專利名稱:制造水溶性鐵葡聚糖的方法
鐵葡聚糖制劑在動物醫(yī)療中，用于靜脈的和肌肉的注射，治療缺鐵的貧血癥。該制劑作為葡聚糖的絡(luò)合物，是通過與膠體的三價(jià)鐵氫氧化物轉(zhuǎn)化制成的。
特別是用于靜脈注射給藥的制劑，對于溶液的穩(wěn)定性和鐵的生物可利用性提出了很高的要求。具有高鐵含量的鐵葡聚糖，也就是說，若制造時(shí)使用了過高的平均分子量的葡聚糖時(shí)，具有20%或更多鐵的每克干物質(zhì)，是不能滿足這種要求的。由于在不同的葡聚糖分子間通過鐵原子在分子內(nèi)部絡(luò)合物的形成，然后又形成了膠體和沉淀物。因此通常是使用4000-5000低分子量的葡聚糖合成含鐵的葡聚糖。這種分子量范圍的葡聚糖，是通過自然的高分子的葡聚糖的酸化水解作用得到的，并且作為副產(chǎn)品，例如在生產(chǎn)醫(yī)用平均分子量為4000-7500的葡聚糖時(shí)，生產(chǎn)出來的。
但這種副產(chǎn)葡聚糖的分子量分布是很寬的，并且一般達(dá)到有關(guān)葡萄糖大約不超過50000分子量。因此一般的共同作法是，在堿性條件下，葡聚糖與三價(jià)的鐵鹽轉(zhuǎn)化得到粗的鐵葡聚糖，通過化費(fèi)多的溶劑沉降分離或通過薄膜分離方法，將不受歡迎的較高分子量的部分去掉。
若醫(yī)用葡聚糖生產(chǎn)的廢料餾份含有過多的葡萄糖和異-麥芽-低糖化物其分子量大約不超過1000，這種糖化物在轉(zhuǎn)化成鐵葡聚糖之前，同樣也必須去掉，因?yàn)樵谵D(zhuǎn)化條件下，能進(jìn)一步分解生成有毒的產(chǎn)物。
由于所談到的原因，希望制造出一種溶于水的具有高鐵含量的鐵葡聚糖，這還意味著，人們所用的葡萄糖必須是平均分子量為2000至4000，分子量分布窄的葡聚糖。
這個任務(wù)，通過本發(fā)明的方法得到了解決，該方法其特征在于，向一種水溶液中，該溶液每1000單位α(1→6)-右旋-葡糖基轉(zhuǎn)移酶含有多于200毫克分子的右旋-葡萄糖，在265至310K和PH-值為4.5至8時(shí)，加入如下數(shù)量的-蔗糖水溶液，蔗糖比葡萄糖的克分子比為2.0至5.0，在蔗糖消耗以后，分離掉葡萄糖放出的果糖和不受歡迎的低糖化物，這樣凈化的葡萄糖具有一平均克分子質(zhì)量為2000至4000，用新沉淀出的三價(jià)鐵氫氧化物轉(zhuǎn)化，有時(shí)并進(jìn)一步凈化。
以這種方式成功的制出了一種水溶性的具有鐵含量為27至33重量百分?jǐn)?shù)的和葡聚糖組份的平均克分子質(zhì)量為2000至4000的鐵葡聚糖。
反應(yīng)混合物，主要是保持在290至300K和在PH-值范圍為5至6.5內(nèi)。此二個指標(biāo)對生成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)有影響。
按照“酶委員會”的分類，把使蔗糖的右旋-吡喃葡糖基轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w上的酶，稱作α(1→6)-右旋-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。這樣一種細(xì)胞外的酶是葡聚糖蔗糖酶(E，C，2，4，1，5)，該酶是由某種乳酸桿菌族的菌種，例如腸系膜明串珠菌，特別是菌種B-512，葡萄聚糖明串珠菌，鏈球菌和乳酸桿菌所構(gòu)成。制取天然的葡聚糖，首先使用蔗糖作受體，并且在鏈聚合中作為鏈引管劑起作用，在這當(dāng)中，由蔗糖通過連續(xù)的轉(zhuǎn)移右旋-吡喃葡萄糖基組到增長的鏈上，構(gòu)成具有數(shù)百萬克分子質(zhì)量的多糖類葡聚糖，而同時(shí)對每個轉(zhuǎn)化的蔗糖分子，產(chǎn)生一分子果糖。
若在這個反應(yīng)中加入了其他的單的，雙的或三-糖類作為受體，就會有損于葡聚糖而在小范圍內(nèi)生成低聚糖。在使用葡萄糖作為受體時(shí)，生成大約78%的天然葡萄糖和大約13%的二-和低聚糖不超過IM-12。(Robyt和Eklund，糖類研究，121，(1983)279-286頁)。典型地是生成的低聚糖類，隨著聚合度的增加，其數(shù)量則逐漸減少。
在發(fā)明的反應(yīng)條件下成功的這樣控制由蔗糖轉(zhuǎn)移葡萄糖基組到葡萄糖上，使其不生成天然的葡聚糖，而是以高產(chǎn)率構(gòu)成具有15至25葡萄糖酐-單元的異-麥芽-低聚糖類。在這當(dāng)中出乎預(yù)料的是，生成的異-麥芽-低聚糖類，隨著聚合度的增加，其數(shù)量不再是逐漸減少，而是與轉(zhuǎn)化的蔗糖數(shù)量有關(guān)，主要是生成一種一定的聚合度。
