表示，KGF的成熟形式則用SEQ ID NO2的32-194位氨基酸殘基表示。本發(fā)明的詳細(xì)描述用具有天然多肽的某些或所有生物學(xué)特性的任何形式的角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子均可實(shí)施本發(fā)明的方法。所述形式包括從生物體液、細(xì)胞和組織中分離并純化的，或用化學(xué)合成或通過(guò)在已經(jīng)用編碼DNA或RNA轉(zhuǎn)化的異源宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組方法而得到的。在前文提到的WO90/08771中描述了用于生產(chǎn)角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子的重組方法。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的其它方法也適用于相同的目的。
作為實(shí)例，可以將編碼KGF蛋白質(zhì)的核苷酸序列或其部分序列插入到適宜的表達(dá)載體，即含有插入蛋白質(zhì)編碼序列之轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的元件的載體中。也可以由天然KGF基因和/或其連接區(qū)提供必需的轉(zhuǎn)錄和翻譯信號(hào)?？梢杂酶鞣N宿主-載體系統(tǒng)以表達(dá)蛋白質(zhì)編碼序列。這些包括但不限于用病毒(痘病毒，腺病毒等)感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)；用病毒(如棒狀病毒)和諸如含酵母載體的酵母或用噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌這樣一些微生物感染昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)。這些載體的表達(dá)元件其長(zhǎng)度和特異性可以有所不同。根據(jù)所用的宿主-載體系統(tǒng)，可以采用多種適宜的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件中的任何一種。
可以使用任何以前描述的將核苷酸片段插入到載體中的方法，以構(gòu)建含嵌合基因的表達(dá)載體，所述嵌合基因由適宜的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)和蛋白質(zhì)編碼序列組成。這些方法可包括體外重組DNA和合成技術(shù)以及體內(nèi)重組(遺傳重組)。用第二個(gè)核酸序列可以調(diào)節(jié)核酸序列編碼的KGF蛋白質(zhì)或肽片段的表達(dá)，以便在用重組DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中表達(dá)KGF蛋白質(zhì)或肽。例如，用本領(lǐng)域已知的任何啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件可以控制KGF的表達(dá)?？捎糜诳刂芀GF表達(dá)的啟動(dòng)子包括，但不限于，SV40早期啟動(dòng)子區(qū)，在勞氏肉瘤病毒3′長(zhǎng)末端重復(fù)中所含的啟動(dòng)子，皰疹胸苷激酶啟動(dòng)子，金屬硫蛋白基因的調(diào)節(jié)序列，原核表達(dá)載體，如β-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子，或tac啟動(dòng)子，含胭脂堿合成酶啟動(dòng)子區(qū)(Herrera-Estrella等人)的植物表達(dá)載體，或花椰菜花葉病毒35S RNA啟動(dòng)子，以及光合酶核酮糖二磷酸羧化酶的啟動(dòng)子，來(lái)自酵母或其他真菌的啟動(dòng)子元件，如Gal4啟動(dòng)子，ADC(醇脫氫酶)啟動(dòng)子，PGK(磷酸甘油激酶)啟動(dòng)子，堿性磷酸酶啟動(dòng)子，和下列具有組織特異性而且已應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的動(dòng)物轉(zhuǎn)錄控制區(qū)在胰腺腺泡細(xì)胞中有活性的胰肽酶EI基因控制區(qū)，在胰β細(xì)胞中有活性的胰島素基因控制區(qū)，在淋巴樣細(xì)胞中有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)(Grosschedl等人)，在睪丸，乳腺，淋巴樣和肥大細(xì)胞中