專利名稱：用dll4拮抗劑治療糖尿病的方法
用DLL4拮抗劑治療糖尿病的方法
發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域此發(fā)明涉及 用δ樣配體4Φ114)拮抗劑治療疾病、紊亂或病癥的方法，其中增加調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg細(xì)胞或Treg)的數(shù)量是有益的。更具體地,本發(fā)明的方法可通過用Dl 14拮抗劑阻斷Dl 14與Notch受體的結(jié)合，從而增加Treg的數(shù)量，預(yù)防、治療或減輕糖尿病。此外，本發(fā)明涉及用D114拮抗劑降低血糖水平，或減少或阻斷自身抗體，包括分別針對胰島素和谷氨酸脫羧酶65(GAD65)的自身抗體的產(chǎn)生的方法。
相關(guān)領(lǐng)域的描述Notch受體及其配體之間的相互作用代表了一條在進(jìn)化上保守的途徑，此途徑不僅對細(xì)胞命運的決定很重要，而且對調(diào)節(jié)在造血作用和發(fā)育中的胸腺中的種系決定(lineage decision)很重要(Artavanis-Tsakonas 等人，1999, Science284:770-776;Skokos 等人，2007;J Exp Med 204:1525-1531;和 Amsen 等人，2004，Cellll7:515-526)。最近有研究顯示，D114_Notchl抑制導(dǎo)致在T細(xì)胞發(fā)育的完全阻斷，并伴隨B細(xì)胞的異位出現(xiàn)(ectopic appearance)和樹枝狀細(xì)胞(DC)的擴(kuò)增，DC是由胸腺內(nèi)的原 T 細(xì)胞到 DC 的命運轉(zhuǎn)化產(chǎn)生(Hozumi 等人，2008，J Exp Med 205(11) : 2507-2513; Koch等人，2008，J Exp Med 205 (11) : 2515-2523;和 Feyerabend等人，2009，Immunity30:1-13)。因此，越來越多的證據(jù)表明，Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對決定造血祖細(xì)胞中的細(xì)胞命運決定是至關(guān)重要的。此外，已有研究顯示了 DC對調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg)體內(nèi)平衡的體內(nèi)反饋控制(Darrasse-JSze 等人，2009，J Exp Med 206 (9) : 1853-1862)。然而，Notch 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在控制DC來源和發(fā)育，和因此在Treg體內(nèi)平衡中的作用仍然未知。這是一個非常重要的問題，因為鑒定誘發(fā)Treg擴(kuò)增的新方法可用于治療自身免疫疾病和紊亂。人D114(hD114)的核酸和氨基酸序列分別顯示在SEQ ID N0:1和2中。D114拮抗劑及其用途在 WO 2007/143689，W02007/070671, WO 2008/076379，WO 2008/042236，和W0/2008/019144 中公開。
發(fā)明概述本發(fā)明是部分基于發(fā)明人的如下觀察，即特異性結(jié)合D114并阻斷D114結(jié)合Notch受體的抗體能夠完全預(yù)防在小鼠中的實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)(此為人多發(fā)性硬化癥的動物模型)的發(fā)展，而對照抗體沒有預(yù)防EAE。此外，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，抗D114抗體的此作用與增加的Treg細(xì)胞數(shù)有關(guān)。另外，還觀察到，抗D114抗體避免了血糖水平的增加和保持了 NOD/ShiLtJ小鼠(I型糖尿病的動物模型)中的胰島數(shù)和形態(tài)，且這些作用至少部分是通過Treg的擴(kuò)增介導(dǎo)的。因此，在第一個方面，本發(fā)明涉及增加Treg細(xì)胞數(shù)的方法，其包括對有需要的受試者施用有效量的Dl 14拮抗劑，其中所述Dl 14拮抗劑阻斷Dl 14和Not ch受體之間的相互作用，且Treg細(xì)胞數(shù)增加。在第二個方面，本發(fā)明涉及預(yù)防、治療或減輕疾病、紊亂或病癥的方法，其中增加Treg細(xì)胞數(shù)是有益的，所述方法包括對有需要的受試者施用治療有效量的D114拮抗劑。本發(fā)明的方法可治療的疾病或紊亂是任意疾病、紊亂或病癥，其通過去除、抑制或降低D114活性而受益，即改善、減輕、抑制或預(yù)防，從而在治療的受試者中增加Treg細(xì)胞數(shù)。本發(fā)明的方法可治療的這樣的疾病或紊亂之一是糖尿病，即I型和2型糖尿病。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或減輕I型或2型糖尿病的方法，其包括對有需要的受試者施用治療有效量的Dl 14拮抗劑。在第三個方面，本發(fā)明涉及降低血糖水平的方法，其包括對有需要的受試者施用治療有效量的Dl 14拮抗劑。在第四個方面，本發(fā)明涉及減少或阻斷自身抗體的產(chǎn)生的方法，其包括對有需要的受試者施用治療有效量的D114拮抗劑。自身抗體可包括針對胰島素的自身抗體，針對GAD65的自身抗體，等等?！ぴ谝粋€實施方案中，用于上述本發(fā)明的任意方法的D114拮抗劑是D114抗體或其片段(“抗D114Ab”或“D114Ab”)，其以高親和力特異性結(jié)合D114并阻斷D114與Notch受體的結(jié)合和/或阻斷DlH-Notch信號途徑?？贵w可為多克隆、單克隆(mAb)、嵌合、人源化或全人抗體或其片段?？贵w片段可為單鏈抗體、Fab或(Fab’)2。在一個實施方案中，Dl 14Ab或其抗原結(jié)合片段結(jié)合hDl 14 (SEQ ID NO: 2)的N-端結(jié)構(gòu)域(殘基 S27-R172)，或 δ /Serrate/Lag-2 (DSL)結(jié)構(gòu)域(殘基 V173-C217)，或N-端-DSL結(jié)構(gòu)域(殘基S27-C217)中的表位。在另一個實施方案中，D114Ab或其抗原結(jié)合片段結(jié)合hD114(SEQ ID NO: 2)的EGF結(jié)構(gòu)域，即約氨基酸殘基Q218-N251 (結(jié)構(gòu)域
I)，E252-D282 (結(jié)構(gòu)域 2)，D284-E322 (結(jié)構(gòu)域 3)，E324-E360 (結(jié)構(gòu)域 4)，S362-E400 (結(jié)構(gòu)域5)，K402-E438(結(jié)構(gòu)域6)，H440-E476(結(jié)構(gòu)域7)，或S480-E518 (結(jié)構(gòu)域8)之一中的表位。在一些實施方案中，抗體或抗體片段可結(jié)合涉及超過一種上面枚舉的表位的構(gòu)象表位。用于本發(fā)明的方法的D114Ab或其片段能夠以高親和力結(jié)合人D114，并具有通過表面等離子共振測量的約InM或更低，約500pM或更低，約300pM或更低，約200pM或更低，約IOOpM或更低，或約50pM或更低的平衡解離常數(shù)(Kd)。在一個實施方案中，D114Ab或其片段包含重鏈可變區(qū)(HCVR)，其包含3個重鏈互補(bǔ)決定區(qū)，HCDR1，HCDR2和HCDR3，分別具有SEQ ID NO: 22，24和26的氨基酸序列。在另一個實施方案中，抗體或其片段包含輕鏈可變區(qū)(LDVR)，其包含3個輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)，IXDRl，LCDR2和LCDR3，分別具有SEQ ID NO: 30，32和34的氨基酸序列。在另一個實施方案中，D114Ab或其片段包含重鏈和輕鏈⑶R序列，所述⑶R序列包含SEQ ID NO: 22，24，26，30，32和34的⑶R序列組合。在另一個實施方案中，D114Ab包含HCVR，其包含SEQ ID N0:20或116的氨基酸序列，或D114Ab包含LCVR，其包含SEQ ID N0:28或118的氨基酸序列。在另一個實施方案中，D114Ab 包含 SEQ ID NO: 20/28 (REGN281)或 116/118 (REGN421)的 HCVR/LCVR組合。在某些實施方案中，D114Ab包含選自下述的重鏈⑶Rl/⑶R2/⑶R3組合和輕鏈 CDR1/CDR2/CDR3 組合:SEQ ID NO: 6/8/10 和 SEQ ID NO: 14/16/18，分別地;SEQID NO:38/40/42 和 SEQ ID NO: 46/48/50，分別地；SEQ ID NO:54/56/58 和 SEQ IDNO: 62/64/66，分別地；SEQ ID NO: 70/72/74 和 SEQ ID NO: 78/80/82，分別地；SEQ IDNO:86/88/90 和 SEQ ID NO:94/96/98，分別地；和 SEQ ID NO: 102/104/106 和 SEQ IDN0:110/112/114，分別地。在另一個實施方案中，D114Ab包含HCVR，其包含SEQ ID NO:4,36，52，68，84，或 100 的氨基酸序列，或 LCVR，其包含 SEQ ID NO: 12，44，60，76，92，或 108的氨基酸序列。在另一個實施方案中，D114Ab包含選自:SEQ ID NO:4/12 (REGN279) ; SEQID NO:36/44(REGN290);SEQ ID NO:52/60(REGN306);SEQ ID NO:68/76(REGN309);SEQ IDN0:84/92(REGN310);和 SEQ ID NO: 100/108 (REGN289)的 HCVR/LCVR 組合。
編碼SEQ ID N0:4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116 和 118 的氨基酸序列的核苷酸序列分別顯示在 SEQ ID NO: 3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105，107，109，111，113，115 和 117 中。在另一個實施方案中，適用于本發(fā)明的方法的D114拮抗劑是融合蛋白，其包含與多聚化成分(multimerizing component)融合的至少一種可溶性Notch受體或其能夠結(jié)合D114的片段。在一個實施方案中，可溶性Notch受體是人Notchl或Notch4。在另一個實施方案中，本發(fā)明的Dl 14拮抗劑是能夠結(jié)合Notch受體的修飾的Dl 14蛋白，但這樣的結(jié)合不導(dǎo)致受體的活化。在某些實施方案中，本發(fā)明的D114拮抗劑是融合蛋白，其包含與多聚化成分，例如免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，例如，人IgG的Fe結(jié)構(gòu)域融合的Dl 14的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其片段。在某些實施方案中，D114拮抗劑包括可阻斷DlH-Notch相互作用的小分子和其他試劑。在第五個方面，本發(fā)明涉及上述任意方法，其中將D114拮抗劑與至少一種另外的治療劑同時或相繼地共同施用，例如，降血糖劑(例如胰島素、胰島素類似物等等)，例如，免疫抑制劑(immunosuppressive agent)或免疫抑制劑(immunosuppressant),抗炎劑,鎮(zhèn)痛齊U，等等)，其中多種治療劑可能具有彼此重疊的治療效果。用于與D114拮抗劑組合的合適的免疫抑制劑包括，但不限于，糖皮質(zhì)激素，環(huán)孢菌素，甲氨蝶呤，干擾素β (IFN-β)，他克莫司，西羅莫司，硫唑嘌呤，巰嘌呤，阿片樣物質(zhì)，霉酚酸酯，TNF結(jié)合蛋白，例如英夫利昔單抗(infliximab),依那西普(eternacept),阿達(dá)木單抗，等等,細(xì)胞毒性抗生素，例如放線菌素D，蒽環(huán)類，絲裂霉素C，博來霉素，光輝霉素，等等，靶向免疫細(xì)胞的抗體，例如抗CD20抗體，抗⑶3抗體，等等。用于與抗D114拮抗劑組合治療的合適的抗炎劑和/或鎮(zhèn)痛藥包括，皮質(zhì)類固醇，非甾體抗炎藥(NSAID)，例如阿司匹林，布洛芬，萘普生等等，TNF-α拮抗齊IJ，IL-I拮抗劑，IL-6拮抗劑，對乙酰氨基酚，嗎啡類似物，等等。在第六個方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含D114拮抗劑，至少一種另外的治療劑，和可藥用的載體。在一個實施方案中，D114拮抗劑是以高親和力特異性結(jié)合D114并中和D114活性的D114Ab或其片段，至少一種另外的治療劑是任意上述降血糖劑，免疫抑制劑，抗炎劑，鎮(zhèn)痛藥，等等。在第七個方面，本發(fā)明涉及試劑盒，其包含容納本發(fā)明的藥物組合物的容器，和具有使用說明的說明書(package insert)。在一個實施方案中,試劑盒可包含容納特異性結(jié)合hD114的抗體或其片段的容器，和容納至少一種上述另外的治療劑的另一個容器。通過以下發(fā)明詳述的綜述，其他目的和優(yōu)勢將變得顯而易見。
附圖簡述


圖1A-1B顯示了 D114阻斷對T細(xì)胞和B細(xì)胞發(fā)育的影響。對小鼠注射抗D114抗體(REGN577)或?qū)φ杖薋e片段(hFc)。14天后，收獲胸腺，通過流式細(xì)胞術(shù)評估T細(xì)胞和B細(xì)胞亞群。圖1A:顯示⑶4_CD8_(雙陰性胸腺前體或“DN”)，^4+^8+(雙陽性胸腺前體或“DP”)，CD4+或CD8+(單陽性胸腺前體或“SP”)，和DN/CD44+CD25—(處于DNl階段的胸腺前體)T細(xì)胞數(shù)的點圖。點圖中的數(shù)字代表T細(xì)胞亞群在全部胸腺細(xì)胞中的百分比(平均值土SEM)。圖1B:顯示B細(xì)胞(B220+)在DNl細(xì)胞中的百分比(平均值土SD)的柱狀圖(即，用 CD4TD8XD44+CD25-門控)。圖2A-2B顯示了 D114阻斷對骨髓中的B細(xì)胞發(fā)育階段(圖2A)和對脾中的B細(xì)胞體內(nèi)平衡(圖2B)的影響。點圖中的數(shù)字代表B細(xì)胞亞群在骨髓或脾中的全部細(xì)胞中的百分比(平均值土SEM)。GC:生發(fā)中心B細(xì)胞；T1和T2:B細(xì)胞亞群；M:邊緣B細(xì)胞；和Fo:濾泡B細(xì)胞。 圖3A-3D顯示了 Dl 14阻斷對樹突細(xì)胞(DC)發(fā)育的影響。圖3A:顯示在抗Dl 14Ab處 理后，在胸腺中的傳統(tǒng) DC (“cDC”; B220XD1IC+)和漿細(xì)胞樣 DC (“pDC”; roCAl+B220+CDl IC+)的擴(kuò)增。點圖中的數(shù)字代表在第14天時，DC在全部細(xì)胞中的平均百分比(平均值土SEM)。圖3B:條形圖顯示在D114Ab處理的小鼠(■)和hFc對照處理的小鼠(口 )的胸腺中的cDC和pDC擴(kuò)增的動力學(xué)。圖3C:點圖顯示D114Ab對胸腺中的DC前體細(xì)胞(MHCn1TDllclatintCD135+Sirp-aint)和晚期DC前體細(xì)胞(MHciI1t5CDllcint)的影響。點圖中的數(shù)字代表在第14天時，DC前體細(xì)胞在全部細(xì)胞中的平均百分比(平均值土SEM)。圖3D:點圖顯示MHCII1t5CDlIcintDC 在用 Dl I 4Ab 處理的小鼠的胸腺中的 DNl (CD4_CD8_CD44+CD25_)原 T 細(xì)胞群中存在，但在用hFc對照Ab處理的小鼠的胸腺中不存在。點圖中的數(shù)字代表在第3天時，MHCII10CDlIcintDC在DNl原T細(xì)胞群中的平均數(shù)(平均值土SEM)。圖4顯示了 D114阻斷對源自T/DC DNl共同祖細(xì)胞的胸腺內(nèi)可變(alternative)DC系發(fā)育為未成熟DC(imDC)的影響。將DNl⑶45. I+LirT分選細(xì)胞轉(zhuǎn)移到用D114Ab( ■)或hFc對照Ab ( □)處理的⑶45. 2+宿主小鼠的胸腺內(nèi)。圖5顯示了 D114阻斷對參與DC發(fā)育的關(guān)鍵細(xì)胞因子，CSF_1 (M-CSF)的血清水平的影響。通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)測量未處理的(Ξ )，或用同種型對照Ab(D)或D114Ab( ■)處理的小鼠的血清CSF-I水平。圖6顯示了在用三苯氧胺(TAM)處理后，遺傳D114缺失對包含三苯氧胺誘導(dǎo)的Cre重組酶構(gòu)建體，CreERT2的DLL4C0IN小鼠中的B細(xì)胞和DC體內(nèi)平衡的影響。點圖中的數(shù)字代表B細(xì)胞、以及pDC和cDC 二者在胸腺中的全部細(xì)胞中的平均百分比(平均值土 SEM)。圖7A-7C顯示了 Dl 14阻斷/缺失對Treg體內(nèi)平衡的影響。圖7A:點圖顯示相比用hFc對照Ab處理的小鼠，在用D114-Ab處理2周的小鼠的胸腺內(nèi)的Treg的擴(kuò)增。點圖中的數(shù)字代表Treg在胸腺中的CD3+CD4+T細(xì)胞中的平均百分比(平均值土 SEM)。圖7B:條形圖分別顯示在用D114Ab(_)和hFc對照Ab(D)處理的小鼠的胸腺(上圖)和脾(下圖)中的Treg發(fā)育的動力學(xué)。圖7C:點圖顯示相比用玉米油對照處理的對照DLL4C0IN，在用三苯氧胺(TAM)處理的DLL4C0IN小鼠的胸腺內(nèi)的Treg的擴(kuò)增。點圖中的數(shù)字代表Treg在胸腺中的⑶3+⑶4+T細(xì)胞中的平均百分比(平均值土SEM)。圖8A-8B顯示了在每周2次持續(xù)2周用D114_Ab (REGN421)處理(lmg/kg或5mg/kg)或hFc處理(5mg/kg)后，在第7和14天，和在處理停止后第28天觀察到的D114阻斷對表達(dá)人Dl 14 (hDl 14)的小鼠胸腺中的DC (圖8A)和Treg體內(nèi)平衡(圖8B)的影響。點圖中的數(shù)字代表PDC和cDC(圖8A)或Treg (圖8B)在胸腺中的全部細(xì)胞中的平均百分比(平均值土 SEM)。圖9A-9B顯示了 D114阻斷在實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠模型中的影響。圖9A:圖表顯示了每個處理組的EAE發(fā)病率(%)。圖9B:圖表顯示了基于平均疾病評分的EAE的發(fā)展。處理為用抗D114Ab (REGN577)預(yù)誘導(dǎo)(▼);同種型對照Ab預(yù)誘導(dǎo)(□ ) ； REGN577 后誘導(dǎo)(▲);或抗 VLA-4AL· (PS/2)預(yù)誘導(dǎo)(■)。圖10顯示了 D114阻斷對EAE小鼠淋巴結(jié)中的IL-17和IFN-Y產(chǎn)生的影響。通過ELISA在第12和18天測量了用D114Ab ( ■)或hFc對照Ab ( □)處理的EAE小鼠淋巴結(jié)中的IL-17(左圖)和IFN-Y (右圖)的水平。圖11A-11E顯示了 D114Ab在NOD小鼠糖尿病模型中的影響。圖IlA顯示了接受hFC對照Ab(·)或抗D114Ab(REGN577) ( ■)的9周齡小鼠中的％糖尿病發(fā)生率(血糖水 平2次連續(xù)測定高于250mg/dL)。也顯示了用D114Ab處理和之后在20周時注射PC61Ab的5只小鼠的％糖尿病發(fā)生率(□ )。PC61Ab是抗⑶25抗體并消耗Treg細(xì)胞。圖IlB顯示了通過ELISA測量的相比未處理的野生型(WT)小鼠，在用D114Ab或hFc對照處理的NOD小鼠中的抗胰島素自身抗體(口 )和抗谷氨酸脫羧酶65(GAD65)自身抗體(■)的產(chǎn)生。圖IlC顯示了用D114Ab (左圖)或hFc對照(右圖)處理的NOD小鼠的蘇木精和伊紅(H&E)染色的胰腺切片。黑色箭頭指示單獨的胰島，白色箭頭指示胰島內(nèi)的浸潤細(xì)胞(右圖)。圖IlD顯示了在用hFc對照處理的(□)或D114Ab處理的(■)小鼠胰腺中的胰島數(shù)(左圖)或％浸潤的胰島(右圖)。圖IlE顯示了在處理后42天在疾病發(fā)作時用D114Ab( ·)或hFc對照(口)處理的小鼠中的血糖水平的改變。
發(fā)明詳述在描述本方法以前，應(yīng)當(dāng)理解，此發(fā)明不受限于描述的特定方法和實驗條件，因為這些方法和條件可改變。還應(yīng)當(dāng)理解，本文使用的術(shù)語僅是為了描述特定實施方案的目的，無意為限制性的，因為本發(fā)明的范圍僅受限于隨附的權(quán)利要求書。如在此說明書和隨附的權(quán)利要求書中所使用的，單數(shù)形式“一個”，“一種”，和“所述”包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文明確地另外指出。因此例如，提及“一種方法”包括本文描述的，和/或在閱讀了此公開后對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的類型的一種或多種方法，和/或步驟。除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與此發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的具有相同的含義。盡管可使用與本文描述的方法和材料類似或等同的任意方法和材料實踐或檢驗本發(fā)明，現(xiàn)在描述優(yōu)選方法和材料。本文提及的所有出版物以其整體引入本文作為參考。定義術(shù)語“D114拮抗劑”，如本文使用的，包括能夠阻斷D114結(jié)合Notch受體(例如Notchl和Notch4)和/或阻斷DlH-Notch信號途徑(見，例如，WO 2008/076379)的針對D114的抗體及其片段，包含與多聚化成分融合的D114細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，或其片段(見例如，美國專利公開號2006/0134121和2008/0107648)，阻斷D114和Notch受體之間的相互作用的肽和肽體(peptibody)(見,例如,美國專利號7，138,370)，等等。因此,在某些實施方案中，所述術(shù)語也包含拮抗劑，例如特異性結(jié)合Notch受體(例如，抗Notchl抗體，抗Notch4抗體，等等)和阻斷Dl 14-Notch信號途徑的小分子，抗體或其抗原結(jié)合片段，
坐坐寸寸O術(shù)語〃抗體〃，如本文使用的，旨在指免疫球蛋白分子，其包含通過二硫鍵相互連接的4條多肽鏈，2條重(H)鏈和2條輕(L)鏈。每條重鏈包含重鏈可變區(qū)(本文簡稱為HCVR或Vh)和重鏈恒定區(qū)(Ch)。重鏈恒定區(qū)包含3個結(jié)構(gòu)域，ChI，CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(本文簡稱為LCVR或VJ和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個結(jié)構(gòu)域，Q。Vh和'區(qū)可進(jìn)一步細(xì)分為名為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)，在其中穿插更保守的區(qū)域，被稱為框架區(qū)(FR)。每個Vh和 '由3個CDR和4個FR組成，從氨基端到羧基端以如下順序排列FR1, CDRl，F(xiàn)R2, CDR2, FR3, CDR3,和 FR4。鑒定HCVR和LCVR氨基酸序列內(nèi)的CDR的方法和技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，其可用于鑒定在本文公開的特定HCVR和/或LCVR氨基酸序列內(nèi)的CDR?？捎糜阼b定CDR邊界的常規(guī)方法包括Kabat定義，Chothia定義，和AbM定義。一般來說，Kabat定義是基于序列可變 性,Chothia定義是基于結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)的位置，AbM定義是Kabat和Chothia方法的折衷。見,例如，Kabat,"Sequences of Proteins of Immunological Interest, "National Institutesof Health, Bethesda, Md. (1991) ; Al-Lazikani 等人，J. Mol. Biol. 273 :927-948(1997);和Martin 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272(1989)。用于鑒定抗體內(nèi)的 CDR 序列的公共數(shù)據(jù)庫也是現(xiàn)有的。也可以取代一個或多個⑶R殘基或省略一個或多個⑶R。在科學(xué)文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了如下抗體，其中可省去I或2個⑶R用于結(jié)合。Padlan等人(1995FASEB J. 9:133-139)基于公開的晶體結(jié)構(gòu)分析了抗體及其抗原之間的接觸區(qū)，并得出結(jié)論，僅約1/5至1/3的CDR殘基實際接觸抗原。Padlan也發(fā)現(xiàn)許多抗體中有I或2個CDR不含與抗原接觸的氨基酸(又見，Vajdos 等人 2002J Mol Biol 320:415-428)?？苫谝郧暗难芯?例如，⑶RH2中的殘基H60-H65經(jīng)常是不需要的)，通過分子建模和/或?qū)嶒灧椒◤奈挥贑hothia⑶R之外的Kabat⑶R區(qū)中鑒定不接觸抗原的⑶R殘基。如果省略CDR或其殘基，其通常被取代為占據(jù)另一種人抗體序列或這些序列的共有序列的對應(yīng)位置上的氨基酸。也可實驗選擇在CDR內(nèi)的取代位置和用于取代的氨基酸。實驗取代可為保守或非保守取代。術(shù)語“抗體”也包括具有修飾的糖基化模式的抗體。在一些應(yīng)用中，去除不期望的糖基化位點的修飾可能是有用的，或例如，去除海藻糖部分以增強(qiáng)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)功能(見Shield等人(2002) JBC 277:26733)。在其他應(yīng)用中，去除N-糖基化位點可降低針對治療抗體的不期望的免疫應(yīng)答，或提高抗體的親和力。在其他應(yīng)用中，可進(jìn)行半乳糖基化修飾以修飾補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合片段"(或簡單地"抗體片段”)，如本文使用的，指保留特異性結(jié)合hD114、或任意其他預(yù)期靶蛋白的能力的抗體的一種或多種片段?？贵w片段可包括Fab片段，F(xiàn)(ab’)2片段，F(xiàn)d片段，F(xiàn)v片段，單鏈Fv (s cFv)分子，dAb片段，由模擬抗體高變區(qū)的氨基酸殘基組成的最小識別單元(例如，包含CDR的片段，或分離的CDR)。其他工程分子，例如雙抗體(diabody),三鏈抗體(triabody),四鏈抗體(tetrabody)和微抗體(minibody),也包括在如本文使用的措辭“抗原結(jié)合片段”中。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體片段可綴合治療部分(“免疫綴合物”)，例如細(xì)胞毒素，化療藥物，免疫抑制劑或放射性同位素。抗體的抗原結(jié)合片段將一般包含至少一個可變結(jié)構(gòu)域。可變結(jié)構(gòu)域可為任意大小或氨基酸組成，并通常包含至少一個⑶R，所述⑶R與一種或多種框架序列相鄰，或位于同一讀框(in frame with)。在具有Vh結(jié)構(gòu)域和Vlj結(jié)構(gòu)域相連的抗原結(jié)合片段中,Vh和Vlj結(jié)構(gòu)域可彼此處于任意合適的排列。例如，可變區(qū)可為二聚的并包含VH-VH，Vh-'或二聚體?？蛇x地，抗體的抗原結(jié)合片段可包含單體Vh或\結(jié)構(gòu)域。在某些實施方案中，抗體的抗原結(jié)合片段可包含至少一個可變結(jié)構(gòu)域，所述可變結(jié)構(gòu)域與至少一個恒定結(jié)構(gòu)域共價連接。在本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合片段內(nèi)可見的可變和恒定結(jié)構(gòu)域的非限制性代表構(gòu)型包括WVh-ChI; (ii)VH-CH2; (iii)VH-CH3; (iv)Vh-ChI-Ch2; (v) Vh-ChI-Ch2-Ch3; (vi) Vh-Ch2-Ch3 ; (vi i) Vh-Cl; (viii) Vl-ChI ; (ix)VL-CH2; (x)Vl-Ch3 ; (xi)VL-CHl-CH2; (xi i)VL-CHl-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3;和(xiv) Vl-Clo 在包括上面列出的任意代表構(gòu)型的可變和恒定結(jié)構(gòu)域的任意構(gòu)型中，可變和恒定結(jié)構(gòu)域可彼此直接連接，或通過完全或部分的鉸鏈或接頭區(qū)連接。鉸鏈區(qū)可由至少2個(例如，5，10，15，20，40，60個或更多)氨基酸組成，其導(dǎo)致在單個多肽分子中的相鄰可變和/或恒定結(jié)構(gòu)域之間·的靈活(flexible)或半靈活的連接。此外，本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合片段可包含上面列出的任意可變和恒定結(jié)構(gòu)域構(gòu)型與另一種上述構(gòu)型和/或與一個或多個單體Vh或\結(jié)構(gòu)域非共價連接(例如，通過二硫鍵)的同源二聚體或異源二聚體(或其他多聚體)。如同全抗體分子，抗原結(jié)合片段可為單特異性或多特異性的(例如，雙特異性)?？贵w的多特異性抗原結(jié)合片段通常包含至少2個不同的可變結(jié)構(gòu)域，其中每個可變結(jié)構(gòu)域能夠特異性結(jié)合單獨的抗原或相同抗原上的不同表位。使用本領(lǐng)域現(xiàn)有的常規(guī)技術(shù)，任意的多特異性抗體形式可經(jīng)改變以適用于本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合片段的情況。術(shù)語〃人抗體"，如本文使用的，旨在包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人HiAb可包含不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機(jī)或定點誘變或通過體內(nèi)的體細(xì)胞突變引入的突變)，例如在CDR、特別是CDR3中的。然而，術(shù)語〃人抗體"，如本文使用的，不旨在包括下述mAb，其中在人FR序列上嫁接來源于另一種哺乳動物物種(例如，小鼠)種系的CDR序列。本文公開的全人抗D114抗體可包含相比對應(yīng)種系序列，在重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的框架和/或CDR區(qū)中的一種或多種氨基酸取代、插入和/或缺失。通過比較本文公開的氨基酸序列和從例如公共抗體序列數(shù)據(jù)庫中得到的種系序列，可容易地確定這樣的突變。本發(fā)明包括來源于本文公開的任意氨基酸序列的抗體，及其抗原結(jié)合片段，其中在一個或多個框架和/或CDR區(qū)內(nèi)的一個或多個氨基酸被突變?yōu)榭贵w來源種系序列的對應(yīng)殘基，或另一種人種系序列的對應(yīng)殘基，或?qū)?yīng)種系殘基的保守氨基酸取代(這樣的序列改變在本文中統(tǒng)稱為“種系突變”)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員從本文公開的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列開始，可容易地產(chǎn)生許多包含一個或多個獨立的種系回復(fù)突變或其組合的抗體和抗原結(jié)合片段。在某些實施方案中，在Vh和/或' 結(jié)構(gòu)域內(nèi)的所有框架和/或CDR殘基被回復(fù)突變?yōu)樵诳贵w所來源的原始種系序列中的殘基。在其他實施方案中，僅某些殘基被回復(fù)突變?yōu)樵嫉姆N系序列，例如，僅在FRl的最初8個氨基酸內(nèi)或FR4的最后8個氨基酸內(nèi)的突變殘基，或僅在CDR1，CDR2或CDR3內(nèi)的突變殘基。在其他實施方案中，一個或多個框架和/或CDR殘基被突變?yōu)椴煌N系序列(即，與抗體最初來源的種系序列不同的種系序列)的對應(yīng)殘基。此外，本發(fā)明的抗體可包含在框架和/或CDR區(qū)內(nèi)的2個或多個種系突變的任意組合，例如，其中某個單獨的殘基被突變?yōu)樘囟ǚN系序列的對應(yīng)殘基，而某個與原始種系序列不同的另外的殘基被保留或被突變?yōu)椴煌N系序列的對應(yīng)殘基。一旦得到，可容易地檢測包含一個或多個種系突變的抗體和抗原結(jié)合片段的一種或多種期望性能，例如改進(jìn)的結(jié)合特異性、提高的結(jié)合親和力、改進(jìn)或增強(qiáng)的拮抗或激動生物性能(視情況而定)、降低的免疫原性，等等。以此一般方式得到的抗體和抗原結(jié)合片段包括在本發(fā)明中。本發(fā)明也包括下述抗Dl 14抗體，其包含本文公開的任意HCVR，LCVR,和/或⑶R氨基酸序列的具有一種或多種保守取代的變體。例如，本發(fā)明包括下述抗D114抗體，其具有相對本文公開的任意HCVR，LCVR,和/或CDR氨基酸序列，具有例如，10個或更少，8個或更少，6個或更少，4個或更少，2個或I個保守氨基酸取代的HCVR，LCVR,和/或⑶R氨基酸序列。在一個實施方案中，HCVR包含SEQ ID NO: 116的氨基酸序列，其中具有10個或更少的保守氨基酸取代。在另一個實施方案中，HCVR包含SEQ ID NO: 116的氨基酸序列，其中具有8個或更少的保守氨基酸取代。在另一個實施方案中，HCVR包含SEQ ID N0:116的氨基酸序列，其中具有6個或更少的保守氨基酸取代。在另一個實施方案中，HCVR包含SEQ ID NO: 116的氨基酸序列，其中具有4個或更少的保守氨基酸取代。在另一個實施方案中，HCVR包含SEQ ID NO: 116的氨基酸序列，其中具有2個或I個保守氨基酸取代。在一個實施方案中，LCVR包含SEQ ID NO: 118的氨基酸序列，其中具有10個或更少的保守氨基酸取代。在另一個實施方案中，LCVR包含SEQ ID NO: 118的氨基酸序列，其中具有8個或更少的保守氨基酸取代。在另一個實施方案中，LCVR包含SEQ ID NO: 118的氨基酸序列，其中具有6個或更少的保守氨基酸取代。在另一個實施方案中，LCVR包含SEQ ID N0:118的氨基酸序列，其中具有4個或更少的保守氨基酸取代。在另一個實施方案中，LCVR包含SEQ IDNO: 118的氨基酸序列，其中具有2個或I個保守氨基酸取代?！爸泻汀被颉白钄唷笨贵w，旨在指下述抗體，其與D114的結(jié)合導(dǎo)致D114生物活性的抑制?？赏ㄟ^測量D114生物活性的一種或多種指示，評估此D114生物活性的抑制?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的若干標(biāo)準(zhǔn)體外或體內(nèi)測定評估D114生物活性的這些指示。例如，通過D114結(jié)合Notch受體的抑制評估抗體中和D114活性的能力。同樣地，術(shù)語也適用于針對其他靶，例如Notchl和Notch4的抗體；這樣的抗體抑制靶的生物活性，從而抑制D114_Notch相互作用或信號途徑。術(shù)語〃特異性結(jié)合〃等等，指抗體或其抗原結(jié)合片段與抗原形成在生理條件下相對穩(wěn)定的復(fù)合物。特異性結(jié)合可通過至少約IxlO-6M或更低的平衡解離常數(shù)表征(例如，較小的Kd表示較緊密的結(jié)合)。測定2個分子是否特異性結(jié)合的方法是本領(lǐng)域熟知的，包括，例如，平衡透析，表面等離子共振，等等。然而，特異性結(jié)合hD114的分離的抗體可展示對其他抗原，例如其他物種的D114分子的交叉反應(yīng)性。此外，雖然如此，認(rèn)為結(jié)合hD114和一種或多種其他抗原的多特異性抗體(例如，雙特異性)是如本文使用的"特異性結(jié)合"hD114的抗體。術(shù)語〃KD〃，如本文使用的，旨在指特定抗體-抗原相互作用的平衡解離常數(shù)。術(shù)語“高親和力”抗體指以表面等離子共振，例如，BIAC0RE 或溶液-親和ELISA測量的約InM或更低，約500pM或更低，約400pM或更低，約300pM或更低，約200pM或更低，或約IOOpM或更低，或約50pM或更低的Kd結(jié)合D114的抗體。
術(shù)語〃表面等離子共振〃，如本文使用的，指通過檢測生物傳感器矩陣內(nèi)的蛋白質(zhì)濃度的改變，允許分析實時生物特異性相互作用的光學(xué)現(xiàn)象，例如使用BIAC0RE 系統(tǒng)(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden 和 Piscataway, N. J.)。術(shù)語〃表位〃是與抗體結(jié)合的抗原區(qū)。表位可被定義為結(jié)構(gòu)或功能的。功能表位一般是一組結(jié)構(gòu)表位，并具有對相互作用的親和力有直接貢獻(xiàn)的殘基。表位也可為構(gòu)象的，即由非線性氨基酸組成。在某些實施方案中，表位可包括決定簇，決定簇是分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)，例如氨基酸，糖側(cè)鏈，磷?；?，或磺?；?，在某些實施方案中，表位可具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，和/或特定的電荷特征。表位在獨特的空間構(gòu)象中一般包括至少3個，和更通常地，至少5個或8-10個氨基酸。
術(shù)語“治療”，如本文使用的，除非另外說明，旨在指預(yù)防(或預(yù)防性)和治療程序。需要治療的受試者不僅包括已患上特定病癥、紊亂或疾病的受試者，而且包括具有患上這樣的病癥、紊亂或疾病的傾向或容易患上這樣的病癥、紊亂或疾病的受試者，所述受試者受益于預(yù)防程序，從而相比未作治療的受試者，降低了這樣的病癥、紊亂或疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)，或發(fā)展(如果發(fā)生的話)。短語“治療有效量”，“預(yù)防有效量”，或“有效量”指產(chǎn)生施用的期望效果的量。精確的量將取決于治療目的、接受治療的受試者的年齡和體型(size)、施用途徑，等等，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用已知技術(shù)確定(見，例如，Lloyd(1999)The Art, Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding)。
一般描述本發(fā)明是部分基于以下發(fā)現(xiàn)，即通過Dl 14-特異性抗體阻斷Dl 14導(dǎo)致Treg細(xì)胞數(shù)增加，其進(jìn)而預(yù)防、減輕或延緩小鼠中的EAE或糖尿病的發(fā)展。有關(guān)全人Dl 14Ab，包括重組人D114Ab的描述，見國際專利公開號WO 2008/076379。
治療施用和制劑本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或減輕疾病或紊亂的方法，其中增加Treg細(xì)胞數(shù)是有利的，所述方法包括施用治療有效量的包含D114拮抗劑，例如D114Ab的藥物組合物。包含D114拮抗劑的藥物組合物還可包含一種或多種另外的治療劑，例如免疫抑制劑，抗炎齊U，鎮(zhèn)痛劑，降血糖劑，等等(見以下章節(jié))。依照本發(fā)明的治療組合物可與合適的載體、賦形劑和摻入制劑以提供改進(jìn)的轉(zhuǎn)移、遞送、耐受性等的其他試劑一起施用。許多合適的制劑可見所有藥物化學(xué)家已知的藥典Remington’s Pharmaceutical Sciences, MackPublishing Company, Easton, PA。這些制劑包括,例如，粉末,糊劑，藥膏，凝膠劑,臘類，油類，脂類，含脂(陽離子或陰離子)小泡(例如LIP0FECTIN )，DNA綴合物，無水吸收糊齊U，水包油和油包水乳劑，乳劑聚乙二醇(多種分子量的聚乙二醇)，半固體凝膠，和含聚乙二醇的半固體混合物。又見 Powell 等人〃Compendium of excipients for parenteralformulations"PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52:238-311。用于全身施用，最初可通過體外測定估計治療有效劑量。例如，可在動物模型中制定劑量以得到循環(huán)濃度范圍，范圍中包括在細(xì)胞培養(yǎng)物中測定的IC5(I。這樣的信息可用于更準(zhǔn)確地確定人中的有效劑量。也可使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，從體內(nèi)數(shù)據(jù)，例如動物模型估計初始劑量。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員基于動物數(shù)據(jù)可容易地優(yōu)化對人的施用。劑量可根據(jù)待施用的受試者的年齡和體型(例如，體重或體表面積)、靶疾病、病癥、施用途徑，等等而變化。用于D114拮抗劑，特別是用于D114抗體的全身施用，用于靜脈內(nèi)施用的一般劑量范圍是約O. Ol至約100mg/kg體重,約O. I至約50mg/kg,或約O. 2至約10mg/kg的每日劑量。用于皮下施用，可以約Img至約800mg,約IOmg至約500mg,約20mg至約400mg,約30mg至約300mg,或約50mg至約200mg,以至少約25mg/ml,約50mg/ml,約75mg/ml,約 100mg/ml,約 125mg/ml,約 150mg/ml,約 175mg/ml,約 200mg/ml,或約 250mg/ml的抗體濃度，至少，每天I至5次，每周I至5次，或每個月I至5次施用抗體?？蛇x地，最初可通過靜·脈內(nèi)注射施用抗體，隨后通過相繼的皮下施用。多種遞送系統(tǒng)是已知的，并可用于施用本發(fā)明的藥物組合物，例如，在脂質(zhì)體中封裝、微粒、微囊、能夠表達(dá)突變病毒的重組細(xì)胞，受體介導(dǎo)的胞吞(見，例如，Wu等人(1987)J.Biol. Chem. 262:4429-4432)。引入方法包括，但不限于，真皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外和口服途徑?？赏ㄟ^任意方便的途徑施用組合物，例如通過輸注或團(tuán)注注射，通過經(jīng)上皮或粘膜皮膚層(lining)(例如，口腔粘膜、直腸和腸粘膜，等等)吸收，也可與其他生物活性劑一起施用。施用可為全身或局部的。也可在小泡，特別是脂質(zhì)體中遞送藥物組合物(見Langer (1990) Science249:1527-1533;Treat 等人(1989)在 Liposomes in the Therapy of InfectiousDisease and Cancer 中，Lopez Berestein 和 Fidler(編)，Liss, New York,pp. 353-365; Lopez-Berestein,同上，pp. 317-327; 一般同上)。在某些情況下，可在受控的釋放系統(tǒng)中遞送藥物組合物。在一個實施方案中，可使用泵(見 Langer,見上；Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201)。在另一個實施方案中，可使用聚合物材料；見，Medical Applications of Controlled Release, Langer和Wise(編)，CRC Pres. , Boca Raton, Florida (1974)。在另一個實施方案中，受控的釋放系統(tǒng)可位于組合物的祀附近，因此僅需要部分全身劑量(見,例如，Goodson, in MedicalApplications of controlled Release,見上，vol. 2, pp. 115-138,1984)?？勺⑸涞闹破房砂ㄓ糜陟o脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)和肌肉內(nèi)注射，點滴輸注等的劑型。可通過公知方法制備這些可注射的制品。例如，可通過例如，在傳統(tǒng)用于注射的無菌水性介質(zhì)或油性介質(zhì)中溶解、懸浮或乳化上述抗體及其鹽制備可注射的制品。作為用于注射的水性介質(zhì)，可使用例如，生理鹽水，含葡萄糖和其他助劑的等滲溶液，等等，其可與合適的增溶劑例如醇(例如，乙醇)，多元醇(例如，丙二醇，聚乙二醇)，非離子表面活性劑[例如，聚山梨醇酯80，HC0-50(氫化蓖麻油的聚氧化乙烯(50mol)加合物)]，等等組合使用。作為油性介質(zhì)，可使用例如芝麻油，大豆油，等等，其可與增溶劑例如苯甲酸芐酯，苯甲醇，等等組合使用。優(yōu)選地在合適的安瓿中裝滿這樣制備的注射劑。可使用標(biāo)準(zhǔn)針頭和注射器皮下或靜脈內(nèi)遞送本發(fā)明的藥物組合物。另外，有關(guān)皮下遞送，筆式遞送裝置(pen deliverydevice)可容易地用于遞送本發(fā)明的藥物組合物。這樣的筆式遞送裝置可為可重復(fù)使用的或一次性的?？芍貜?fù)使用的筆式遞送裝置一般利用可替換的包含藥物組合物的盒。一旦盒內(nèi)的所有藥物組合物被施用，盒變空，可容易地丟棄空盒并替換為包含藥物組合物的新盒。然后可重復(fù)使用筆式遞送裝置。在一次性筆式遞送裝置中沒有可替換的盒。相反地，一次性筆式遞送裝置預(yù)先裝滿在裝置內(nèi)的容器中儲存的藥物組合物。一旦容器中的藥物組合物耗盡，就丟棄整個裝置。許多可重復(fù)使用的筆式和自我注射器遞送裝置可用于皮下遞送本發(fā)明的藥物組合物。實例包括，但當(dāng)然不限于AUTOPEN (Owen Mumford, Inc.，Woodstock, UK),DISETRONIC pen (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Switzerland), HUMALOGMIX75/25 pen, HUMALOG pen, HUMALIN 70/30 pen (Eli Lilly 和 Co.，Indianapolis, IN)，NOVOPEN I, II 和 III(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR (NovoNordisk, Copenhagen, Denmark), BD pen(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ),OPTIPEN ,OPTIPEN PRO ,OPTIPEN STARLET ,和 OPTICLIK (sanofi-aventis，F(xiàn)rankfurt，Germany)，僅舉出這幾個例子?？捎糜谄は逻f送本發(fā)明的藥物組合物的一次性筆式遞送裝置的實例包括，但當(dāng)然不限于 S0L0STAR pen (sanof i-aventis), FLEXPEN (Novo Nordisk),和 KWIKPEN (Eli Lilly)。有利地，將用于上述口服或胃腸外使用的藥物組合物制成適應(yīng)活性成分劑量的單位劑量劑型。這樣的單位劑量劑型包括，例如，片劑，丸劑，膠囊，注射劑(安瓿)，栓劑，等等。包含的D114拮抗劑，例如D114抗體的量一般為每單位劑量劑型約O. I至約800mg;特別地在注射劑劑型中，優(yōu)選包含的抗體為約5至約lOOmg，用于其他劑型約10至約250mg。
在某些實施方案中，可能期望對需要治療的區(qū)域局部施用本發(fā)明的藥物組合物；這可通過例如(但不用于限制)手術(shù)期間的局部輸注，局部應(yīng)用，例如，通過注射，通過導(dǎo)管或通過植入物實現(xiàn)，所述植入物為多孔、無孔或凝膠狀材料，包括膜，例如硅橡膠膜，纖維或商業(yè)皮膚替代品。
組合治療在本發(fā)明的治療方法中，D114拮抗劑可單獨提供，或與一種或多種另外的治療劑組合提供，例如免疫抑制劑或免疫抑制劑，抗炎劑，鎮(zhèn)痛劑，直接或間接降血糖劑，等等。合適的免疫抑制劑包括，但不限于，糖皮質(zhì)激素，環(huán)孢菌素，甲氨蝶呤，干擾素β (IFN-β)，他克莫司，西羅莫司，硫唑嘌呤，巰嘌呤，阿片樣物質(zhì)，霉酚酸酯，TNF結(jié)合蛋白，例如英夫利昔單抗，依那西普，阿達(dá)木單抗，等等，細(xì)胞毒性抗生素，例如放線菌素D，蒽環(huán)類，絲裂霉素C，博來霉素，光輝霉素，等等，靶向免疫細(xì)胞的抗體，例如抗CD20抗體，抗CD3抗體，等等。用于與抗D114拮抗劑組合治療的合適的抗炎劑和/或鎮(zhèn)痛藥包括，皮質(zhì)類固醇，非留體抗炎藥(NSAID)，例如阿司匹林，布洛芬，萘普生等等，TNF-α拮抗劑(例如，Centocor Inc.的英夫利昔單抗或REMICADE , Centocor Inc.的戈利木單抗；Amgen/Wyeth的依那西普或ENBREL㊣j Abbott Laboratories的阿達(dá)木單抗或HUMIRA ,等等)，IL-1拮抗劑(例如，IL-I 結(jié)合融合蛋白，例如，Regeneron Pharmaceuticals, Inc.的ARCALYST ，見美國專利號6，927，044;Amgen的KINERET ,等等)，IL-6拮抗劑(例如，在美國專利號7，582，298中公開的抗IL-6受體抗體，和Roche的ACTEMRA ),對乙酰氨基酚,嗎啡類似物，等等。合適的降血糖劑包括，但不限于，胰島素及其類似物，雙胍類，磺胺類藥物及其尿素衍生物，α -葡糖苷酶抑制劑，噻唑烷二酮(thiazolidinedione)及其衍生物，二肽基肽酶-4抑制劑，瓜爾豆膠，瑞格列奈，那格列奈，艾塞那肽(exenatide)，普蘭林肽，苯氟雷司，利拉魯肽，米格列奈，醛糖還原酶抑制劑，等等。D114拮抗劑，例如hD114Ab或其片段，和上述另外的治療劑可一起或分別地共同施用。當(dāng)使用單獨的劑量制劑時，本發(fā)明的抗體或其片段和其他試劑可同時施用，或在交錯的時間分別施用，即以合適的順序相繼施用。
試劑盒
本發(fā)明還提供了制成品或試劑盒，其包含包裝材料、容器和包含在容器中的藥物試劑，其中所述藥物試劑包含至少一種D114拮抗劑，例如D114抗體，和至少一種另外的治療劑，且其中所述包裝材料包含顯示適應(yīng)癥和使用說明的標(biāo)簽或說明書。在一個實施方案中，D114拮抗劑和另外的治療劑可包含在單獨的容器中。
實施例提供以下實施例以為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何產(chǎn)生和使用本發(fā)明的方法和組合物的完全公開和描述，且無意限制發(fā)明人視作其發(fā)明的范圍。已經(jīng)努力確保有關(guān)使用的數(shù)字(例如，量、溫度等等)的準(zhǔn)確性，但應(yīng)當(dāng)考慮一些實驗誤差和偏差。除非另外指出，部分是以重量計的部分，溫度是以攝氏度計的，壓力是在大氣壓下或接近大氣壓下，圖的誤差條=平均值土 SEM。在以下實施例中，用于流式細(xì)胞術(shù)的目的，使用在補(bǔ)充3%FCS的Dulbecco’ sPBS(GIBCO INVITR0GEN )1X中的以下抗體染色細(xì)胞用于DC，分別用針對信號調(diào)節(jié)蛋白 a (Sirp- α ;貨號 Ρ84; BD Biosciences)，B220 (貨號 RA3-6B2)，PDCA-I (貨號eBio927)，CD8(貨號 53-6. 7)，CDllb (貨號 Ml/70)，MHCII (貨號 M5/114. 15. 2)，CDllc (貨號N418),和CD135(貨號A2F10)的抗體；用于T，B和NK細(xì)胞，分別用針對CD4 (貨號GKl. 5或 L3T4)，CD3(貨號 145-2C11)，CD25(貨號 PC61 或 7D4)，CD44(貨號 IM7)，F(xiàn)oxP3(貨號 FJK16s);和 F4/80(貨號 ΒΜ8)，ΝΚ1· I (貨號 ΡΚ136)，IgM(貨號 11/41)，IgD (貨號 26-1 Ic)，CD43(貨號 S7)，CD21(貨號 eBio4E3)，HSA (貨號 Μ1/69)，和 CD23 (貨號 B3B4)的抗體(均來自 eBioscience) ο
實施例I:Dl 14阻斷對B細(xì)胞，樹突細(xì)胞和T細(xì)胞發(fā)育的影響據(jù)顯示，DlH-Notchl抑制導(dǎo)致T細(xì)胞發(fā)育的完全阻斷，并伴隨B細(xì)胞的異位出現(xiàn)和樹突細(xì)胞(DC)的擴(kuò)增，DC是由胸腺內(nèi)的原T細(xì)胞到DC的命運轉(zhuǎn)化產(chǎn)生(Hozumi等人，2008，J Exp Med 205 (11) : 2507-2513; Koch 等人，2008，J Exp Med 205 (11) : 2515-2523;和Feyerabend等人,2009, Immunity30:1_13)。然而,仍然不知道受Dl 14阻斷直接影響的是DC發(fā)育的哪個特定階段。為了回答此問題，用5或25mg/kg抗D114Ab(REGN577) (n=5)或人Fe片段(對照)(n=5)皮下注射6周齡C57B1/6小鼠(Jackson Labs), I周2次持續(xù)2周?；诠嫉男蛄?W0 2007/143689)自制REGN577。REGN 577結(jié)合人和小鼠D114，但檢測不到其結(jié)合人Dlll和JAGl。注射后14天收獲胸腺和脾，并在補(bǔ)充10%胎牛血清(FCS)和包含膠原酶D (SigmaAldrich)的完全RPMI 1640培養(yǎng)基(Invitrogen)中在37° C下消化30分鐘。為終止反應(yīng)，加入2mM EDTA,使器官懸浮物通過70_mm細(xì)胞過濾器。通過在補(bǔ)充10%FCS的完全RPMI1640培養(yǎng)基沖洗股骨和脛骨從每只小鼠收集骨髓(BM)，并在RPMI培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞。在用上述針對特定標(biāo)記物的抗體染色細(xì)胞后，通過流式細(xì)胞術(shù)評估T細(xì)胞、B細(xì)胞和DC亞群。在BD LSR II流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)上操作染色的細(xì)胞，和使用FlowJo軟件(版本 8. 8. 6; Tree Star Inc.)分析數(shù)據(jù)。圖IA和IB顯示了胸腺中的T和B細(xì)胞群。如在圖IA中顯示，D114阻斷誘發(fā)胸腺內(nèi)雙陰性(“DN” ；CD4TD8_)T細(xì)胞數(shù)的顯著增加和雙陽性(“DP” ；OT4+CD8+)T細(xì)胞數(shù)的減少。另外，相同的處理誘發(fā)胸腺內(nèi)B細(xì)胞的異位出現(xiàn)，所述B細(xì)胞來源于原T細(xì)胞(即，處于DNl階段的CD44+CD25XD4XD8-細(xì)胞)(見圖1B)。相反地，Dl 14阻斷對骨髓中(圖2A)或外周脾B細(xì)胞亞群中(圖2B)的B細(xì)胞發(fā)育沒有影響。此外，D114阻斷誘發(fā)胸腺中常規(guī)DC( “cDC” ;B220_CDllc+)和漿細(xì)胞樣 DC( “pDC” ;PDCA1+B220+CD11C+)的擴(kuò)增(圖 3A)，在初次注射D114Ab后第7天(p < O. 001)開始顯著擴(kuò)增直至第14天(p < O. 001)，并繼續(xù)擴(kuò)增直至第21天(P < O. 01)(圖3B)。在圖3A的點圖中的數(shù)字代表在第14天時DC在總細(xì)胞中的平均百分比。此外，DC在用D114Ab(REGN577)處理的小鼠外周中擴(kuò)增。在表I中顯示了相比對照小鼠(hFc處理)，用D114Ab處理后脾中DC的百分比和絕對數(shù)的增長倍數(shù)。表I
初次注射后的,,f
權(quán)利要求
1.一種S樣配體4Φ114)拮抗劑，用于在受試者中預(yù)防、治療或減輕I型或2型糖尿病，其中所述拮抗劑阻斷D114和Notch受體之間的相互作用，和預(yù)防、治療或減輕糖尿病。
2.一種δ樣配體4(D114)拮抗劑，用于在有需要的受試者中降低血糖水平，其中所述拮抗劑阻斷D114和Notch受體之間的相互作用，和降低血糖水平。
3.—種δ樣配體4(D114)拮抗劑，用于在需要減少或阻斷自身抗體產(chǎn)生的受試者中減少或阻斷自身抗體的產(chǎn)生，其中所述拮抗劑阻斷D114和Notch受體之間的相互作用，和減少或阻斷自身抗體的產(chǎn)生。
4.一種預(yù)防、治療或減輕I型或2型糖尿病的方法，其包括對有需要的受試者施用治療有效量的Dl 14拮抗劑。
5.一種降低血糖水平的方法，其包括對有需要的受試者施用治療有效量的D114拮抗 劑。
6.一種減少或阻斷自身抗體的產(chǎn)生的方法，其包括對有需要的受試者施用治療有效量的Dl 14拮抗劑。
7.權(quán)利要求3的Dl14拮抗劑或權(quán)利要求6的方法，其中所述自身抗體是針對胰島素的自身抗體，或針對谷氨酸脫羧酶65 (GAD65)的自身抗體，或這二者。
8.權(quán)利要求I至3和7中任一項的D114拮抗劑或權(quán)利要求4至7中任一項的方法，其中所述D114拮抗劑是特異性結(jié)合人D114(hD114)并阻斷Dl 14-Notch信號途徑的抗體或其片段，或包含與人IgG的Fe結(jié)構(gòu)域融合的Dl 14的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其片段的融合蛋白。
9.權(quán)利要求8的D114拮抗劑或方法，其中所述抗體或其片段包含重鏈可變區(qū)(HCVR)，其分別包含SEQ ID NO :22, 24和26的重鏈CDR1，CDR2和CDR3序列，或輕鏈可變區(qū)(LCVR)，其分別包含SEQ ID NO: 30，32和34的輕鏈⑶Rl,⑶R2和⑶R3序列，或包含這二者。
10.權(quán)利要求9的D114拮抗劑或方法，其中所述抗體或其片段包含SEQID N0:20或SEQ ID NO: 116 的 HCVR 序列，或 SEQ ID NO: 28 或 SEQ ID NO: 118 的 LCVR 序列，或 SEQ IDNO :20/28 或 116/118 的 HCVR/LCVR 組合。
11.權(quán)利要求I至3和7至10中任一項的Dl14拮抗劑，其與至少一種選自降血糖劑，免疫抑制劑，抗炎劑，和鎮(zhèn)痛劑的另外的治療劑組合。
12.權(quán)利要求11的D114拮抗劑，其中所述另外的治療劑是選自胰島素或其類似物，糖皮質(zhì)激素，環(huán)孢菌素，甲氨蝶呤，非甾體抗炎藥(NSAID)，TNF-α拮抗劑，IL-I拮抗劑，IL-6拮抗劑，和阿片樣物質(zhì)的至少一種。
13.權(quán)利要求4至10中任一項的方法，還包括共同施用治療有效量的至少一種選自降血糖劑，免疫抑制劑，抗炎劑，和鎮(zhèn)痛劑的另外的治療劑。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述另外的治療劑是選自胰島素或其類似物，糖皮質(zhì)激素，環(huán)孢菌素，甲氨蝶呤，非留體抗炎藥(NSAID)，TNF-α拮抗劑，IL-I拮抗劑，IL_6拮抗劑，和阿片樣物質(zhì)的至少一種。
15.權(quán)利要求11或12的Dl14拮抗劑或權(quán)利要求13或14的方法，其中所述Dl 14拮抗劑和至少一種另外的治療劑用于同時或相繼施用。
16.如在權(quán)利要求1-3，7-12和15中任一項定義的δ樣配體4(Dl 14)拮抗劑在受試者中預(yù)防、治療或減輕I型或2型糖尿病中的用途。
17.δ樣配體4 (D114)拮抗劑在制備用于在受試者中預(yù)防、治療或減輕I型或2型糖尿病的藥物中的用途。
18.δ樣配體4(D114)拮抗劑在制備用于在受試者中降低血糖水平的藥物中的用途。
19.δ樣配體4(D114)拮抗劑在制備用于在受試者中減少或阻斷自身抗體的產(chǎn)生的藥物中的用途。
20.權(quán)利要求19的用途，其中所述自身抗體是針對胰島素的自身抗體，或針對谷氨酸脫羧酶65(GAD65)的自身抗體，或這二者。
21.權(quán)利要求17至20中任一項的用途，其中所述D114拮抗劑是特異性結(jié)合hD114并阻斷DlH-Notch信號途徑的抗體或其片段，或包含與人IgG的Fe結(jié)構(gòu)域融合的Dl 14的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其片段的融合蛋白。
22.權(quán)利要求21的用途，其中所述抗體或其片段包含重鏈可變區(qū)(HCVR)，其分別包含SEQ ID NO :22, 24和26的重鏈CDR1，CDR2和CDR3序列，或輕鏈可變區(qū)(LCVR)，其分別包含SEQ ID NO: 30，32和34的輕鏈CDRl, CDR2和CDR3序列，或包含這二者。
23.權(quán)利要求22的D114拮抗劑或方法，其中所述抗體或其片段包含SEQID N0:20或SEQ ID NO: 116 的 HCVR 序列，或 SEQ ID NO: 28 或 SEQ ID NO: 118 的 LCVR 序列，或 SEQ IDNO :20/28 或 116/118 的 HCVR/LCVR 組合。
全文摘要
本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或減輕糖尿病的方法，通過對有需要的受試者施用治療有效量的阻斷DLL4-Notch信號途徑的DLL4拮抗劑。如在糖尿病的小鼠模型中觀察到的，DLL4拮抗劑通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg)的擴(kuò)增，展示了對胰島的保護(hù)作用，降低了血糖水平，并阻斷了自身抗體的產(chǎn)生，包括針對胰島素和谷氨酸脫羧酶65(GAD65)的自身抗體。因此，本發(fā)明還提供了降低血糖，和/或減少或阻斷自身抗體產(chǎn)生的方法，通過對有需要的受試者施用治療有效量的阻斷DLL4-Notch信號途徑的DLL4拮抗劑。合適的用于本發(fā)明的DLL4拮抗劑包括特異性結(jié)合DLL4和阻斷DLL4-Notch相互作用的抗體或抗體片段,DLL4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域,等等。
文檔編號A61P37/00GK102947336SQ201180016820
公開日2013年2月27日 申請日期2011年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月29日
發(fā)明者D·斯科克斯 申請人:瑞澤恩制藥公司