在發(fā)明的方法中，為取得所希望的異-麥芽-低聚糖類的高產(chǎn)率，可采用一種這樣的速度連續(xù)的添加蔗糖的水溶液，已有數(shù)量的酶能使流入的蔗糖數(shù)量立即轉(zhuǎn)化，并且在反應(yīng)混合物中避免蔗糖富集，這種富集可以導(dǎo)致沒有控制生成高分子的葡聚糖。無論如何，反應(yīng)混合物的糖一干基物質(zhì)的蔗糖組份，在連續(xù)轉(zhuǎn)化的平衡狀態(tài)，不應(yīng)超過25%。
不用凈化的葡聚糖-蔗糖酶，也可以使用由酶和生產(chǎn)酶的細(xì)菌組成的混合物。
反應(yīng)結(jié)構(gòu)可以描述如下葡萄糖+n蔗糖 (葡聚糖蔗糖酶)/()異-麥芽-(n+1)-糖類+n果糖在這里n是放入的蔗糖克分子數(shù)，它的右旋一吡喃葡萄糖基組用于構(gòu)成低分子的葡聚糖，而同時(shí)放出相應(yīng)數(shù)目果糖。
這個反應(yīng)根據(jù)發(fā)明可以這樣控制，使生產(chǎn)出各所希望分子量的異-麥芽-低聚糖或多糖。在所談到的溫度和氫離子濃度的條件下，在這種合成反應(yīng)中達(dá)到的分子量，與以一定的酶活性，在已有溶液中的有關(guān)受體的克分子數(shù)量和總加入的蔗糖與受體克分子的比例有關(guān)系。
酶活性單位U(＝單位)是α(1→6)-右旋-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的數(shù)量，該數(shù)量在PH5，2和298K，每分鐘轉(zhuǎn)化1μ克分子的蔗糖。
若加入比已有的酶活性能轉(zhuǎn)化的蔗糖還多，那么控制分子的大小就不可能了。
若以酶活性1000單位作為基礎(chǔ)，那么在蔗糖添加量總的為1000毫克分子和葡萄糖每1000單位為100至500毫克分子，特別是200至500毫克分子，可得到所希望的具有一平均分子量大約為2000至4000的低聚糖的混合物。
因此也可能，在幾個探索試驗(yàn)中用變換葡萄糖分子數(shù)量在指明的范圍內(nèi)，在預(yù)先確定α(1→6)-右旋-葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性(例如1000單位)和一恒定的蔗糖數(shù)量(例如1000毫克分子)，適量的添加蔗糖，使它直接被酶所轉(zhuǎn)化，這樣控制蔗糖的右旋-吡喃葡萄糖基團(tuán)在作為受體的葡萄糖上的加成反應(yīng)，使其能夠以高產(chǎn)率合成所希望的具有窄分子量分布的異-麥芽-低聚糖或多糖類的餾份。
可以取出總的必需的葡萄糖數(shù)量，或保持其余的反應(yīng)條件，特別是濃度比例，同樣連續(xù)的適量的替換葡萄糖，正如它作為受體消耗掉的一樣。因此，使合成反應(yīng)完全連續(xù)進(jìn)行也是可能的。
本發(fā)明方法的一個預(yù)想不到的優(yōu)點(diǎn)是，反應(yīng)混合物的糖-干基物質(zhì)含量可以是很高的，它可以是30至50%，特別是40至50%。
雖然發(fā)明的酶催化的合成反應(yīng)是無菌進(jìn)行的，正如例如合成天然葡聚糖通常的作法一樣，為了避免不受歡迎的酶母生長，可以向反應(yīng)混合物添加抗核分裂物質(zhì)(Mytosehemmer，麥頭司阻止劑)，如硫酸，數(shù)量不超過1000毫克/公斤，特別是400至600毫克/公斤。
由反應(yīng)的混合物，通過分離不轉(zhuǎn)化的葡萄糖，放出的果糖和少于6葡糖酐-單位的異-麥芽-低聚糖，制取低平均分子量2000至4000的葡聚糖，可以按照原為已知的方法，例如通過用乙醇分級沉淀進(jìn)行。
通過用一充滿強(qiáng)酸性的陽離子交換劑酸的色譜分離副產(chǎn)品，已證明是很適宜的。
為了制取鐵-葡聚糖，然后將異-麥芽-低聚糖混合物的水的懸濁，與新沉淀的洗過的三價(jià)鐵的氫氧化物一起加熱直至373K，直到三價(jià)鐵的氫氧化物溶解于溶劑中。建議這種轉(zhuǎn)化，在有檸檬酸或堿性檸檬鹽存在情況下進(jìn)行，像由西德書1768912已知的一樣。
為了去掉陰離子或陽離子，這些離子在轉(zhuǎn)化以后還含在鐵葡聚糖的溶液中，這要經(jīng)受陽離子交換劑和陰離子交換劑處理。
