本申請根據(jù)35U.S.C.§119(e)要求于2014年5月23日提交的美國臨時申請?zhí)?2/002,603的權(quán)益，其內(nèi)容通過引用以其整體并入本文。

背景技術(shù)：

嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)為癌癥的過繼性T細(xì)胞免疫治療提供了有前景的方法。通常，CAR包含抗體的單鏈片段可變(single chain fragment variable，scFv)區(qū)或?qū)δ[瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigen，TAA)具有特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其通過鉸鏈和跨膜區(qū)與T細(xì)胞信號傳導(dǎo)分子的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域偶聯(lián)。最常見的淋巴細(xì)胞活化部分包括與T細(xì)胞效應(yīng)物功能觸發(fā)(例如CD3ζ)部分串聯(lián)的T細(xì)胞共刺激結(jié)構(gòu)域。CAR介導(dǎo)的過繼性免疫療法允許CAR-移植的T細(xì)胞以非HLA限制性方式直接識別靶腫瘤細(xì)胞上的TAA。

大多數(shù)患有B細(xì)胞惡性腫瘤(包括B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病(B cell acute lymphocytic leukemia，B-ALL)和慢性淋巴細(xì)胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL))的患者將由于其疾病而死亡。治療這些患者的一種方法是通過CAR的表達(dá)，對T細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾以靶向在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原。CAR是經(jīng)設(shè)計(jì)以人白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)非依賴性方式識別細(xì)胞表面抗原的抗原受體。嘗試使用表達(dá)CAR的遺傳修飾細(xì)胞來治療這些類型的患者已經(jīng)取得了有前景的成功。

在大多數(shù)癌癥中，腫瘤特異性抗原尚未明確限定，但在B細(xì)胞惡性腫瘤中，CD19是一種有吸引力的腫瘤靶標(biāo)。CD19的表達(dá)局限于正常和惡性B細(xì)胞(Uckun等，Blood，1988，71：13-29)，因此CD19是廣泛接受的用來安全測試CAR的靶標(biāo)。

附圖說明

當(dāng)結(jié)合附圖閱讀時，將更好地理解本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的以下詳細(xì)描述。為了說明本發(fā)明的目的，在附圖中示出了目前優(yōu)選的一些實(shí)施方案。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于附圖中所示實(shí)施方案的精確排列和手段。

圖1提供了CAR-4S慢病毒設(shè)計(jì)的示意圖。

圖2是示出CAR T細(xì)胞靶向GFP+/B-ALL細(xì)胞的一系列照片。頂行示出明視場圖像。底行示出GFP圖像。

圖3是描繪CAR T(CFSE)增殖測定的一系列圖。

圖4是示出靶向CD19+癌細(xì)胞的CAR T細(xì)胞的共聚焦顯微成像的一系列照片。箭頭指向CD19白血病細(xì)胞，所述細(xì)胞在0分鐘時是完整的，并在8分鐘時凋亡。與所述白血病細(xì)胞相鄰和在左側(cè)的細(xì)胞是抗CD19CAR T細(xì)胞。

圖5是示出CAR二聚化和凋亡的合成誘導(dǎo)物的圖。

圖6是示出CAR T凋亡的迅速誘導(dǎo)的圖。

圖7是示出Lenti-4S-CAR T細(xì)胞治療的圖。

圖8是示出慢病毒(lentiviral，LV)基因有效轉(zhuǎn)移到人T細(xì)胞中的FACS數(shù)據(jù)的一系列圖。

圖9是示出第5天LV CAR T細(xì)胞的FACS數(shù)據(jù)的一系列圖。

圖10是示出CAR-T輸注后血漿IgG的圖。

圖11是示出CAR-T輸注后血漿IgA/IgM的圖。

圖12是示出IL-6濃度、IFN-γ濃度、PBMC中的CAR拷貝數(shù)和BM中的CAR拷貝數(shù)的一系列圖。

圖13是用于病例研究2的治療方案的圖。

圖14是示出輸注后不同時間點(diǎn)的血清尿酸和肌酐水平的一系列圖。

圖15是示出輸注后不同時間點(diǎn)的血清IL-6和IFN-γ濃度的一系列圖。

圖16是示出輸注后不同時間點(diǎn)的Ig(IgG、IgA或IgM)水平的圖。

圖17是示出在CAR T細(xì)胞治療之前、細(xì)胞輸注后20天和細(xì)胞輸注后56天的臨床響應(yīng)的一系列照片。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明部分涉及用于治療癌癥的組合物和方法，所述癌癥包括但不限于血液型的癌癥。本發(fā)明涉及經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)嵌合抗原受體(CAR)的T細(xì)胞的過繼性細(xì)胞轉(zhuǎn)移的策略。CAR是這樣的分子，其將期望的抗原(例如腫瘤抗原)的基于抗體的特異性與T細(xì)胞受體活化細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組合以產(chǎn)生表現(xiàn)出特異性抗腫瘤細(xì)胞免疫活性的嵌合蛋白。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供其中CAR或其部分完全是人源的組合物，從而使宿主免疫應(yīng)答的風(fēng)險最小化。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明一般涉及經(jīng)遺傳修飾以穩(wěn)定表達(dá)所需CAR的T細(xì)胞的用途。表達(dá)CAR的T細(xì)胞在本文中稱為CAR T細(xì)胞或CAR修飾的T細(xì)胞。優(yōu)選地，可以對細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾以在其表面上穩(wěn)定表達(dá)抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而賦予MHC非依賴性的新抗原特異性。在一些情況下，T細(xì)胞經(jīng)遺傳修飾以穩(wěn)定表達(dá)將特定抗體的抗原識別結(jié)構(gòu)域與CD3-ζ鏈或FcR蛋白的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組合成單一嵌合蛋白質(zhì)的CAR。在一個具體實(shí)例中，CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)和CD3ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其中所述共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)包含CD28信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、CD137信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和CD27信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，以及自毀性(self-destructive)基因設(shè)計(jì)，例如誘導(dǎo)的胱天蛋白酶9(iCasp9)基因。在一個甚至更具體的實(shí)施方案中，CAR的元件的如下排列：

scFv-28-137-27-CD3z-2A-iCasp9

CD28元件可以但不一定包含上述CAR實(shí)施方案的至少一部分跨膜結(jié)構(gòu)域。CAR還可以包含幾個鉸鏈元件和/或間隔區(qū)序列(例如在單獨(dú)的結(jié)構(gòu)域元件之間)。

本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及并入了一系列新的結(jié)構(gòu)域的CAR，所述結(jié)構(gòu)域提供了不同功能方面，其協(xié)同地共同作用以提高功效。例如，在一些實(shí)施方案中，CAR包含抗原識別結(jié)構(gòu)域、刺激活性的抗原共信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、增加T細(xì)胞存活的存活結(jié)構(gòu)域、T細(xì)胞記憶結(jié)構(gòu)域和效應(yīng)物活化結(jié)構(gòu)域?；蛘?，CAR還可以包含誘導(dǎo)安全性的結(jié)構(gòu)域。圖1提供了實(shí)現(xiàn)這種多功能性的一系列結(jié)構(gòu)域的一個實(shí)例。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的CAR包含具有抗原識別結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和多功能胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的胞外結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，兩個CAR蛋白在體內(nèi)二聚化(例如形成同源或異源二聚體)。在一些實(shí)施方案中，CAR可以包含完全人抗體或抗體片段，例如scFv。在一個實(shí)施方案中，使用與CAR中的一個結(jié)構(gòu)域天然締合的跨膜結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，可以通過氨基酸替換來選擇或修飾跨膜結(jié)構(gòu)域，以避免這些結(jié)構(gòu)域與相同或不同表面膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域結(jié)合，以使得其與受體復(fù)合物的其他成員的相互作用最小化。在一些實(shí)施方案中，跨膜結(jié)構(gòu)域是CD8a跨膜結(jié)構(gòu)域。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的CAR T細(xì)胞可以通過將包含編碼靶向腫瘤抗原的所需CAR的核酸的慢病毒載體引入細(xì)胞中來產(chǎn)生。例如，慢病毒載體在細(xì)胞中包含編碼包含腫瘤抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如靶向CD19)、任選CD8a鉸鏈、跨膜結(jié)構(gòu)域以及CD28、CD137、CD27和CD3-ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域之CAR的核酸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的CAR T細(xì)胞能夠在體內(nèi)復(fù)制，從而導(dǎo)致長期持久性，其可以導(dǎo)致持續(xù)的腫瘤控制。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的CAR T細(xì)胞可以通過將編碼期望的CAR的RNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，CAR在經(jīng)遺傳修飾的CAR T細(xì)胞中瞬時表達(dá)。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含人抗體或其片段的CAR。本發(fā)明部分地基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即包含抗原識別結(jié)構(gòu)域的CAR特異性識別腫瘤抗原，所述抗原識別結(jié)構(gòu)域包含完全人抗體片段。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的人CAR可以用于治療癌癥和其他疾病，并避免誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的風(fēng)險。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及施用表達(dá)CAR的經(jīng)遺傳修飾的T細(xì)胞，以使用淋巴細(xì)胞輸注治療患有癌癥或有患癌風(fēng)險的患者。優(yōu)選地，在治療中使用自體淋巴細(xì)胞輸注。從需要治療的患者收集自體PBMC，并使用本文所述和本領(lǐng)域已知的方法活化和擴(kuò)增T細(xì)胞，然后再輸注回患者。

本發(fā)明可以包括使用表達(dá)CAR的T細(xì)胞，所述CAR包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)和CD3ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其中所述共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)包含CD28信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、CD137信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和CD27信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的CAR T細(xì)胞可以經(jīng)歷穩(wěn)健的體內(nèi)T細(xì)胞擴(kuò)增，并且可以建立在血液和骨髓中以高水平持續(xù)延長量時間的特異性記憶細(xì)胞。在一些情況下，輸注到患者體內(nèi)的本發(fā)明CAR T細(xì)胞可以在癌癥患者中體內(nèi)消除癌細(xì)胞。

定義

除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。盡管與本文所述相似或等同的任何方法和材料可用于本發(fā)明的測試的實(shí)踐中，但是在本文中描述了優(yōu)選的材料和方法。在描述和要求保護(hù)本發(fā)明時，將使用以下術(shù)語。

還應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的術(shù)語僅用于描述特定實(shí)施方案的目的，而不意在限制。

本文中無量詞修飾的名詞表示一個/種或多于一個/種(即至少一個/種)。例如，“一個/種要素”是指一個/種要素或多于一個/種要素。

當(dāng)涉及可測量值例如量、持續(xù)時間等時，本文所使用的“約”意指包括特定值+20％或+10％，更優(yōu)選+5％，甚至更優(yōu)選+1％，且仍更優(yōu)選+0.1％的變化，因?yàn)檫@些變化適于執(zhí)行所公開的方法。

如本文所用，術(shù)語“FRa結(jié)合結(jié)構(gòu)域”可以指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何FRa特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個實(shí)例中，F(xiàn)Ra結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含單鏈可變片段(scFv)，其包含特異性結(jié)合FRa的抗體的重鏈(V_H)和輕鏈(V_L)的可變區(qū)?？笷Ra抗體、抗體片段及其變體是本領(lǐng)域公知的，并且充分描述于美國專利公開U.S 20100055034；U.S.20090324594；U.S.20090274697；U.S.20080260812；U.S.20060239910；U.S.20050232919；U.S.20040235108中，其均通過引用以其整體并入本文。在一個實(shí)施方案中，F(xiàn)Ra結(jié)合結(jié)構(gòu)域是抗FRa抗體的同源物、變體、異構(gòu)體或功能片段。每種可能性代表本發(fā)明的單獨(dú)實(shí)施方案。

在一些實(shí)施方案中，“蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域”或“結(jié)構(gòu)域”是指可以通過以下方法鑒定的不同球形單元：結(jié)構(gòu)測定方法如X射線晶體學(xué)或NMR；其他生物物理方法，例如掃描量熱法(根據(jù)該方法蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域作為獨(dú)特單元溶解(參見例如Pabo等，Proc Natl Acad Sci U S A.(1979)76(4)：1608-12))；或者與已經(jīng)測定其結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的序列相似性。SCOP數(shù)據(jù)庫(Murzin等，J Mol Biol.(1995)247(4)：536-40)提供了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的鑒定，以使得可以通過序列比較鑒定新蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域組織。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域可以包含足以驅(qū)動這種多肽折疊成離散結(jié)構(gòu)的氨基酸序列，其中沿著多肽主鏈的基本上所有可旋轉(zhuǎn)鍵均被約束在約10度內(nèi)。

本文所用的“活化”是指已經(jīng)被充分刺激以誘導(dǎo)可檢測細(xì)胞增殖的T細(xì)胞的狀態(tài)?；罨部梢耘c誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生和可檢測的效應(yīng)物功能相關(guān)。術(shù)語“活化的T細(xì)胞”尤其指正在進(jìn)行細(xì)胞分裂的T細(xì)胞。

本文所用的術(shù)語“抗體”是指與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白分子?？贵w可以是源自天然來源或來自重組來源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反應(yīng)性部分?？贵w通常是免疫球蛋白分子的四聚體。本發(fā)明中的抗體可以以多種形式存在，包括例如多克隆抗體、單克隆抗體、Fv、Fab和F(ab)₂，以及單鏈抗體、人抗體和人源化抗體(Harlow等，1999于：Using Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY；Harlow等，1989于：Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York；Houston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；Bird等，1988，Science 242：423-426)。

術(shù)語“抗體片段”是指完整抗體的一部分，并且指完整抗體的抗原決定可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)₂和Fv片段、線性抗體、單鏈抗體(例如scFv抗體)和由抗體片段形成的多特異性抗體。

本文所用的“抗體重鏈”是指以其天然存在的構(gòu)象存在于所有抗體分子中的兩種類型多肽鏈中較大的那種。

如本文所用的“抗體輕鏈”是指以其天然存在的構(gòu)象存在于所有抗體分子中的兩種類型多肽鏈中較小的那種，κ和λ輕鏈?zhǔn)侵竷煞N主要的抗體輕鏈同種型。

本文所用的術(shù)語“合成抗體”是指使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的抗體，例如本文所述的由噬菌體表達(dá)的抗體。該術(shù)語也應(yīng)解釋為意指通過合成編碼抗體的DNA分子產(chǎn)生的抗體，該DNA分子表達(dá)抗體蛋白或指定該抗體的氨基酸序列，其中使用本領(lǐng)域可得且公知的合成DNA或氨基酸序列技術(shù)獲得了該DNA或氨基酸序列。

本文使用的術(shù)語“抗原”或“Ag”定義為引發(fā)免疫應(yīng)答的分子。這種免疫應(yīng)答可涉及抗體產(chǎn)生，或特異性免疫活性細(xì)胞的活化，或兩者。技術(shù)人員將理解，任何大分子(包括實(shí)際上所有的蛋白質(zhì)或肽)均可以充當(dāng)抗原。此外，抗原可以來自重組或基因組DNA。因此，技術(shù)人員將理解，包含編碼引發(fā)免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)之核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA均編碼如本文所使用的術(shù)語“抗原”。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，抗原不需要僅由基因的全長核苷酸序列編碼。顯然，本發(fā)明包括但不限于使用多于一個基因的部分核苷酸序列，并且這些核苷酸序列以多種組合排列以引發(fā)所需的免疫應(yīng)答。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，抗原完全不需要由“基因”編碼。顯然，抗原可以合成產(chǎn)生或者可以來自生物樣品。這樣的生物樣品可以包括但不限于組織樣品、腫瘤樣品、細(xì)胞或生物流體。

本文所用的術(shù)語“腫瘤抗原”是指與癌細(xì)胞相關(guān)的抗原。腫瘤抗原的實(shí)例包括但不限于CD19、CD20、CD22、ROR1、間皮素(mesothelin)、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F(xiàn)77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR和MAGE A3 TCR。

本文所用的術(shù)語“抗腫瘤效應(yīng)”是指這樣的生物學(xué)效應(yīng)，其可以表現(xiàn)為腫瘤體積的減少、腫瘤細(xì)胞數(shù)目的降低、轉(zhuǎn)移數(shù)目的減低、壽命期望的增加或改善與癌性病癥相關(guān)的多種生理癥狀?！翱鼓[瘤效應(yīng)”也可以表現(xiàn)為本發(fā)明的肽、多核苷酸、細(xì)胞和抗體首先預(yù)防腫瘤發(fā)生的能力。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“自身抗原”意指被免疫系統(tǒng)錯誤地識別為外來物的任何自體抗原。自身抗原包括但不限于細(xì)胞蛋白質(zhì)、磷蛋白、細(xì)胞表面蛋白質(zhì)、細(xì)胞脂質(zhì)、核酸、糖蛋白(包括細(xì)胞表面受體)。

本文使用的術(shù)語“自身免疫病”定義為由自身免疫應(yīng)答引起的病癥。自身免疫病是對自體抗原的不適當(dāng)和過度響應(yīng)的結(jié)果。自身免疫病的實(shí)例包括但不限于，艾迪生病、斑禿、強(qiáng)直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克羅恩病、糖尿病(I型)、營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解、附睪炎、腎小球性腎炎、格雷夫斯病、吉蘭-巴雷綜合征、橋本病、溶血性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、尋常性天皰瘡、銀屑病、風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病、舍格倫綜合征、脊柱關(guān)節(jié)病、甲狀腺炎、脈管炎(vasculitis)、白癜風(fēng)、粘液水腫、惡性貧血、潰瘍性結(jié)腸炎等。

如本文所使用的術(shù)語“自體的”意指來自相同個體的任何材料，其隨后被重新引入所述個體中。

“同種異體”是指來自相同物種的不同動物的移植物?！爱惙N”是指來自不同物種的動物的移植物。

本文使用的術(shù)語“癌癥”定義為特征在于異常細(xì)胞的快速和不受控制生長的疾病。癌細(xì)胞可以局部擴(kuò)散或通過血流和淋巴系統(tǒng)擴(kuò)散到身體的其他部分。多種癌癥的實(shí)例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。在一個具體實(shí)施方案中，癌癥是指B細(xì)胞相關(guān)的惡性腫瘤。

本文使用的術(shù)語“共刺激配體”包括抗原呈遞細(xì)胞(例如aAPC、樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞等)上的分子，其特異性結(jié)合T細(xì)胞上的同源共刺激分子，從而除了由例如TCR/CD3復(fù)合物與負(fù)載有肽的MHC分子之結(jié)合提供的初級信號之外，提供介導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的信號，包括但不限于增殖、活化、分化等。共刺激配體可包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導(dǎo)型共刺激配體(inducible costimulatory ligand，ICOS-L)、細(xì)胞間粘附分子(intercellular adhesion molecule，ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受體、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、結(jié)合Toll配體受體的激動劑或抗體和特異性結(jié)合B7-H3的配體。共刺激配體還尤其包括特異性結(jié)合存在于T細(xì)胞上的共刺激分子的抗體，所述共刺激分子例如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、和特異性結(jié)合CD83的配體。

“共刺激分子”是指T細(xì)胞上的同源結(jié)合伴侶，其與共刺激配體特異性結(jié)合，從而介導(dǎo)T細(xì)胞的共刺激響應(yīng)，例如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I類分子、BTLA和Toll配體受體。本文所用的“共刺激信號”是指與初級信號(primary signal)(例如TCR/CD3連接)組合導(dǎo)致T細(xì)胞增殖和/或關(guān)鍵分子的上調(diào)或下調(diào)的信號。

“疾病”是動物的一種健康狀態(tài)，其中動物不能維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，并且其中如果疾病不被改善，則動物的健康繼續(xù)惡化。相反，動物中的“病癥”是這樣的健康狀態(tài)，其中動物能夠維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，但是其中動物的健康狀態(tài)比不存在該病癥時的狀態(tài)更差。未經(jīng)治療，病癥不一定引起動物健康狀態(tài)的進(jìn)一步降低。

本文所用的“有效量”意指提供治療或預(yù)防益處的量。

“編碼”指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列的固有性質(zhì)，其充當(dāng)在生物學(xué)過程中合成具有確定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或確定的氨基酸序列和由其產(chǎn)生的生物學(xué)性質(zhì)的其他聚合物和大分子的模板。因此，如果對應(yīng)于基因的mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯在細(xì)胞或其他生物系統(tǒng)中產(chǎn)生蛋白質(zhì)，則該基因編碼蛋白質(zhì)。編碼鏈(其核苷酸序列與mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非編碼鏈(用作基因或cDNA轉(zhuǎn)錄的模板)都可被認(rèn)為編碼該基因或cDNA的蛋白質(zhì)或其他產(chǎn)物。

如本文所用，“內(nèi)源”是指來自生物體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)內(nèi)部或在其中產(chǎn)生的任何材料。

如本文所用，術(shù)語“外源”是指從生物體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)外部引入或產(chǎn)生的任何材料。

本文使用的術(shù)語“表達(dá)”定義為由其啟動子驅(qū)動的特定核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。

“表達(dá)載體”是指包含重組多核苷酸的載體，所述重組多核苷酸包含與待表達(dá)的核苷酸序列有效連接的表達(dá)控制序列。表達(dá)載體包含足夠的用于表達(dá)的順式作用元件；其他用于表達(dá)的元件可以由宿主細(xì)胞或在體外表達(dá)系統(tǒng)中提供。表達(dá)載體包括本領(lǐng)域已知的所有那些，例如并入了重組多核苷酸的黏粒、質(zhì)粒(例如，裸露的或包含在脂質(zhì)體中)和病毒(例如慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)。

“同源”是指兩個多肽之間或兩個核酸分子之間的序列相似性或序列同一性。當(dāng)兩個比較的序列中的位置均被相同的堿基或氨基酸單體亞基占據(jù)時，例如，如果兩個DNA分子各自中的位置均被腺嘌呤占據(jù)，則分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分比是兩個序列共有的匹配或同源位置的數(shù)目除以所比較的位置數(shù)目×100的函數(shù)。例如，如果兩個序列中10個位置中有6個匹配或同源，則這兩個序列是60％同源的。例如，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。一般地，兩個序列比對時進(jìn)行比較以給出最大同源性。

本文使用的術(shù)語“免疫球蛋白”或“Ig”定義為一類蛋白質(zhì)，其作為抗體起作用。由B細(xì)胞表達(dá)的抗體有時被稱為BCR(B cell receptor，B細(xì)胞受體)或抗原受體。包括在這類蛋白質(zhì)中的五個成員是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于身體分泌物中的第一抗體，所述身體分泌物例如唾液、淚、母乳、胃腸分泌物以及呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物。IgG是最常見的循環(huán)抗體。IgM是在大多數(shù)對象中在初次免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的主要免疫球蛋白。它是在凝集、補(bǔ)體結(jié)合(complement fixation)和其他抗體應(yīng)答中最有效的免疫球蛋白，并且在防御細(xì)菌和病毒中是重要的。IgD是不具有已知抗體功能的免疫球蛋白，但可以充當(dāng)抗原受體。IgE是在暴露于變應(yīng)原時通過引起介體從肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞中釋放從而介導(dǎo)速發(fā)型超敏反應(yīng)的免疫球蛋白。

如本文所用，“說明材料”包括可用于傳達(dá)本發(fā)明組合物和方法的有用性的出版物、記錄、圖表或任何其他表達(dá)介質(zhì)。本發(fā)明試劑盒的說明材料可以例如附加到含有本發(fā)明核酸、肽和/或組合物的容器，或者與含有核酸、肽和/或組合物的容器一起運(yùn)輸?；蛘?，該說明材料可以與容器分開運(yùn)輸，目的是說明材料和化合物由接受者合作使用。

“分離的”意指從天然狀態(tài)改變或移出。例如，天然存在于活動物中的核酸或肽不是“分離的”，但是與其天然狀態(tài)的共存材料部分分開或完全分開的相同核酸或肽是“分離的”。分離的核酸或蛋白質(zhì)可以以基本上純化的形式存在，或可以存在于非天然環(huán)境例如宿主細(xì)胞中。

在本發(fā)明的上下文中，使用了以下通常出現(xiàn)的核酸堿基的縮寫。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鳥苷，“T”是指胸苷，而“U”是指尿苷。

除非另有說明，否則“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此是簡并形式并且編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短語核苷酸序列(其編碼蛋白質(zhì)或RNA)還可包括內(nèi)含子，其程度為編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列在一些形式中可含有內(nèi)含子。

本文所使用的“慢病毒”是指逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae family)的屬。

慢病毒在逆轉(zhuǎn)錄病毒中是獨(dú)特的，其能夠感染非分裂細(xì)胞；它們可以將顯著量的遺傳信息遞送到宿主細(xì)胞的DNA中，因此它們是基因遞送載體的一種最有效方法。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的實(shí)例。來自慢病毒的載體提供了在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)顯著水平基因轉(zhuǎn)移的手段。

本文所用的術(shù)語“調(diào)節(jié)”意指與不存在處理或化合物的對象中的應(yīng)答水平相比，和/或與在其他方面相同但未經(jīng)處理的對象中的應(yīng)答水平相比，介導(dǎo)了對象中可檢測的應(yīng)答水平的提高或降低。該術(shù)語包括干擾和/或影響天然信號或應(yīng)答，從而在對象(優(yōu)選人)中介導(dǎo)有益的治療響應(yīng)。

“密碼子優(yōu)化的”意指針對目的基因的翻譯效率，將與特定氨基酸相關(guān)的密碼子進(jìn)行優(yōu)化。密碼子優(yōu)化通常涉及評估目的基因或序列，并以用于特定細(xì)胞或物種中相同氨基酸的更普遍或共同的密碼子取代該密碼子。本領(lǐng)域技術(shù)人員用于評價密碼子優(yōu)化的程序包括由Integrated DNA Technologies、EnCor Biotechnology，Inc.、JCat、OptimumGene TM(GenScript USA，Inc.，Pisataway，NJ 08854)等提供的那些。編碼本文所述CAR實(shí)施方案的序列可以是密碼子優(yōu)化的，這可以提高它們的翻譯效率。

除非另有具體說明，否則“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此是簡并形式并且編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質(zhì)和RNA的核苷酸序列可以包括內(nèi)含子。

術(shù)語“有效連接”是指調(diào)節(jié)序列與異源核酸序列之間的功能性連接，這導(dǎo)致后者的表達(dá)。例如，當(dāng)?shù)谝缓怂嵝蛄信c第二核酸序列處于功能關(guān)系時，所述第一核酸序列與所述第二核酸序列有效連接。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，則該啟動子與編碼序列有效連接。通常，有效連接的DNA序列是連續(xù)的，并且在必要時在相同的閱讀框中連接兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)。

術(shù)語“過表達(dá)的”腫瘤抗原或腫瘤抗原的“過表達(dá)”意在表示來自疾病區(qū)域(如患者的特定組織或器官內(nèi)的實(shí)體瘤)的細(xì)胞中腫瘤抗原相對于來自該組織或器官的正常細(xì)胞中的表達(dá)水平的異常水平?；加幸阅[瘤抗原的過表達(dá)為特征的實(shí)體瘤或血液惡性腫瘤的患者可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測定來確定。

免疫原性組合物的“腸胃外”施用包括例如，皮下(s.c)、靜脈內(nèi)(i.v.)、肌內(nèi)(i.m.)或胸骨內(nèi)注射或輸注技術(shù)。

術(shù)語“患者”、“對象”、“個體”等在本文中可互換使用，并且指可適用于本文所述方法的任何動物或其細(xì)胞，無論是體外還是原位。在某些非限制性實(shí)施方案中，患者、對象或個體是人。

本文使用的術(shù)語“多核苷酸”定義為核苷酸鏈。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，本文所用的核酸和多核苷酸是可互換的。本領(lǐng)域技術(shù)人員具有這樣的一般知識，即核酸是多核苷酸，其可以水解成單體“核苷酸”。單體核苷酸可以水解成核苷。如本文所用，多核苷酸包括但不限于通過本領(lǐng)域可用的任何手段獲得的所有核酸序列，所述手段包括但不限于重組手段，即使用普通克隆技術(shù)和PCR^TM等，以及通過合成手段從重組文庫或細(xì)胞基因組克隆核酸序列。

如本文所使用，術(shù)語“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用，并且是指由通過肽鍵共價連接的氨基酸殘基構(gòu)成的化合物。蛋白質(zhì)或肽必須含有至少兩個氨基酸，并且可以包含蛋白質(zhì)或肽序列的氨基酸的最大數(shù)目沒有限制。多肽包括包含通過肽鍵彼此連接的兩個或更多個氨基酸的任何肽或蛋白質(zhì)。如本文所用，該術(shù)語是指短鏈(其在本領(lǐng)域中通常也稱為例如肽、寡肽和寡聚體)，以及較長鏈(其在本領(lǐng)域中通常稱為蛋白質(zhì))兩者，其中有很多類型?！岸嚯摹卑ɡ缟锘钚云?、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚體、異源二聚體、多肽變體、經(jīng)修飾的多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重組肽、合成肽、或其組合。

本文所用的術(shù)語“啟動子”定義為起始多核苷酸序列特異性轉(zhuǎn)錄所需的由細(xì)胞合成機(jī)器或引入的合成機(jī)器識別的DNA序列。

如本文所用的術(shù)語“啟動子/調(diào)節(jié)序列”意指表達(dá)與啟動子/調(diào)節(jié)序列有效連接的基因產(chǎn)物所需的核酸序列。在一些情況下，該序列可以是核心啟動子序列，而在另一些情況下，該序列還可以包含增強(qiáng)子序列和表達(dá)基因產(chǎn)物所需的其他調(diào)節(jié)元件。啟動子/調(diào)節(jié)序列可以是例如以組織特異性方式表達(dá)基因產(chǎn)物的啟動子/調(diào)節(jié)序列?！敖M成型”啟動子是這樣的核苷酸序列，當(dāng)其與編碼或指定基因產(chǎn)物的多核苷酸有效連接時，使得基因產(chǎn)物在細(xì)胞的大多數(shù)或所有生理?xiàng)l件下在細(xì)胞中產(chǎn)生。

“誘導(dǎo)型”啟動子是這樣的核苷酸序列，當(dāng)其與編碼或指定基因產(chǎn)物的多核苷酸有效連接時，基本上僅當(dāng)對應(yīng)于啟動子的誘導(dǎo)物存在于細(xì)胞中時才在細(xì)胞中產(chǎn)生基因產(chǎn)物。

“組織特異性”啟動子是這樣的核苷酸序列，當(dāng)其與編碼基因或由基因指定的多核苷酸有效連接時，基本上只有該細(xì)胞是對應(yīng)于該啟動子的組織類型的細(xì)胞時，才在細(xì)胞中產(chǎn)生基因產(chǎn)物。

如本文所用，關(guān)于抗體的術(shù)語“特異性結(jié)合”意指識別特異性抗原但基本上不識別或結(jié)合樣品中的其他分子的抗體。例如，特異性結(jié)合來自一個物種的抗原的抗體也可以結(jié)合來自一個或更多個物種的該抗原。但是，這種種間交叉反應(yīng)性本身不改變抗體根據(jù)特異性的分類。在另一個實(shí)例中，特異性結(jié)合抗原的抗體也可以結(jié)合該抗原的不同等位基因形式。然而，這種交叉反應(yīng)性本身不改變抗體根據(jù)特異性的分類。在一些情況下，術(shù)語“特異性結(jié)合”或“特異性地結(jié)合”可用于指抗體、蛋白質(zhì)或肽與第二化學(xué)物質(zhì)的相互作用，意味著該相互作用取決于化學(xué)物質(zhì)上特定結(jié)構(gòu)(例如，抗原決定簇或表位)的存在；例如，抗體一般識別并結(jié)合特定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，而不是蛋白質(zhì)。如果抗體對表位“A”具有特異性，則在含有經(jīng)標(biāo)記的“A”和抗體的反應(yīng)中，含有表位A的分子(或游離的，未標(biāo)記的A)的存在將減少結(jié)合于抗體的標(biāo)記的A的量。

術(shù)語“刺激”意指通過刺激性分子(例如，TCR/CD3復(fù)合物)與其同源配體結(jié)合從而介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件(例如但不限于經(jīng)由TCR/CD3復(fù)合物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo))而誘導(dǎo)的初級應(yīng)答。刺激可介導(dǎo)某些分子表達(dá)的改變，例如TGF-β的下調(diào)，和/或細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的再組織等。

本文所用的術(shù)語“刺激性分子”意指與存在于抗原呈遞細(xì)胞上的同源刺激性配體特異性結(jié)合的T細(xì)胞上的分子。

本文所用的“刺激性配體”意指這樣的配體，當(dāng)其存在于抗原呈遞細(xì)胞(例如aAPC、樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞等)上時，可與T細(xì)胞上的同源結(jié)合伴侶(在本文中稱為“刺激性分子”)特異性結(jié)合，從而介導(dǎo)T細(xì)胞的初級應(yīng)答，包括但不限于活化、免疫應(yīng)答的起始、增殖等。刺激性配體是本領(lǐng)域公知的，并且尤其包括負(fù)載有肽的MHC I類分子、抗CD3抗體、超級激動劑(superagonist)抗CD28抗體和超級激動劑抗CD2抗體。

術(shù)語“對象”旨在包括其中可引起免疫應(yīng)答的活生物體(例如哺乳動物)。對象的實(shí)例包括人、狗、貓、小鼠、大鼠、及其轉(zhuǎn)基因種。

如本文所用，“基本上純化的”細(xì)胞是基本上不含其他細(xì)胞類型的細(xì)胞?；旧霞兓募?xì)胞還指已經(jīng)與其他細(xì)胞類型分離的細(xì)胞，其中該細(xì)胞通常以其天然存在狀態(tài)與其他細(xì)胞類型締合。在一些情況下，基本上純化的細(xì)胞群是指同源的細(xì)胞群。在另一些情況下，該術(shù)語簡單地指已經(jīng)與在天然狀態(tài)下天然地與其締合的細(xì)胞相分離的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞在體外培養(yǎng)。在另一些實(shí)施方案中，細(xì)胞不在體外培養(yǎng)。

本文所用的術(shù)語“治療的”意指治療和/或預(yù)防。通過抑制、緩解或根除疾病狀態(tài)獲得治療效果。

術(shù)語“治療有效量”是指將引起研究者、獸醫(yī)、醫(yī)生或其他臨床醫(yī)生所尋求的組織、系統(tǒng)或?qū)ο蟮纳锘蜥t(yī)學(xué)響應(yīng)之目標(biāo)化合物的量。術(shù)語“治療有效量”包括當(dāng)施用時足以防止所治療的病癥或疾病之一種或更多種病征或癥狀發(fā)展或在一定程度上將其減輕的化合物的量。治療有效量將根據(jù)化合物、疾病及其嚴(yán)重程度和待治療對象的年齡、體重等而變化。

如本文使用的術(shù)語，“治療”疾病意指降低對象所經(jīng)歷的疾病或病癥的至少一種病征或癥狀的頻率或嚴(yán)重程度。

如本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)染的”或“轉(zhuǎn)化的”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)的”是指將外源核酸轉(zhuǎn)移或引入宿主細(xì)胞的過程?！稗D(zhuǎn)染的”或“轉(zhuǎn)化的”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)的”細(xì)胞是已經(jīng)用外源核酸轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。所述細(xì)胞包括原代對象細(xì)胞及其后代。

如本文所用的短語“在轉(zhuǎn)錄控制下”或“有效連接”意指啟動子相對于多核苷酸處于正確的位置和取向，以控制通過RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄起始和多核苷酸的表達(dá)。

“載體”是包含分離的核酸并且可以用于將分離的核酸遞送至細(xì)胞內(nèi)部的物質(zhì)組合物。許多載體是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于線性多核苷酸、與離子或兩親化合物相關(guān)的多核苷酸、質(zhì)粒和病毒。因此，術(shù)語“載體”包括自主復(fù)制的質(zhì)?；虿《?。該術(shù)語還應(yīng)被解釋為包括促進(jìn)核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的非質(zhì)粒和非病毒化合物，例如聚賴氨酸化合物、脂質(zhì)體等。病毒載體的實(shí)例包括但不限于腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等。

范圍：貫穿本公開內(nèi)容，本發(fā)明的多個方面可以以范圍格式呈現(xiàn)。應(yīng)當(dāng)理解，范圍格式的描述僅僅是為了方便和簡潔，并且不應(yīng)被解釋為對本發(fā)明范圍的不靈活的限制。因此，范圍的描述應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為已經(jīng)具體公開了所有可能的子范圍以及該范圍內(nèi)的單獨(dú)數(shù)值。例如，諸如1至6的范圍描述應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為已經(jīng)具體公開了子范圍，例如從1至3、從1至4、從1至5、從2至4、從2至6、從3至6等，以及該范圍內(nèi)的單獨(dú)數(shù)字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。無論范圍的寬度如何均適用。

描述

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療尤其是癌癥的疾病的組合物和方法。所述癌癥可以是血液惡性腫瘤、實(shí)體瘤、原發(fā)或轉(zhuǎn)移性腫瘤?；蛘?，本公開內(nèi)容的一些實(shí)施方案可用于治療其他疾病，包括感染性疾病。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了經(jīng)工程改造以表達(dá)CAR的細(xì)胞(例如，T細(xì)胞)，其中CAR T細(xì)胞表現(xiàn)出抗腫瘤性質(zhì)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，CAR是全人CAR。本發(fā)明的CAR可以經(jīng)工程改造以包含胞外結(jié)構(gòu)域，其具有與T細(xì)胞抗原受體復(fù)合物ζ鏈(例如CD3ζ)的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域融合的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)在T細(xì)胞中表達(dá)時，本發(fā)明的CAR能夠基于抗原結(jié)合特異性重定向抗原識別。一種示例性抗原是CD19，因?yàn)檫@種抗原在惡性B細(xì)胞上表達(dá)。然而，本發(fā)明不限于靶向CD19。相反，本發(fā)明包括任何抗原結(jié)合部分，當(dāng)所述抗原結(jié)合部分與其同源抗原結(jié)合時，影響腫瘤細(xì)胞以使得腫瘤細(xì)胞不能生長，促使其死亡，或受到影響以使得患者的腫瘤負(fù)荷減少或消除。在一些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分與來自多個共刺激分子的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和ζ鏈融合。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的CAR包含以下排列：

scFv-28-137-27-CD3z-2A-iCasp9。

在一些實(shí)施方案中，上述示例性的，非限制性排列從左到右是CAR的N末端到C末端。CAR可以包含或另外包含如本文所述的元件的任意其他組合。

組合物

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含胞外和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體(CAR)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的CAR完全是人的。在一些實(shí)施方案中，胞外結(jié)構(gòu)域包含靶特異性結(jié)合元件，其另外稱為抗原結(jié)合部分。細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域或其他胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)和ζ鏈部分。共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)是指包含共刺激分子的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的一部分CAR。共刺激分子是除抗原受體或其配體之外的細(xì)胞表面分子，其是淋巴細(xì)胞對抗原有效應(yīng)答所需的。

應(yīng)當(dāng)理解的是，CAR可以包含具有本文所提供之序列或其變體的區(qū)域(例如，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、安全結(jié)構(gòu)域和/或接頭，或其任意組合)，或其任一個的片段(例如，保留CAR活性所需的功能的變體和/或片段)可以包含在如本文所述的CAR蛋白中。在一些實(shí)施方案中，變體相對于所示序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸改變。在一些實(shí)施方案中，變體具有與所示序列至少80％、至少85％、至少90％、90％至95％、至少95％或至少99％相同的序列。在一些實(shí)施方案中，片段比本文提供的序列短1至5個、5至10個、10至20個、20至30個、30至40個或40至50個氨基酸。在一些實(shí)施方案中，片段在所提供序列的N末端、C末端或兩個末端區(qū)域處更短。在一些實(shí)施方案中，片段含有本文提供的序列中氨基酸數(shù)目的80％至85％、85％至90％、90％至95％或95％至99％。

在CAR的胞外結(jié)構(gòu)域與跨膜結(jié)構(gòu)域之間，或在CAR的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域與跨膜結(jié)構(gòu)域之間，可以并入間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域。如本文所使用，術(shù)語“間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域”一般意指起作用將跨膜結(jié)構(gòu)域與多肽鏈中的胞外結(jié)構(gòu)域或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域連接的任何寡肽或多肽。間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域可以包含多至300個氨基酸，優(yōu)選10至100個氨基酸，且最優(yōu)選25至50個氨基酸。

在一些實(shí)施方案中，CAR的間隔區(qū)和/或鉸鏈序列選自一個或更多個以下間隔區(qū)序列或鉸鏈序列：

間隔區(qū)序列：

GGGGS(SEQ ID NO：1)

GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：2)

GGGGS x3(SEQ ID NO：3)

GS18：GSTSGGGSGGGSGGGGSS(SEQ ID NO：4)

218S：GSTSGSGKPGSSEGSTKG(SEQ ID NO：5)

GS8：GGGGSGGG(SEQ ID NO：6)

鉸鏈序列：

天然：VEPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：7)

C233S：LDPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：8)

C233P：VEPKSPDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：9)

σ5：LDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：10)

抗原結(jié)合部分

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的CAR包含靶特異性結(jié)合元件，其另外稱為抗原結(jié)合部分或抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。部分的選擇取決于限定了靶細(xì)胞表面的配體類型和數(shù)量。例如，可以選擇抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域以識別作為與特定疾病狀態(tài)相關(guān)的靶細(xì)胞上的細(xì)胞表面標(biāo)志物起作用的配體。因此，可以作為本發(fā)明CAR中抗原部分結(jié)構(gòu)域的配體起作用的細(xì)胞表面標(biāo)志物的實(shí)例包括與病毒、細(xì)菌和寄生蟲感染，自身免疫病以及癌細(xì)胞相關(guān)的那些。在一些實(shí)施方案中，可以通過工程改造特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞上抗原的所需抗原結(jié)合部分，將本發(fā)明的CAR工程改造為靶向目的腫瘤抗原。在本發(fā)明的上下文中，“腫瘤抗原”或“過度增殖性疾病抗原”或“與過度增殖性疾病相關(guān)的抗原”是指特定過度增殖性疾病(例如癌癥)所共有的抗原。本文討論的抗原僅作為實(shí)例包括其中。該列表不旨在為排他性的，并且其他實(shí)例對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的。

CAR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可靶向例如CD19、CD20、CD22、ROR1、間皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、CD37 PSMA、糖脂F(xiàn)77、HER2、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR和MAGE A3 TCR?；蛘?，CAR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域部分靶向的抗原包括但不限于FRα、CD24、CD44、CD133、CD166、epCAM、CA-125、HE4、Oval、雌激素受體、孕酮受體、HER-2/neu、uPA、PAI-1等?？梢杂肞CT公開WO2013/123061(第20頁)中的教導(dǎo)靶向?qū)Π┌Y具有特異性的其他抗原。

抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是結(jié)合抗原的任何結(jié)構(gòu)域，包括但不限于單克隆抗體、單鏈抗體(例如scFv)、多克隆抗體、合成抗體、人抗體、人源化抗體、及其片段。在一些情況下，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域來自CAR將最終用于其中的相同物種是有益的。例如，對于在人中使用，CAR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含人抗體或其片段可能是有益的。因此，在一個實(shí)施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域部分包含人抗體或其片段。

對于人中抗體的體內(nèi)使用，可優(yōu)選使用人抗體。完全人抗體對于人類對象的治療性處理是特別理想的。人抗體可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法制備，包括使用來自人免疫球蛋白序列的抗體文庫的噬菌體展示方法，包括對這些技術(shù)的改進(jìn)。也參見美國專利號4,444,887和4,716,111；以及PCT公開WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096，WO 96/33735和WO 91/10741；其各自均通過引用以其整體并入本文。人抗體也可以是其中重鏈和輕鏈由來自一個或更多個人DNA來源的核苷酸序列編碼的抗體。還可以使用不能表達(dá)功能性內(nèi)源免疫球蛋白但可表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生人抗體。例如，人重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因復(fù)合物可以隨機(jī)引入或通過同源重組引入小鼠胚胎干細(xì)胞中?；蛘撸巳酥劓満洼p鏈基因之外，可以將人可變區(qū)、恒定區(qū)和多樣性區(qū)引入小鼠胚胎干細(xì)胞中。小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因可以經(jīng)由通過同源重組引入人免疫球蛋白基因座分開或同時呈現(xiàn)非功能性。例如，已經(jīng)描述了在嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失導(dǎo)致完全抑制了內(nèi)源抗體的產(chǎn)生。將修飾的胚胎干細(xì)胞擴(kuò)增并顯微注射到胚泡中以產(chǎn)生嵌合小鼠。然后將嵌合小鼠繁殖以產(chǎn)生表達(dá)人抗體的純合后代。用選定的抗原(例如本發(fā)明多肽的全部或一部分)以正常方式免疫轉(zhuǎn)基因小鼠。

可以使用常規(guī)雜交瘤技術(shù)從免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠獲得針對抗原的抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在B細(xì)胞分化期間重排，隨后經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變。因此，使用這種技術(shù)，可以產(chǎn)生治療上可用的IgG、IgA、IgM和IgE抗體，包括但不限于IgG1(γ1)和IgG3。對于用于產(chǎn)生人抗體和人單克隆抗體的這種技術(shù)和用于產(chǎn)生這樣的抗體的方案的詳細(xì)討論，參見例如PCT公開號WO2014/055771、WO 98/24893、WO 96/34096和WO 96/33735；以及美國專利號5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318和5,939,598，其各自均通過引用以其整體并入本文。

“人源化”抗體保留與原始抗體相似的抗原特異性，即在本發(fā)明中，結(jié)合例如CD19的能力。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明CAR的抗原結(jié)合部分的部分靶向CD19。優(yōu)選地，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明CAR中的抗原結(jié)合部分的部分是全人抗CD19 scFV。示例性CD19 scFV教導(dǎo)于美國專利號US7902338和US7109304，以及美國公開申請?zhí)朥S20070178103和US20130287748，以及PCT公開申請?zhí)朩O2014153270A1中，關(guān)于與CD19 scFV相關(guān)的教導(dǎo)，其各自均通過引用并入本文。示例性CD19 scFV在SEQ ID NO：34至45的序列中提供。在一些實(shí)施方案中，CD19 scFV包含SEQ ID NO：34至45中任一個的序列或其變體，所述變體與SEQ ID NO：34至45中任一個至少80％、85％、90％、95％、98％或99％相同。

跨膜結(jié)構(gòu)域

關(guān)于跨膜結(jié)構(gòu)域，CAR可以設(shè)計(jì)成包含融合至CAR胞外結(jié)構(gòu)域的跨膜結(jié)構(gòu)域。在一個實(shí)施方案中，使用了與CAR中的結(jié)構(gòu)域之一天然締合的跨膜結(jié)構(gòu)域。在一些情況下，可以通過氨基酸替換來選擇或修飾跨膜結(jié)構(gòu)域以避免這些結(jié)構(gòu)域與相同或不同表面膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而使與受體復(fù)合物的其他成員的相互作用最小化。

跨膜結(jié)構(gòu)域可以來自天然來源或來自合成來源。當(dāng)來源為天然時，結(jié)構(gòu)域可以來自任何膜結(jié)合或跨膜蛋白質(zhì)。本發(fā)明中特別有用的跨膜區(qū)可以來自T細(xì)胞受體的α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD27、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154(例如，至少包含其跨膜區(qū))。在一些情況下，也可以使用多種人鉸鏈，包括人Ig(免疫球蛋白)鉸鏈?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的或本文所述的任何方法(例如通過使用UniProt數(shù)據(jù)庫)來鑒定跨膜結(jié)構(gòu)域。

在一些實(shí)施方案中，跨膜結(jié)構(gòu)域可以是合成的，在這種情況下，其將主要包含疏水性殘基，例如亮氨酸和纈氨酸。優(yōu)選地，在合成的跨膜結(jié)構(gòu)域的每個末端會發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸、色氨酸和纈氨酸的三聯(lián)體。任選地，短的寡肽或多肽接頭，優(yōu)選長度為2至10個氨基酸，可以形成CAR的跨膜結(jié)構(gòu)域與胞質(zhì)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域之間的連接。甘氨酸-絲氨酸雙聯(lián)體提供特別合適的接頭。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明CAR中的跨膜結(jié)構(gòu)域是CD8跨膜結(jié)構(gòu)域。用于此目的之CD8的序列在PCT公開號WO2014/055771中教導(dǎo)。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明CAR中的跨膜結(jié)構(gòu)域是CD28跨膜結(jié)構(gòu)域。

在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的CAR中的跨膜結(jié)構(gòu)域是CD28跨膜結(jié)構(gòu)域。下文提供了CD28的一個示例性序列，以及一個示例性跨膜結(jié)構(gòu)域序列。在一些實(shí)施方案中，CD28跨膜結(jié)構(gòu)域包含以下示例性跨膜結(jié)構(gòu)域序列或者其片段或變體，其能夠?qū)鲂蛄械腃AR錨定到細(xì)胞膜。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，完整的跨膜結(jié)構(gòu)域或其部分可以與胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或其部分一起實(shí)施。在一些實(shí)施方案中，所用的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域是CD28序列的連續(xù)部分。

CD28(19至220位氨基酸)

NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO：11)

CD28(153至179位氨基酸，跨膜結(jié)構(gòu)域)

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO：12)

在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的CAR包含含有全部或部分胞外結(jié)構(gòu)域、全部或部分跨膜結(jié)構(gòu)域以及全部或部分胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的CD28區(qū)。下面提供了包含在CAR中的CD28區(qū)的一個示例性序列。在一些實(shí)施方案中，CD28跨膜結(jié)構(gòu)域包含以下示例性跨膜結(jié)構(gòu)域序列或者其片段或變體，其能夠?qū)鲂蛄械腃AR錨定到細(xì)胞膜。

CD28區(qū)

IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSAS(SEQ ID NO：13)

在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的CAR中的跨膜結(jié)構(gòu)域是CD27跨膜結(jié)構(gòu)域。下面提供了CD27的一個示例性序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，CD27的完整跨膜結(jié)構(gòu)域或其部分可以與胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或其部分一起實(shí)施。在一些實(shí)施方案中，所述結(jié)構(gòu)域是CD27序列的連續(xù)部分。

CD27(20至260位氨基酸)

ATPAPKSCPERHYWAQGKLCCQMCEPGTFLVKDCDQHRKAAQCDPCIPGVSFSPDHHTRPHCESCRHCNSGLLVRNCTITANAECACRNGWQCRDKECTECDPLPNPSLTARSSQALSPHPQPTHLPYVSEMLEARTAGHMQTLADFRQLPARTLSTHWPPQRSLCSSDFIRILVIFSGMFLVFTLAGALFLHQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO：14)

在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的CAR的跨膜結(jié)構(gòu)域包含鉸鏈結(jié)構(gòu)域，例如CD8鉸鏈結(jié)構(gòu)域。參見PCT公開號WO2014/055771，其教導(dǎo)了一個示例性CD8鉸鏈結(jié)構(gòu)域序列。下文還提供了一個示例性的CD8鉸鏈結(jié)構(gòu)域序列。在一些實(shí)施方案中，CD8鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含下述示例性序列或者其片段或變體，其能夠?yàn)镃AR或連接于鉸鏈結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域提供柔性或防止其空間位阻。在一些情況下，也可以使用多種人鉸鏈，包括人Ig(免疫球蛋白)鉸鏈。

CD8鉸鏈結(jié)構(gòu)域

AKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO：15)

胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明CAR的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)活化其中已經(jīng)放置了CAR的免疫細(xì)胞的至少一種正常效應(yīng)物功能。術(shù)語“效應(yīng)物功能”是指細(xì)胞的特化功能。例如，T細(xì)胞的效應(yīng)物功能可以是細(xì)胞溶解活性或輔助活性(包括細(xì)胞因子的分泌)。因此，術(shù)語“細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”是指蛋白質(zhì)的一部分，其轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)物功能信號并指導(dǎo)細(xì)胞執(zhí)行特化功能。雖然通?？梢允褂谜麄€細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，但在許多情況下，不必使用整個鏈。就使用細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的截短部分的程度而言，只要其轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)物功能信號，則此類截短部分可用于代替完整鏈。因此，術(shù)語細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域意指包括足以轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)物功能信號的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的任何截短部分。

用于本發(fā)明CAR中的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的實(shí)例包括T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)的胞質(zhì)序列和共同受體，其共同作用以在抗原受體結(jié)合后起始信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；以及具有相同功能性能力的這些序列的任何衍生物或變體和任何合成序列。

已知單獨(dú)通過TCR產(chǎn)生的信號不足以完全活化T細(xì)胞，并且還需要次級或共刺激信號。因此，T細(xì)胞活化可以由兩種不同類別的胞質(zhì)信號傳導(dǎo)序列介導(dǎo)：通過TCR起始抗原依賴性初級活化的那些(初級胞質(zhì)信號傳導(dǎo)序列)，以及以抗原非依賴性方式起作用以提供次級或共刺激信號的那些(次級胞質(zhì)信號傳導(dǎo)序列)。

初級胞質(zhì)信號傳導(dǎo)序列以刺激方式或以抑制方式調(diào)節(jié)TCR復(fù)合物的初級活化。以刺激方式起作用的初級胞質(zhì)信號傳導(dǎo)序列可含有稱為基于免疫受體酪氨酸的活化基序或ITAM的信號傳導(dǎo)基序。含有在本發(fā)明中特別有用的初級胞質(zhì)信號傳導(dǎo)序列的ITAM的實(shí)例包括來自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。特別優(yōu)選的是，本發(fā)明CAR中的胞質(zhì)信號傳導(dǎo)分子包含來自CD3ζ的胞質(zhì)信號傳導(dǎo)序列。

可以將CAR的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)為包含CD3ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域自身或與在本發(fā)明CAR的上下文中可用的任何其他所需的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組合。例如，CAR的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域可以包含CD3ζ鏈部分和共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)。共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)是指包含共刺激分子細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的CAR的一部分。因此，雖然本發(fā)明主要以CD28、CD137和CD27作為共刺激信號傳導(dǎo)元件的示例，但是其他額外的共刺激元件也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

本發(fā)明CAR的胞質(zhì)信號傳導(dǎo)部分內(nèi)的胞質(zhì)信號傳導(dǎo)序列可以以隨機(jī)或指定的順序彼此連接。任選地，短的寡肽或多肽接頭，優(yōu)選長度為2至10個氨基酸，可以形成連接。甘氨酸-絲氨酸雙聯(lián)體提供了特別合適的接頭。

在一些實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域以包含CD3ζ的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD28、CD137和CD27的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

在一些實(shí)施方案中，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含CD27細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(例如，CD27胞質(zhì)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域)。在一些實(shí)施方案中，CD27信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域顯示增強(qiáng)免疫效應(yīng)物活性(包括但不限于細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生)的效應(yīng)物信號傳導(dǎo)功能。下文提供了一個示例性CD27信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域序列。在一些實(shí)施方案中，CD27信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含以下示例性序列或者其片段或變體，與包含下文示例性序列的CAR相比，當(dāng)其包含在CAR中時具有相同或改善的功能(例如細(xì)胞溶解活性、細(xì)胞增殖或細(xì)胞因子分泌)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何合適方法測試該功能。

CD27信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域

QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO：16)

在一些實(shí)施方案中，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含CD137細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(例如，CD137胞質(zhì)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域)。下文提供了一個示例性的CD137信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域序列。

CD137信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO：17)

在一些實(shí)施方案中，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含CD28細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(例如，CD28胞質(zhì)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域)。下文提供了一個示例性的CD28信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域序列。

CD28信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域

RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO：18)

在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的CAR包含來自CD3ζ的胞質(zhì)信號傳導(dǎo)序列。下文提供了CD3ζ結(jié)構(gòu)域序列的實(shí)例。在一些實(shí)施方案中，CD3ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含下述CD3ζ序列之一或者其片段或變體，與包含以下序列的CAR相比，當(dāng)其包含在CAR中時具有相同或改善的功能(例如細(xì)胞溶解活性或細(xì)胞因子的分泌)。

CD3ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域

RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO：19)

CD3ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO：20)

可以設(shè)計(jì)CAR的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域以包含與本公開內(nèi)容的CAR的上下文中可用的任何其他所需的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域相組合的CD3ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。例如，CAR的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域可以包含CD3ζ結(jié)構(gòu)域和共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)。共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)是指包含共刺激分子的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的CAR的一部分。因此，盡管本公開內(nèi)容主要以4-1BB、CD28、CD137和CD27作為共刺激信號傳導(dǎo)元件的示例，但是其他額外的共刺激元件也在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)。共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)的實(shí)例序列如下所示。

CD28(180至220位氨基酸，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域)

RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO：21)

4-1BB(CD137)細(xì)胞內(nèi)TRAF結(jié)合結(jié)構(gòu)域

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO：22)

ICOS細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域

CWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL(SEQ ID NO：23)

OX40細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域

ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(SEQ ID NO：24)

CD27細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域

QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO：25)

CD127細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域

KRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ(SEQ ID NO：26)

在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的CAR包含凋亡誘導(dǎo)基因Casp9或者其結(jié)構(gòu)域或截短形式。一個示例性Casp9序列和截短序列如下。在一些實(shí)施方案中，CAR包含CD3ζ結(jié)構(gòu)域與Casp9之間的接頭(例如，肽接頭)。

在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的CAR包含凋亡誘導(dǎo)基因Casp9或者其結(jié)構(gòu)域或截短形式。一個示例性Casp9序列和截短序列如下。在一些實(shí)施方案中，CAR包含CD3ζ結(jié)構(gòu)域與Casp9之間的接頭(例如，肽接頭)。

CASP9氨基酸序列

MDEADRRLLRRCRLRLVEELQVDQLWDALLSRELFRPHMIEDIQRAGSGSRRDQARQLIIDLETRGSQALPLFISCLEDTGQDMLASFLRTNRQAAKLSKPTLENLTPVVLRPEIRKPEVLRPETPRPVDIGSGGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS(SEQ ID NO：27)

截短的CASP9氨基酸序列

VGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS(SEQ ID NO：28)

在一些實(shí)施方案中，CD3ζ結(jié)構(gòu)域與Casp9結(jié)構(gòu)域之間的肽接頭是2A肽接頭。“2A肽接頭”是指編碼小核糖核酸病毒(picornavirus)(例如口蹄疫病毒(F2A)、馬鼻炎A病毒(E2A)、Thosea asigna病毒(T2A)和豬捷申病毒(teschovirus)-1(P2A))的2A區(qū)的氨基酸序列或其部分。通常，2A肽接頭通過引起核糖體跳躍(ribosome skipping)使得能夠進(jìn)行多順反子蛋白質(zhì)表達(dá)。以下提供2A接頭的實(shí)例。

F2A：VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：30)

E2A：QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：31)

T2A：EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：32)

P2A：ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：33)

在一些實(shí)施方案中，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域還包含iCasp9結(jié)構(gòu)域和/或FKBP結(jié)構(gòu)域。通常，F(xiàn)K506結(jié)合蛋白(FK 506binding protein，F(xiàn)KBP)在某些小分子(例如FK1012、FK506、FKCsA、雷帕霉素、香豆霉素、赤霉素、HaXS等)存在下二聚化。因此，F(xiàn)KBP可用于進(jìn)行化學(xué)二聚化。例如，F(xiàn)KBP結(jié)構(gòu)域可以與無活性的胱天蛋白酶9(inactive caspase 9，iCasp9)融合。在某些小分子存在下，iCasp9-FKBP蛋白將二聚化并活化Casp9，從而誘導(dǎo)含有iCasp9-FKBP融合蛋白的細(xì)胞的凋亡。下文提供了一個示例性突變的FK506結(jié)合蛋白基序。

FKBP f36v氨基酸序列

MGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE(SEQ ID NO：29)

在一些實(shí)施方案中，CAR包含以下序列或由其組成，其通過包含在其中的示例性結(jié)構(gòu)域分解：

抗CD19 scFv鏈1(例如，SEQ ID NO：34至45中任一個的鏈1)

GSTSGSGKPGSSEGSTKG(任選的接頭；SEQ ID NO：5)

抗CD19 scFv鏈2(例如，SEQ ID NO：34至45中任一個的鏈2)

GSTSGSGKPGSSEGSTKG(任選的接頭；SEQ ID NO：5)

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(CD28跨膜結(jié)構(gòu)域；SEQ ID NO：12)

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(CD137胞質(zhì)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；SEQ ID NO：17)

GSTSGSGKPGSSEGSTKG(任選的接頭；SEQ ID NO：5)

QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(CD27胞質(zhì)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；SEQ ID NO：14)

RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(CD3ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；SEQ ID NO：19)

2A接頭(例如SEQ ID NO：30至33中的任一個)

VGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS(截短的Casp9，SEQ ID NO：28)。

然而，應(yīng)當(dāng)理解，本文所述序列的其他組合也可以用于CAR中。

載體

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括包含CAR序列的DNA構(gòu)建體，其中所述序列包含與細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的核酸序列有效連接的抗原結(jié)合部分的核酸序列?？捎糜诒景l(fā)明CAR中的示例性細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括但不限于CD3ζ、CD27、CD137、CD28等的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在一些情況下，CAR還可以包含凋亡誘導(dǎo)基因Casp9。

編碼所需分子的核酸序列可以使用本領(lǐng)域已知的重組方法獲得，例如使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過從表達(dá)基因的細(xì)胞中篩選文庫，通過從已知包含所述基因的載體獲得基因，或通過直接從含有所述基因的細(xì)胞和組織中分離?；蛘?，可以合成地產(chǎn)生目的基因，而非克隆。

本發(fā)明還提供其中插入了本發(fā)明DNA的載體。來自逆轉(zhuǎn)錄病毒(如慢病毒)的載體是實(shí)現(xiàn)長期基因轉(zhuǎn)移的合適工具，因?yàn)樗鼈冊试S轉(zhuǎn)基因的長期穩(wěn)定整合及其在子細(xì)胞中的擴(kuò)增。慢病毒載體相對于來自致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒(如鼠白血病病毒)的載體具有附加的優(yōu)點(diǎn)，在于它們可以轉(zhuǎn)導(dǎo)非增殖細(xì)胞，例如肝細(xì)胞。它們還具有低免疫原性的附加優(yōu)點(diǎn)。在另一個實(shí)施方案中，所需CAR可以通過轉(zhuǎn)座子在細(xì)胞中表達(dá)。

簡言之，編碼CAR的天然或合成核酸的表達(dá)通常通過將編碼CAR多肽或其部分的核酸與啟動子有效連接，并將該構(gòu)建體整合到表達(dá)載體中來實(shí)現(xiàn)。載體可以適合于復(fù)制和整合真核生物。典型的克隆載體含有可用于調(diào)節(jié)所需核酸序列表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、起始序列和啟動子。本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體還可以用于使用標(biāo)準(zhǔn)基因遞送方案的核酸免疫和基因治療。基因遞送的方法是本領(lǐng)域已知的。參見例如美國專利號5,399,346、5,580,859、5,589,466，以其整體通過引用并入本文。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了基因治療載體。

核酸可以克隆到多種類型的載體中。例如，可以將核酸克隆到這樣的載體中，所述載體包括但不限于質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒和黏粒。特別感興趣的載體包括表達(dá)載體、復(fù)制載體、探針產(chǎn)生載體和測序載體。

此外，可以以病毒載體的形式向細(xì)胞提供表達(dá)載體。病毒載體技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，并且描述于例如Sambrook等(2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)和其他病毒學(xué)和分子生物學(xué)手冊中。可用作載體的病毒包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒和慢病毒。通常，合適的載體含有在至少一種生物體中有功能的復(fù)制起點(diǎn)、啟動子序列、方便的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)和一個或更多個可選擇標(biāo)志物(例如WO 01/96584；WO 01/29058；和美國專利號6,326,193)。

已經(jīng)開發(fā)了許多基于病毒的系統(tǒng)以將基因轉(zhuǎn)移到哺乳動物細(xì)胞中。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒為基因遞送系統(tǒng)提供了方便的平臺?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)將所選擇的基因插入載體中并包裝在逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中。然后可以分離重組病毒并體內(nèi)或離體遞送至對象的細(xì)胞。許多逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的。在一些實(shí)施方案中，使用腺病毒載體。許多腺病毒載體是本領(lǐng)域已知的。在一個實(shí)施方案中，使用慢病毒載體。

另外的啟動子元件(例如增強(qiáng)子)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的頻率。通常，這些位于起始位點(diǎn)上游30至110bp的區(qū)域中，盡管最近已經(jīng)示出許多啟動子也包含起始位點(diǎn)下游的功能元件。啟動子元件之間的間隔通常是柔性的，以使得當(dāng)元件相對于另一個元件反轉(zhuǎn)或移動時會保持啟動子功能。在胸苷激酶(thymidine kinase，tk)啟動子中，啟動子元件之間的間隔可以在活性開始下降之前增加至50bp遠(yuǎn)。依據(jù)于啟動子，似乎單獨(dú)元件可以協(xié)作或獨(dú)立地發(fā)揮作用以激活轉(zhuǎn)錄。

合適的啟動子的一個實(shí)例是立即早期巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)啟動子序列。該啟動子序列是能夠驅(qū)動與其有效連接的任何多核苷酸序列的高水平表達(dá)的強(qiáng)組成型啟動子序列。合適的啟動子的另一個實(shí)例是延伸生長因子-1a(EF-1a)。然而，也可以使用其他組成型啟動子序列，包括但不限于猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)早期啟動子、小鼠乳腺瘤病毒(mouse mammary tumor virus，MMTV)、人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)長末端重復(fù)(long terminal repeat，LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽白血病病毒啟動子、埃-巴病毒立即早期啟動子、勞氏肉瘤病毒啟動子，以及人基因啟動子，例如但不限于肌動蛋白啟動子、肌球蛋白啟動子、血紅蛋白啟動子和肌酸激酶啟動子。此外，本發(fā)明不應(yīng)限于使用組成型啟動子。誘導(dǎo)型啟動子也被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。誘導(dǎo)型啟動子的使用提供了能夠開啟多核苷酸序列表達(dá)的分子開關(guān)，當(dāng)期望這種表達(dá)時，其有效連接，或者當(dāng)不需要表達(dá)時關(guān)閉表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動子的實(shí)例包括但不限于金屬硫蛋白啟動子、糖皮質(zhì)激素啟動子、孕酮啟動子和四環(huán)素啟動子。

為了評估CAR多肽或其部分的表達(dá)，待引入細(xì)胞中的表達(dá)載體還可以含有可選擇性標(biāo)志物基因或報道基因或兩者，以促進(jìn)從試圖通過病毒載體轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞群鑒定和選擇表達(dá)的細(xì)胞。在另一些方面，可以在分開的DNA片段上攜帶可選擇標(biāo)志物并將其用于共轉(zhuǎn)染方法中?？蛇x擇標(biāo)志物和報道基因兩者的側(cè)翼可以有適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列以使得能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)?？捎玫目蛇x擇標(biāo)志物包括例如抗生素抗性基因，例如neo等。

報告基因用于鑒定潛在被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和用于評估調(diào)節(jié)性序列的功能。通常，報告基因是不存在于接受者生物體或組織中或不由接受者生物體或組織表達(dá)的基因，并且其編碼多肽，所述多肽的表達(dá)通過一些容易檢測的性質(zhì)例如酶促活性表現(xiàn)。在將DNA引入接受者細(xì)胞后的合適時間測定報告基因的表達(dá)。合適的報告基因可以包括編碼以下的基因：螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、分泌的堿性磷酸酶或綠色熒光蛋白基因(例如Ui-Tei等，2000 FEBS Letters 479：79-82)。合適的表達(dá)系統(tǒng)是公知的，并且可以使用已知技術(shù)制備或商業(yè)獲得。通常，顯示報告基因最高水平表達(dá)的具有最小5’側(cè)翼區(qū)的構(gòu)建體被鑒定為啟動子。這樣的啟動子區(qū)可以連接到報告基因并用于評價試劑調(diào)節(jié)啟動子驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的能力。

將基因引入細(xì)胞和表達(dá)入細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的。在表達(dá)載體的情況中，可以通過本領(lǐng)域中的任何方法容易地將載體引入宿主細(xì)胞，例如哺乳動物、細(xì)菌、酵母或昆蟲細(xì)胞。例如，表達(dá)載體可以通過物理、化學(xué)或生物學(xué)手段轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中。

用于將多核苷酸引入宿主細(xì)胞的物理方法包括磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(lipofection)、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔等。用于產(chǎn)生包含載體和/或外源核酸的細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域公知的。參見例如Sambrook等(2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)。將多核苷酸引入宿主細(xì)胞的一種優(yōu)選方法是磷酸鈣轉(zhuǎn)染。

用于將目的多核苷酸引入宿主細(xì)胞的生物學(xué)方法包括使用DNA和RNA載體。病毒載體，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已成為將基因插入哺乳動物(例如人)細(xì)胞中最廣泛使用的方法。其他病毒載體可來自慢病毒、痘病毒、單純皰疹病毒I、腺病毒和腺相關(guān)病毒等。參見例如美國專利號5,350,674和5,585,362。

用于將多核苷酸引入宿主細(xì)胞的化學(xué)手段包括膠體分散系統(tǒng)，例如大分子復(fù)合物、納米膠囊、微球、珠，和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)包括水包油乳劑、膠束、混合膠束和脂質(zhì)體。用作體外和體內(nèi)遞送載劑的一種示例性膠體系統(tǒng)是脂質(zhì)體(例如人工膜囊泡)。

在使用非病毒遞送系統(tǒng)的情況下，一種示例性遞送載劑是脂質(zhì)體。考慮了使用脂質(zhì)制劑將核酸引入宿主細(xì)胞(體外、離體或體內(nèi))。在另一個方面，核酸可以與脂質(zhì)締合。與脂質(zhì)締合的核酸可以包封在脂質(zhì)體的水性內(nèi)部、散布在脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙層內(nèi)、通過與脂質(zhì)體和寡核苷酸兩者締合的連接分子連接到脂質(zhì)體、包埋在脂質(zhì)體中、與脂質(zhì)體復(fù)合、分散在含有脂質(zhì)的溶液中、與脂質(zhì)混合、與脂質(zhì)組合、以懸浮液包含在脂質(zhì)中、包含或與膠束復(fù)合、或者以其他方式與脂質(zhì)締合。脂質(zhì)、脂質(zhì)/DNA或脂質(zhì)/表達(dá)載體相關(guān)組合物不限于溶液中的任何特定結(jié)構(gòu)。例如，它們可以以雙層結(jié)構(gòu)存在，作為膠束或以“塌陷(collapsed)”結(jié)構(gòu)存在。它們還可以簡單地散布在溶液中，可能形成尺寸或形狀不均勻的聚集體。脂質(zhì)是可以天然存在的脂肪物質(zhì)或合成脂質(zhì)。例如，脂質(zhì)包括天然存在于細(xì)胞質(zhì)中的脂肪液滴以及包含長鏈脂族烴及其衍生物的化合物類，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。

適合使用的脂質(zhì)可以從商業(yè)來源獲得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰膽堿(dimyristyl phosphatidylcholine，“DMPC”)可以從Sigma，St.Louis，MO獲得；雙十六烷基磷酸酯(dicetyl phosphate，“DCP”)可以從K&K Laboratories(Plainview，NY)獲得；膽固醇(cholesterol，“Choi”)可以從Calbiochem-Behring獲得；二肉豆蔻?；字８视?dimyristyl phosphatidylglycerol，“DMPG”)和其他脂質(zhì)可以從Avanti Polar Lipids，Inc.(Birmingham，AL)獲得。脂質(zhì)在氯仿或氯仿/甲醇中的儲備溶液可以在約-20℃下儲存。氯仿用作唯一的溶劑，因?yàn)樗燃状几菀讚]發(fā)?！爸|(zhì)體”是涵蓋通過產(chǎn)生封閉的脂質(zhì)雙層或聚集體形成的多種單層和多層脂質(zhì)載劑的通用術(shù)語。脂質(zhì)體可以表征為具有帶有磷脂雙層膜和內(nèi)部水性介質(zhì)的囊狀結(jié)構(gòu)。多層脂質(zhì)體具有通過水性介質(zhì)分離的多個脂質(zhì)層。當(dāng)磷脂懸浮在過量的水溶液中時，它們自發(fā)形成。脂質(zhì)組分在封閉結(jié)構(gòu)形成之前經(jīng)歷自我重排，并且將水和溶解的溶質(zhì)包埋在脂質(zhì)雙層之間(Ghosh等，1991 Glycobiology 5：505-10)。然而，也涵蓋在溶液中具有與正常囊泡結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)的組合物。例如，脂質(zhì)可以呈現(xiàn)膠束結(jié)構(gòu)或僅作為脂質(zhì)分子的不均勻聚集體存在。也考慮lipofectamine-核酸復(fù)合物。

無論是用于將外源核酸引入宿主細(xì)胞的方法或以其他方式將細(xì)胞暴露于本發(fā)明的抑制劑，為了證實(shí)重組DNA序列在宿主細(xì)胞中的存在，可以進(jìn)行多種測定。這樣的測定包括例如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的“分子生物學(xué)”測定，例如Southern和Northern印跡、RT-PCR和PCR；“生物化學(xué)”測定，例如通過免疫學(xué)方法(ELISA和Western印跡)或通過本文所述的測定來檢測特定肽的存在與否，以鑒定落入本發(fā)明范圍內(nèi)的試劑。

RNA轉(zhuǎn)染

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明經(jīng)遺傳修飾的T細(xì)胞為通過引入RNA進(jìn)行修飾。在一個實(shí)施方案中，體外轉(zhuǎn)錄的RNA CAR可以作為瞬時轉(zhuǎn)染形式引入細(xì)胞。通過使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)產(chǎn)生的模板通過體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA。來自任何來源的目的DNA可以通過PCR直接轉(zhuǎn)化成模板以用于使用合適的引物和RNA聚合酶的體外mRNA合成。DNA的來源可以是例如基因組DNA、質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其他合適的DNA來源。用于體外轉(zhuǎn)錄的所需模板是本發(fā)明的CAR。例如，RNA CAR的模板包含含有抗CD19scFv的胞外結(jié)構(gòu)域；跨膜結(jié)構(gòu)域(例如CD8a的鉸鏈和跨膜結(jié)構(gòu)域或CD28的跨膜結(jié)構(gòu)域)；并且胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含CD3ζ的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD28、CD137和CD27的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

在一個實(shí)施方案中，用于PCR的DNA含有開放閱讀框。DNA可以來自生物體基因組的天然存在的DNA序列。在一個實(shí)施方案中，DNA是全長目的基因或基因的一部分。該基因可以包含5’和/或3’非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)中的一些或全部。該基因可以包含外顯子和內(nèi)含子。在一個實(shí)施方案中，待用于PCR的DNA是人基因。在另一個實(shí)施方案中，待用于PCR的DNA是包含5’和3’UTR的人基因?；蛘撸珼NA可以是在天然存在的生物體中通常不表達(dá)的人工DNA序列。一種示例性人工DNA序列是含有連接在一起以形成編碼融合蛋白之開放閱讀框的基因部分的DNA序列。連接在一起的DNA部分可以來自單個生物體或來自多于一個生物體。

可用作PCR的DNA來源的基因包括編碼對生物體提供治療或預(yù)防效果或可用于診斷生物體中的疾病或病癥之多肽的基因。優(yōu)選的基因是可用于短期治療或其中存在關(guān)于劑量或表達(dá)的基因的安全性問題的基因。例如，為了治療癌癥，自身免疫病，寄生蟲、病毒、細(xì)菌、真菌或其他感染，待表達(dá)的轉(zhuǎn)基因可以編碼作用為免疫系統(tǒng)細(xì)胞的配體或受體的多肽，或者可以起作用以刺激或抑制生物體的免疫系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，不期望具有延長的對免疫系統(tǒng)的持續(xù)刺激，也不需要產(chǎn)生在成功治療后持續(xù)的變化，因?yàn)檫@可能隨后引起新的問題。對于自身免疫病的治療，可能需要在突發(fā)期間但不是長期地抑制或阻抑免疫系統(tǒng)，這可能導(dǎo)致患者對感染過度敏感。

PCR用于產(chǎn)生用于轉(zhuǎn)染的mRNA的體外轉(zhuǎn)錄的模板。用于進(jìn)行PCR的方法是本領(lǐng)域公知的。設(shè)計(jì)用于PCR的引物以具有與待用作PCR模板的DNA區(qū)域基本上互補(bǔ)的區(qū)域。如本文所用，“基本上互補(bǔ)”是指這樣的核苷酸序列，其中引物序列中的大部分或全部堿基是互補(bǔ)的，或者一個或更多個堿基是非互補(bǔ)的或錯配的。基本上互補(bǔ)的序列能夠在用于PCR的退火條件下與預(yù)期的DNA靶標(biāo)退火或雜交?？梢栽O(shè)計(jì)引物以與DNA模板的任何部分基本上互補(bǔ)。例如，可以設(shè)計(jì)引物以擴(kuò)增在細(xì)胞(開放閱讀框)中正常轉(zhuǎn)錄的基因部分，包括5’和3’UTR。還可以設(shè)計(jì)引物以擴(kuò)增編碼特定目的結(jié)構(gòu)域的基因部分。在一個實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)引物以擴(kuò)增人cDNA的編碼區(qū)，包括5’和3’UTR的全部或部分。通過本領(lǐng)域公知的合成方法產(chǎn)生可用于PCR的引物。

“正向引物”是包含與DNA模板上位于待擴(kuò)增DNA序列上游的核苷酸基本上互補(bǔ)的核苷酸區(qū)域的引物?！吧嫌巍痹诒疚闹杏糜谥赶鄬τ诰幋a鏈在待擴(kuò)增DNA序列5’的位置?！胺聪蛞铩笔前c待擴(kuò)增DNA序列下游的雙鏈DNA模板基本上互補(bǔ)的核苷酸區(qū)域的引物?！跋掠巍痹诒疚闹杏糜谥赶鄬τ诰幋a鏈在待擴(kuò)增的DNA序列3’的位置。

可用于PCR的任何DNA聚合酶均可用于本文公開的方法中。試劑和聚合酶可從許多來源商購獲得。

也可以使用具有促進(jìn)穩(wěn)定性和/或翻譯效率的能力的化學(xué)結(jié)構(gòu)。RNA優(yōu)選具有5’和3’UTR。在一個實(shí)施方案中，5’UTR的長度為0至3000個核苷酸。待添加到編碼區(qū)的5’和3’UTR序列的長度可以通過不同的方法改變，包括但不限于設(shè)計(jì)退火到UTR的不同區(qū)域的PCR引物。使用這種方法，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以修飾所需的5’和3’UTR長度，以在將轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)染后實(shí)現(xiàn)最佳翻譯效率。

5’和3’UTR可以是目的基因的天然存在的內(nèi)源5’和3’UTR?；蛘?，可以通過將UTR序列并入正向和反向引物或通過模板的任何其他修飾來添加與目的基因非內(nèi)源的UTR序列。使用與目的基因非內(nèi)源的UTR序列可用于修飾RNA的穩(wěn)定性和/或翻譯效率。例如，已知3’UTR序列中富含AU的元件可以降低mRNA的穩(wěn)定性。因此，可以基于本領(lǐng)域公知的UTR的性質(zhì)選擇或設(shè)計(jì)3’UTR以提高轉(zhuǎn)錄的RNA的穩(wěn)定性。

在一個實(shí)施方案中，5’UTR可以含有內(nèi)源基因的Kozak序列?；蛘撸?dāng)如上所述通過PCR添加目的基因的非內(nèi)源5’UTR時，可以通過添加5’UTR序列來重新設(shè)計(jì)共有Kozak序列。Kozak序列可以提高一些RNA轉(zhuǎn)錄物的翻譯效率，但似乎并不是所有RNA都需要其才能夠有效翻譯。許多mRNA對Kozak序列的需求是本領(lǐng)域已知的。在另一些實(shí)施方案中，5’UTR可來自其RNA基因組在細(xì)胞中穩(wěn)定的RNA病毒。在另一些實(shí)施方案中，可以在3’或5’UTR中使用多種核苷酸類似物以阻止mRNA的外切核酸酶降解。

為了能夠從DNA模板合成RNA，而不需要基因克隆，應(yīng)該將轉(zhuǎn)錄啟動子連接于待轉(zhuǎn)錄序列上游的DNA模板。當(dāng)將用作RNA聚合酶啟動子的序列添加到正向引物的5’端時，RNA聚合酶啟動子被并入待轉(zhuǎn)錄的開放閱讀框上游的PCR產(chǎn)物中。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文別處所述，啟動子是T7聚合酶啟動子。其他可用的啟動子包括但不限于T3和SP6RNA聚合酶啟動子。T7、T3和SP6啟動子的共有核苷酸序列是本領(lǐng)域已知的。

在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，mRNA具有在5’端上的帽和3’poly(A)尾兩者，其確定細(xì)胞中的核糖體結(jié)合、翻譯起始和mRNA穩(wěn)定性。在環(huán)狀DNA模板(例如質(zhì)粒DNA)上，RNA聚合酶產(chǎn)生不適合在真核細(xì)胞中表達(dá)的長多聯(lián)產(chǎn)物(long concatameric product)。在3’UTR端線性化的質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)錄會導(dǎo)致產(chǎn)生正常大小的mRNA，其在真核生物轉(zhuǎn)染中不是有效的，即使其在轉(zhuǎn)錄后是聚腺苷酸化的。

在線性DNA模板上，噬菌體T7RNA聚合酶可以將轉(zhuǎn)錄物的3’端延伸超過模板的最后堿基(Schenborn和Mierendorf，Nuc Acids Res.，13：6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz，Eur.J.Biochem.，270：1485-65(2003))。

將polyA/T段整合入DNA模板的常規(guī)方法是分子克隆。然而，整合到質(zhì)粒DNA中的polyA/T序列可以引起質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，這就是為什么從細(xì)菌細(xì)胞獲得的質(zhì)粒DNA模板常常被缺失和其他偏差嚴(yán)重?fù)p害。這使得克隆過程不僅費(fèi)力而且費(fèi)時，并且通常不可靠。這就是為什么非常需要允許構(gòu)建具有polyA/T3’段的DNA模板而不必克隆的方法。

轉(zhuǎn)錄DNA模板的polyA/T區(qū)段可以在PCR期間通過使用含有polyT尾的反向引物(例如100T尾(大小可以是50至5000T))產(chǎn)生，或者在PCR之后通過任何其他方法產(chǎn)生，所述方法包括但不限于DNA連接或體外重組。poly(A)尾也向RNA提供穩(wěn)定性并減少其降解。通常，poly(A)尾的長度與轉(zhuǎn)錄的RNA的穩(wěn)定性正相關(guān)。在一個實(shí)施方案中，poly(A)尾為100至5000個腺苷。

使用poly(A)聚合酶(例如大腸桿菌(E.coli)polyA聚合酶(E-PAP))體外轉(zhuǎn)錄后，RNA的poly(A)尾可以進(jìn)一步延伸。在一個實(shí)施方案中，將poly(A)尾的長度從100個核苷酸增加到300個至400個核苷酸導(dǎo)致RNA的翻譯效率提高約兩倍。另外，不同化學(xué)基團(tuán)與3’端的連接可提高mRNA穩(wěn)定性。這種連接可以包含修飾的/人工核苷酸、適配體和其他化合物。例如，可使用poly(A)聚合酶將ATP類似物并入poly(A)尾中。ATP類似物可以進(jìn)一步提高RNA的穩(wěn)定性。

5’帽也向RNA分子提供穩(wěn)定性。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過本文公開的方法產(chǎn)生的RNA包含5’帽。使用本領(lǐng)域已知的和本文描述的技術(shù)提供5’帽(Cougot等，Trends in Biochem.Sci.，29：436-444(2001)；Stepinski等，RNA，7：1468-95(2001)；Elango等，Biochim.Biophys.Res.Commun.，330：958-966(2005))。

通過本文公開的方法產(chǎn)生的RNA還可以含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site，IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒、染色體或人工設(shè)計(jì)的序列，其起始不依賴于帽之核糖體與mRNA結(jié)合并促進(jìn)翻譯的起始。可以包括適合于細(xì)胞電穿孔的任何溶質(zhì)，其可以包含促進(jìn)細(xì)胞通透性和生存力的因子，例如糖、肽、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、抗氧化劑和表面活性劑。

可以使用多種不同方法中的任何一種將RNA引入靶細(xì)胞，例如，市售方法，其包括但不限于：電穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems，Cologne，德國))，(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments，Boston，Mass.)或Gene Pulser II(BioRad，Denver，Colo.)，Multiporator(Eppendort，Hamburg，德國)，使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染的陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，聚合物包封，肽介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或生物射彈顆粒遞送系統(tǒng)例如“基因槍”(參見例如Nishikawa等，Hum Gene Ther.，12(8)：861-70(2001))。

遺傳修飾的T細(xì)胞

在一些實(shí)施方案中，使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體將CAR序列(例如，如本文所述的編碼CAR的核酸序列)遞送到細(xì)胞中。使用轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞作為載體或者無細(xì)胞局部或全身遞送的包封的、結(jié)合的或裸露的載體，可以將表達(dá)CAR的逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體遞送到不同類型的真核細(xì)胞以及組織和整個生物體中。所使用的方法可以用于其中需要穩(wěn)定表達(dá)或穩(wěn)定表達(dá)充分的任何目的。

在另一些實(shí)施方案中，使用體外轉(zhuǎn)錄的mRNA將CAR序列遞送到細(xì)胞中。使用轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為載體或者無細(xì)胞局部或全身遞送包封的、結(jié)合的或裸露的mRNA，可以將體外轉(zhuǎn)錄的mRNA CAR遞送到不同類型的真核細(xì)胞以及組織和整個生物體中。所使用的方法可以用于其中需要穩(wěn)定表達(dá)或穩(wěn)定表達(dá)充分的任何目的。

在另一個實(shí)施方案中，所需的CAR可以通過轉(zhuǎn)座子的方式在細(xì)胞中表達(dá)。

所公開的方法可以應(yīng)用于在癌癥、干細(xì)胞、急性和慢性感染以及自身免疫病領(lǐng)域中的基礎(chǔ)研究和治療中的T細(xì)胞活性調(diào)節(jié)，包括評估遺傳修飾的T細(xì)胞殺傷靶癌細(xì)胞的能力。

所述方法還提供了通過改變例如啟動子或輸入RNA的量來控制廣泛范圍內(nèi)的表達(dá)水平的能力，使得可以單獨(dú)調(diào)節(jié)表達(dá)水平。此外，基于PCR的mRNA產(chǎn)生技術(shù)極大地促進(jìn)具有不同結(jié)構(gòu)及其結(jié)構(gòu)域組合的嵌合受體mRNA的設(shè)計(jì)。例如，相同細(xì)胞中多種嵌合受體上的不同細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)物/共刺激因子結(jié)構(gòu)域的變化允許測定受體組合的結(jié)構(gòu)，其評估針對多抗原靶標(biāo)的最高水平的細(xì)胞毒性，同時對正常細(xì)胞具有最低的細(xì)胞毒性。

本發(fā)明RNA轉(zhuǎn)染方法的一個優(yōu)點(diǎn)是RNA轉(zhuǎn)染基本上是瞬時的，并且無載體：可以在短暫的體外細(xì)胞活化后，將RNA轉(zhuǎn)基因遞送至淋巴細(xì)胞并作為最小表達(dá)盒在其中表達(dá)，而不需要任何額外的病毒序列。在這些條件下，轉(zhuǎn)基因不可能整合到宿主細(xì)胞基因組中。

因?yàn)镽NA的轉(zhuǎn)染效率和其均勻修飾整個淋巴細(xì)胞群的能力，所以細(xì)胞的克隆不是必需的。用體外轉(zhuǎn)錄的RNA(in vitro-transcribed RNA，IVT-RNA)對T細(xì)胞的遺傳修飾利用了兩種不同的策略，這兩種策略在多種動物模型中已經(jīng)被成功地測試。通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或電穿孔用體外轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。優(yōu)選地，期望使用多種修飾來穩(wěn)定IVT-RNA，以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的IVT-RNA延長的表達(dá)。

一些IVT載體在文獻(xiàn)中是已知的，其以標(biāo)準(zhǔn)化方式用作用于體外轉(zhuǎn)錄的模板，并且已經(jīng)以產(chǎn)生穩(wěn)定的RNA轉(zhuǎn)錄物的方式進(jìn)行遺傳修飾。

目前本領(lǐng)域中所使用的方案基于具有以下結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒載體：使得RNA轉(zhuǎn)錄的5’RNA聚合酶啟動子，隨后是3’和/或5’側(cè)翼為非翻譯區(qū)(UTR)的目的基因，和含有50至70個A核苷酸的3’聚腺嘌呤基盒(polyadenyl cassette)。在體外轉(zhuǎn)錄之前，將環(huán)狀質(zhì)粒通過II型限制酶(識別序列對應(yīng)于切割位點(diǎn))在聚腺嘌呤基盒的下游線性化。因此，聚腺嘌呤基盒對應(yīng)于轉(zhuǎn)錄物中較后的poly(A)序列。作為該方法的結(jié)果，一些核苷酸在線性化后保留為酶切割位點(diǎn)的部分，并在3’端延伸或掩蔽poly(A)序列。還不清楚這種非生理性突出端是否會影響從這種構(gòu)建體胞內(nèi)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量。

RNA相對于更傳統(tǒng)的質(zhì)粒或病毒方法具有幾個優(yōu)點(diǎn)。來自RNA來源的基因表達(dá)不需要轉(zhuǎn)錄，并且在轉(zhuǎn)染后迅速產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物。此外，由于RNA僅必須進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)而不是細(xì)胞核，因此通常的轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)致極高的轉(zhuǎn)染率。此外，基于質(zhì)粒的方法需要驅(qū)動目的基因表達(dá)的啟動子在所研究的細(xì)胞中有活性。

在另一個方面，RNA構(gòu)建體可通過電穿孔遞送入細(xì)胞。參見例如，將核酸構(gòu)建體電穿孔進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞的制劑與方法，如US 2004/0014645、US 2005/0052630A1、US 2005/0070841 A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1中所教導(dǎo)。任何已知細(xì)胞類型的電穿孔所需的多種參數(shù)(包括電場強(qiáng)度)一般在相關(guān)研究文獻(xiàn)中以及本領(lǐng)域的許多專利和應(yīng)用中是已知的。參見例如美國專利號6,678,556、美國專利號7,171,264和美國專利號7,173,116。用于電穿孔治療應(yīng)用的設(shè)備是可商購獲得的，例如MedPulser^TM DNA電穿孔治療系統(tǒng)(Inovio/Genetronics，San Diego，Calif.)，并描述于專利中，如美國專利號6,567,694；美國專利號6,516,223、美國專利號5,993,434、美國專利號6,181,964、美國專利號6,241,701和美國專利號6,233,482；電穿孔也可用于體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞，例如在US20070128708A1中所述。電穿孔也可以用于在體外將核酸遞送到細(xì)胞中。

因此，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多可獲得的裝置和電穿孔系統(tǒng)中的任一種，經(jīng)電穿孔介導(dǎo)將包括表達(dá)構(gòu)建體的核酸施用到細(xì)胞中，提出了用于將目的RNA遞送到靶細(xì)胞的令人興奮的新手段。

T細(xì)胞來源

在本發(fā)明T細(xì)胞的擴(kuò)增和遺傳修飾之前，可以從對象獲得T細(xì)胞來源。T細(xì)胞可以從許多來源獲得，包括外周血單核細(xì)胞、骨髓、淋巴結(jié)組織、臍帶血、胸腺組織，來自感染部位的組織、腹水、胸膜積液、脾組織和腫瘤。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以使用本領(lǐng)域可用的任何數(shù)量的T細(xì)胞系。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以使用技術(shù)人員已知的任何數(shù)量的技術(shù)例如Ficoll^TM分離從獲自對象的血液單位獲得T細(xì)胞。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，來自個體循環(huán)血液的細(xì)胞通過單采血液成分術(shù)(apheresis)獲得。單采血液成分術(shù)產(chǎn)物通常含有淋巴細(xì)胞，包括T細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、B細(xì)胞，其他有核白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板。在一個實(shí)施方案中，可以洗滌通過單采血液成分術(shù)收集的細(xì)胞以除去血漿級分并將細(xì)胞置于適當(dāng)?shù)木彌_液或培養(yǎng)基中以用于后續(xù)處理步驟。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，用磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffered saline，PBS)洗滌細(xì)胞。在一個替代實(shí)施方案中，洗滌溶液缺少鈣并且可缺少鎂或可缺少許多(如果不是全部)二價陽離子。再次令人驚訝地，在不存在鈣的情況下的初始活化步驟導(dǎo)致活化的放大。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易理解的，洗滌步驟可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法實(shí)現(xiàn)，例如通過根據(jù)制造商的說明書使用半自動化“無逆流”離心機(jī)(例如，Cobe 2991細(xì)胞處理器，Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)。洗滌后，可以將細(xì)胞重懸浮在多種生物相容性緩沖液中，例如不含Ca²⁺、不含Mg²⁺的PBS、PlasmaLyte A或者含有或不含緩沖液的其他鹽水溶液。或者，可以除去單采血液成分術(shù)樣品不需要的組分，并將細(xì)胞直接重懸浮在培養(yǎng)基中。

在另一個實(shí)施方案中，通過裂解紅細(xì)胞并消耗單核細(xì)胞(例如通過PERCOLL^TM梯度離心或通過逆流離心淘析)從外周血淋巴細(xì)胞分離T細(xì)胞?？梢酝ㄟ^陽性或陰性選擇技術(shù)進(jìn)一步分離特定的T細(xì)胞亞群，例如CD3⁺、CD28⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD45RA⁺和CD45RO⁺T細(xì)胞。例如，在一個實(shí)施方案中，通過與抗CD3/抗CD28(即3x28)綴合珠(例如M-450 CD3/CD28T)孵育足以進(jìn)行陽性選擇所需T細(xì)胞的時間段來分離T細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，該時間段為約30分鐘。在另一個實(shí)施方案中，時間段范圍為30分鐘至36小時或更長，以及其間的所有整數(shù)值。在另一個實(shí)施方案中，所述時間段為至少1、2、3、4、5或6小時。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述時間段為10至24小時。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，孵育時間段為24小時。為了從患有白血病的患者中分離T細(xì)胞，使用更長的孵育時間(例如24小時)可以提高細(xì)胞產(chǎn)量。在與其他細(xì)胞類型相比有很少T細(xì)胞的任何情況下，例如從腫瘤組織或免疫受損個體分離腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)的情況下，可以使用更長的孵育時間來分離T細(xì)胞。此外，使用更長的孵育時間可以提高捕獲CD8+T細(xì)胞的效率。因此，通過簡單地縮短或延長T細(xì)胞被允許結(jié)合CD3/CD28珠的時間和/或通過提高或降低珠與T細(xì)胞的比(如本文進(jìn)一步描述)，可以在培養(yǎng)起始時或在過程中的其他時間點(diǎn)優(yōu)先選擇T細(xì)胞亞群或針對其選擇T細(xì)胞亞群。此外，通過提高或降低珠或其他表面上的抗CD3和/或抗CD28抗體的比，可以在培養(yǎng)起始或其他所需時間點(diǎn)優(yōu)先選擇T細(xì)胞亞群或針對其選擇T細(xì)胞亞群。技術(shù)人員將認(rèn)識到，多輪選擇也可以用于本發(fā)明的上下文中。在某些實(shí)施方案中，可能需要執(zhí)行選擇過程并在活化和擴(kuò)增過程中使用“未選擇的”細(xì)胞?！拔催x擇的”細(xì)胞也可以進(jìn)行其他輪的選擇。

通過陰性選擇進(jìn)行的T細(xì)胞群富集可以與針對陰性選擇的細(xì)胞特有的表面標(biāo)志物的抗體的組合來實(shí)現(xiàn)。一種方法是通過陰性磁性免疫粘附或流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞分選和/或選擇，其使用針對存在于陰性選擇的細(xì)胞上的細(xì)胞表面標(biāo)志物的單克隆抗體混合物。例如，為了通過陰性選擇來富集CD4⁺細(xì)胞，單克隆抗體混合物通常包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗體。在某些實(shí)施方案中，可能需要富集或陽性選擇通常表達(dá)CD4⁺、CD25⁺、CD62L^hi、GITR⁺和FoxP3⁺的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。

或者，在某些實(shí)施方案中，通過抗C25綴合的珠或其他類似的選擇方法耗盡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。

為了通過陽性或陰性選擇分離所需的細(xì)胞群，可以改變細(xì)胞和表面(例如，顆粒(如珠))的濃度。在某些實(shí)施方案中，可能期望顯著降低珠和細(xì)胞混合在一起的體積(即，提高細(xì)胞的濃度)，以確保細(xì)胞和珠的最大接觸。例如，在一個實(shí)施方案中，使用20億個細(xì)胞/ml的濃度。在一個實(shí)施方案中，使用10億個細(xì)胞/ml的濃度。在另一個實(shí)施方案中，使用大于1億個細(xì)胞/ml。在另一個實(shí)施方案中，使用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000萬個細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度。在另一個實(shí)施方案中，使用7500、8000、8500、9000、9500萬或1億個細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度。在其他實(shí)施方案中，可以使用1.25或1.5億個細(xì)胞/ml的濃度。使用高濃度可以導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)量、細(xì)胞活化和細(xì)胞擴(kuò)增的增加。此外，高細(xì)胞濃度的使用允許更有效地捕獲可能弱表達(dá)目的靶抗原(例如CD28陰性T細(xì)胞)的細(xì)胞，或從存在許多腫瘤細(xì)胞的樣品(即白血病血液、腫瘤組織等)中捕獲細(xì)胞。這樣的細(xì)胞群可具有治療價值并且是期望獲得的。例如，使用高濃度的細(xì)胞允許更有效地選擇通常具有更弱CD28表達(dá)的CD8⁺T細(xì)胞。

在一個相關(guān)實(shí)施方案中，可能需要使用更低濃度的細(xì)胞。通過顯著稀釋T細(xì)胞和表面(例如顆粒(如珠))的混合物，顆粒與細(xì)胞之間的相互作用被最小化。這選擇表達(dá)大量期望抗原的細(xì)胞結(jié)合到顆粒。例如，CD4⁺T細(xì)胞表達(dá)更高水平的CD28，并且與稀釋濃度的CD8⁺T細(xì)胞相比被更有效地捕獲。在一個實(shí)施方案中，所用細(xì)胞的濃度為5×10⁶/ml。在另一些實(shí)施方案中，所用的濃度可以為約1×10⁵/ml至1×10⁶/ml，以及其間的任何整數(shù)值。

在另一些實(shí)施方案中，細(xì)胞可以在2至10℃或室溫下在旋轉(zhuǎn)器上以變化的速度孵育不同長度的時間。

用于刺激的T細(xì)胞也可在洗滌步驟后冷凍。不希望受理論束縛，冷凍和隨后的解凍步驟會通過除去細(xì)胞群中的粒細(xì)胞和一定程度的單核細(xì)胞而提供更均勻的產(chǎn)物。在除去血漿和血小板的洗滌步驟后，可以將細(xì)胞懸浮在冷凍溶液中。盡管許多冷凍溶液和參數(shù)在本領(lǐng)域中是已知的并且在本文的上下文中將是可用的，一種方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或培養(yǎng)基，其含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO，或31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO，或含有例如Hespan和PlasmaLte A的其他合適的細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基，然后將細(xì)胞以1°每分鐘的速率冷凍至-80℃，并儲存在液氮儲罐的汽相中。可以使用其他受控冷凍的方法，以及立即在-20℃下或在液氮中的不受控制的冷凍。在某些實(shí)施方案中，如本文所述解凍和洗滌冷凍保存的細(xì)胞，并使其在使用本發(fā)明的方法活化之前在室溫下靜置1小時。

在本發(fā)明的上下文中還涵蓋，當(dāng)可能需要本文所述的擴(kuò)增細(xì)胞之前的時間段，從對象收集血液樣品或單采血液成分術(shù)產(chǎn)物。因此，可以在任何需要的時間點(diǎn)收集待擴(kuò)增的細(xì)胞的來源，并分離和冷凍期望的細(xì)胞(例如T細(xì)胞)以在之后用于針對任何數(shù)量的疾病或病癥的T細(xì)胞治療，所述疾病或病癥將受益于T細(xì)胞治療，例如本文所述的那些。在一個實(shí)施方案中，從通常健康的對象獲取血液樣品或單采血液成分。在某些實(shí)施方案中，血液樣品或單采血液成分取自具有發(fā)生疾病風(fēng)險但是尚未發(fā)生疾病的通常健康的對象，并且分離并冷凍目的細(xì)胞用于以后使用。在某些實(shí)施方案中，T細(xì)胞可以擴(kuò)增、冷凍，并在以后使用。在某些實(shí)施方案中，在診斷本文所述的特定疾病之后不久但在任何治療之前從患者收集樣品。在另一個實(shí)施方案中，在任何數(shù)量的相關(guān)治療方式之前，從來自對象的血液樣品或者單采血液成分中分離細(xì)胞，所述治療方式包括但不限于用以下治療：藥劑例如那他珠單抗、依法珠單抗、抗病毒劑、化學(xué)治療、放射、免疫抑制劑如環(huán)孢素(cyclosporin)、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506、抗體，或其他免疫清除劑(immunoablative agent)如CAMPATH、抗CD3抗體、環(huán)磷酰胺、氟達(dá)拉濱、環(huán)孢素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、類固醇、FR901228和輻照。這些藥物抑制鈣依賴性磷酸酶鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(環(huán)孢菌素(cyclosporine)和FK506)或抑制對生長因子誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等，Cell 66：807-815，1991；Henderson等，Immun.73：316-321，1991；Bierer等，Curr.Opin.Immun.5：763-773，1993)。在另一個實(shí)施方案中，針對患者分離細(xì)胞并冷凍用于隨后的聯(lián)用(例如，在之前、同時或之后)，所述聯(lián)用為與骨髓或干細(xì)胞移植，使用化學(xué)治療劑例如氟達(dá)拉濱、外束放射治療(external-beam radiation theraoy，XRT)、環(huán)磷酰胺或抗體(如OKT3或CAMPATH)的T細(xì)胞清除治療聯(lián)用。在另一個實(shí)施方案中，細(xì)胞在之前分離，并且可以冷凍以隨后用于B細(xì)胞清除治療之后的治療，例如與CD20反應(yīng)的藥劑(例如利妥昔單抗)。

在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，T細(xì)胞為治療后直接從患者獲得。在這方面，已經(jīng)觀察到在某些癌癥治療之后，特別是使用損害免疫系統(tǒng)的藥物的治療之后，在患者通常從治療中恢復(fù)期間的治療后不久，所獲得的T細(xì)胞的質(zhì)量可能是對其離體擴(kuò)增能力而言最佳的或改善的。同樣，在使用本文所述的方法的離體操作之后，這些細(xì)胞可以處于植入和體內(nèi)擴(kuò)增增強(qiáng)的優(yōu)選狀態(tài)。因此，在本發(fā)明的上下文中，預(yù)期在該恢復(fù)階段期間收集血細(xì)胞，包括T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞或造血譜系的其他細(xì)胞。此外，在某些實(shí)施方案中，動員(mobilization)(例如，用GM-CSF動員)和條件化(condition)方案可用于在對象中產(chǎn)生這樣的條件，其中特定細(xì)胞類型的再群體化(repopulation)、再循環(huán)、再生和/或擴(kuò)增是有利的，特別是在治療后的確定的時間窗口期間。舉例說明性細(xì)胞類型包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和免疫系統(tǒng)的其他細(xì)胞。

T細(xì)胞的活化和擴(kuò)增

無論在T細(xì)胞的遺傳修飾之前或之后表達(dá)所需的CAR，一般均可以使用例如在以下專利中所述的方法活化和擴(kuò)增T細(xì)胞：美國專利6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041和美國專利申請公開號20060121005。

通常，通過與其上連接有刺激CD3/TCR復(fù)合物相關(guān)信號的試劑和刺激T細(xì)胞表面上的共刺激分子的配體的表面接觸而擴(kuò)增本發(fā)明的T細(xì)胞。特別地，可以如本文所述刺激T細(xì)胞群，例如通過與固定在表面上的抗CD3抗體或其抗原結(jié)合片段或抗CD2抗體接觸，或通過與聯(lián)合鈣離子載體的蛋白激酶C活化劑(例如苔蘚蟲素，bryostatin)接觸。對于T細(xì)胞表面上輔助分子的共刺激，使用結(jié)合輔助分子的配體。例如，可以在適于刺激T細(xì)胞增殖的條件下使T細(xì)胞群與抗CD3抗體和抗CD28抗體接觸。為了刺激CD4⁺T細(xì)胞或CD8⁺T細(xì)胞的增殖，使用抗CD3抗體和抗CD28抗體?？笴D28抗體的實(shí)例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，Besancon，法國)，可以如本領(lǐng)域通常已知的其他方法那樣使用(Berg等，Transplant Proc.30(8)：3975-3977，1998；Haanen等，J.Exp.Med.190(9)：13191328，1999；Garland等，J.Immunol Meth.227(l-2)：53-63，1999)。

在某些實(shí)施方案中，T細(xì)胞的初級刺激信號和共刺激信號可以通過不同的方案提供。例如，提供每個信號的試劑可以在溶液中或偶聯(lián)到表面。當(dāng)偶聯(lián)到表面時，試劑可偶聯(lián)到同一表面(即“順式”形式)或偶聯(lián)到不同的表面(即“反式”形式)?；蛘?，可以將一種試劑偶聯(lián)到表面，而另一種試劑在溶液中。在一個實(shí)施方案中，提供共刺激信號的試劑結(jié)合到細(xì)胞表面，而提供初級活化信號的試劑在溶液中或偶聯(lián)到表面。在某些實(shí)施方案中，這兩種試劑均可以在溶液中。在另一個實(shí)施方案中，試劑可以是可溶形式，然后交聯(lián)到表面，例如表達(dá)Fc受體的細(xì)胞或抗體或?qū)⒔Y(jié)合所述試劑的其他結(jié)合劑。在這方面，參見例如人工抗原呈遞細(xì)胞(artificial antigen presenting cell，aAPC)的美國專利申請公開號20040101519和20060034810，其被考慮用于本發(fā)明中的T細(xì)胞活化和擴(kuò)增。

在一些實(shí)施方案中，將兩種試劑固定在珠上，或者在相同的珠上，即“順式”，或者在不同的珠上，即“反式”。舉例來說，提供初級活化信號的試劑是抗CD3抗體或其抗原結(jié)合片段，并且提供共刺激信號的試劑是抗CD28抗體或其抗原結(jié)合片段；并且這兩種試劑以相等的分子量共同固定至相同的珠。在一個實(shí)施方案中，使用了1∶1比例的與珠結(jié)合的每種抗體以用于CD4⁺T細(xì)胞擴(kuò)增和T細(xì)胞生長。在本發(fā)明的某些方面，使用這樣的與珠結(jié)合的抗CD3∶CD28抗體的比例，以使得與使用1∶1的比例觀察到的擴(kuò)增相比，觀察到T細(xì)胞擴(kuò)增的增加。在一個具體實(shí)施方案中，與使用1∶1的比例觀察到的擴(kuò)增相比，觀察到約1至約3倍的增加。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合珠的CD3∶CD28抗體的比例范圍為100∶1到1∶100和其間的所有整數(shù)值。在本發(fā)明的一個方面，與抗CD3抗體相比，更多的抗CD28抗體結(jié)合至顆粒，即CD3∶CD28的比例小于1。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，結(jié)合珠的抗CD28抗體與抗CD3抗體的比例大于2∶1。在一個特定實(shí)施方案中，使用1∶100的結(jié)合珠的CD3∶CD28抗體比例。在另一個實(shí)施方案中，使用1∶75的結(jié)合珠的CD3∶CD28抗體比例。在另一個實(shí)施方案中，使用1∶50的結(jié)合珠的CD3∶CD28抗體比例。在另一個實(shí)施方案中，使用1∶30的結(jié)合珠的CD3∶CD28抗體比例。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，使用1∶10的結(jié)合珠的CD3∶CD28抗體比例。在另一個實(shí)施方案中，使用1∶3的結(jié)合珠的CD3∶CD28抗體比例。在另一個實(shí)施方案中，使用3∶1的結(jié)合珠的CD3∶CD28抗體比例。

1∶500至500∶1的顆粒與細(xì)胞的比例以及之間的任何整數(shù)值可用于刺激T細(xì)胞或其他靶細(xì)胞。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易理解的，顆粒與細(xì)胞的比例可以取決于相對于靶細(xì)胞的顆粒大小。例如，小尺寸珠只能結(jié)合幾個細(xì)胞，而較大的珠?？梢越Y(jié)合許多細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞與顆粒的比例范圍為1∶100至100∶1以及其間的任何整數(shù)值，并且在另一些實(shí)施方案中，比例包括1∶9至9∶1以及其間的任何整數(shù)值，其也可以用于刺激T細(xì)胞。導(dǎo)致T細(xì)胞刺激的抗CD3偶聯(lián)顆粒和抗CD28偶聯(lián)顆粒與T細(xì)胞的比例可以如上所述變化，然而某些優(yōu)選的值包括1∶100、1∶50、1∶40、1∶30、1∶20、1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1和15∶1，一個優(yōu)選的比例為每個T細(xì)胞至少1∶1的顆粒。在一個實(shí)施方案中，使用顆粒與細(xì)胞的比例為1∶1或更小。在一個具體實(shí)施方案中，優(yōu)選的顆粒：細(xì)胞比為1∶5。在另一些實(shí)施方案中，顆粒與細(xì)胞的比可以根據(jù)刺激的天數(shù)而變化。例如，在一個實(shí)施方案中，顆粒與細(xì)胞的比例在第一天為1∶1至10∶1，并且之后每天或每隔一天將額外的顆粒添加至細(xì)胞多至10天，最終比例為1∶1至1∶10(基于添加當(dāng)天的細(xì)胞計(jì)數(shù))。在一個具體實(shí)施方案中，顆粒與細(xì)胞的比例在刺激的第一天為1∶1，并在刺激的第三和第五天調(diào)整為1∶5。在另一個實(shí)施方案中，在每天或每隔一天的基礎(chǔ)上添加顆粒，至最終比例在刺激的第一天為1∶1，在第三和第五天為1∶5。在另一個實(shí)施方案中，顆粒與細(xì)胞的比例在刺激的第一天為2∶1，并且在刺激的第三天和第五天調(diào)整為1∶10。在另一個實(shí)施方案中，在每天或每隔一天的基礎(chǔ)上添加顆粒，至最終比例在刺激的第一天為1∶1，在第三和第五天為1∶10。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，多種其他比例可適用于本發(fā)明。特別地，比例將根據(jù)顆粒尺寸以及細(xì)胞尺寸和類型而變化。

在本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，將細(xì)胞(例如T細(xì)胞)與藥劑包被的珠組合，隨后分離珠和細(xì)胞，然后培養(yǎng)細(xì)胞。在一個替代的實(shí)施方案中，在培養(yǎng)之前，藥劑包被的珠和細(xì)胞不分離，而是一起培養(yǎng)。在另一個實(shí)施方案中，首先通過施加力(例如磁力)濃縮珠和細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞表面標(biāo)志物的連接增加，從而誘導(dǎo)細(xì)胞刺激。

舉例來說，可以通過使連接有抗CD3和抗CD28的順磁珠(3×28個珠)與T細(xì)胞接觸來連接細(xì)胞表面蛋白。在一個實(shí)施方案中，將細(xì)胞(例如，10⁴至10⁹個T細(xì)胞)和珠(例如，比例為1∶1的M-450CD3/CD28T順磁珠)在緩沖液中組合，優(yōu)選PBS(無二價陽離子如鈣和鎂)。同樣，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地理解，可以使用任何細(xì)胞濃度。例如，靶細(xì)胞在樣品中可能是非常稀少的并且僅包含0.01％的樣品，或者整個樣品(即100％)可包含目的靶細(xì)胞。因此，任何細(xì)胞數(shù)目均在本發(fā)明的情形中。在某些實(shí)施方案中，可能需要顯著降低顆粒和細(xì)胞混合在一起的體積(即，提高細(xì)胞的濃度)，以確保細(xì)胞和顆粒的最大接觸。例如，在一個實(shí)施方案中，使用約20億個細(xì)胞/ml的濃度。在另一個實(shí)施方案中，使用大于1億個細(xì)胞/ml。在另一個實(shí)施方案中，使用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000萬個細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度。在另一個實(shí)施方案中，使用7500、8000、8500、9000、9500萬或1億個細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度。在另一些實(shí)施方案中，可以使用1.25或1.5億個細(xì)胞/ml的濃度。使用高濃度可以導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)量、細(xì)胞活化和細(xì)胞擴(kuò)增的增加。此外，高細(xì)胞濃度的使用允許更有效地捕獲可能弱表達(dá)目的靶抗原(例如CD28陰性T細(xì)胞)的細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，這樣的細(xì)胞群可具有治療價值并且是期望獲得的。例如，使用高濃度的細(xì)胞允許更有效地選擇通常具有更弱CD28表達(dá)的CD8⁺T細(xì)胞。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，混合物可以培養(yǎng)幾小時(約3小時)至約14天或其間的任何小時整數(shù)值。在另一個實(shí)施方案中，可以將混合物培養(yǎng)21天。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，將珠和T細(xì)胞一起培養(yǎng)約8天。在另一個實(shí)施方案中，將珠和T細(xì)胞一起培養(yǎng)2至3天。也可能需要幾個刺激循環(huán)，以使得T細(xì)胞的培養(yǎng)時間可以是60天或更長。適于T細(xì)胞培養(yǎng)的條件包括可含有增殖和存活所必需的因子的合適培養(yǎng)基(例如，最低必須培養(yǎng)基或RPMI培養(yǎng)基1640或X-vivo 15(Lonza))，包含血清(例如胎?；蛉搜?、白介素-2(interleukin-2，IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFp和TNF-α或技術(shù)人員已知的用于細(xì)胞生長的任何其他添加劑。用于細(xì)胞生長的其他添加劑包括但不限于表面活性劑、人血漿蛋白制劑(plasmanate)和還原劑，例如N-乙?；腚装彼岷?-巰基乙醇。培養(yǎng)基可以包括添加了氨基酸、丙酮酸鈉和維生素的RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo15和X-Vivo 20、Optimizer，其中無血清或補(bǔ)充有足夠用于T細(xì)胞生長和擴(kuò)增的適量血清(或血漿)或一組確定的激素，和/或一定量的細(xì)胞因子?？股?，例如青霉素和鏈霉素，僅包含在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)物中，而不包含在將要輸注到對象的細(xì)胞培養(yǎng)物中。將靶細(xì)胞保持在支持生長所需的條件下，例如，適當(dāng)?shù)臏囟?例如37℃)和氣氛(例如空氣加5％CO₂)。

已經(jīng)暴露于不同刺激時間的T細(xì)胞可以表現(xiàn)出不同的特征。例如，通常的血液或單采血液成分的外周血單核細(xì)胞產(chǎn)物具有大于細(xì)胞毒性或抑制性T細(xì)胞群(T_c，CD8⁺)的輔助T細(xì)胞群(3/4，CD4⁺)。通過刺激CD3和CD28受體的T細(xì)胞的離體擴(kuò)增產(chǎn)生了這樣的T細(xì)胞群，其在約第8至9天之前主要由3/4細(xì)胞組成，而在約第8至9天后，該T細(xì)胞群包含越來越多的Tc細(xì)胞群。因此，根據(jù)治療的目的，用主要包含T_H細(xì)胞的T細(xì)胞群輸注對象可能是有利的。類似地，如果已經(jīng)分離了Tc細(xì)胞的抗原特異性亞組，則更大程度地?cái)U(kuò)增該亞組可能是有益的。

此外，除了CD4和CD8標(biāo)志物之外，其他表型標(biāo)志物顯著變化，但在大部分中，其在細(xì)胞擴(kuò)增過程期間可重復(fù)。因此，這種可重復(fù)性使得能夠?yàn)樘囟康亩ㄖ苹罨腡細(xì)胞產(chǎn)物。

治療應(yīng)用

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括經(jīng)修飾以表達(dá)CAR的細(xì)胞(例如，T細(xì)胞)，所述CAR組合了特異性抗體的抗原識別結(jié)構(gòu)域與CD3ζ、CD28、CD27、或其任意組合的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。因此，在一些情況下，經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞可以引發(fā)CAR介導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用CAR將原代T細(xì)胞的特異性重定向到腫瘤抗原的用途。因此，本發(fā)明還提供了刺激針對哺乳動物靶細(xì)胞群或組織的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法，包括向哺乳動物施用表達(dá)CAR的T細(xì)胞的步驟，其中所述CAR包含與預(yù)定靶標(biāo)特異性相互作用的結(jié)合部分，包含例如人CD3ζ的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的ζ鏈部分和共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一類細(xì)胞治療，其中T細(xì)胞被遺傳修飾以表達(dá)CAR，并且CAR T細(xì)胞被輸注到有此需要的接受者。輸注的細(xì)胞能夠殺傷接受者中的腫瘤細(xì)胞。與抗體治療不同，CAR T細(xì)胞能夠在體內(nèi)復(fù)制，從而引起長期持久性，其可導(dǎo)致持續(xù)的腫瘤控制。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的CAR T細(xì)胞可以經(jīng)歷穩(wěn)健的體內(nèi)T細(xì)胞擴(kuò)增，并且可以持續(xù)延長量的時間。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的CAR T細(xì)胞發(fā)展成特異性記憶T細(xì)胞，其可以被重新活化以抑制任何另外的腫瘤形成或生長。例如，本發(fā)明的CD19特異性CAR T細(xì)胞可以經(jīng)歷穩(wěn)健的體內(nèi)T細(xì)胞擴(kuò)增，并在血液和骨髓中以高水平持續(xù)延長量的時間，并形成特異性記憶T細(xì)胞。不希望受任何特定理論的束縛，在遇到并隨后消除表達(dá)替代抗原的靶細(xì)胞后，CAR T細(xì)胞可在體內(nèi)分化成中心記憶樣狀態(tài)。

不希望受任何特定理論的束縛，CAR修飾的T細(xì)胞引發(fā)的抗腫瘤免疫應(yīng)答可以是主動或被動免疫應(yīng)答。此外，CAR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答可以是過繼性免疫治療方法的一部分，其中CAR修飾的T細(xì)胞誘導(dǎo)了對CAR中的抗原結(jié)合部分具有特異性的免疫應(yīng)答。例如，CD19特異性CAR T細(xì)胞引發(fā)針對表達(dá)CD19的細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答。

盡管本文公開的數(shù)據(jù)具體公開了包含人抗CD19scFv(例如C4scFv)、跨膜結(jié)構(gòu)域，以及CD28、CD137、CD27和CD3ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的慢病毒載體，但是本發(fā)明應(yīng)當(dāng)解釋為包括如本文別處所述的構(gòu)建體的每個組分的任何數(shù)量的變化。也就是說，本發(fā)明包括使用在CAR中的任何抗原結(jié)合部分以產(chǎn)生對抗原結(jié)合部分具有特異性的CAR介導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答。例如，本發(fā)明CAR中的抗原結(jié)合部分可以靶向腫瘤抗原以用于治療癌癥的目的。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明CAR的抗原結(jié)合部分被設(shè)計(jì)為治療特定的癌癥。例如，可以設(shè)計(jì)CAR具有信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域CD28、CD137、CD27和CD3ζ以靶向FRα，其可用于治療癌癥和病癥，所述癌癥和病癥包括但不限于卵巢癌、肺癌、乳腺癌、腎癌、結(jié)腸直腸癌、其他實(shí)體癌等。如上所述，經(jīng)設(shè)計(jì)靶向CD19的CAR可用于治療癌癥，例如B細(xì)胞相關(guān)癌癥。

本發(fā)明的CAR修飾的T細(xì)胞還可以充當(dāng)哺乳動物中離體免疫和/或體內(nèi)治療的一種疫苗。優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。

關(guān)于離體免疫，在將細(xì)胞施用于哺乳動物之前，在體外發(fā)生以下的至少一種：i)擴(kuò)增細(xì)胞，ii)將編碼CAR的核酸引入細(xì)胞，和/或iii)冷凍保存細(xì)胞。

離體方法在本領(lǐng)域中是公知的，并且在下文中更充分地討論。簡言之，從哺乳動物(優(yōu)選人)分離細(xì)胞并用表達(dá)本文公開的CAR的載體進(jìn)行遺傳修飾(即，體外轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)。可以將CAR修飾的細(xì)胞施用于哺乳動物接受者以提供治療益處。所述哺乳動物接受者可以是人，并且CAR修飾的細(xì)胞對于接受者可以是自體的。或者，細(xì)胞對于接受者可以是同種異體、同基因或異種的。

用于離體擴(kuò)增造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的方法描述于美國專利號5,199,942中，其通過引用并入本文，其可以應(yīng)用于本發(fā)明的細(xì)胞。其他合適的方法是本領(lǐng)域已知的，因此本發(fā)明不限于細(xì)胞離體擴(kuò)增的任何特定方法。簡言之，T細(xì)胞的離體培養(yǎng)和擴(kuò)增包括：(1)從哺乳動物的外周血采集物或骨髓外植體收集CD34+造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞；并且(2)離體擴(kuò)增這樣的細(xì)胞。除了在美國專利號5,199,942中描述的細(xì)胞生長因子之外，其他因子如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配體也可用于細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增。除了在離體免疫方面使用基于細(xì)胞的疫苗之外，本發(fā)明還提供用于體內(nèi)免疫以引發(fā)針對患者中抗原的免疫應(yīng)答的組合物和方法。

通常，如本文所述活化和擴(kuò)增的細(xì)胞可用于治療和預(yù)防在免疫受損的個體中出現(xiàn)的疾病。特別地，本發(fā)明的CAR修飾的T細(xì)胞用于治療卵巢癌。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞用于治療處于發(fā)生卵巢癌風(fēng)險中的患者。因此，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防卵巢癌的方法，其包括向有此需要的對象施用治療有效量的本發(fā)明的CAR修飾的T細(xì)胞。

本發(fā)明的CAR修飾的T細(xì)胞可以單獨(dú)施用，或作為藥物組合物與稀釋劑和/或與其他組分例如IL-2或其他細(xì)胞因子或細(xì)胞群組合施用。簡言之，本發(fā)明的藥物組合物可以包含本文所述的靶細(xì)胞群，其與一種或更多種藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑組合。這樣的組合物可以包含緩沖液，例如中性緩沖鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水等；碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質(zhì)；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化劑；螯合劑如EDTA或谷胱甘肽；助劑(例如氫氧化鋁)；和防腐劑。

本發(fā)明的組合物優(yōu)選配制成用于靜脈內(nèi)施用。

本發(fā)明的藥物組合物可以以適于待治療(或預(yù)防)的疾病的方式施用。將通過諸如患者的狀況、患者疾病的類型和嚴(yán)重程度等因素來確定施用的量和頻率，盡管合適的劑量可以通過臨床試驗(yàn)確定。

當(dāng)指“免疫有效量”、“抗腫瘤有效量”、“腫瘤抑制有效量”或“治療量”時，待施用的本發(fā)明組合物的精確量可以由醫(yī)生考慮年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉(zhuǎn)移程度和患者(對象)的狀況的個體差異來確定。一般而言，包含本文所述T細(xì)胞的藥物組合物可以以10⁴至10⁹個細(xì)胞/kg體重，優(yōu)選10⁵至10⁶個細(xì)胞/kg體重的劑量施用，包括那些范圍內(nèi)的所有整數(shù)值。T細(xì)胞組合物也可以以這些劑量施用多次?？梢酝ㄟ^使用在免疫治療中通常已知的輸注技術(shù)施用細(xì)胞(參見例如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319：1676，1988)。對于特定患者的最佳劑量和治療方案可以由醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員通過監(jiān)測患者的疾病病征并相應(yīng)地調(diào)整治療而容易地確定。

在某些實(shí)施方案中，可能期望向?qū)ο笫┯没罨腡細(xì)胞，然后根據(jù)本發(fā)明隨后再次抽取血液(或已進(jìn)行單采血液成分術(shù))，從其中活化T細(xì)胞，并用這些活化和擴(kuò)增的T細(xì)胞再輸注患者。該過程可以每幾周進(jìn)行多次。在某些實(shí)施方案中，T細(xì)胞可以從10cc至400cc抽取的血液活化。在某些實(shí)施方案中，T細(xì)胞從20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc抽取的血液活化。不受理論束縛，使用這種多次抽血/多次再輸注方案可用于選擇出某些T細(xì)胞群。

主題組合物的施用可以以任何方便的方式進(jìn)行，包括通過霧化吸入、注射、攝入、輸血、植入或移植。本文所述的組合物可以皮下、皮內(nèi)、腫瘤內(nèi)、結(jié)內(nèi)(intranodally)、髓內(nèi)、肌內(nèi)、通過靜脈內(nèi)(i.v.)注射或腹膜內(nèi)向患者施用。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的T細(xì)胞組合物通過皮內(nèi)或皮下注射向患者施用。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的T細(xì)胞組合物優(yōu)選通過i.v.注射來施用。T細(xì)胞的組合物可以直接注射到腫瘤、淋巴結(jié)或感染部位中。

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，將使用本文所述的方法或本領(lǐng)域已知的其中將T細(xì)胞擴(kuò)增至治療水平的其他方法活化并擴(kuò)增的細(xì)胞與任何數(shù)量的相關(guān)治療方式結(jié)合(例如，之前、同時或之后)向患者施用，所述治療方式包括但不限于用藥劑治療如抗病毒治療、西多福韋和白細(xì)胞介素-2、阿糖胞苷(也稱為ARA-C)或那他珠單抗來治療MS患者，或依法珠單抗來治療銀屑病患者，或其他治療來治療PML患者。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的T細(xì)胞可與以下聯(lián)用：化學(xué)治療、放射、免疫抑制劑，例如環(huán)孢素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506、抗體，或其他免疫清除劑例如CAM PATH、抗CD3抗體或其他抗體療法、細(xì)胞毒素、氟達(dá)拉濱、環(huán)孢素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、類固醇、FR901228、細(xì)胞因子和輻照。這些藥物抑制鈣依賴性磷酸酶鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(環(huán)孢菌素和FK506)或抑制對生長因子誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)重要的p70S6激酶(雷帕霉素)。在另一個實(shí)施方案中，將本發(fā)明的細(xì)胞組合物與以下聯(lián)合施用(例如，之前、同時或之后)于患者：骨髓移植、使用化學(xué)治療劑例如氟達(dá)拉濱、外束放射治療(XRT)、環(huán)磷酰胺或抗體(如OKT3或CAMPATH)的T細(xì)胞清除治療。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞組合物在B細(xì)胞清除治療后施用，所述B細(xì)胞清除治療例如與CD20反應(yīng)的藥劑，如利妥昔單抗。例如，在一個實(shí)施方案中，對象可以經(jīng)歷高劑量化學(xué)治療，接著為外周血干細(xì)胞移植的標(biāo)準(zhǔn)治療。在某些實(shí)施方案中，在移植后，對象接受本發(fā)明擴(kuò)增的免疫細(xì)胞的輸注。在另一個實(shí)施方案中，在手術(shù)之前或之后施用擴(kuò)增的細(xì)胞。

向患者施用的上述治療的劑量將隨所治療的病癥和治療的接受者的確切性質(zhì)而變化。可以根據(jù)本領(lǐng)域接受的實(shí)踐進(jìn)行用于人體施用的劑量的標(biāo)度。對于成年患者，例如CAMPATH的劑量通常在1至約100mg的范圍內(nèi)，通常每天施用，持續(xù)1至30天的時間段。優(yōu)選的日劑量為每天1至10mg，但在一些情況下可以使用多至每天40mg的更大劑量(描述于美國專利號6,120,766中)。已經(jīng)討論了CAR T細(xì)胞給藥和日程安排的策略(Ertl等，2011，Cancer Res，71：3175-81；Junghans，2010，Journal of Translational Medicine，8：55)。

實(shí)驗(yàn)實(shí)施例

通過參考以下實(shí)驗(yàn)實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的一些方面。除非另有說明，提供這些實(shí)施例僅僅是為了說明的目的，并且不旨在限制。因此，本發(fā)明絕不應(yīng)被解釋為限于以下實(shí)施例，而是應(yīng)被解釋為涵蓋作為本文提供的教導(dǎo)的結(jié)果而變得明顯的任何和所有變化。

實(shí)施例1：CAR T細(xì)胞工程改造靶向B細(xì)胞惡性腫瘤

圖1-17闡述了多個實(shí)施例，其示出了證明CAR實(shí)施方案可用于治療和有效治愈B細(xì)胞惡性腫瘤的數(shù)據(jù)。下面進(jìn)一步描述數(shù)據(jù)。

過繼性T細(xì)胞治療的限制是MHC限制。腫瘤通過缺失MHC-I和MHC-II逃脫以分別逃避CD8和CD4 T細(xì)胞。CAR-T治療的三個關(guān)鍵包括(a)鑒定靶抗原并獲得scFv(b)高效率基因轉(zhuǎn)移到T細(xì)胞中以及(c)為了功效和安全性而改善T細(xì)胞信號傳導(dǎo)和擴(kuò)增。

使用慢病毒載體向T細(xì)胞遞送CAR可能是有利的，原因如下：

a)容易制備

b)有效負(fù)載大，＞9kb

c)整合到分裂和非分裂細(xì)胞中

d)擴(kuò)增的向性(VSV-G)

e)沒有表達(dá)病毒基因

f)無病毒啟動子(SIN-自身失活)

g)沒有關(guān)于免疫缺陷(AIDS)患者中HIV整合相關(guān)的癌癥的報道。

創(chuàng)建CAR-4S慢病毒載體(圖1)。CAR-4S包括scFv-CD28-CD137-CD27-CD3z-2A-iCasp9。所使用的scFV是抗CD19scFV。添加其他結(jié)構(gòu)域以輔助共信號傳導(dǎo)、T細(xì)胞存活、T細(xì)胞記憶、效應(yīng)物活化和誘導(dǎo)的安全性。將CAR遞送至T細(xì)胞并示出其靶向B-ALL細(xì)胞(圖2)。進(jìn)行CAR T增殖測定，并且示出4S CAR在6天時具有33％的值(圖3)。證明抗CD19 CAR T細(xì)胞能夠殺傷靶CD19白血病細(xì)胞，在一些情況下在8分鐘內(nèi)誘導(dǎo)凋亡(圖4)。

為了提高CAR的安全性，可以使用CAR二聚化和凋亡的合成誘導(dǎo)物(例如AP1903)，其可以與FKBp-Casp9相互作用(圖5)。這種“安全”CAR包括4S-CAR?？梢栽?S-CAR T細(xì)胞中快速誘導(dǎo)凋亡(圖6)。這些4S-CAR可以用于慢病毒-4S-CAR T細(xì)胞治療，例如通過在第1天收集血液和活化T細(xì)胞，在第2至3天進(jìn)行CAR基因轉(zhuǎn)移，在第4天擴(kuò)增CAR T細(xì)胞，以及在第5天將CAR T細(xì)胞輸注到人體中以靶向人的腫瘤(圖7)。作為概念證明，示出慢病毒(lentiviral，LV)基因轉(zhuǎn)移到人T細(xì)胞中是有效的(圖8)。示出這些LV CAR T細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)移后笫5天表達(dá)CD28和CD8或CD28和CD27(圖9)。

接下來，對人患者進(jìn)行兩個病例研究。病例研究1患者的詳情如下：

a)43歲女性-復(fù)發(fā)性難治的Ph+ALL

b)診斷于2007年8月，超CVAD：CR

c)2007年11月，異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)

d)BCR/ABL+：格列衛(wèi)(Gleevec)

e)BCR/ABL＞125％

f)ALL復(fù)發(fā)，伊馬替尼耐藥

g)經(jīng)口達(dá)沙替尼，VDLD+IL-2/胸腺素

h)尼洛替尼抗性

i)普納替尼(Ponatinib)試驗(yàn)，復(fù)發(fā)的BCR/ABL

j)復(fù)發(fā)(BM 35％)。

病例研究1名患者接受1.1×10⁸的CD19 CAR T輸注。輸注后7天的CAR T輸注響應(yīng)包括發(fā)熱(39.7℃)、胸悶、呼吸短促和咳嗽以及血痰。在輸注后9天，患者具有發(fā)熱(40℃，非感染性發(fā)熱)和升高的LDH(1333U/L相對于正常的114至240U/L)。在CAR-T輸注后監(jiān)測血漿IgG，并且在CAR輸注后第19天和之后每3周向患者施用IVIg(圖10)。在CAR-T輸注后也監(jiān)測血漿IgA/IgM水平(圖11)。繼續(xù)病例研究，總共3次輸注：0.6至3×10e7/kg。在第120天，患者為BCR/ABL陰性。監(jiān)測IL-6、干擾素-γ、外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中的CAR拷貝數(shù)和骨髓(bone marrow，BM)中的CAR拷貝數(shù)的水平(圖12)。

進(jìn)行第二個病例研究(病例研究2)。病例研究2患者的詳情如下：

a)34歲男性

b)有2周的腹部腫塊病史

c)活組織檢查：NHL，Burkitt淋巴瘤

a.IHC：CD20(+++)，PAX-5(+++)，CD79a(+++)，CD10(+)，Bcl-6(+)，Mum-1(-)，Ki-67(+＞75％)

b.FISH：Myc易位。

病例研究2患者的治療史如下表所示。

病例研究2中患者的CAR T細(xì)胞輸注治療方案包括在第-7天的PBMC收集和CAR T細(xì)胞制備，在第-6天至-4天施用氟達(dá)拉濱(25mg/m2)，在第8天輸注CAR T細(xì)胞(6×10e7)，在第3天輸注CAR T細(xì)胞(6×10e7)，并在第7天輸注CAR T細(xì)胞(3.0×10e8)。第11天的輸注響應(yīng)包括：

a)發(fā)汗、厭食、惡心、嘔吐、缺氧

b)發(fā)熱：39.3℃

c)低血壓：BP 75/45mmHg

d)HR：150至180bpm

e)流體復(fù)蘇，輸注多巴胺。

還監(jiān)測患者的血清尿酸和肌酸水平(圖14)，以及血清細(xì)胞因子IL-6和干擾素-γ的水平(圖15)。還監(jiān)測IgG、IgA和IgM的水平(圖16)。還監(jiān)測患者的臨床響應(yīng)，并觀察到B細(xì)胞減少(圖17)。

總而言之，4S產(chǎn)生的CAR T細(xì)胞高效靶向B-ALL，CAR T細(xì)胞快速擴(kuò)增并且在體內(nèi)根除B細(xì)胞，輸注的CAR T細(xì)胞能夠快速到達(dá)BM，并且4S CAR設(shè)計(jì)在患者中具有重要的安全特征。

無需進(jìn)一步描述，相信本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以使用前述描述和以下說明性實(shí)施例制備和利用本發(fā)明的化合物并實(shí)施要求保護(hù)的方法。因此，以下工作實(shí)施例具體指出了本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案，并且不應(yīng)被解釋為以任何方式限制本公開內(nèi)容的其余部分。

序列表

<110> 佛羅里達(dá)大學(xué)研究基金會有限公司

<120> 基于CAR的免疫治療

<130> U1197.70039WO00

<150> US 62/002,603

<151> 2014-05-23

<160> 45

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 間隔區(qū)

<400> 1

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 間隔區(qū)

<400> 2

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 間隔區(qū)

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 4

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GS18 間隔區(qū)

<400> 4

Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Ser

<210> 5

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 218S 間隔區(qū)

<400> 5

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Ser Glu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GS8 間隔區(qū)

<400> 6

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1 5

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鉸鏈

<400> 7

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C233S 鉸鏈

<400> 8

Leu Asp Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 9

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C233P 鉸鏈

<400> 9

Val Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> δ5 鉸鏈

<400> 10

Leu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 11

<211> 202

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28氨基酸19-220

<400> 11

Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn

1 5 10 15

Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu

20 25 30

Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys

35 40 45

Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr

50 55 60

Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile

85 90 95

Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly

100 105 110

Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe

115 120 125

Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val

130 135 140

Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

145 150 155 160

Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met

165 170 175

Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala

180 185 190

Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

195 200

<210> 12

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28跨膜結(jié)構(gòu)域

<400> 12

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 13

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28區(qū)

<400> 13

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

35 40 45

Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe

50 55 60

Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn

65 70 75 80

Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr

85 90 95

Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Ala Ser

100 105

<210> 14

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD27氨基酸20-260

<400> 14

Ala Thr Pro Ala Pro Lys Ser Cys Pro Glu Arg His Tyr Trp Ala Gln

1 5 10 15

Gly Lys Leu Cys Cys Gln Met Cys Glu Pro Gly Thr Phe Leu Val Lys

20 25 30

Asp Cys Asp Gln His Arg Lys Ala Ala Gln Cys Asp Pro Cys Ile Pro

35 40 45

Gly Val Ser Phe Ser Pro Asp His His Thr Arg Pro His Cys Glu Ser

50 55 60

Cys Arg His Cys Asn Ser Gly Leu Leu Val Arg Asn Cys Thr Ile Thr

65 70 75 80

Ala Asn Ala Glu Cys Ala Cys Arg Asn Gly Trp Gln Cys Arg Asp Lys

85 90 95

Glu Cys Thr Glu Cys Asp Pro Leu Pro Asn Pro Ser Leu Thr Ala Arg

100 105 110

Ser Ser Gln Ala Leu Ser Pro His Pro Gln Pro Thr His Leu Pro Tyr

115 120 125

Val Ser Glu Met Leu Glu Ala Arg Thr Ala Gly His Met Gln Thr Leu

130 135 140

Ala Asp Phe Arg Gln Leu Pro Ala Arg Thr Leu Ser Thr His Trp Pro

145 150 155 160

Pro Gln Arg Ser Leu Cys Ser Ser Asp Phe Ile Arg Ile Leu Val Ile

165 170 175

Phe Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly Ala Leu Phe Leu

180 185 190

His Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu

195 200 205

Pro Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser

210 215 220

Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser

225 230 235 240

Pro

<210> 15

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD8鉸鏈結(jié)構(gòu)域

<400> 15

Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

1 5 10 15

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

20 25 30

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 16

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD27信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域

<400> 16

Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro

1 5 10 15

Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr

20 25 30

Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro

35 40 45

<210> 17

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD137信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域

<400> 17

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 18

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域

<400> 18

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 19

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域

<400> 19

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 20

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3ζ信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域

<400> 20

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 21

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域

<400> 21

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 22

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4-1BB細(xì)胞內(nèi)TRAF結(jié)合結(jié)構(gòu)域

<400> 22

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 23

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOS細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域

<400> 23

Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn

1 5 10 15

Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg

20 25 30

Leu Thr Asp Val Thr Leu

35

<210> 24

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OX40細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域

<400> 24

Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His

1 5 10 15

Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln

20 25 30

Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile

35 40

<210> 25

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD27細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域

<400> 25

Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro

1 5 10 15

Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr

20 25 30

Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro

35 40 45

<210> 26

<211> 194

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD127細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域

<400> 26

Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys

1 5 10 15

Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val Ser

20 25 30

Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp Asp

35 40 45

Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro

50 55 60

Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln

65 70 75 80

Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile Thr Pro Glu Ser Phe

85 90 95

Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys

100 105 110

Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser

115 120 125

Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly

130 135 140

Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile

145 150 155 160

Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu

165 170 175

Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln

180 185 190

Asn Gln

<210> 27

<211> 416

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CASP9結(jié)構(gòu)域

<400> 27

Met Asp Glu Ala Asp Arg Arg Leu Leu Arg Arg Cys Arg Leu Arg Leu

1 5 10 15

Val Glu Glu Leu Gln Val Asp Gln Leu Trp Asp Ala Leu Leu Ser Arg

20 25 30

Glu Leu Phe Arg Pro His Met Ile Glu Asp Ile Gln Arg Ala Gly Ser

35 40 45

Gly Ser Arg Arg Asp Gln Ala Arg Gln Leu Ile Ile Asp Leu Glu Thr

50 55 60

Arg Gly Ser Gln Ala Leu Pro Leu Phe Ile Ser Cys Leu Glu Asp Thr

65 70 75 80

Gly Gln Asp Met Leu Ala Ser Phe Leu Arg Thr Asn Arg Gln Ala Ala

85 90 95

Lys Leu Ser Lys Pro Thr Leu Glu Asn Leu Thr Pro Val Val Leu Arg

100 105 110

Pro Glu Ile Arg Lys Pro Glu Val Leu Arg Pro Glu Thr Pro Arg Pro

115 120 125

Val Asp Ile Gly Ser Gly Gly Phe Gly Asp Val Gly Ala Leu Glu Ser

130 135 140

Leu Arg Gly Asn Ala Asp Leu Ala Tyr Ile Leu Ser Met Glu Pro Cys

145 150 155 160

Gly His Cys Leu Ile Ile Asn Asn Val Asn Phe Cys Arg Glu Ser Gly

165 170 175

Leu Arg Thr Arg Thr Gly Ser Asn Ile Asp Cys Glu Lys Leu Arg Arg

180 185 190

Arg Phe Ser Ser Leu His Phe Met Val Glu Val Lys Gly Asp Leu Thr

195 200 205

Ala Lys Lys Met Val Leu Ala Leu Leu Glu Leu Ala Gln Gln Asp His

210 215 220

Gly Ala Leu Asp Cys Cys Val Val Val Ile Leu Ser His Gly Cys Gln

225 230 235 240

Ala Ser His Leu Gln Phe Pro Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Gly Cys

245 250 255

Pro Val Ser Val Glu Lys Ile Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr Ser Cys

260 265 270

Pro Ser Leu Gly Gly Lys Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gly

275 280 285

Gly Glu Gln Lys Asp His Gly Phe Glu Val Ala Ser Thr Ser Pro Glu

290 295 300

Asp Glu Ser Pro Gly Ser Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr Pro Phe Gln

305 310 315 320

Glu Gly Leu Arg Thr Phe Asp Gln Leu Asp Ala Ile Ser Ser Leu Pro

325 330 335

Thr Pro Ser Asp Ile Phe Val Ser Tyr Ser Thr Phe Pro Gly Phe Val

340 345 350

Ser Trp Arg Asp Pro Lys Ser Gly Ser Trp Tyr Val Glu Thr Leu Asp

355 360 365

Asp Ile Phe Glu Gln Trp Ala His Ser Glu Asp Leu Gln Ser Leu Leu

370 375 380

Leu Arg Val Ala Asn Ala Val Ser Val Lys Gly Ile Tyr Lys Gln Met

385 390 395 400

Pro Gly Cys Phe Asn Phe Leu Arg Lys Lys Leu Phe Phe Lys Thr Ser

405 410 415

<210> 28

<211> 278

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CASP9截短的結(jié)構(gòu)域

<400> 28

Val Gly Ala Leu Glu Ser Leu Arg Gly Asn Ala Asp Leu Ala Tyr Ile

1 5 10 15

Leu Ser Met Glu Pro Cys Gly His Cys Leu Ile Ile Asn Asn Val Asn

20 25 30

Phe Cys Arg Glu Ser Gly Leu Arg Thr Arg Thr Gly Ser Asn Ile Asp

35 40 45

Cys Glu Lys Leu Arg Arg Arg Phe Ser Ser Leu His Phe Met Val Glu

50 55 60

Val Lys Gly Asp Leu Thr Ala Lys Lys Met Val Leu Ala Leu Leu Glu

65 70 75 80

Leu Ala Gln Gln Asp His Gly Ala Leu Asp Cys Cys Val Val Val Ile

85 90 95

Leu Ser His Gly Cys Gln Ala Ser His Leu Gln Phe Pro Gly Ala Val

100 105 110

Tyr Gly Thr Asp Gly Cys Pro Val Ser Val Glu Lys Ile Val Asn Ile

115 120 125

Phe Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser Leu Gly Gly Lys Pro Lys Leu Phe

130 135 140

Phe Ile Gln Ala Cys Gly Gly Glu Gln Lys Asp His Gly Phe Glu Val

145 150 155 160

Ala Ser Thr Ser Pro Glu Asp Glu Ser Pro Gly Ser Asn Pro Glu Pro

165 170 175

Asp Ala Thr Pro Phe Gln Glu Gly Leu Arg Thr Phe Asp Gln Leu Asp

180 185 190

Ala Ile Ser Ser Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ile Phe Val Ser Tyr Ser

195 200 205

Thr Phe Pro Gly Phe Val Ser Trp Arg Asp Pro Lys Ser Gly Ser Trp

210 215 220

Tyr Val Glu Thr Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln Trp Ala His Ser Glu

225 230 235 240

Asp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Arg Val Ala Asn Ala Val Ser Val Lys

245 250 255

Gly Ile Tyr Lys Gln Met Pro Gly Cys Phe Asn Phe Leu Arg Lys Lys

260 265 270

Leu Phe Phe Lys Thr Ser

275

<210> 29

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FKBP f36v 結(jié)構(gòu)域

<400> 29

Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe

1 5 10 15

Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu

20 25 30

Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys

35 40 45

Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val

50 55 60

Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp

65 70 75 80

Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala

85 90 95

Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu

100 105

<210> 30

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2A 肽接頭

<400> 30

Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20

<210> 31

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2A 肽接頭

<400> 31

Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 32

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2A 肽接頭

<400> 32

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 33

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2A 肽接頭

<400> 33

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 34

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 scfv

<400> 34

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr

195 200 205

Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser

<210> 35

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 scfv

<400> 35

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Gln Ser Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr

195 200 205

Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser

<210> 36

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 scFV

<400> 36

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala

130 135 140

Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala

145 150 155 160

Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly

180 185 190

Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu

195 200 205

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln

210 215 220

Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Lys

<210> 37

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 scfv

<400> 37

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Gln Ser Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala

130 135 140

Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala

145 150 155 160

Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly

180 185 190

Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu

195 200 205

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln

210 215 220

Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Lys

<210> 38

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 scfv

<400> 38

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

115 120 125

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr

130 135 140

Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

145 150 155 160

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

165 170 175

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys Ser

180 185 190

Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys

195 200 205

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

210 215 220

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 39

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 scfv

<400> 39

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

115 120 125

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr

130 135 140

Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

145 150 155 160

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

165 170 175

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Gln Ser Ser Leu Lys Ser

180 185 190

Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys

195 200 205

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

210 215 220

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 40

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 scfv

<400> 40

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met

130 135 140

Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr

145 150 155 160

Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr

165 170 175

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