有活性的小鼠乳腺腫瘤病毒控制區(qū)(Leder等人)，在肝中有活性的白蛋白基因控制區(qū)，在肝中有活性的α甲胎蛋白基因控制區(qū)，在肝中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)，在髓樣細(xì)胞中有活性的β球蛋白基因控制區(qū)，在腦中的少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中有活性的髓磷脂堿性蛋白基因控制區(qū)，在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(qū)，以及在下丘腦中有活性的促性腺釋放激素基因控制區(qū)。
通過(guò)DNA-DNA雜交，“標(biāo)記”基因功能是否存在以及插入序列的表達(dá)，正如對(duì)于本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來(lái)說(shuō)是熟悉的那些方法，可以鑒定含KGF基因插入片段的表達(dá)載體。
可以用本領(lǐng)域已知的數(shù)種方法增殖KGF基因。適宜的宿主系統(tǒng)和生長(zhǎng)條件一經(jīng)建立，就可以大量增殖并制備重組表達(dá)載體。
另外，調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)或以所需的特定方式修飾并加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞菌株可加以選擇。在存在某種誘導(dǎo)劑的情況下，可以提高從某些啟動(dòng)子開(kāi)始的表達(dá)。因此，可以控制基因工程KGF蛋白質(zhì)的表達(dá)。此外，不同的宿主細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)翻譯和翻譯后的加工和修飾具有特征性的和特殊的機(jī)制(例如，糖基化，谷氨酸殘基的γ羧化，蛋白水解裂解)?？梢赃x擇適宜的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)以確保所表達(dá)的外源蛋白質(zhì)按需要修飾和加工。
應(yīng)當(dāng)理解，本文中所用的術(shù)語(yǔ)“角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子”和“KGF”包括并意指(除非另作說(shuō)明，意思可互換)天然KGF和KGF類似物蛋白質(zhì)(或“突變蛋白”)，所述類似物的特征在于與天然KGF的肽序列有基本上相同的肽序列，而且保持了天然KGF的某些或全部生物學(xué)活性，特別是非成纖維細(xì)胞上皮細(xì)胞增殖(例如，根據(jù)H-胸苷摻入法測(cè)定的結(jié)果)，BALB/MK角化細(xì)胞的刺激作用比NIH/3T3成纖維細(xì)胞的大至少約500倍，BALB/MK角化細(xì)胞的刺激作用比BS/589上皮細(xì)胞或CC1208上皮細(xì)胞的大至少約50倍?！疤卣髟谟谂c天然KGF肽序列有基本上相同的肽序列”指在嚴(yán)格的雜交條件下，優(yōu)選由能夠使SEQ IDNO1中201-684位核苷酸雜交的DNA序列編碼的肽序列。
通過(guò)排列兩個(gè)序列以最大程度地匹配殘基，包括移動(dòng)氨基和/或羧基末端，按需要導(dǎo)入缺口和/或刪除候選插入片段中的殘基，可以確定兩個(gè)氨基酸序列之間相應(yīng)氨基酸的位置。用熟知的和常規(guī)使用的序列同源性/相同性掃描系統(tǒng)程序中的一個(gè)即可以完成數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，序列分析和操作(例如，Pearson and Lipman(1988)，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，852444-2448；Altschul等人(1990)分子生物學(xué)雜志，215403-410；Lipmanand Pearson(1985)，科學(xué)，2221435或Devereux等人(1984)，核酸研究，12387-395)。
在前面提到的嚴(yán)格的雜交條件是指將通常在雜交反應(yīng)中加以控制的鹽，溫度，有機(jī)溶劑和其它參數(shù)等諸條件嚴(yán)格地綜合起來(lái)。舉證性的嚴(yán)格的雜交條件是在62-67℃，4X SSC中雜交，然后在62-67℃，用0.1X SSC洗滌約1小時(shí)。另外，舉證性的嚴(yán)格的雜交條件是在40-45℃，45-55％甲酰胺，4X SSC中雜交(參見(jiàn)，T.Maniatis等人，分子克隆(實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))(Molecular Cloning(A Laboratory Manual)；冷泉港實(shí)驗(yàn)室(Cold Spring Harbor Laboratory)(1982)，p387-389)。