例1向43克三氯化鐵-六水合物的250毫升的水溶液中，通過滴入28克蘇打溶液，溶于600ml水中，三價(jià)鐵的氫氧化物則沉淀出來。將此三價(jià)氫氧化鐵過濾分離出來，并用蒸餾水洗滌，將三價(jià)氫氧化鐵倒入一立升攪拌燒瓶中，并用15克通過色譜取得的低聚糖混合物，平均克分子物質(zhì)為3000克/克分子以及0.5克檸檬酸混合。
在加入9毫升的20%的NaOH-溶液以后，將該混合物在368-373K的條件下進(jìn)行攪拌，直到三價(jià)鐵的氫氧化物完全溶入溶液。
將生成的鐵葡聚糖的深紅色溶液，在室溫下進(jìn)行冷卻，并利用離子交換劑徹底脫鹽。
在無菌過濾以后，通過蒸發(fā)使溶液濃縮至一含量為10%鐵/毫升，并無菌裝入安瓿。以干物質(zhì)為基準(zhǔn)，鐵含量為29.5%。
取得的鐵葡聚糖溶液，按照英國獸醫(yī)的1965年法典，對有關(guān)的毒性進(jìn)行了檢驗(yàn)。
為此試驗(yàn)，使用了平均重量為20克的NMI-老鼠(飼養(yǎng)Winkelmann，溫克勒曼，Paderborn，柏得堡)。
試驗(yàn)用的劑量為0.25毫升/動物，在注射完后，試驗(yàn)物質(zhì)立即引起輕微的運(yùn)動失調(diào)，但這種失調(diào)在1小時(shí)以內(nèi)，又逐漸完全消失。對其余的以后觀察的一段時(shí)間，沒有再發(fā)現(xiàn)癥狀，也沒有出現(xiàn)死亡。
例2在16立升的酶，葡聚糖蔗糖酶的水溶液中，它有一活性為5400單位/立升，在298K溶解了7.3公斤結(jié)晶的葡萄糖。溶液的PH-值為5.4。向此溶液中連續(xù)用泵輸入2.6公斤/小時(shí)40%的PH-值為5.4的蔗糖溶液。48小時(shí)以后，停止添加蔗糖，并使酶在以后的2小時(shí)，通過加熱反應(yīng)混合物至70℃失去活性。
由反應(yīng)混合物的一個樣品，通過凝膠色譜將單糖化物組份和雙糖化物組份分開，并按照索毛克義-磷酸鹽-方法(糖類化學(xué)方法，卷1(1962)，384-386頁)，測定低聚糖餾份分子量的平均值Mn。它是Mn＝2540，這與一平均的聚合度為15.7葡萄糖酐單位相適應(yīng)。糖的干基物質(zhì)的果糖組份為45.0%，葡萄糖組份為3.6%。45立升這種糖化物溶液，加到一色譜分離裝置中，該裝置含有400立升強(qiáng)酸性的，載以鈉離子的陽離子交換劑樹脂，并通過加入43立升/小時(shí)蒸餾水，由柱子中洗提出各個糖化物。
在初餾物60立升以后，在接著以后的22立升以內(nèi)，由分離柱洗提出異-麥芽-低聚糖混合物，該混合物有一平均克分子質(zhì)量為3000克/克分子。
試驗(yàn)報(bào)告一胎產(chǎn)的仔豬，分成二個對比組，每4個小豬為一組。一個組在生下的第三天按照英國書1200902每只豬注射2毫升鐵葡聚糖，另一個小組每只豬注射2毫升本發(fā)明的鐵葡聚糖。在注射部位的細(xì)胞組織出現(xiàn)的變色，在一天以后，所有的那些用本發(fā)明的鐵葡聚糖注射的小豬，都消失了，相反對用商業(yè)上通用的鐵葡聚糖注射的小豬，這種變色還清楚可見。對這些小豬，細(xì)胞組織的變色，在打針后的第二天才消失。
這個結(jié)果證明，本發(fā)明的鐵葡聚糖的鐵比商業(yè)上通用的鐵葡聚糖的鐵較快的被構(gòu)成血液的組織所利用。
權(quán)利要求
1.制取水溶性的，具有鐵含量為27至33重量百分?jǐn)?shù)的和葡聚糖組份的平均克分子質(zhì)量為2000至4000的鐵萄聚糖的方法，其特征在于，向一水溶液中，該溶液，在每1000單位的α(1→6)-右旋-萄糖基轉(zhuǎn)移酶中，含有多于200毫克分子的右旋-葡萄糖，在265至310K和pH-值為4.5至8時(shí)，加入-蔗糖水溶液，其數(shù)量為蔗糖與萄葡糖的分子比為2.0至5.0，在蔗糖消耗以后，分離出萄葡糖，放出的果糖和不希望的低聚糖，這樣凈化的葡聚糖與新沉淀的三價(jià)鐵的氫氧化物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并且有時(shí)進(jìn)一步凈化。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其特征在于，此葡萄糖的水溶液，在每1000單位的酶中，含有400至600毫克分子的葡萄糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1或2之一的方法，其特征在于，反應(yīng)是在290至300K時(shí)進(jìn)行的。