用于免疫治療的rna制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于免疫治療領(lǐng)域，具體地，屬于腫瘤免疫治療領(lǐng)域。本發(fā)明提供了用于在全身性施用后將RNA遞送至脾中的抗原呈遞細(xì)胞(例如樹突細(xì)胞(DC))的藥物制劑。特別地，本文所述的制劑使得能夠在全身性施用編碼抗原的RNA后誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
【專利說明】用于免疫治療的RNA制劑

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫治療領(lǐng)域，具體屬于腫瘤免疫治療領(lǐng)域。本發(fā)明涉及提供用于在 全身性施用后將RNA高選擇性地遞送至脾的抗原呈遞細(xì)胞（例如樹突細(xì)胞（DC))的藥物制 齊U。特別地，本文所述的制劑使得能夠在全身性施用編碼抗原的RNA后誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。

【背景技術(shù)】
[0002] 核酸（如DNA、siRNA或RNA)用于在患者中進(jìn)行多種治療性干預(yù)是令人感興趣的。 在腫瘤治療中相對(duì)新的免疫學(xué)方法是基于通過編碼RNA在抗原呈遞細(xì)胞（APC)中表達(dá)腫 瘤抗原，以誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤的T細(xì)胞應(yīng)答（Weide，B.等，(2008) Journal of Immunotherapy 31 (2) :180-188 ;Weide，B?等，(2009) Tournal of Immunotherapy 32(5) :498-507 ； Kreiter，S?等，(2010) Cancer Res 70 (22) : 9031-9040 ;Kuhn，A. N?等，(2010) Gene Ther 17(8) :961-971)。用于此種干預(yù)的靶細(xì)胞是存在于例如淋巴結(jié)（LN)或脾中的樹突細(xì)胞 (DC)。
[0003] 為了提供DC對(duì)RNA的充分?jǐn)z取，將RNA局部施用于淋巴結(jié)已被證明是成功的。然 而，這樣的局部施用需要醫(yī)生的專業(yè)技能。因此，需要能夠進(jìn)行全身性施用的RNA制劑，例 如，靜脈內(nèi)（i.v.)施用、皮下（s. c.)施用、皮內(nèi)（i.d.)施用或通過吸入施用。從文獻(xiàn)中 已知多種用于全身性施用核酸的方法。在非病毒基因的轉(zhuǎn)移中，使用陽離子脂質(zhì)體來誘導(dǎo) DNA/RNA縮合，并且促進(jìn)細(xì)胞攝取。陽離子脂質(zhì)體通常由陽離子脂質(zhì)（如D0TAP)和一種或 更多種輔助脂質(zhì)（如DOPE)組成。所謂的"脂質(zhì)體復(fù)合物（lipoplex)"可由陽離子（帶正 電的）脂質(zhì)體和陰離子（帶負(fù)電的）核酸形成。在最簡(jiǎn)單的情況下，脂質(zhì)體復(fù)合物通過某種 混合方案使核酸與脂質(zhì)體混合來自發(fā)形成，但是也可應(yīng)用多種其他方案。帶正電的脂質(zhì)體 與帶負(fù)電的核酸之間的靜電相互作用是形成脂質(zhì)體復(fù)合物的驅(qū)動(dòng)力。除了脂質(zhì)組分以外， 陽離子部分和陰離子部分之間的電荷比也對(duì)有效的縮合和轉(zhuǎn)染起重要作用。一般來說，月旨 質(zhì)體復(fù)合物的過量正電荷被認(rèn)為是有效轉(zhuǎn)染所必需的（Templeton, N. S?等，(1997)Nature Biotechnology 15(7) :647-652 ；Zhdanov, R. I.等，(2002)Bioelectrochemistry 58(1)： 53-64 ；Templeton, N. S. (2003) Current Medicinal Chemistry 10 (14) : 1279-1287)。大多 數(shù)天然膜帶負(fù)電，因此，帶正電的脂質(zhì)體復(fù)合物與帶負(fù)電的生物膜之間的靜電相互吸引作 用可能在細(xì)胞結(jié)合和脂質(zhì)體復(fù)合物攝取方面起作用。被視為轉(zhuǎn)染的最優(yōu)+/_比率的典型范 圍是2至4。如果具有較低的過量正電荷，則轉(zhuǎn)染效率大幅下降至幾乎為零。遺憾的是，由 于已報(bào)道帶正電的脂質(zhì)體和脂質(zhì)體復(fù)合物具有升高的毒性，這對(duì)于這樣的制備物作為藥品 的應(yīng)用是一個(gè)問題。
[0004] 已證實(shí)，上述脂質(zhì)體復(fù)合物能夠在多種器官中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。表達(dá)的具體的器官分布 以復(fù)雜的方式取決于制劑和施用參數(shù)（脂質(zhì)組成、尺寸、施用途徑）。迄今為止，還不能充分 實(shí)現(xiàn)在指定的靶器官或細(xì)胞部分中進(jìn)行選擇性表達(dá)同時(shí)避免在非靶器官中表達(dá)。已經(jīng)報(bào)道 了使用螢光素酶DNA或RNA作為報(bào)道基因（reporter)，在例如肺、肝、脾、腎和心臟中進(jìn)行的 轉(zhuǎn)染。已證明，避免靶向肺和肝特別困難，因?yàn)?，在許多情況下，靶向肺和肝占主導(dǎo)。肺具有 非常大的表面，并且它是經(jīng)i.v.注射的化合物在施用后第一個(gè)通過的器官。肝是脂質(zhì)體和 具有親脂性化合物（如存在于脂質(zhì)體復(fù)合物中的脂質(zhì)）制劑的典型靶器官。
[0005] 對(duì)于基于RNA的免疫治療，由于存在對(duì)肺或肝的免疫應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)，所以靶向肺或 肝可能是有害的。因此，對(duì)于這樣的治療，需要僅對(duì)DC(例如脾中的）具有高選擇性的制劑。 某些配體已被認(rèn)為可改進(jìn)靶向選擇性。例如，包含甘露糖官能化脂質(zhì)的脂質(zhì)體被認(rèn)為能改 進(jìn)對(duì)巨噬細(xì)胞的靶向。然而，這樣的組分使制劑更加復(fù)雜，從而使得實(shí)際的藥物開發(fā)更加復(fù) 雜。此外，選擇性被限制，并且某些脂質(zhì)體級(jí)分仍然被其他器官攝取。另一個(gè)問題是血清的 相互作用以及RNA在血清中的降解，帶正電的脂質(zhì)體復(fù)合物對(duì)其起促進(jìn)作用。此外，對(duì)于治 療適用性，需要滿足藥品在例如化學(xué)穩(wěn)定性和物理穩(wěn)定性方面的要求。此外，用于腹膜內(nèi)應(yīng) 用的產(chǎn)品必須是無菌的并且滿足顆粒特性方面的某些要求。此外，產(chǎn)品必須適合于制造。
[0006] 總之，在開發(fā)具有高的脾選擇性的、滿足用于施用于患者之產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的可注射RNA 制劑方面的問題仍有待解決。
[0007] 本發(fā)明提供了對(duì)上述問題的解決方案。根據(jù)本發(fā)明，提供了具有限定粒徑的納米 顆粒RNA制劑，其中所述顆粒的凈帶電接近為0,或者帶負(fù)電。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案 中，所述RNA納米顆粒是RNA脂質(zhì)體復(fù)合物。意想不到的是，發(fā)現(xiàn)由RNA和脂質(zhì)體形成的電 中性或帶負(fù)電的脂質(zhì)體復(fù)合物在全身性施用后導(dǎo)致RNA在脾DC中大量表達(dá)。測(cè)定出報(bào)道 基因在靶細(xì)胞（脾）中的強(qiáng)表達(dá)，而在其他器官中低表達(dá)。此外，可誘導(dǎo)針對(duì)模式抗原的強(qiáng) 免疫應(yīng)答。這是令人意想不到的，因?yàn)檫^量的正電荷通常被認(rèn)為是成功攝取和表達(dá)的前提 條件。在此，我們已發(fā)現(xiàn)，雖然表達(dá)的絕對(duì)量隨著過量正電荷的降低而降低，但是在全身性 施用后表達(dá)仍然高至足以提供脂質(zhì)體復(fù)合物的治療效力。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明，可形成具有明確限定的粒徑分布特征（通過動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量）并且 具有低級(jí)分的亞可見顆粒的脂質(zhì)體復(fù)合物，其為對(duì)患者進(jìn)行靜脈內(nèi)施用所需的。如果通過 自裝配將脂質(zhì)體與RNA孵育來形成，則初始脂質(zhì)體的粒徑僅受到輕微影響，并且沒有發(fā)現(xiàn) 不期望的大聚集物部分。通過選擇前體脂質(zhì)體的尺寸和混合條件，可得到不同尺寸。這是令 人驚訝的，因?yàn)樵趯NA與陽離子脂質(zhì)體孵育過程中通常觀察到大聚集物的形成。該聚集 物的形成對(duì)于開發(fā)用于靜脈內(nèi)施用或皮下施用可接受的脂質(zhì)體復(fù)合物制劑來說是一個(gè)主 要障礙。所述顆粒在至少24小時(shí)內(nèi)是穩(wěn)定的，并且不傾向于隨時(shí)間而聚集。所述顆粒可進(jìn) 行冷凍和融化，而不會(huì)形成聚集物，同時(shí)保持初始粒徑特征，并且保持生物學(xué)活性。所述顆 ?？蛇M(jìn)行凍干和用水重構(gòu)，而不會(huì)形成聚集物，同時(shí)保持初始粒徑特征，并且保持生物學(xué)活 性。所述顆?？赏ㄟ^不同的方案來制造，這些方案可擴(kuò)展并且可在受控的條件下進(jìn)行。由 于有著這樣的性質(zhì)，本發(fā)明的脂質(zhì)體復(fù)合物制劑在粒徑分布特征和穩(wěn)定性方面滿足藥物制 劑施用于患者的重要要求。此外，與帶正電的脂質(zhì)體復(fù)合物相比，本文所述的RNA納米顆粒 預(yù)期具有更低的毒性并且表現(xiàn)出更小的不期望的血清相互作用。特別地，所述制劑適用于 腸胃外施用，包括靜脈內(nèi)施用和皮下施用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 發(fā)明概述
[0010] 免疫治療策略是用于治療例如感染性疾病和癌癥疾病的有前景的選擇。對(duì)越來越 多的病原體相關(guān)抗原和腫瘤相關(guān)抗原（本文中也稱為腫瘤抗原）的鑒定導(dǎo)致收集了大量用 于免疫治療的合適靶標(biāo)。
[0011] 本發(fā)明一般包含通過靶向病變細(xì)胞來對(duì)疾病進(jìn)行免疫治療。本發(fā)明提供了對(duì)表達(dá) 抗原的細(xì)胞的選擇性清除，從而使對(duì)不表達(dá)所述抗原的正常細(xì)胞的有害作用最小化。因此， 優(yōu)選的用來治療的疾病是其中一種或更多種抗原被表達(dá)的那些，例如癌癥疾病或感染性疾 病。
[0012] 本發(fā)明旨在在患者中通過主動(dòng)免疫來誘導(dǎo)并擴(kuò)增能夠特異性識(shí)別并殺傷病變細(xì) 胞的T細(xì)胞，以特異性靶向表達(dá)抗原的細(xì)胞。具體地，本發(fā)明使表示為RNA的抗原能夠在體 內(nèi)選擇性地進(jìn)入抗原呈遞細(xì)胞（例如，樹突細(xì)胞）中。該抗原可被加工以產(chǎn)生MHC分子的 肽伴侶，或者如果其可與MHC分子結(jié)合的話，則其可在不需要進(jìn)一步加工的情況下被呈遞。 優(yōu)選其中完整抗原在體內(nèi)通過抗原呈遞細(xì)胞被加工的施用形式，因?yàn)檫@還可產(chǎn)生有效免疫 應(yīng)答所需的輔助T細(xì)胞應(yīng)答。因此，當(dāng)施用于患者時(shí)，根據(jù)本發(fā)明所提供的組合物提供了一 種或更多種MHC呈遞表位，用于刺激、引發(fā)和/或擴(kuò)增針對(duì)T細(xì)胞，該T細(xì)胞所針對(duì)的細(xì)胞 表達(dá)MHC所呈遞表位的來源抗原。因此，本文所述的組合物優(yōu)選能夠誘導(dǎo)或促進(jìn)針對(duì)以呈 遞I類MHC抗原為特征之疾病的細(xì)胞應(yīng)答，優(yōu)選細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性。
[0013] 特別地，本發(fā)明涉及包含納米顆粒的藥物組合物，所述納米顆粒包含編碼的至少 一種抗原的RNA，其中：
[0014] (i)所述納米顆粒中的正電荷數(shù)不超過所述納米顆粒中的負(fù)電荷數(shù)，和/或
[0015] (ii)所述納米顆粒具有中性電荷或凈負(fù)電荷，和/或
[0016] (iii)在所述納米顆粒中正電荷與負(fù)電荷的電荷比為1. 4 : 1或更低，和/或
[0017] (iv)所述納米顆粒的4電勢(shì)為0或更低。
[0018] 優(yōu)選地，本文所述納米顆粒在至少2小時(shí)內(nèi)是膠體穩(wěn)定的，S卩，不發(fā)生聚集、沉淀， 或者通過動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量不發(fā)生高于30%的尺寸和多分散性指數(shù)的升高。
[0019] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述納米顆粒中正電荷與負(fù)電荷的電荷比為1.4 : 1至 1 : 8,優(yōu)選1.2 : 1至 1 : 4,例如，I : 1至 1 : 3,例如 1 : 1.2至 1 : 2，1 : 1.2至 1:1.8，1:1.3至1:1.7，特別是1:1.4至1:1.6，例如約1:1.5。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述納米顆粒的4電勢(shì)為-5或更低，-10或更低，-15或更 低，-20或更低或者-25或更低。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述納米顆粒的（電勢(shì)為-35或更 高，-30或更高或者-25或更高。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有OmV至-50mV，優(yōu)選 OmV至-40mV或者-IOmV至-30mV的4電勢(shì)。
[0021] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述納米顆粒包含至少一種脂質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述納 米顆粒包含至少一種陽離子脂質(zhì)。所述陽離子脂質(zhì)可為單陽離子的（monocationic)或多 陽離子的（polycationic)。任何陽離子兩親分子（例如包含至少一個(gè)親水和親脂部分的分 子）都是本發(fā)明涵義范圍內(nèi)的陽離子脂質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述正電荷由所述至少一 種陽離子脂質(zhì)貢獻(xiàn)，而所述負(fù)電荷由所述RNA貢獻(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述納米顆粒包含 至少一種輔助脂質(zhì)。所述輔助脂質(zhì)可為中性脂質(zhì)或陰離子脂質(zhì)。所述輔助脂質(zhì)可為天然脂 質(zhì)（例如磷脂）或天然脂質(zhì)類似物，或完全合成脂質(zhì)，或與天然脂質(zhì)沒有相似性的類脂質(zhì)分 子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述陽離子脂質(zhì)和/或所述輔助脂質(zhì)是形成雙層（bilayer)的脂 質(zhì)。
[0022] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種陽離子脂質(zhì)包括1，2-二-0-十八烯基-3-三甲 基銨丙烷（DOTM)或其類似物或衍生物，和/或1，2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷（DOTAP) 或其類似物或衍生物。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種輔助脂質(zhì)包括1，2-二-(9Z-十八?；?sn-甘 油基-3-憐酸乙醇胺（I，2_di- (9Z_octadecenoyl) -sn-glycero-3-phosphoethanolamin e，DOPE)或其類似物或衍生物、膽固醇（Chol)或其類似物或衍生物和/或1，2_二油酰 基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿（DOPC)或其類似物或衍生物。
[0024] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種陽離子脂質(zhì)與所述至少一種輔助脂質(zhì)的摩爾比 為 10 : 0 至3 : 7,優(yōu)選9 : 1至3 : 7、4 : 1至 I : 2、4 : 1 至 2 : 3、7 : 3至 I : 1 或2 : 1至1 : 1，優(yōu)選約1 : 1。在一個(gè)實(shí)施方案中，在該比率中，所述陽離子脂質(zhì)的摩爾 量通過用所述陽離子脂質(zhì)的摩爾量乘以所述陽離子脂質(zhì)中的正電荷數(shù)而得到。
[0025] 在多個(gè)實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)不被官能化，例如，不被甘露糖、組氨酸和/或咪唑 官能化，所述納米顆粒不包含靶向配體，例如甘露糖官能化的脂質(zhì)，和/或所述納米顆粒 不包含以下的一種或更多種：pH依賴性化合物、陽離子聚合物（例如包含組氨酸和/或 聚賴氨酸的聚合物，其中所述聚合物可任選地被PEG化（PEGylated)和/或組胺酰基化 (histidylated))或二價(jià)離子（例如 Ca2+)。
[0026] 在多個(gè)實(shí)施方案中，所述RNA納米顆粒可包含肽，其優(yōu)選具有高至2500Da的分子 量。
[0027] 在本文所述的納米顆粒中，所述脂質(zhì)可與所述RNA形成復(fù)合物和/或可包封所述 RNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述納米顆粒包含脂質(zhì)體復(fù)合物或脂質(zhì)體。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述脂質(zhì)被包含在包封所述RNA的囊泡中。所述囊泡可為多層囊泡、單層囊泡或其混合物。 所述囊泡可為脂質(zhì)體。
[0028] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述納米顆粒是這樣的脂質(zhì)體復(fù)合物，其包含摩爾比為 10 : 0至1 : 9,優(yōu)選8 : 2至3 : 7,并且更優(yōu)選7 : 3至5 : 5的DOTMA和DOPE，并且 其中DOTMA中的正電荷與RNA中的負(fù)電荷的電荷比為1.8 : 2至0.8 : 2,更優(yōu)選1.6 : 2 至1 : 2,甚至更優(yōu)選1.4 : 2至1.1 : 2,并且甚至更優(yōu)選約1.2 : 2。
[0029] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述納米顆粒是這樣的脂質(zhì)體復(fù)合物，其包含摩爾比為 10 : 0至1 : 9,優(yōu)選8 : 2至3 : 7,并且更優(yōu)選7 : 3至5 : 5的DOTMA和膽固醇，并且 其中DOTMA中的正電荷與RNA中的負(fù)電荷的電荷比為1.8 : 2至0.8 : 2,更優(yōu)選1.6 : 2 至1 : 2,甚至更優(yōu)選1.4 : 2至1.1 : 2,并且甚至更優(yōu)選約1.2 : 2。
[0030] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述納米顆粒是這樣的脂質(zhì)體復(fù)合物，其包含摩爾比為 10 : 0至1 : 9,優(yōu)選8 : 2至3 : 7,并且更優(yōu)選7 : 3至5 : 5的DOTAP和DOPE，并且 其中DOTMA中的正電荷與RNA中的負(fù)電荷的電荷比為1.8 : 2至0.8 : 2,更優(yōu)選1.6 : 2 至1 : 2,甚至更優(yōu)選1.4 : 2至1.1 : 2,并且甚至更優(yōu)選約1.2 : 2。
[0031] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述納米顆粒是這樣的脂質(zhì)體復(fù)合物，其包含摩爾比為2 : 1 至1 : 2,優(yōu)選2 : 1至I : 1的DOTMA和DOPE，并且其中DOTMA中的正電荷與RNA中的負(fù) 電荷的電荷比為1.4 : 1或更低。
[0032] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述納米顆粒是這樣的脂質(zhì)體復(fù)合物，其包含摩爾比為2 : 1 至1 : 2,優(yōu)選2 : 1至I : 1的DOTMA和膽固醇，并且其中DOTMA中的正電荷與RNA中的 負(fù)電荷的電荷比為1.4 : 1或更低。
[0033] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述納米顆粒是這樣的脂質(zhì)體復(fù)合物，其包含摩爾比為2 : I 至1 : 2,優(yōu)選2 : 1至I : 1的DOTAP和DOPE，并且其中DOTAP中的正電荷與RNA中的負(fù) 電荷的電荷比為1.4 : 1或更低。
[0034] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有約50nm至約IOOOnm,優(yōu)選約50nm至約 400nm，優(yōu)選約IOOnm至約300nm，例如約150nm至約200nm的平均粒徑。在一個(gè)實(shí)施方案 中，所述納米顆粒具有約200nm至約700nm、約200nm至約600nm，優(yōu)選約250nm至約550nm， 特別為約300nm至約500nm或約200nm至約400nm范圍內(nèi)的平均粒徑。
[0035] 在一個(gè)實(shí)施方案中，通過動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量的本文所述納米顆粒的多分散性指數(shù)為 〇. 5更低，優(yōu)選0. 4或更低，或者甚至更優(yōu)選0. 3或更低。
[0036] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的納米顆粒可通過以下一種或更多種方式得到：（i) 將水相中的脂質(zhì)體與水相中的RNA-起孵育，（ii)將溶解于水可混溶有機(jī)溶劑（例如乙 醇）中的脂質(zhì)與水溶液中的RNA-起孵育，（iii)逆相蒸發(fā)技術(shù)，（iv)對(duì)所述產(chǎn)物進(jìn)行冷凍 和融化，（V)對(duì)所述產(chǎn)物進(jìn)行脫水和再水化，（vi)對(duì)所述產(chǎn)物進(jìn)行凍干和再水化，或（Vii) 對(duì)所述產(chǎn)物進(jìn)行噴霧干燥和再水化。
[0037] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述納米顆粒通過這樣的方法來生產(chǎn)，其包括將所述RNA與 優(yōu)選0. ImM至5mM (例如0. ImM至4mM或0. 3mM至ImM)濃度的二價(jià)離子一起孵育，然后包含 進(jìn)所述納米顆粒中，和/或?qū)⑺鯮NA與優(yōu)選ImM至500mM(例如IOOmM至200mM或130mM 至170mM)濃度的一價(jià)離子一起孵育，然后包含進(jìn)所述納米顆粒中，和/或?qū)⑺鯮NA與緩 沖劑一起孵育，然后包含進(jìn)所述納米顆粒中的步驟。
[0038] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在對(duì)RNA進(jìn)行二價(jià)陽離子的孵育后，涉及通過添加脂質(zhì)體和/ 或其他水相來進(jìn)行至少大于1. 5倍，優(yōu)選大于2倍，或大于5倍的稀釋步驟。
[0039] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述二價(jià)陽離子是鈣離子，其中所述鈣離子的終濃度低于 4mM，優(yōu)選低于3mM，甚至更優(yōu)選為2. 2mM或更低。
[0040] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的納米顆粒通過這樣的方法來生產(chǎn)，所述方法包括 擠出所述納米顆粒的步驟和/或過濾所述納米顆粒的步驟和/或凍干所述納米顆粒的步 驟。
[0041] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在全身性施用所述納米顆粒后，在脾中發(fā)生RNA表達(dá)。在一個(gè) 實(shí)施方案中，在全身性施用所述納米顆粒后，在肺和/或肝中發(fā)生或基本發(fā)生RNA表達(dá)。在 一個(gè)實(shí)施方案中，在全身性施用所述納米顆粒后，脾中的RNA表達(dá)是肺中RNA表達(dá)量的至少 5倍，優(yōu)選至少8倍，優(yōu)選至少10倍，優(yōu)選至少20倍，優(yōu)選至少50倍，優(yōu)選至少100倍，優(yōu)選 至少1000倍或甚至更高。在一個(gè)實(shí)施方案中，在全身性施用所述納米顆粒后，在脾的抗原 呈遞細(xì)胞中，優(yōu)選專職性抗原呈遞細(xì)胞中，發(fā)生RNA表達(dá)。
[0042] 在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)進(jìn)行全身性施用時(shí)，所述納米顆粒靶向脾，或在脾中累積。 優(yōu)選地，當(dāng)進(jìn)行了全身性施用時(shí)所述納米顆粒將RNA遞送至脾的抗原呈遞細(xì)胞，優(yōu)選專職 性抗原呈遞細(xì)胞，例如樹突細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞。優(yōu)選地，所述納米顆粒在靶器官或靶組織 處釋放RNA，和/或進(jìn)入靶器官或靶組織的細(xì)胞中。優(yōu)選地，所述靶器官或靶組織是脾，所 述靶器官或靶組織處的細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞，例如樹突細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)進(jìn)行了 全身性施用時(shí)，所述納米顆粒不靶向或基本不靶向肺和/或肝，或不在或基本不在肺和/或 肝累積。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶向脾或在脾中累積的納米顆粒的量是靶向肺或在肺中累積 的量的至少5倍，優(yōu)選至少8倍，優(yōu)選至少10倍，優(yōu)選至少20倍，優(yōu)選至少50倍，優(yōu)選至少 100倍，優(yōu)選至少1000倍或甚至更高。
[0043] 根據(jù)本發(fā)明，全身性施用優(yōu)選通過腸胃外施用，優(yōu)選通過靜脈內(nèi)施用、皮下施用、 皮內(nèi)施用或動(dòng)脈內(nèi)施用。
[0044] 由本文所述納米顆粒中包含的RNA編碼的抗原優(yōu)選是疾病相關(guān)抗原，或者其引發(fā) 針對(duì)疾病相關(guān)抗原或表達(dá)疾病相關(guān)抗原之細(xì)胞的免疫應(yīng)答。
[0045] 本發(fā)明的藥物組合物還可包含一種或更多種可藥用載體、稀釋劑和/或賦形劑。 本發(fā)明的藥物組合物還可包含至少一種佐劑。
[0046] 本發(fā)明的藥物組合物可配制成用于全身性施用。
[0047] 本發(fā)明的藥物組合物可用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，特別是針對(duì)疾病相關(guān)抗原或表達(dá)疾病 相關(guān)抗原的細(xì)胞的免疫應(yīng)答，例如針對(duì)癌癥的免疫應(yīng)答。因此，所述藥物組合物可用于預(yù)防 性和/或治療性處理涉及疾病相關(guān)抗原或表達(dá)疾病相關(guān)抗原的細(xì)胞的疾病，例如癌癥。優(yōu) 選地，所述免疫應(yīng)答是T細(xì)胞應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疾病相關(guān)抗原是腫瘤抗原。
[0048] 在一個(gè)實(shí)施方案中，包含在本文所述的納米顆粒中的RNA不包含假尿苷殘基，并 且優(yōu)選不包含經(jīng)修飾的核苷。
[0049] 本發(fā)明還涉及用于將抗原遞送至脾的抗原呈遞細(xì)胞（優(yōu)選為專職性抗原呈遞細(xì) 胞，例如樹突細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞）或在脾的抗原呈遞細(xì)胞（優(yōu)選為專職性抗原呈遞細(xì)胞， 例如樹突細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞）中表達(dá)抗原的方法，其包括將本發(fā)明的藥物組合物施用于 對(duì)象。
[0050] 本發(fā)明還涉及用于在對(duì)象中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答（優(yōu)選針對(duì)癌癥的免疫應(yīng)答）的方法， 其包括將本發(fā)明的藥物組合物施用于所述對(duì)象。
[0051] 本發(fā)明還涉及用于在對(duì)象中刺激、引發(fā)和/或擴(kuò)增T細(xì)胞的方法，其包括將本發(fā)明 的藥物組合物施用于所述對(duì)象。
[0052] 本發(fā)明還涉及用于在對(duì)象中治療或預(yù)防涉及抗原的疾病（優(yōu)選癌癥疾?。┑姆?法，其包括將本發(fā)明的藥物組合物施用于所述對(duì)象。
[0053] 在以上方面中，所述疾病可為腫瘤生長和/或腫瘤轉(zhuǎn)移。因此，本發(fā)明還涉及在患 有腫瘤發(fā)生和/或腫瘤轉(zhuǎn)移或處于其風(fēng)險(xiǎn)下的對(duì)象中治療或預(yù)防腫瘤生長和/或腫瘤轉(zhuǎn)移 的方法，其包括將本發(fā)明的藥物組合物施用于所述對(duì)象。
[0054] 在一個(gè)方面中，本發(fā)明還提供了用于本文所述的治療方法的本文所述的藥劑和組 合物。
[0055] 本發(fā)明還涉及本文所述的顆粒。
[0056] 本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)包含RNA的納米顆粒的方法，其包括以下步驟：（a)提供配 制在氯化鈉溶液中的RNA，以及（b)向所述RNA添加脂質(zhì)體。所述氯化鈉溶液可為水溶液。 水可用于制備氯化鈉溶液，并且在一個(gè)實(shí)施方案中，其可為所用的唯一溶劑。在一個(gè)實(shí)施方 案中，所述氯化鈉溶液包含約50mM至約300mM，優(yōu)選約IOOmM至約200mM，優(yōu)選約150mM的 氯化鈉。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述氯化鈉溶液是等滲的氯化鈉溶液。所述脂質(zhì)體可在水中 配制。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過將所述脂質(zhì)體注入所述RNA制劑中來將所述脂質(zhì)體添加至 所述RNA中。根據(jù)上述方法生產(chǎn)的納米顆?？蔀槿绫疚乃龅募{米顆粒。
[0057] 由下文的詳細(xì)描述和權(quán)利要求書，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將是明顯的。

【具體實(shí)施方式】
[0058] 雖然以下詳細(xì)描述了本發(fā)明，但是應(yīng)理解，本發(fā)明并不限于本文所描述的特定方 法、方案和試劑，因?yàn)檫@些是可變化的。還應(yīng)理解，本文所用的術(shù)語僅用于描述特定實(shí)施方 案的目的，并非旨在限制本發(fā)明的的范圍，本發(fā)明的范圍將僅受所附權(quán)利要求書限制。除非 另有定義，否則本文所用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語都具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常 理解的相同的含義。
[0059] 在下文中將描述本發(fā)明的要素。雖然這些要素與具體實(shí)施方案一起列出，但是應(yīng) 理解，它們可以任何方式和任意數(shù)目進(jìn)行組合以創(chuàng)建另外的實(shí)施方案。不同描述的實(shí)施例 和優(yōu)選實(shí)施方案不應(yīng)被解釋為僅將本發(fā)明限制于明確描述的實(shí)施方案。此描述應(yīng)被理解為 支持并涵蓋將明確描述之實(shí)施方案與任意數(shù)目之公開和/或優(yōu)選要素組合的實(shí)施方案。此 夕卜，除非在上下文中另有說明，否則在本申請(qǐng)中的所有描述的要素的任何排列與組合都應(yīng) 被視為通過本申請(qǐng)的說明書公開。
[0060] 優(yōu)選地，本文所使用的術(shù)語如在"A multilingual glossary of biotechnological terms : (IUPAC Recommendations)，'，H. G. W. Leuenberger, B. Nagel 和 H. K6丨bl編著，（1995)Helvetica Chimica Acta, CH-4010Basel，Switzerland 中所描述的 進(jìn)行定義。
[0061] 除非另有說明，否則本發(fā)明的實(shí)施將采用生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)的常 規(guī)方法以及在本領(lǐng)域文獻(xiàn)中所解釋的重組DNA技術(shù)（參見例如，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第二版，J. Sambrook等編著，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989)〇
[0062] 在整個(gè)說明書和隨后的權(quán)利要求書中，除非上下文另有說明，否則詞語"包含""包 括"應(yīng)理解為表示包含所述成員、整數(shù)或步驟，或者成員、整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其 他成員、整數(shù)或步驟或者成員、整數(shù)或步驟的組，盡管在一些實(shí)施方案中，這樣的其他成員、 整數(shù)或步驟或者成員、整數(shù)或步驟的組可被排除，即，該主題由所述的成員、整數(shù)或步驟或 者成員、整數(shù)或步驟的組組成。除非在本文中另有說明或與上下文明顯相矛盾，否則在描述 本發(fā)明的上下文中（尤其是權(quán)利要求書的上下文中）未使用數(shù)量詞修飾的名詞和類似的指 代應(yīng)解釋為涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)二者。本文列舉的數(shù)值范圍僅旨在充當(dāng)逐一列舉落入該范圍內(nèi) 的每個(gè)單獨(dú)數(shù)值的速記方法。除非本文中另有說明，否則每個(gè)單個(gè)值都將并入說明書中，就 如其在本文中被單獨(dú)記載一樣。
[0063] 除非在本文中另有說明或與上下文明顯矛盾，否則本文描述的所有方法可以以任 何合適的順序進(jìn)行。本文所提供的任何以及所有實(shí)例或示例性語言（例如，"例如"）的使 用僅旨在更好地闡述本發(fā)明，而不構(gòu)成對(duì)另外要求的本發(fā)明范圍的限制。在本說明書中沒 有語言應(yīng)被解釋為表示任何未要求保護(hù)的要素對(duì)實(shí)施本發(fā)明必不可少。
[0064] 本說明書的整個(gè)文本中引用了幾篇文獻(xiàn)。本文引用的每篇文獻(xiàn)（包括所有專利、 專利申請(qǐng)、科學(xué)出版物、制造商說明書手冊(cè)、使用說明等）（無論上文或下文）均通過引用整 體并入本文。本文中的任何內(nèi)容均不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明因在先發(fā)明而無權(quán)早于這些公 開。
[0065] 本發(fā)明描述了施用后誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的藥劑和組合物，所述免疫應(yīng)答特別是針對(duì)疾 病相關(guān)抗原或表達(dá)疾病相關(guān)抗原的細(xì)胞（例如癌細(xì)胞）的細(xì)胞免疫應(yīng)答。特別地，本發(fā)明 預(yù)期了 RNA編碼誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的抗原性蛋白質(zhì)或肽（本文中也稱為"抗原"）的用途，所述 免疫應(yīng)答特別是針對(duì)疾病相關(guān)抗原或表達(dá)疾病相關(guān)抗原的細(xì)胞的T細(xì)胞應(yīng)答。這些抗原性 蛋白質(zhì)或肽可包含基本與疾病相關(guān)抗原或其一個(gè)或更多個(gè)片段的序列對(duì)應(yīng)的或者與其相 同的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原性蛋白質(zhì)或肽包含來自疾病相關(guān)抗原的MHC呈遞 的肽序列。用編碼完整或基本完整的疾病相關(guān)抗原或其片段（例如I類MHC肽和II類MHC 肽）的RNA進(jìn)行免疫使得能夠誘導(dǎo)I類MHC應(yīng)答和/或II類MHC應(yīng)答，從而刺激T細(xì)胞， 例如能夠裂解病變細(xì)胞的CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，和/或CD4+T細(xì)胞。這樣的免疫還可 誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答（B細(xì)胞應(yīng)答），導(dǎo)致產(chǎn)生針對(duì)該抗原的抗體。因此，本發(fā)明的藥物組合物 可用于基因疫苗接種，在基因疫苗接種中通過向?qū)ο笾幸刖幋a抗原性蛋白質(zhì)或肽的合適 RNA分子來刺激免疫應(yīng)答。本文公開的藥劑和組合物可用作治療性或預(yù)防性疫苗，用于治療 或預(yù)防疾病，例如，本文公開的疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，疾病相關(guān)抗原是腫瘤抗原。在該 實(shí)施方案中，本文描述的藥劑和組合物可用于治療癌癥或癌轉(zhuǎn)移。優(yōu)選地，病變器官或組織 的特征為病變細(xì)胞，例如表達(dá)疾病相關(guān)抗原，并且優(yōu)選為在MHC分子環(huán)境下呈遞疾病相關(guān) 抗原的癌細(xì)胞。
[0066] 術(shù)語"免疫應(yīng)答"是指對(duì)抗原或表達(dá)抗原的細(xì)胞的綜合身體應(yīng)答，優(yōu)選指細(xì)胞免疫 應(yīng)答，或細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。所述免疫應(yīng)答可為保護(hù)性/防止性/預(yù)防性和/ 或治療性的。
[0067] "誘導(dǎo)免疫應(yīng)答"可意為，在誘導(dǎo)前針對(duì)特定抗原或表達(dá)抗原的細(xì)胞沒有免疫應(yīng) 答，但是其還可意為在誘導(dǎo)前針對(duì)特定抗原或表達(dá)抗原的細(xì)胞有一定水平的免疫應(yīng)答，并 且在誘導(dǎo)后所述免疫應(yīng)答得到增強(qiáng)。因此，"誘導(dǎo)免疫應(yīng)答"也包括"增強(qiáng)免疫應(yīng)答"。優(yōu)選 地，在對(duì)象中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答后，所述對(duì)象受到保護(hù)免于發(fā)生疾病，例如感染性疾病或癌癥疾 病，或者通過誘導(dǎo)免疫應(yīng)答使疾病癥狀減輕。例如，可在患有病毒性疾病的患者中或在處于 發(fā)生病毒性疾病之風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象中針對(duì)病毒性抗原誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。例如，可在患有癌癥疾病 的患者中或在處于發(fā)生癌癥疾病風(fēng)險(xiǎn)下的對(duì)象中針對(duì)腫瘤抗原誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。在這種情況 下，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答可意為，所述對(duì)象的疾病狀態(tài)減輕，所述對(duì)象沒有發(fā)生轉(zhuǎn)移，或處于發(fā)生 癌癥疾病風(fēng)險(xiǎn)下的對(duì)象沒有發(fā)生癌癥。
[0068] "細(xì)胞免疫應(yīng)答"、"細(xì)胞應(yīng)答"、"針對(duì)抗原的細(xì)胞應(yīng)答"或類似術(shù)語意為，包括針對(duì) 表達(dá)抗原并且以由I類或II類MHC呈遞抗原為特征之細(xì)胞的細(xì)胞應(yīng)答。所述細(xì)胞應(yīng)答涉 及稱為T細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞，其充當(dāng)"輔助細(xì)胞"或"殺傷細(xì)胞"。輔助T細(xì)胞（也稱 為CD4+T細(xì)胞）通過調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答發(fā)揮核心作用，而殺傷細(xì)胞（也稱為細(xì)胞毒性T細(xì)胞、溶 細(xì)胞性T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞或CTL)殺傷病變細(xì)胞（例如受感染細(xì)胞或癌細(xì)胞），防止產(chǎn)生更 多的病變細(xì)胞。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及針對(duì)表達(dá)一種或更多種腫瘤抗原并且 優(yōu)選由I類MHC呈遞該腫瘤抗原的癌細(xì)胞的抗腫瘤CTL應(yīng)答刺激。
[0069] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"抗原"包括包含至少一個(gè)能引發(fā)免疫應(yīng)答的表位和/或免疫應(yīng) 答所針對(duì)的表位的任何分子，優(yōu)選肽或蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，本發(fā)明上下文中的抗原是這樣的分 子，其任選在加工后誘導(dǎo)優(yōu)選特異性針對(duì)該抗原或表達(dá)該抗原的細(xì)胞的免疫應(yīng)答。特別地， "抗原"涉及指這樣的分子，其任選在加工后被MHC分子呈遞，并特異地與T淋巴細(xì)胞（T細(xì) 胞）反應(yīng)。
[0070] 因此，抗原或其片段應(yīng)能夠被T細(xì)胞受體識(shí)別。優(yōu)選地，如果被T細(xì)胞受體識(shí)別， 抗原或片段能夠在合適的共刺激信號(hào)存在下誘導(dǎo)攜帶特異性識(shí)別該抗原或片段之T細(xì)胞 受體的T細(xì)胞進(jìn)行克隆擴(kuò)增。在本發(fā)明實(shí)施方案的上下文中，抗原或片段在MHC分子的環(huán) 境下優(yōu)選由細(xì)胞呈遞，優(yōu)選由抗原呈遞細(xì)胞和/或病變細(xì)胞呈遞，其導(dǎo)致針對(duì)該抗原或表 達(dá)該抗原的細(xì)胞的免疫應(yīng)答。
[0071] 根據(jù)本發(fā)明，設(shè)想了作為用于免疫應(yīng)答的候選物的任何合適的抗原，其中所述免 疫應(yīng)答優(yōu)選為細(xì)胞免疫應(yīng)答。
[0072] 抗原優(yōu)選為對(duì)應(yīng)于或來自于天然存在的抗原的產(chǎn)物。該天然存在的抗原可包括或 可來自過敏原、病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲和其他感染原和病原體，或者抗原也可以是腫瘤抗 原。根據(jù)本發(fā)明，抗原可以對(duì)應(yīng)天然存在的產(chǎn)物，例如，病毒蛋白或其一部分。
[0073] 術(shù)語"病原體"涉及病原微生物，并且包括病毒、細(xì)菌、真菌、單細(xì)胞生物和寄生蟲。 病原病毒的實(shí)例有人免疫缺陷病毒（HIV)、巨細(xì)胞病毒（CMV)、皰疫病毒（HSV)、甲肝病毒 (HAV)、HBV、HCV、乳頭瘤病毒和人嗜 T 細(xì)胞病毒（human T-Iymphotrophic virus，HTLV)。 單細(xì)胞生物包括瘧原蟲、錐體蟲、阿米巴蟲等。
[0074] 術(shù)語"疾病相關(guān)抗原"是指所有具有病原顯著性的抗原，并且包括"腫瘤抗原"。根 據(jù)本發(fā)明，期望誘導(dǎo)針對(duì)疾病相關(guān)抗原或表達(dá)疾病相關(guān)抗原并且優(yōu)選在MHC分子的環(huán)境下 呈遞疾病相關(guān)抗原之細(xì)胞的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，疾病相關(guān)抗原是天然存在的抗原。在一個(gè) 實(shí)施方案中，疾病相關(guān)抗原在病變細(xì)胞中表達(dá)，并且優(yōu)選由細(xì)胞的MHC分子呈遞。
[0075] 由包含在本文所述納米顆粒中的RNA編碼的抗原應(yīng)誘導(dǎo)針對(duì)待靶向的疾病相關(guān) 抗原或表達(dá)待靶向之疾病相關(guān)抗原的細(xì)胞的免疫應(yīng)答。因此，由包含在本文所述納米顆粒 中的RNA編碼的抗原可對(duì)應(yīng)于或者可包含疾病相關(guān)抗原或其一個(gè)或更多個(gè)免疫原性片段， 例如疾病相關(guān)抗原的一個(gè)或更多個(gè)MHC結(jié)合肽。因此，由包含在本文所述納米顆粒中的RNA 編碼的抗原可為重組抗原。
[0076] 本發(fā)明上下文中的術(shù)語"重組"意為"通過基因工程來制造"。優(yōu)選地，"重組物 質(zhì)"（例如本發(fā)明上下文中的重組核酸）不是天然存在的。
[0077] 本文所用術(shù)語"天然存在的"是指物質(zhì)可以在自然界中找到的事實(shí)。例如，存在于 生物體（包括病毒）中且可從天然來源分離，并且沒有在實(shí)驗(yàn)室中被人有意改造的肽或核 酸是天然存在的。
[0078] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗原可為腫瘤抗原，S卩，癌細(xì)胞的組分，例如在癌細(xì)胞中 表達(dá)的、可來自細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞表面或細(xì)胞核的蛋白質(zhì)或肽，特別是主要在胞內(nèi)出現(xiàn)或作為癌 細(xì)胞上的表面抗原的那些。例如，腫瘤抗原包括癌胚抗原（carcinoembryonal antigen)、 a 1-胎蛋白、異鐵蛋白以及胚胎性硫糖蛋白抗原（fetal sulphoglycoprotein)、a2-H_鐵 蛋白和Y-胎蛋白。根據(jù)本發(fā)明，腫瘤抗原優(yōu)選包括任何這樣的抗原，其在腫瘤或癌中以及 在腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞中表達(dá)，并且任選表征腫瘤或癌以及腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞的類型和/或 表達(dá)水平。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語"腫瘤抗原"或"腫瘤相關(guān)抗原"優(yōu)選涉及在正常條件 下在有限數(shù)量的組織和/或器官中或在特定的發(fā)育階段特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)，例如，腫瘤 抗原可為在正常條件下在胃組織中（優(yōu)選在胃黏膜中）、在生殖器官中（例如在睪丸中）、 在滋養(yǎng)層組織（例如在胎盤）或在生殖系細(xì)胞中特異性表達(dá)，并且在一種或更多種腫瘤組 織或癌組織中表達(dá)或異常表達(dá)。在此上下文中，"有限數(shù)量"優(yōu)選是指不超過3,更優(yōu)選不 超過2或1。本發(fā)明上下文中的腫瘤抗原包括例如，分化抗原，優(yōu)選細(xì)胞類型特異性分化抗 原，即，在正常條件下在某個(gè)分化階段的某個(gè)細(xì)胞類型中特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)；癌癥/睪丸 抗原，即，在正常條件下在睪丸中并且有時(shí)在胎盤中特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)；以及生殖系特異 性抗原。在本發(fā)明的上下文中，所述腫瘤抗原優(yōu)選在正常組織中不表達(dá)，或僅很少表達(dá)。優(yōu) 選地，腫瘤抗原或腫瘤抗原的異常表達(dá)鑒別癌細(xì)胞。在本發(fā)明上下文中，對(duì)象（例如，患有 癌癥疾病的患者）的癌細(xì)胞表達(dá)的腫瘤抗原優(yōu)選是所述對(duì)象的自身蛋白質(zhì)。在一些優(yōu)選實(shí) 施方案中，本發(fā)明上下文中的腫瘤抗原在正常條件下在非必需的組織或器官（即，當(dāng)被免 疫系統(tǒng)損傷時(shí)不導(dǎo)致對(duì)象死亡的組織或器官）中，或者免疫系統(tǒng)不可及或難以觸及的身體 器官或結(jié)構(gòu)中特異性表達(dá)。優(yōu)選地，在正常組織中表達(dá)的腫瘤抗原和在癌組織中表達(dá)的腫 瘤抗原之間，腫瘤抗原的氨基酸序列相同。優(yōu)選地，腫瘤抗原由表達(dá)該抗原的癌細(xì)胞呈遞。