因此，蛋白質(zhì)包括氨基酸的等位基因變異或缺失，取代或插入，包括天然KGF的片段，嵌合或雜交分子。KGF的一個(gè)實(shí)例包括具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2中的Cys1和Cys15被取代或缺失的氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，與親本分子相比，所得的分子的穩(wěn)定性得到改善(如U.S.S.N 08/487825所教導(dǎo)的，1995年7月7日申請(qǐng))。KGF的另一實(shí)例包括電荷改變的多肽，其中天然KGF的41-154位氨基酸殘基(優(yōu)選殘基為Arg41，Gln43，Lys55，Lys95，Lys128，Asn137，Gln138，Lys139，Arg144，Lys147，Gln152，Lys153，或Thr154)中的一個(gè)或多個(gè)已缺失或用中性氨基酸殘基或帶負(fù)電荷的氨基酸殘基-被選擇來(lái)影響正電荷減少的蛋白質(zhì)-取代(如在U.S.S.N 08/323337中所教導(dǎo)的，1994年10月13日申請(qǐng))。KGF的另一實(shí)例包括通過(guò)用有較高成環(huán)能力的至少一個(gè)氨基酸取代天然KGF中Asn115-His116-Tyr117-Asn118-Thr119成環(huán)區(qū)內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸而產(chǎn)生的這樣一些蛋白質(zhì)(如在U.S.S.N 08/323473中教導(dǎo)的，1994年10月13日申請(qǐng))。另一實(shí)例還包括在天然KGF的123-133區(qū)(SEQ ID NO2的氨基酸154-164序列)內(nèi)有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失或加成物這樣一些蛋白質(zhì)；這些蛋白質(zhì)可能有激動(dòng)或拮抗活性。
特別公開(kāi)的蛋白質(zhì)包括下列KGF分子(表示為在SEQ ID NO2所列成熟蛋白質(zhì)(負(fù)信號(hào)序列)中的那一位置所發(fā)現(xiàn)的殘基，接著的括號(hào)中標(biāo)明所述氨基酸的位置，然后為取代的殘基或“-”表示為缺失)C(1，15)S，ΔN15-ΔN24，ΔN3/C(15)S，ΔN3/C(15)-，ΔN8/C(15)S，ΔN8/C(15)-，C(1，15)S/R(144)E，C(1，15)S/R(144)Q，ΔN23/R(144)Q，C(1，15，40)S，C(1，15，102)S，C(1，15，102，106)S，ΔN23/R(137)E，ΔN23/K(139)E，ΔN23/K(139)Q，ΔN23/R(144)A，ΔN23/R(144)E，ΔN23/R(144)L，ΔN23/K(147)E，ΔN23/K(147)Q，ΔN23/K(153)E，ΔN23/K(153)Q，ΔN23/Q(152)E/K(153)E；R(144)Q和H(116)G。
為了在治療中實(shí)際應(yīng)用，可以用任何常規(guī)方法將KGF配制成用適宜于施用的藥物組合物，包括但不限于非腸道給予，如皮下，靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射。這些標(biāo)準(zhǔn)制劑很可能包括適宜的用于液體制劑的緩沖鹽，防腐劑和穩(wěn)定劑，或通常用于凍干制劑的適宜的緩沖鹽，穩(wěn)定劑，防腐劑和填充劑。還可將KGF配制成緩慢釋放的形式，通過(guò)真皮內(nèi)，皮下，或腹腔內(nèi)給藥施用。用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法，可以配制KGF的這些緩慢釋放形式。大多數(shù)KGF的施用方案可以由患者在家中作皮下注射或真皮內(nèi)給藥，或由醫(yī)生將長(zhǎng)期緩慢釋放制劑植入皮下或腹腔內(nèi)來(lái)應(yīng)用。
可以由醫(yī)生根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定KGF的劑量方案。通常，認(rèn)為KGF的有效量為每天每個(gè)患者每kg體重約0.001-約10mg，優(yōu)選劑量為約0.05-約5mg/kg/天。治療方案可以包括KGF的單次或重復(fù)注射，或KGF的緩慢連續(xù)釋放的低劑量，這要取決于每個(gè)患者糖尿病的類型和嚴(yán)重程度。使用KGF的療程必須產(chǎn)生足夠的胰β細(xì)胞功能以便在代謝需求改變的過(guò)程中保持血液葡萄糖水平的正常，而且避免經(jīng)常的或深度的低血糖。目的是使患I型糖尿病的患者恢復(fù)胰島細(xì)胞的功能以避免其經(jīng)常需要外源胰島素。新診斷為I型糖尿病的患者，其某些胰島功能尚有保留，可以作為KGF治療的候選人。KGF可以用來(lái)保持該型糖尿病患者的胰島功能從而消除，延緩或避免永久的糖尿病癥狀。一般認(rèn)為I型糖尿病是自體免疫疾病，從而用免疫抑制劑對(duì)其進(jìn)行治療。根據(jù)本發(fā)明，可以用KGF與免疫抑制劑相結(jié)合來(lái)治療該疾病，包括在胰島細(xì)胞移植的固定中作為一種佐劑應(yīng)用。就下列應(yīng)用來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。材料在下列體內(nèi)研究中所用的試驗(yàn)材料是，特別表明的天然(天然產(chǎn)生的)序列的KGF，二種KGF類似物，其中一種類似物已經(jīng)用定點(diǎn)誘變的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，由絲氨酸取代天然氨基酸序列1和15位的半胱氨酸(即C(1，15)S)，另一種則用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，切掉天然KGF N-末端的前23個(gè)氨基酸(即ΔN23)。通過(guò)在大腸桿菌中重組表達(dá)生產(chǎn)所有蛋白質(zhì)，然后純化至均一，它們?cè)贜-末端各含一甲硫氨酸殘基(Met-1)。將各蛋白質(zhì)作為皮下制劑使用。以前的試驗(yàn)表明，當(dāng)在成年大鼠中全身施用時(shí)，這些蛋白質(zhì)有可比較的活性。在下列研究所用的糖尿病和非糖尿病大鼠中，天然序列KGF和各類似物有可比活性。糖尿病的體內(nèi)模型化學(xué)誘發(fā)的各種動(dòng)物糖尿病模型通常用來(lái)研究所述疾病及其治療。鏈脲菌素可誘發(fā)小鼠，大鼠，倉(cāng)鼠，狗和猴中的糖尿病，盡管最常用的是在大鼠和小鼠中的研究。Junod等人，Proc.Soc.Exp.Pio.Med.126210-205(1967)；Rerup，藥物學(xué)評(píng)論(Pharm.Rev.)22485-518(1970)；Rossini等人，P.N.A.S.742485-2489(1977)，和Ar′Rajab and Ahren，胰(Pancreas)850-57(1993)。在大鼠中，鏈脲菌素以45-70mg/kg的劑量單次靜脈注射可以誘發(fā)穩(wěn)定的糖尿病。45mg/kg以下的劑量誘發(fā)可恢復(fù)的短暫糖尿病狀態(tài)。在鏈脲菌素注射的一天內(nèi)，誘發(fā)了高血糖狀態(tài)。與正常大鼠相比，血液中的胰島素水平基本上保持不變；但在胰腺中的胰島素和C-肽總含量嚴(yán)重降低。大鼠出現(xiàn)了人糖尿病的典型癥候和癥狀血液葡萄糖水平升高(高血糖)，尿中有葡萄糖(糖尿)，易渴(煩渴)，排尿次數(shù)增多(尿頻)，易餓(多食)。
在鏈脲菌素誘發(fā)的Sprague-Dawley大鼠糖尿病模型上完成本公開(kāi)內(nèi)容中所描述的研究。采用在研究開(kāi)始體重為200-260克的雄性大鼠。通過(guò)每kg體重單次靜脈內(nèi)注射溶于檸檬酸鈉緩沖液中的50mg鏈脲菌素來(lái)誘發(fā)糖尿病。非糖尿病對(duì)照大鼠接受單次靜脈內(nèi)注射檸檬酸鈉緩沖液作為對(duì)照。每天皮下注射KGF。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，KGF的劑量為3或5mg/kg/天。在第一個(gè)試驗(yàn)中，KGF治療開(kāi)始于誘發(fā)糖尿病的前2天，一直持續(xù)到糖尿病誘發(fā)后，共進(jìn)行8次注射。在第二和第三個(gè)試驗(yàn)中，供皮下施用的KGF治療開(kāi)始于用鏈脲菌素誘發(fā)糖尿病的1天后。在第四個(gè)試驗(yàn)中，7天的KGF治療開(kāi)始于鏈脲菌素處理的7天后，然后再給動(dòng)物治療12個(gè)星期。在所有試驗(yàn)中，除第四個(gè)試驗(yàn)外，均用血液葡萄糖水平，尿葡萄糖水平和尿體積作為終點(diǎn)進(jìn)行分析。另外，在某些試驗(yàn)中要測(cè)量水?dāng)z取量，尿C-肽水平或胰腺的總胰島素和C-肽含量。在第四個(gè)試驗(yàn)中，評(píng)估的終點(diǎn)的只是液葡萄糖。
由于通過(guò)肝循環(huán)除去了大部分的胰島素，所以測(cè)量外周胰島素濃度反映了肝后代謝過(guò)程而不是從胰腺的胰島素分泌。因此，經(jīng)常測(cè)量C-肽，用作胰島素分泌的外周指標(biāo)。C-肽是從前胰島素加工成胰島素而產(chǎn)生的。胰島素和C-肽是以等摩爾量從β細(xì)胞中分泌的，而只有少量的C-肽由肝排出。KGF的體內(nèi)施用第一個(gè)研究用描述的糖尿病模型，首先用下列四組試驗(yàn)大鼠評(píng)估KGF治療糖尿病的效力1皮下注射不含鏈脲菌素的氯化鈉溶液預(yù)治療和后治療的對(duì)照(非糖尿病)大鼠；2靜脈注射50mg/kg鏈脲菌素誘發(fā)大鼠的糖尿病，皮下注射氯化鈉溶液作預(yù)治療和后治療的大鼠；3靜脈注射50mg/kg鏈脲菌素誘發(fā)大鼠的糖尿病，皮下注射天然KGF作預(yù)治療和后治療的大鼠；和4用皮下注射天然KGF治療的對(duì)照大鼠，不用鏈脲菌素。
在7天期間，給所有四組治療大鼠施用5mg/kg/天的天然KGF或等體積的氯化鈉溶液。在KGF或氯化鈉施用開(kāi)始后2天，給2組和3組中的大鼠靜脈注射55mg/kg單劑量的鏈脲菌素，已知該劑量可以在大鼠中誘發(fā)中等程度糖尿病。監(jiān)測(cè)所有大鼠非禁食的血液葡萄糖水平，體重，禁食后的尿葡萄糖水平和尿排出量。給2和3組施用鏈脲菌素7天后(即開(kāi)始研究后9天)，將所有各組中的大鼠過(guò)夜禁食，殺死，然后進(jìn)行尸檢。在每種情況下，將胰腺保存在福爾馬林鋅中，包埋，然后進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)加工。
如圖1所示，與非糖尿病對(duì)照大鼠(1組)相比，在鏈脲菌素施用后的第5天，糖尿病對(duì)照大鼠(2組)中的非禁食血液葡萄糖水平顯著升高。在鏈脲菌素施用前已經(jīng)用KGF預(yù)治療并用KGF進(jìn)行后治療的糖尿病大鼠，其非禁食血液葡萄糖水平比非KGF治療的糖尿病對(duì)照(2組)的顯著低，但仍比非糖尿病對(duì)照(1組)的高，見(jiàn)圖1。如圖2所示，2組糖尿病對(duì)照大鼠的禁食尿葡萄糖水平和尿體積在該研究開(kāi)始的第7天(即用鏈脲菌素注射后5天)顯著升高。這種情況是由于在胰島中生產(chǎn)胰島素的β細(xì)胞受到破壞，而且葡萄糖代謝嚴(yán)重失調(diào)，從而導(dǎo)致尿中排出葡萄糖。與此相反，3組的糖尿病大鼠(用KGF進(jìn)行了預(yù)治療和后治療)禁食尿中的葡萄糖升高的程度顯著低于糖尿病對(duì)照(2組)大鼠。KGF治療組的尿排出量也顯著低于糖尿病對(duì)照組的，見(jiàn)圖2。
這些結(jié)果與用鏈脲菌素作為誘發(fā)劑而誘發(fā)大鼠中度糖尿病的情況相一致。在糖尿病誘發(fā)前用KGF治療，而且在誘發(fā)后，又用KGF連續(xù)治療的糖尿病大鼠表現(xiàn)出輕度的糖尿病。因此，可以得出結(jié)論，KGF治療可以部分預(yù)防糖尿病的誘發(fā)或者在鏈脲菌素誘導(dǎo)的β細(xì)胞破壞后，可以恢復(fù)生產(chǎn)胰島素的胰島細(xì)胞。為了區(qū)別這些可能性，接著研究疾病誘發(fā)后開(kāi)始的KGF治療。
第二個(gè)研究用前述的相同的糖尿病模型，用下列三組試驗(yàn)大鼠評(píng)估KGF治療糖尿病的效力1皮下施用不含鏈脲菌素的氯化鈉溶液治療的對(duì)照大鼠；2靜脈內(nèi)施用鏈脲菌素誘發(fā)糖尿病，然后皮下施用氯化鈉溶液后治療的大鼠，和3靜脈內(nèi)施用鏈脲菌素誘發(fā)糖尿病，然后皮下施用C(1，15)S后治療的大鼠。
在誘發(fā)糖尿病后1天開(kāi)始，在13天的過(guò)程中以3mg/kg/天的劑量或氯化鈉溶液給試驗(yàn)大鼠施用。在試驗(yàn)過(guò)程中一直監(jiān)測(cè)血液葡萄糖水平，尿葡萄糖水平，尿排出量總計(jì)以及禁食和非禁食條件下攝取的水量。在靜脈注射鏈脲菌素1天內(nèi)，2組和3組的大鼠得了糖尿病(圖3)。在注射鏈脲菌素后24小時(shí)，給3組大鼠開(kāi)始KGF治療并此后每天持續(xù)。在1，2，4，5和8天測(cè)量非禁食后血液葡萄糖水平。如圖3所表明的，在3組中的KGF治療能夠使循環(huán)中的血液葡萄糖水平在第4天降低到接近對(duì)照大鼠的葡萄糖水平(1組)，這種情況持續(xù)到第8天。在第2，5和8天測(cè)量非禁食的尿葡萄糖排出量。圖4表明，KGF治療將尿葡萄糖水平降低了八分之七以上。相似的，當(dāng)在第5和8天測(cè)量時(shí)，KGF治療的糖尿病大鼠的尿排出量也正常了(圖5)。每24小時(shí)的水?dāng)z取ml數(shù)在KGF治療的糖尿病大鼠中沒(méi)有增加，與作為對(duì)照的接受氯化鈉溶液的糖尿病大鼠中的一樣(圖6)。在發(fā)病后第8天使大鼠禁食，在第9天時(shí)禁食后的血液葡萄糖水平在這三組之間沒(méi)有差異。在第9天時(shí)，與糖尿病大鼠相比，KGF治療的糖尿病大鼠禁食后的水?dāng)z取量和尿排出量明顯減少，這進(jìn)一步說(shuō)明疾病的消除。
第三個(gè)研究第三個(gè)研究是第二個(gè)研究的重復(fù)，并證實(shí)圖3-6中的數(shù)據(jù)。另外，在該試驗(yàn)中，當(dāng)對(duì)大鼠進(jìn)行尸檢時(shí)，從各大鼠中取出整個(gè)胰腺，提取胰島素和C-肽，然后進(jìn)行定量分析。下面的表1顯示三組中各自從胰腺所提取的胰島素或C-肽的平均量。當(dāng)與用氯化鈉溶液治療的糖尿病大鼠相比時(shí)，KGF能夠增加糖尿病大鼠胰腺中的胰島素和C-肽的總含量。
表1組1胰腺中的總含量胰島素(μg) C-肽(μmol)對(duì)照 83.7±6.723.5±0.1糖尿病加氯化鈉治療6.4±3.30.4±0.1糖尿病加KGF治療 18.9±7.41.0±0.31n＝每組3-4只大鼠2平均值±S.E.
第四個(gè)研究在于了解在Sprague-Dawley大鼠模型上，KGF對(duì)鏈脲菌素誘發(fā)的糖尿病的作用。在第0天，使各組大鼠接受45或50mg/kg鏈脲菌素(STZ)。在這些處理后，每天監(jiān)測(cè)非禁食條件下的血液葡萄糖水平以評(píng)估胰島損傷的嚴(yán)重程度。在第5天，將STZ處理的動(dòng)物根據(jù)高血糖的程度分成2組(20只/組)。分組界限定為血液葡萄糖水平為300mg/dl。以STZ未處理的動(dòng)物組作為對(duì)照。在第7天時(shí)，給高血糖組的10只動(dòng)物皮下注射ΔN23(3/mg/kg/天)或PBS，連續(xù)7天。然后每天，每隔一天或每周監(jiān)測(cè)血液葡萄糖水平。結(jié)果在圖7中列出。注意到在KGF給藥期間，接受KGF的兩組STZ處理的動(dòng)物的血液葡萄糖均有顯著降低。重要的是，就STZ處理的動(dòng)物體現(xiàn)的平均血液葡萄糖降低而言，開(kāi)始血糖濃度為＜300mg/dl的血液葡萄糖組，穩(wěn)定在約150mg/dl，而在開(kāi)始血糖濃度為＞300mg/dl的血液葡萄糖組見(jiàn)到的血液葡萄糖降低只是暫時(shí)的。注意圖7中橫座標(biāo)天數(shù)刻度是非線性的。
權(quán)利要求
1.治療糖尿病的方法，包括給患有所述疾病的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子或其類似物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中哺乳動(dòng)物是人。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子選自C(1，15)S和ΔN23。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中以含有藥物學(xué)可接受的載體的藥物組合物的形式施用角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子或其類似物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中以非經(jīng)胃腸給藥的注射方式施用所述藥物組合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子或其類似物的施用量為約0.001-10mg/kg體重/天。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述施用量為約0.05-約5mg/kg/天。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種用角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子治療哺乳動(dòng)物糖尿病的方法和藥物組合物。
文檔編號(hào)A61P11/00GK1168678SQ95196410
公開(kāi)日1997年12月24日 申請(qǐng)日期1995年10月12日 優(yōu)先權(quán)日1994年10月13日
發(fā)明者S·L·奧克曼, G·F·皮爾斯 申請(qǐng)人:安姆根有限公司