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1至3之一的方法，其特征在于，反應(yīng)混合物的pH-值為5至6.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1至4之一的方法，其特征在于，蔗糖比葡萄糖的分子比為3.0至4.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1至5之一的方法，其特征在于，連續(xù)地加入蔗糖溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1至6之一的方法，其特征在于，用這樣一種速度加入蔗糖溶液，使蔗糖直接被α(1→6)-右旋-葡糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化掉。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1至7之一的方法，其特征在于，反應(yīng)混合物的糖干基物質(zhì)含量為30%至50%，特別是40%至50%。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1至8之一的方法，其特征在于，使用了由細(xì)菌明串珠菌屬的中腸菌，特別是菌種B-512排出的葡聚糖蔗糖酶作為(1→6)-右旋-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1至8之一的方法，其特征在于，使用了由細(xì)菌明串珠菌屬的葡聚糖菌排出的葡聚糖蔗糖酶，作為α(1→6)-右旋-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求
1至10之一的方法，其特征在于，如此適量的連續(xù)替換右旋-葡萄糖，正如它作為受體消耗的一樣。
12.根據(jù)權(quán)利要求
1至11之一的方法，其特征在于，為了避免不希望的酵母生長，向反應(yīng)的混合物中，添加抗核分裂物質(zhì)(Mytose-hemmer，麥頭司阻止劑)。
13.根據(jù)權(quán)利要求
12的方法，其特征在于，加入了硫酸，其數(shù)量低于1000毫克/公斤，主要為400至600毫克/公斤。
14.根據(jù)權(quán)利要求
1至13之一的方法，其特征在于，由單糖、雙糖和低聚糖的混合物，通過逐級沉淀或色譜，分離出平均克分子質(zhì)量為2000至4000的葡聚糖。
15.根據(jù)權(quán)利要求
1至14之一的方法，其特征在于，將由異一麥牙-低聚糖混合物和沉淀的三價(jià)鐵的氫氧化物構(gòu)成的水懸濁液加熱不低于373K，直到三價(jià)鐵的氫氧化物溶于溶液中。
16.根據(jù)權(quán)利要求
15的方法，其特征在于在檸檬酸或堿性檸檬酸鹽存在情況下，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
17.根據(jù)權(quán)利要求
15或16的方法之一，其特征在于，轉(zhuǎn)化后得到的鐵葡聚糖的溶液，用陰離子交換劑和陽離子交換劑進(jìn)行處理。
專利摘要
制取水溶性的，具有鐵含量為27至33重量百分?jǐn)?shù)的和葡聚糖組份的平均克分子質(zhì)量為2000至4000的鐵葡聚糖的方法，其特征在于，向一水溶液中該水溶液，在每1000單位的α(1→6)-右旋-葡糖基轉(zhuǎn)移酶中，含有多于200毫克分子的右旋-萄葡糖，在265至310K和pH值為4.5至8時(shí)，加入一種蔗糖水溶液，其數(shù)量為蔗糖與葡萄糖的分子比為2.0至5.0，在蔗糖消耗以后，分離出葡萄糖，放出的果糖和不希望的低聚糖，這樣凈化的葡聚糖與新沉淀的三價(jià)鐵的氫氧化物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并且有時(shí)進(jìn)一步凈化。
文檔編號A61K31/28GK85104452SQ85104452
公開日1986年12月10日 申請日期1985年6月11日
發(fā)明者迪特爾·施文格斯 申請人:派弗·蘭根公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan