一種具有輔助降血糖功能的高品質(zhì)發(fā)酵駝乳制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高品質(zhì)發(fā)酵駝乳制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是一種由遺傳、生活、環(huán)境等因素相互作用而引起的胰島素分泌絕對(duì)不足 或相對(duì)不足的疾病，常見(jiàn)發(fā)病特征為機(jī)體內(nèi)在糖、脂肪和蛋白代謝紊亂，外在表現(xiàn)為多飲、 多食、多尿和體重下降。同時(shí)糖尿病還會(huì)誘發(fā)各種并發(fā)癥，據(jù)統(tǒng)計(jì)，糖尿病的全球發(fā)病率均 在飆升，預(yù)計(jì)到2030年全球患者人數(shù)將增至3. 66億，糖尿病已被列為世界第三大慢性非傳 染性疾病。
[0003]目前，糖尿病的治療方法主要包括外科手術(shù)、藥物和非藥物治療。糖尿病藥物治療 又分為兩大類(lèi)，即胰島素治療和口服降糖藥治療。口服降糖西藥包括雙胍類(lèi)藥物、磺脲類(lèi)藥 物、噻唑烷二酮藥物、非磺脲類(lèi)藥物和a-葡萄糖苷酶抑制劑5大類(lèi)。盡管近年來(lái)這些口服 降糖西藥有了迅速的發(fā)展，但它們基本上只起到了單一的促進(jìn)降糖作用，不能改善機(jī)體的 其它機(jī)能，對(duì)糖尿病的并發(fā)癥基本上沒(méi)有治療的效果，而且這些藥物都存在著不同程度的 副作用，即使直接使用胰島素注射也可引發(fā)注射部位肌肉萎縮、視力模糊等副作用，這使得 藥物和胰島素治療在臨床應(yīng)用中受到了很大程度的限制。
[0004] 近年來(lái)，多種乳酸菌已被證實(shí)應(yīng)用于動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)中對(duì)糖尿病具有預(yù)防或 治療的作用，乳酸菌通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)相關(guān)酶的活性，調(diào)節(jié)體內(nèi)糖代謝，是一種安全有效的微 生物調(diào)節(jié)劑，作用溫和且?guī)缀鯚o(wú)毒副作用，開(kāi)辟了有效防治糖尿病及并發(fā)癥的研究新思路， 成為該領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)。本研究利用天然駱駝乳在調(diào)節(jié)血糖方面的優(yōu)勢(shì)，利用篩選出的 具有優(yōu)秀體外a-葡萄糖苷酶抑制能力的乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵，進(jìn)而制備出具有調(diào)節(jié)血糖、促 進(jìn)身體健康功能的保健型發(fā)酵食品類(lèi)，逐漸開(kāi)創(chuàng)我國(guó)功能食品消費(fèi)的新市場(chǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種具有輔助降血糖功能的高品質(zhì)發(fā)酵駝乳的制備方法，通 過(guò)該方法制備的發(fā)酵駝乳酸甜適口，口感細(xì)膩，并具有輔助降血糖的功能。
[0006] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案進(jìn)行的：純駝乳中添加3% -6% (w/w)蜂蜜，添加 2%-4% (w/w)低聚果糖，經(jīng)均質(zhì)，適當(dāng)熱處理后，接種混合菌種發(fā)酵劑，再經(jīng)發(fā)酵制備而 成。
[0007] 本發(fā)明所述混合乳酸菌發(fā)酵劑菌株包括：植物乳桿菌Grxl6(Lactobaci1lus plantarumGrxl6)，保藏號(hào)是CGMCCNO. 7. 205;干酪乳桿菌grxl2(Lactobacilluscasei grxl2)，保藏號(hào)是CGMCCNO. 7696,專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)柺荂N201310312784. 7 ;德氏乳桿菌保加利 亞亞種grx33(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.Bulgaricusgrx33)，保藏號(hào)是CGMCC NO. 7694,專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)柺荂N201310310725. 6 ;發(fā)酵乳桿菌grx07(Lactobacillusfermentum grx07)，保藏號(hào)是CGMCCNO. 8874,專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)柺荂N201410156237. 9。
[0008] 本發(fā)明所述混合乳酸菌發(fā)酵劑的菌株由植物乳桿菌grxl6、干酪乳桿菌grxl2、德 氏乳桿菌保加利亞亞種grx33和發(fā)酵乳桿菌grx07組成，其混合比例為1:1:1:1 (v/v)。
[0009] 本發(fā)明制備的發(fā)酵駝乳，通過(guò)對(duì)鏈脲佐菌素（STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型，以格 列美脲為藥物對(duì)照組，研究駱駝乳和發(fā)酵駝乳的體內(nèi)的輔助降血糖效果。結(jié)果表明，相對(duì)于 模型組，發(fā)酵駝乳能夠顯著改善糖尿病大鼠的飲水量、采食量和體重（P〈〇. 05);干預(yù)第4周 后，大鼠血糖濃度下降了 17. 87%，且效果顯著（P〈0. 05)，同時(shí)提高了糖尿病大鼠的葡萄糖 耐受量，其血液的糖化血紅蛋白（HbAlc)和果糖胺（FMN)水平顯著低于模型組（P〈0.05)，由 此表明駱駝發(fā)酵乳在降低大鼠血糖的同時(shí)，還能夠改善糖尿病大鼠的血脂水平，提高其抗 氧化能力。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1為本發(fā)明菌株的形態(tài)圖。
[0011] 圖2為本發(fā)明菌株16S rDNAPCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；泳道M :100+2+3Kb DNAmaker; 泳道1為：grxl616S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0012] 圖3(&)為菌株組合八1、八2、八3、八4、八5、八6的生長(zhǎng)曲線；
[0013] 圖3〇3)為菌株組合厶7、厶8、厶9、厶10、81、82的生長(zhǎng)曲線；
[0014] 圖3 (c)為菌株組合B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9的生長(zhǎng)曲線；
[0015] 圖3((1)為菌株組合810、(：1、〇2、〇3、〇4、〇5、01的生長(zhǎng)曲線。
[0016] 圖4為11種不同菌株組合的表觀粘度隨剪切時(shí)間變化曲線。
[0017] 圖5 (a)為Bl、B4、B5菌株組合的發(fā)酵駝乳表觀粘度隨剪切速率變化曲線；
[0018] 圖5 (b)為B7、B8、B10菌株組合的發(fā)酵駝乳表觀粘度隨剪切速率變化曲線；
[0019] 圖5 (c)為Cl、C2、D1菌株組合的發(fā)酵駝乳表觀粘度隨剪切速率變化曲線；
[0020] 圖5 (d)為C3、C5菌株組合的發(fā)酵駝乳表觀粘度隨剪切速率變化曲線。
[0021] 圖6 (a)為Bl、B4、B5菌株組合的發(fā)酵駝乳G'和G"的掃描圖；
[0022] 圖6 (b)為B7、B8、B10菌株組合的發(fā)酵駝乳G'和G"的掃描圖；
[0023] 圖6 (c)為Cl、C2菌株組合的發(fā)酵駝乳G'和G"的掃描圖；
[0024] 圖6 (d)為C3、C5、D1菌株組合的發(fā)酵駝乳G'和G"的掃描圖。
[0025] 圖7A為發(fā)酵駝乳對(duì)糖尿病大鼠采食量的影響。
[0026] 圖7B為發(fā)酵駝乳對(duì)糖尿病大鼠飲水量的影響。
[0027] 圖8發(fā)酵駝乳對(duì)糖尿病大鼠和平均體重的變化影響。
[0028] 圖9發(fā)酵駝乳對(duì)糖尿病大鼠葡萄糖耐受量的影響。
[0029] 植物乳桿菌Grxl6 (Lactobacillus plantarum. Grxl6)，于2015年8月7日保藏 于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院 3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，分類(lèi)命名為：植物乳桿菌Lactobacillus plantarum.保藏 號(hào)是CGMCC NO. 10921。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 本研究采用傳統(tǒng)涂布平板法從廣西巴馬長(zhǎng)壽村采集的樣品中分離乳酸菌，通過(guò)模 擬人體胃腸道環(huán)境篩選出耐酸耐膽鹽能力較強(qiáng)的菌株，并研究其還原活性、DPPH自由基清 除能力以及耐藥性，最后通過(guò)體外試驗(yàn)篩選出具有較高a-葡萄糖苷酶抑制能力的菌株， 并組合其他菌株作為發(fā)酵劑，制備具有輔助降血糖功能的高品質(zhì)發(fā)酵駝乳。
[0031] 1?樣品米集
[0032] 采集廣西巴馬長(zhǎng)壽村中長(zhǎng)壽人群及其家族人群的糞便樣品，加入lmL滅菌液體石 蠟油密封后，迅速置于冰盒內(nèi)，分離樣品中的乳酸菌。
[0033] 2.乳酸菌的分離
[0034] 將采集的樣品經(jīng)梯度稀釋后，分別接種于MRS固體培養(yǎng)基、LBS固體培養(yǎng)基和PTYG 固體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)48h，挑取平板上的典型菌落，劃線分離得到純菌落。挑取各平 板上的純菌落于MRS液體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)24h后，4°C冰箱冷藏備用或凍干保藏。
[0035] 3.乳酸菌的生理生化試驗(yàn)
[0036] 對(duì)分離到的乳酸菌進(jìn)行革蘭氏染色，于顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，并進(jìn)行接觸酶、運(yùn) 動(dòng)性、硝酸鹽還原及吲哚等生理生化試驗(yàn)。
[0037] 結(jié)果表明，從采集的樣品中分離獲得197株菌株，通過(guò)生理生化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)180株菌 革蘭氏染色為陽(yáng)性，形狀為桿狀、短桿狀或球狀，在15°C及45°C環(huán)境下均能生長(zhǎng)，接觸酶、 運(yùn)動(dòng)性、硝酸鹽還原、吲哚、產(chǎn)H2S及明膠液化試驗(yàn)均為陰性，所以將180株菌初步鑒定為乳 酸菌。
[0038] 4.乳酸菌凝乳性的篩選
[0039] 將180株試驗(yàn)菌株活化后接種于脫脂乳中，37°C培養(yǎng)48h，并觀察凝乳狀況，所有 菌株的凝乳情況見(jiàn)表1。
[0040] 表1試驗(yàn)乳酸菌發(fā)酵24h凝乳情況
[0041]
[0042]
[0043] 注：++為凝固，且凝乳質(zhì)地均勻細(xì)致，凝乳時(shí)間較短，凝塊結(jié)實(shí)，無(wú)乳清析出；+為 凝固，但凝塊不結(jié)實(shí)，凝乳時(shí)間較長(zhǎng)，乳清析出較多.
[0044] 結(jié)果顯示，180株乳酸菌中，有136株在48h內(nèi)凝乳，并且各菌株的凝乳時(shí)間有較大 的差異。因此將篩選出的1