[0079] 可在本發(fā)明中使用的腫瘤抗原的實(shí)例為p53、ART-4, BAGE、￠-連環(huán)蛋白/ m(beta-catenin/m)、Bcr-abL CAMEL、CAP-I、CASP-8、CDC27/m、CDK4/m、CEA、緊密連接蛋白 家族的細(xì)胞表面蛋白（例如，CLAUDIN-6、CLAUDIN-18. 2 和 CLAUDIN-12)、c-MYC、CT、Cyp-B、 DAM、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、GaplOO、HAGE、HER-2/neu、HPV-E7、HPV-E6、 HAST-2、hTERT (或 hTRT)、LAGE、LDLR/FUT、MAGE-A，優(yōu)選 MAGE-Al、MAGE-A2、MAGE-A3、 MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11，或 MAGE-A12、 MAGE-B、MAGE-C、MART-l/Melan-A、MC1R、肌球蛋白 /m、MUCl、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、 NF1、NY-ES0-1、NY-BR-1、pl90 小 BCR-abL(pl90minor BCR-abL)、Pml/RARa、PRAME、蛋白酶 3、PSA、PSM、RAGE、RUl 或 RU2、SAGE、SART-I 或 SART-3、SCGB3A2、SCP1、SCP2、SCP3、SSX、 SURVIVIN、TEL/AML1、TPI/m、TRP-I、TRP-2、TRP-2/INT2、TPTE 和 WT，優(yōu)選 WT-I。
[0080] 術(shù)語"表位"是指分子（例如抗原）中的抗原決定簇，S卩，指被免疫系統(tǒng)識(shí)別（例 如，由T細(xì)胞識(shí)別，特別是當(dāng)在MHC分子的環(huán)境下呈遞時(shí)）的該分子的一部分或片段。蛋白 質(zhì)（例如腫瘤抗原）的表位優(yōu)選包含所述蛋白質(zhì)的連續(xù)部分或不連續(xù)部分，并且為優(yōu)選5 至100個(gè)，優(yōu)選5至50個(gè)，更優(yōu)選8至30個(gè)，最優(yōu)選10至25個(gè)氨基酸長，例如，所述表位 可優(yōu)選為 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或 25 個(gè)氨基酸長。特別優(yōu) 選的是，在本發(fā)明上下文中的表位是T細(xì)胞表位。
[0081] 根據(jù)本發(fā)明，表位可與MHC分子（例如在細(xì)胞表面上的MHC分子）結(jié)合，因此可為 "MHC結(jié)合肽"。術(shù)語"MHC結(jié)合肽"是指與I類MHC和/或II類MHC分子結(jié)合的肽。在I 類MHC/肽復(fù)合物的情況下，結(jié)合肽通常為8至10個(gè)氨基酸長，盡管更長或更短的肽可為有 效的。在II類MHC/肽復(fù)合物的情況下，結(jié)合肽通常為10至25個(gè)氨基酸長，并且特別地為 13至18個(gè)氨基酸長，雖然更長和更短的肽可為有效的。
[0082] 根據(jù)本發(fā)明，由被包含在本文所述納米顆粒中的RNA編碼的抗原可包含疾病相關(guān) 抗原的免疫原性片段，例如疾病相關(guān)抗原的肽片段（本文中也稱為抗原肽），優(yōu)選為MHC結(jié) 合肽。
[0083] 根據(jù)本發(fā)明的"抗原的免疫原性片段"優(yōu)選涉及能夠刺激免疫應(yīng)答的抗原的部分 或片段，所述免疫應(yīng)答優(yōu)選為針對(duì)抗原或者表達(dá)抗原并優(yōu)選呈遞所述抗原之細(xì)胞（例如病 變細(xì)胞，特別是癌細(xì)胞）的細(xì)胞應(yīng)答。優(yōu)選地，抗原的免疫原性片段能夠刺激針對(duì)以由I類 MHC呈遞抗原為特征之細(xì)胞的細(xì)胞應(yīng)答，并且優(yōu)選能夠刺激抗原應(yīng)答性CTL。優(yōu)選地，其為 被T細(xì)胞受體識(shí)別（S卩，特異性結(jié)合）的抗原的部分，特別是如果其在MHC分子的環(huán)境下被 呈遞更是如此。某些優(yōu)選的免疫原性片段與I類或II類MHC分子結(jié)合。本文所用的免疫 原性片段被認(rèn)為與I類或II類MHC分子"結(jié)合"，如果這樣的結(jié)合使用本領(lǐng)域已知的任何測(cè) 定可檢測(cè)。
[0084] 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的抗原的免疫原性片段是I類和/或II類MHC呈遞的肽，或 者可被加工以產(chǎn)生I類和/或II類MHC呈遞的肽。優(yōu)選地，抗原的免疫原性片段包含與該 抗原片段的氨基酸序列基本相對(duì)應(yīng)，并且優(yōu)選與之相同的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述的抗原 片段是I類和/或II類MHC呈遞的肽。
[0085] 如果肽被直接呈遞（即，不經(jīng)加工，特別是不經(jīng)切割），則其具有適合與MHC分子 (特別是I類MHC分子）結(jié)合的長度，并且優(yōu)選為7至20個(gè)氨基酸長，更優(yōu)選7至12個(gè)氨 基酸長，更優(yōu)選8至11個(gè)氨基酸長，特別是9個(gè)或10個(gè)氨基酸長。
[0086] 如果肽是包含額外序列的更大實(shí)體（例如，多肽）的一部分，并且將在加工后（特 別是經(jīng)過切割后）被呈遞，則通過加工產(chǎn)生的肽具有適合與MHC分子（特別是I類MHC分 子）結(jié)合的長度，并且優(yōu)選為7至20個(gè)氨基酸長，更優(yōu)選7至12個(gè)氨基酸長，更優(yōu)選8至 11個(gè)氨基酸長，特別是9個(gè)或10個(gè)氨基酸長。優(yōu)選地，將在加工后呈遞的肽序列源自抗原 的氨基酸序列，即，其序列與抗原片段基本對(duì)應(yīng)并且優(yōu)選完全相同。
[0087] 因此，由包含在本文所述的納米顆粒中的RNA編碼的抗原，可包含與MHC呈遞的疾 病相關(guān)抗原片段基本相對(duì)應(yīng)并優(yōu)選完全相同的7至20個(gè)氨基酸長，更優(yōu)選7至12個(gè)氨基 酸長，更優(yōu)選8至11個(gè)氨基酸長，特別是9個(gè)或10個(gè)氨基酸長的序列，并且在加工后構(gòu)成 呈遞的膚。
[0088] 具有與由I類MHC呈遞的肽序列基本相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的肽可有一個(gè)或更多個(gè) 殘基差異，所述殘基對(duì)于肽在由I類MHC呈遞時(shí)的TCR識(shí)別或?qū)τ陔呐cMHC的結(jié)合不是必 要的。這樣的基本相對(duì)應(yīng)的肽還能夠刺激具有期望特異性的CTL，并且可視作免疫等效的。
[0089] 當(dāng)由MHC呈遞時(shí)，肽應(yīng)當(dāng)可以被T細(xì)胞受體識(shí)別。優(yōu)選地，如果被T細(xì)胞受體識(shí) 另IJ，則所呈遞的肽能夠在合適的共刺激信號(hào)存在下誘導(dǎo)攜帶特異性識(shí)別所呈遞之肽的T細(xì) 胞受體的T細(xì)胞進(jìn)行克隆擴(kuò)增。優(yōu)選地，抗原肽（特別是如果在MHC分子的環(huán)境下呈遞） 能夠刺激免疫應(yīng)答，優(yōu)選針對(duì)它們來自的抗原或表達(dá)該抗原并且優(yōu)選呈遞該抗原之細(xì)胞的 細(xì)胞應(yīng)答。優(yōu)選地，抗原肽能夠刺激針對(duì)由I類MHC呈遞抗原之細(xì)胞的細(xì)胞應(yīng)答，并且優(yōu)選 能夠刺激抗原應(yīng)答性CTL。這樣的細(xì)胞優(yōu)選是本發(fā)明目的的靶細(xì)胞。
[0090] "靶細(xì)胞"應(yīng)當(dāng)意為作為免疫應(yīng)答（例如細(xì)胞免疫應(yīng)答）靶標(biāo)的細(xì)胞。靶細(xì)胞包括 這樣的細(xì)胞，其表達(dá)抗原（例如疾病相關(guān)抗原），并優(yōu)選呈遞所述抗原（特別地，呈遞所述 抗原意為在細(xì)胞中加工抗原，并在細(xì)胞上的MHC分子環(huán)境下呈遞該抗原的一個(gè)或更多個(gè)片 段）。祀細(xì)胞包括任何不期望的細(xì)胞，例如受感染的細(xì)胞或癌細(xì)胞。在一些優(yōu)選實(shí)施方案 中，靶細(xì)胞是表達(dá)如本文所述的抗原并優(yōu)選由I類MHC呈遞所述抗原的細(xì)胞。
[0091] "抗原加工"是指抗原降解成加工產(chǎn)物（例如，將蛋白質(zhì)降解成肽），并且將這些片 段中的一個(gè)或更多個(gè)與MHC分子相關(guān)聯(lián)（例如，通過結(jié)合）來被細(xì)胞（優(yōu)選抗原呈遞細(xì)胞） 呈遞至特異性T細(xì)胞，所述加工產(chǎn)物是所述抗原的片段。
[0092] 抗原呈遞細(xì)胞（APC)是在其表面在主要組織相容性復(fù)合物（MHC)的環(huán)境中呈遞 (即，展示）抗原的細(xì)胞。這包括其中呈遞抗原的僅一個(gè)片段或更多個(gè)片段的情況。T細(xì)胞 可用它們的T細(xì)胞受體（TCR)識(shí)別該復(fù)合體?？乖蔬f細(xì)胞加工抗原，并將它們呈遞至T 細(xì)胞。
[0093] 專職性抗原呈遞細(xì)胞在將抗體內(nèi)化（通過吞噬作用或通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作 用），然后在它們的膜上展示與II類MHC分子結(jié)合的抗原片段方面非常有效。T細(xì)胞識(shí)別 抗原呈遞細(xì)胞膜上的抗原-II類MHC分子復(fù)合物，并與其相互作用。然后抗原呈遞細(xì)胞產(chǎn) 生額外的共刺激信號(hào)，導(dǎo)致T細(xì)胞活化。表達(dá)共刺激分子是專職性抗原呈遞細(xì)胞的典型特 征。
[0094] 專職性抗原呈遞細(xì)胞的主要類型是樹突細(xì)胞（其具有最廣的抗原呈遞范圍，并且 可能是最重要的抗原呈遞細(xì)胞）、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和某些活化的上皮細(xì)胞。
[0095] 樹突細(xì)胞（DC)是白細(xì)胞類群，其將在外周組織中捕獲的抗原經(jīng)II類和I類MHC 兩種抗原呈遞途徑呈遞給T細(xì)胞。公知樹突細(xì)胞是免疫應(yīng)答的強(qiáng)力誘導(dǎo)者，并且這些細(xì)胞 的活化是誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的關(guān)鍵步驟。
[0096] 為方便起見，將樹突細(xì)胞分為"未成熟"細(xì)胞和"成熟"細(xì)胞，這可用作區(qū)分兩個(gè)良 好表征的表型的簡(jiǎn)單方式。然而，該術(shù)語不應(yīng)被解釋為排除分化的所有可能中間階段。
[0097] 未成熟的樹突細(xì)胞的特征為具有高抗原攝取和加工能力的抗原呈遞細(xì)胞，其與 FcY受體和甘露糖受體的高表達(dá)相關(guān)。成熟表型通常表征為這些標(biāo)志物的較低表達(dá)，但是 負(fù)責(zé)T細(xì)胞活化的細(xì)胞表面分子（例如，I類和II類MHC)、粘附分子（例如，CD54和CDll) 以及共刺激分子（例如，⑶40、⑶80、⑶86和4-1BB)高表達(dá)。
[0098] 樹突細(xì)胞的成熟是指該抗原呈遞樹突細(xì)胞導(dǎo)致T細(xì)胞引發(fā)（prime)的樹突細(xì)胞活 化狀態(tài)，而由未成熟樹突細(xì)胞進(jìn)行的呈遞則導(dǎo)致耐受。樹突細(xì)胞的成熟主要由以下引起：被 先天受體檢測(cè)到的具有微生物特征的生物分子（細(xì)菌DNA、病毒RNA、內(nèi)毒素等）、促炎性細(xì) 胞因子（TNF、IL-I、IFN)、通過⑶40L與樹突細(xì)胞表面的⑶40連接，以及從正在經(jīng)歷應(yīng)激細(xì) 胞死亡的細(xì)胞中釋放的物質(zhì)。樹突細(xì)胞可通過在體外用細(xì)胞因子培養(yǎng)骨髓細(xì)胞來衍生，所 述細(xì)胞因子例如，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)和腫瘤壞死因子a。
[0099] 與幼稚T細(xì)胞相互作用所需的II類MHC蛋白不在非專職性抗原呈遞細(xì)胞中組成 型表達(dá)；其僅在非專職性抗原呈遞細(xì)胞受到某些細(xì)胞因子（例如IFNy)的刺激后表達(dá)。 [0100] 可通過用編碼包含待呈遞之肽的肽或蛋白質(zhì)的核酸（例如，編碼抗原的核酸）（例 如，RNA)轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞，從而使該細(xì)胞裝載MHC呈遞的肽。用mRNA轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞是一 種有前景的刺激強(qiáng)抗腫瘤免疫的抗原裝載技術(shù)。
[0101] 術(shù)語"免疫源性"涉及抗原誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的相對(duì)效率。
[0102] 術(shù)語"T細(xì)胞"和"T淋巴細(xì)胞"在本文中可互換使用，并且包括輔助T細(xì)胞（⑶4+T 細(xì)胞）和包括溶細(xì)胞性T細(xì)胞的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL，CD8+T細(xì)胞）。
[0103] T細(xì)胞屬于被稱為淋巴細(xì)胞的白血球群組，并且在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫中發(fā)揮核心作 用?？赏ㄟ^在其細(xì)胞表面的稱為T細(xì)胞受體（TCR)的特殊受體的存在來將它們與其他淋巴 細(xì)胞類型（例如B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞）區(qū)分開來。胸腺是負(fù)責(zé)T細(xì)胞成熟的主要器官。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了若干種不同的T細(xì)胞亞群，每一種都具有不同的功能。
[0104] 輔助T細(xì)胞在免疫過程中協(xié)助其他白血球，包括使B細(xì)胞成熟為漿細(xì)胞以及活化 細(xì)胞毒性T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等功能。因?yàn)樗鼈冊(cè)谄浔砻姹磉_(dá)CD4蛋白，所以這些細(xì)胞也被 稱為CD4+T細(xì)胞。當(dāng)在抗原呈遞細(xì)胞（APC)表面表達(dá)的II類MHC分子將肽抗原呈遞給輔 助T細(xì)胞時(shí)，輔助T細(xì)胞被活化。在活化之后，它們迅速分裂，并分泌稱為細(xì)胞因子的小蛋 白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)或協(xié)助主動(dòng)免疫應(yīng)答。
[0105] 細(xì)胞毒性T細(xì)胞破壞病變細(xì)胞，例如，受感染的細(xì)胞（如受病毒感染的細(xì)胞）和癌 細(xì)胞，并且也參與移植排斥。因?yàn)樗鼈冊(cè)谄浔砻姹磉_(dá)CD8糖蛋白，所以這些細(xì)胞也被稱為 CD8+T細(xì)胞。這些細(xì)胞通過結(jié)合與I類MHC有關(guān)的抗原來識(shí)別其靶標(biāo)，所述I類MHC存在于 身體的幾乎每個(gè)細(xì)胞表面上。
[0106] 大多數(shù)T細(xì)胞具有作為數(shù)種蛋白質(zhì)的復(fù)合物存在的T細(xì)胞受體（TCR)。實(shí)際的T 細(xì)胞受體由兩條獨(dú)立的肽鏈構(gòu)成，其由獨(dú)立的T細(xì)胞受體a和0 (TCRa和TCRP )基因產(chǎn) 生，并被稱為a -TCR鏈和P -TCR鏈。Y S T細(xì)胞表示T細(xì)胞的一個(gè)小亞型，其表面上具有 獨(dú)特的T細(xì)胞受體（TCR)。然而，在Y S T細(xì)胞中，TCR由一條Y鏈和一條S鏈構(gòu)成。該 組T細(xì)胞較a P T細(xì)胞更為不常見（總T細(xì)胞的2% )。
[0107] 所有T細(xì)胞都源自骨髓中的造血干細(xì)胞。源自造血干細(xì)胞的造血祖細(xì)胞存在于胸 腺，并通過細(xì)胞分裂擴(kuò)增以產(chǎn)生大量不成熟的胸腺細(xì)胞。早期胸腺細(xì)胞既不表達(dá)CD4也不 表達(dá)CD8,因此歸類為雙陰性（CD4-CD8-)細(xì)胞。隨著它們通過發(fā)育而發(fā)展，它們成為雙陽性 的胸腺細(xì)胞（⑶4+⑶8+)，并最終成熟為單陽性（⑶4+⑶8-或⑶4-⑶8+)胸腺細(xì)胞，然后從胸 腺釋放至外周組織。
[0108] T細(xì)胞活化的第一信號(hào)通過T細(xì)胞受體與由另一個(gè)細(xì)胞上的主要組織相容性復(fù)合 物（MHC)呈遞的短肽結(jié)合來提供。這確保了只有具有對(duì)該肽特異的TCR的T細(xì)胞被活化。 伴侶細(xì)胞通常是專職性抗原呈遞細(xì)胞（APC)，在初次應(yīng)答的情況下通常為樹突細(xì)胞，但B細(xì) 胞和巨噬細(xì)胞也可為重要的APC。由I類MHC分子呈遞至⑶8+T細(xì)胞的肽的長度為8至10 個(gè)氨基酸長；由II類MHC分子呈遞至⑶4+T細(xì)胞的肽更長，因?yàn)镮I類MHC分子的結(jié)合裂口 (cleft)末端是開放的。
[0109] 術(shù)語"克隆擴(kuò)增"是指特定實(shí)體被擴(kuò)增的過程。在本發(fā)明上下文中，該術(shù)語優(yōu)選用 于免疫應(yīng)答的上下文中，其中淋巴細(xì)胞受到抗原的刺激，增殖，并且識(shí)別所述抗原的特異性 淋巴細(xì)胞被擴(kuò)增。優(yōu)選地，克隆擴(kuò)增導(dǎo)致淋巴細(xì)胞的分化。
[0110] 根據(jù)本發(fā)明，可通過在體內(nèi)將抗原或抗原肽包含進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞中來在體內(nèi)產(chǎn)生 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。所述抗原或抗原肽可體現(xiàn)為RNA。該抗原可被加工以產(chǎn)生針對(duì)MHC 分子的肽伴侶，而其片段可無需進(jìn)一步加工而被呈遞。特別是如果這些片段可與MHC分子 結(jié)合，則為后者的情況。所產(chǎn)生的細(xì)胞呈遞目的復(fù)合物，并被自體細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞識(shí) 另IJ，然后所述自體細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞增殖。
[0111] 可通過多種方法來檢測(cè)⑶4+或⑶8+T細(xì)胞的特異性活化。用于檢測(cè)特異性T細(xì) 胞活化的方法包括檢測(cè)T細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子（例如淋巴因子）的產(chǎn)生或溶細(xì)胞活性的 產(chǎn)生。對(duì)于CD4+T細(xì)胞，用于檢測(cè)特異性T細(xì)胞活化的優(yōu)選方法是檢測(cè)T細(xì)胞的增殖。對(duì) 于CD8+T細(xì)胞，用于檢測(cè)特異性T細(xì)胞活化的優(yōu)選方法是檢測(cè)溶細(xì)胞活性的產(chǎn)生。
[0112] 術(shù)語"主要組織相容性復(fù)合物"和縮寫"MHC"包括I類MHC分子和II類MHC分子， 并且涉及存在于所有脊椎動(dòng)物中的基因復(fù)合物。MHC蛋白或分子對(duì)于免疫反應(yīng)中淋巴細(xì)胞 與抗原呈遞細(xì)胞或病變細(xì)胞之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)很重要，其中，MHC蛋白或分子結(jié)合肽，并將它 們呈遞用于T細(xì)胞受體的識(shí)別。由MHC編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞表面上表達(dá)，并且將自體抗原 (來自該細(xì)胞自身的肽片段）和非自體抗原（例如，入侵微生物的片段）展示給T細(xì)胞。
[0113] MHC區(qū)被分成三個(gè)亞類，I類、II類和III類。I類MHC蛋白包含a鏈和￠2-微 球蛋白（不是由15號(hào)染色體編碼的MHC的一部分）。它們將抗原片段呈遞給細(xì)胞毒性T細(xì) 胞。在大多數(shù)免疫系統(tǒng)細(xì)胞上，特別是在抗原呈遞細(xì)胞上，II類MHC蛋白包含a鏈和運(yùn) 鏈，并且它們將抗原片段呈遞給輔助T細(xì)胞。III類MHC區(qū)編碼另一些免疫組分，例如補(bǔ)體 組分和一些編碼細(xì)胞因子的組分。
[0114] 在人中，MHC區(qū)中編碼細(xì)胞表面上的抗原呈遞蛋白的基因是指人白細(xì)胞抗原 (HLA)基因。然而，縮寫MHC常常用于表示HLA基因產(chǎn)物。HLA基因包括九個(gè)所謂的典 型 MHC 基因：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPAl、HLA-DPBl、HLA-DQAl、HLA-DQBl、HLA-DRA 和 HLA-DRBl。
[0115] 在本發(fā)明所有方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，MHC分子是HLA分子。
[0116] "以呈遞抗原為特征的細(xì)胞"、"呈遞抗原的細(xì)胞"、"由細(xì)胞呈遞的抗原"、"所呈遞的 抗原"或類似的表述意為在MHC分子的環(huán)境中（特別是I類MHC分子），呈遞其表達(dá)的抗原 或源自該抗原的片段（例如通過加工的所述抗原）的細(xì)胞，特別是病變細(xì)胞或靶細(xì)胞（例 如受感染的細(xì)胞或癌細(xì)胞），或者抗原呈遞細(xì)胞。類似地，術(shù)語"以呈遞抗原為特征的疾病" 表示涉及以（特別是用I類MHC)呈遞抗原為特征之細(xì)胞的疾病。細(xì)胞的抗原呈遞可通過 用核酸（例如編碼該抗原的RNA)轉(zhuǎn)染細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)。
[0117] 術(shù)語"免疫等效物"意為免疫學(xué)上等效的分子，例如，對(duì)于免疫學(xué)效應(yīng)的類型如對(duì) 體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)、所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和/或持續(xù)時(shí)間，或者 所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的特異性表現(xiàn)出例如相同或基本相同的免疫學(xué)性質(zhì)和/或發(fā)揮相同或 基本相同的免疫學(xué)效應(yīng)的免疫等效的氨基酸序列。
[0118] 在本發(fā)明上下文中的術(shù)語"免疫效應(yīng)功能"包括任何由免疫系統(tǒng)組分介導(dǎo)的，導(dǎo)致 例如殺傷受感染細(xì)胞或癌細(xì)胞或者抑制腫瘤生長和/或抑制腫瘤發(fā)生（包括抑制已知腫瘤 擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移）的功能。優(yōu)選地，在本發(fā)明上下文中的免疫效應(yīng)功能是T細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)功 能。這樣的功能包括：在輔助T細(xì)胞（CD4+T細(xì)胞）的情況下，在II類MHC分子的環(huán)境中通 過T細(xì)胞受體識(shí)別抗原或抗原肽，釋放細(xì)胞因子和/或活化CD8+淋巴細(xì)胞（CTL)和/或B 細(xì)胞；以及在CTL的情況下，在I類MHC分子的環(huán)境中通過T細(xì)胞受體識(shí)別抗原或抗原肽， 例如通過細(xì)胞凋亡或穿孔素介導(dǎo)的細(xì)胞溶解來消除在I類MHC分子的環(huán)境中呈遞的細(xì)胞 (即，以由I類MHC呈遞抗原為特征的細(xì)胞）；產(chǎn)生細(xì)胞因子（例如IFN-Y和TNF-a)，以 及特異性溶細(xì)胞性殺傷表達(dá)抗原的靶細(xì)胞。
[0119] 根據(jù)本發(fā)明，核酸優(yōu)選為脫氧核糖核酸（DNA)或核糖核酸（RNA)，更優(yōu)選RNA，最優(yōu) 選體外轉(zhuǎn)錄的RNA(IVT RNA)或合成RNA。根據(jù)本發(fā)明，核酸包括基因組DNA、eDNA、mRNA、以 重組方式產(chǎn)生的分子和化學(xué)合成的分子。根據(jù)本發(fā)明，核酸可為單鏈或雙鏈，以及線性或共 價(jià)地閉合成環(huán)的分子形式。核酸可用于例如以RNA的形式引入（即，轉(zhuǎn)染）細(xì)胞，所述RNA 可通過在體外從DNA模板轉(zhuǎn)錄來制備。此外，RNA可在應(yīng)用之前通過序列穩(wěn)定化、加帽和聚 腺苷酸化來修飾。
[0120] 核酸可包含于載體中。本文所用術(shù)語"載體"包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何載 體，包括質(zhì)粒載體、粘粒載體、噬菌體載體（例如A噬菌體）、病毒載體（例如腺病毒載體或 桿狀病毒載體（baculoviral vector))，或人造染色體載體（例如細(xì)菌人造染色體（BAC)、 酵母人造染色體（YAC)或Pl人造染色體（PAC))。所述載體包括表達(dá)載體以及克隆載體。 表達(dá)載體包括質(zhì)粒載體以及病毒載體，并且一般包含期望的編碼序列以及在特定宿主生物 體（例如細(xì)菌、酵母菌、植物、昆蟲或哺乳動(dòng)物）中或在體外表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)該可操作連接 的的編碼序列所需的合適的DNA序列?？寺≥d體一般用于改造和擴(kuò)增某個(gè)期望的DNA片段， 并且可缺少表達(dá)期望DNA片段所需的功能序列。
[0121] 在本發(fā)明上下文中，術(shù)語"RNA"涉及包含核糖核苷酸殘基并優(yōu)選完全或基本由核 糖核苷酸殘基構(gòu)成的分子。"核糖核苷酸"涉及在P-D-呋喃核糖基的2'-位具有羥基的核 苷酸。該術(shù)語包括雙鏈RNA、單鏈RNA、分離的RNA(例如部分純化的RNA)、基本純的RNA、合 成RNA、重組產(chǎn)生的RNA，以及經(jīng)修飾的RNA，其通過添加、缺失、替換和/或改變一個(gè)或更多 個(gè)核苷酸而區(qū)別于天然存在的RNA。這樣的改變可包括向RNA的末端或內(nèi)部（例如，在RNA 的一個(gè)或更多個(gè)核苷酸處）添加非核苷酸材料。RNA分子中的核苷酸還可包含非標(biāo)準(zhǔn)核苷 酸，例如非天然存在的核苷酸或化學(xué)合成的核苷酸或脫氧核苷酸。這些經(jīng)改變的RNA可指 代類似物或天然存在RNA的類似物。
[0122] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"RNA"包括并優(yōu)選涉及"mRNA"，其意為"信使RNA"并且涉及使用 DNA作為模板生成的、編碼肽或蛋白質(zhì)的"轉(zhuǎn)錄物"。mRNA通常包含5'非翻譯區(qū)（5'-UTR)、 蛋白或肽編碼區(qū)以及3'非翻譯區(qū)（3'-UTR)。mRNA在細(xì)胞內(nèi)和體外具有有限的半衰期。優(yōu) 選地，使用DNA模板通過體外轉(zhuǎn)錄來產(chǎn)生mRNA。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過體外轉(zhuǎn)錄 或化學(xué)合成來得到RNA。體外轉(zhuǎn)錄方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，存在多種市售的體 外轉(zhuǎn)錄試劑盒。
[0123] 在本發(fā)明上下文中，術(shù)語"轉(zhuǎn)錄"涉及其中將DNA序列中的遺傳密碼轉(zhuǎn)錄成RNA的 過程。然后RNA可以被翻譯成蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"轉(zhuǎn)錄"包括"體外轉(zhuǎn)錄"。
[0124] 術(shù)語"體外轉(zhuǎn)錄"涉及其中RNA (特別是mRNA)在無細(xì)胞系統(tǒng)中優(yōu)選使用合適的細(xì) 胞提取物來進(jìn)行體外合成的過程。優(yōu)選地，克隆載體適用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物。這些克隆載體一 般稱為轉(zhuǎn)錄載體，并且根據(jù)本發(fā)明術(shù)語"載體"涵蓋克隆載體。根據(jù)本發(fā)明，RNA可通過對(duì)合 適DNA模板的體外轉(zhuǎn)錄得到。調(diào)控轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子可為用于任何RNA聚合酶的任何啟動(dòng)子。 RNA聚合酶的具體例子是17、T3和SP6RNA聚合酶。用于體外轉(zhuǎn)錄的DNA模板可通過克隆 核酸（特別是cDNA)，并將其引入用于體外轉(zhuǎn)錄的合適載體來得到。cDNA可通過反轉(zhuǎn)錄RNA 來得到。優(yōu)選地，克隆載體用于生成轉(zhuǎn)錄物，其通常稱為轉(zhuǎn)錄載體。
[0125] 術(shù)語"表達(dá)"在本文中以其最廣的含義使用，并且包括RNA和/或蛋白質(zhì)或肽的生 成。對(duì)于RNA，術(shù)語"表達(dá)"或"翻譯"特別是指肽或蛋白質(zhì)的生成。表達(dá)可為瞬時(shí)的或可為 穩(wěn)定的。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語表達(dá)還包括"異常表達(dá)"或"不正常表達(dá)"。
[0126] 根據(jù)本發(fā)明，"異常表達(dá)"或"不正常表達(dá)"意為該表達(dá)與對(duì)照相比發(fā)生了改變，優(yōu) 選升高了，所述對(duì)照例如在未患有與某蛋白質(zhì)（例如腫瘤抗原）異常表達(dá)或不正常表達(dá)相 關(guān)之疾病的對(duì)象中的狀態(tài)。表達(dá)升高是指升高至少10%，特別是至少20%，至少50 %或至 少100 %,或更多。在一個(gè)實(shí)施方案中,表達(dá)僅在病變組織中發(fā)生,而在健康組織中表達(dá)受到 抑制。
[0127] 術(shù)語"特異性表達(dá)"意為蛋白質(zhì)基本僅在特定的組織或器官中表達(dá)。例如，腫瘤抗 原特異性地在胃黏膜中表達(dá)，意為所述蛋白質(zhì)主要在胃黏膜中表達(dá)，而在其他組織中不表 達(dá)，或者在其他組織或器官類型中未表達(dá)至顯著程度。因此，僅在胃黏膜細(xì)胞中表達(dá)并以顯 著較低的程度在任何其他組織（例如睪丸）表達(dá)的蛋白質(zhì)是在胃黏膜細(xì)胞中特異性表達(dá) 的。在一些實(shí)施方案中，腫瘤抗原還可在正常條件在多于一種組織類型或器官中特異性表 達(dá)，例如，在2個(gè)或3個(gè)組織類型或器官中，但是優(yōu)選不超過3個(gè)不同的組織或器官類型。在 這種情況下，則為腫瘤抗原在這些器官中特異性表達(dá)的。例如，如果腫瘤抗原在正常條件下 在肺和胃中以優(yōu)選大致相等的程度表達(dá)，則該腫瘤抗原在肺和胃中特異性表達(dá)。
[0128] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"翻譯"涉及在細(xì)胞的核糖體內(nèi)的過程，通過該過程，信使RNA的 鏈指導(dǎo)氨基酸序列組裝以形成蛋白質(zhì)或肽。
[0129] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"RNA編碼"意為，如果處于合適的環(huán)境中，優(yōu)選在細(xì)胞內(nèi)，例如在 抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)，特別是在樹突細(xì)胞內(nèi)，RNA可以被表達(dá)以產(chǎn)生其編碼的蛋白質(zhì)或肽。
[0130] 根據(jù)本發(fā)明，可以根據(jù)需要對(duì)RNA的穩(wěn)定性和翻譯效率進(jìn)行調(diào)節(jié)。根據(jù)本發(fā)明，在 RNA的上下文中所用的術(shù)語"修飾"包括對(duì)RNA進(jìn)行非天然地存在于所述RNA中的任何修 飾。
[0131] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的RNA不具有未加帽的5 ' -三磷酸。 這樣的未加帽的5' -三磷酸的去除可通過用磷酸酶處理RNA來實(shí)現(xiàn)。
[0132] 根據(jù)本發(fā)明，RNA可具有經(jīng)修飾的核糖核苷酸以提高其穩(wěn)定性和/或降低其細(xì)胞 毒性。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明使用的RNA中，胞苷部分地或完全地（優(yōu)選 完全地）被5-甲基胞苷所取代。替選地或另外地，在一個(gè)實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明使用 的RNA中，尿苷部分地或完全地（優(yōu)選完全地）被假尿苷所取代。
[0133] 在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語"修飾"涉及給RNA提供5' -帽或5' -帽類似物。術(shù)語 "5' -帽"是指在mRNA分子5'端存在的帽結(jié)構(gòu)，并且一般由經(jīng)不常見的5' -5'三磷酸鍵 與mRNA連接的鳥核苷酸組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，該鳥苷在7位被甲基化。術(shù)語"常規(guī)的 5' -帽"是指天然存在的RNA5' -帽，優(yōu)選7-甲基鳥苷帽（m7G)。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語 "5' -帽"包括5'-帽類似物，其與RNA帽結(jié)構(gòu)類似并且當(dāng)優(yōu)選在體內(nèi)和/或在細(xì)胞中連 接在RNA上時(shí)，經(jīng)修飾后其具有使RNA穩(wěn)定和/或增強(qiáng)RNA翻譯的能力。
[0134] 優(yōu)選地，RNA的5'末端包含具有以下通式的帽結(jié)構(gòu)：

【權(quán)利要求】
1. 一種包含納米顆粒的藥物組合物，所述納米顆粒包含編碼至少一種抗原的RNA，其 中： (i) 所述納米顆粒中的正電荷數(shù)不超過所述納米顆粒中的負(fù)電荷數(shù)，和/或 (ii) 所述納米顆粒具有中性電荷或凈負(fù)電荷，和/或 (iii) 在所述納米顆粒中正電荷與負(fù)電荷的電荷比為1. 4 : 1或更低，和/或 (iv) 所述納米顆粒的ξ電勢(shì)為〇或更低。
2. 權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中在所述納米顆粒中的正電荷與負(fù)電荷的電荷比 為 1. 4 : 1 至 1 : 8,優(yōu)選 1. 2 : 1 至 1 : 4。
3. 權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物，其中所述納米顆粒包含至少一種脂質(zhì)。
4. 權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述納米顆粒包含至少一種陽離 子脂質(zhì)。
5. 權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其中所述正電荷由所述至少一種陽離子脂質(zhì)貢獻(xiàn)， 而所述負(fù)電荷由所述RNA貢獻(xiàn)。
6. 權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述納米顆粒包含至少一種輔助 脂質(zhì)。
7. 權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其中所述輔助脂質(zhì)是中性脂質(zhì)。
8. 權(quán)利要求4至7中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述至少一種陽離子脂質(zhì)包括1， 2-二-0-十八烯基-3-三甲基銨丙烷（DOTMA)和/或1，2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷 (D0TAP)。
9. 權(quán)利要求6至8中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述至少一種輔助脂質(zhì)包括1， 2-二-(9Ζ-十八?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺（DOPE)、膽固醇（Choi)和/或1，2_二 油?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿（D0PC)。
10. 權(quán)利要求6至9中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述至少一種陽離子脂質(zhì)與所述 至少一種輔助脂質(zhì)的摩爾比為10 : 0至3 : 7,優(yōu)選9 : 1至3 : 7、4 : 1至1 : 2、4 : 1 至2 : 3、7 : 3至1 : 1或2 : 1至1 : 1，優(yōu)選約1 : 1。
11. 權(quán)利要求3至10中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述脂質(zhì)與所述RNA形成復(fù)合 物，和/或包封所述RNA。
12. 權(quán)利要求3至11中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述脂質(zhì)被包含在包封所述 RNA的囊泡中。
13. 權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述納米顆粒是這樣的脂質(zhì)體 復(fù)合物，其包含摩爾比為10 : 〇至1 : 9,優(yōu)選8 : 2至3 : 7,并且更優(yōu)選7 : 3至5 : 5 的D0TMA和DOPE，并且其中D0TMA中的正電荷與所述RNA中的負(fù)電荷的電荷比為1.8 : 2 至0.8 : 2,更優(yōu)選1.6 : 2至1 : 2,甚至更優(yōu)選1.4 : 2至1.1 : 2,并且甚至更優(yōu)選約 1. 2 : 2。
14. 權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述納米顆粒是這樣的脂質(zhì)體 復(fù)合物，其包含摩爾比為10 : 〇至1 : 9,優(yōu)選8 : 2至3 : 7,并且更優(yōu)選7 : 3至5 : 5 的D0TMA和膽固醇，并且其中D0TMA中的正電荷與所述RNA中的負(fù)電荷的電荷比為1.8 : 2 至0.8 : 2,更優(yōu)選1.6 : 2至1 : 2,甚至更優(yōu)選1.4 : 2至1.1 : 2,并且甚至更優(yōu)選約 1. 2 : 2。
15. 權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述納米顆粒是這樣的脂質(zhì)體 復(fù)合物，其包含摩爾比為10 : 〇至1 : 9,優(yōu)選8 : 2至3 : 7,并且更優(yōu)選7 : 3至5 : 5 的DOTAP和DOPE，并且其中DOTMA中的正電荷與所述RNA中的負(fù)電荷的電荷比為1. 8 : 2 至0.8 : 2,更優(yōu)選1.6 : 2至1 : 2,甚至更優(yōu)選1.4 : 2至1.1 : 2,并且甚至更優(yōu)選約 1. 2 : 2。
16. 權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述納米顆粒具有約50nm至約 lOOOnm，優(yōu)選約100nm至約800nm，優(yōu)選約200nm至約600nm，例如約300nm至約500nm的平 均直徑。
17. 權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述納米顆?？赏ㄟ^以下的一 種或更多種方式得到：（i)將水相中的脂質(zhì)體與水相中的RNA-起孵育，（ii)將溶解于水 可混溶有機(jī)溶劑中的所述脂質(zhì)與水溶液中的RNA -起孵育，所述水可混溶有機(jī)溶劑例如乙 醇，（iii)逆相蒸發(fā)技術(shù)，（iv)對(duì)所述產(chǎn)物進(jìn)行冷凍和融化，（v)對(duì)所述產(chǎn)物進(jìn)行脫水和再 水化，（vi)對(duì)所述產(chǎn)物進(jìn)行凍干和再水化，或（vii)對(duì)所述產(chǎn)物進(jìn)行噴霧干燥和再水化。
18. 權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述納米顆粒通過這樣的方法 來生產(chǎn)，其包括將所述RNA與二價(jià)陽離子一起孵育，然后包含進(jìn)所述納米顆粒中，和/或用 將所述RNA與一價(jià)離子一起孵育，然后包含進(jìn)所述納米顆粒中，和/或?qū)⑺鯮NA與緩沖劑 一起孵育，然后包含進(jìn)所述納米顆粒中的步驟。
19. 權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述納米顆粒通過包括擠出之 步驟和/或凍干所述納米顆粒之步驟的方法來生產(chǎn)。
20. 權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中在全身性施用所述納米顆粒后， 在脾中發(fā)生RNA表達(dá)。
21. 權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中在全身性施用所述納米顆粒后， 在肺和/或肝中不發(fā)生或基本不發(fā)生RNA表達(dá)。
22. 權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中在全身性施用所述納米顆粒后， 在脾中的RNA表達(dá)是肺中RNA表達(dá)量的至少5倍。
23. 權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中在全身性施用所述納米顆粒后， 在脾的抗原呈遞細(xì)胞中，優(yōu)選專職性抗原呈遞細(xì)胞中發(fā)生RNA表達(dá)。
24. 權(quán)利要求23所述的藥物組合物，其中所述抗原呈遞細(xì)胞是樹突細(xì)胞和/或巨噬細(xì) 胞。
25. 權(quán)利要求20至24中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中通過腸胃外施用，優(yōu)選通過靜 脈內(nèi)施用、皮下施用、皮內(nèi)施用或動(dòng)脈內(nèi)施用來進(jìn)行全身性施用。
26. 權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述抗原是疾病相關(guān)抗原，或者 其引發(fā)針對(duì)疾病相關(guān)抗原或表達(dá)疾病相關(guān)抗原之細(xì)胞的免疫應(yīng)答。
27. 權(quán)利要求1至26中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其還包含一種或更多種可藥用載劑、 稀釋劑和/或賦形劑。
28. 權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其還包含至少一種佐劑。
29. 權(quán)利要求1至28中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其被配制成用于全身性施用。
30. 權(quán)利要求1至29中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，優(yōu)選針對(duì)癌癥 的免疫應(yīng)答。
31. 權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述RNA不包含假尿苷殘基，并 且優(yōu)選不包含經(jīng)修飾的核苷。
32. 權(quán)利要求1至31中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其用于預(yù)防性和/或治療性處理涉 及抗原的疾病，優(yōu)選癌癥疾病。
33. -種用于將抗原遞送至脾的抗原呈遞細(xì)胞優(yōu)選專職性抗原呈遞細(xì)胞，或在脾的抗 原呈遞細(xì)胞優(yōu)選專職性抗原呈遞細(xì)胞中表達(dá)抗原的方法，其包括將權(quán)利要求1至32中任一 項(xiàng)的藥物組合物施用于對(duì)象。
34. 權(quán)利要求33所述的方法，其中所述抗原呈遞細(xì)胞是樹突細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞。
35. -種用于在對(duì)象中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，優(yōu)選針對(duì)癌癥之免疫應(yīng)答的方法，其包括將權(quán)利 要求1至32中任一項(xiàng)的藥物組合物施用于所述對(duì)象。
36. -種用于在對(duì)象中刺激、引發(fā)和/或擴(kuò)增T細(xì)胞的方法，其包括將權(quán)利要求1至32 中任一項(xiàng)的藥物組合物施用于所述對(duì)象。
37. -種在對(duì)象中治療或預(yù)防涉及抗原的疾病，優(yōu)選癌癥疾病的方法，其包括將權(quán)利要 求1至32中任一項(xiàng)的藥物組合物施用于所述對(duì)象。
38. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的顆粒。
39. -種用于生產(chǎn)包含RNA之納米顆粒的方法，其包括以下步驟： (a) 提供配制在氯化鈉溶液中的RNA，和 (b) 將脂質(zhì)體添加至所述RNA中。
40. 權(quán)利要求39所述的方法，其中所述氯化鈉溶液是水溶液。
41. 權(quán)利要求39或40所述的方法，其中溶劑是水。
42. 權(quán)利要求39至41中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述氯化鈉溶液含有約50mM至約 300mM，優(yōu)選約100mM至約200mM，優(yōu)選約150mM的氯化鈉。
43. 權(quán)利要求39至42中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述氯化鈉溶液是等滲氯化鈉溶液。
44. 權(quán)利要求39至43中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述脂質(zhì)體配制在水中。
45. 權(quán)利要求39至44中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過將所述脂質(zhì)體注入所述RNA制劑 中來將所述脂質(zhì)體添加至所述RNA。
46. 權(quán)利要求39至45中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述納米顆粒是前述權(quán)利要求中任一 項(xiàng)所述的納米顆粒。
【文檔編號(hào)】A61K9/127GK104302276SQ201380016262
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2013年3月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月26日
【發(fā)明者】烏爾·沙欣, 海因里希·哈斯, 塞巴斯蒂安·克賴特爾, 穆斯塔法·迪肯, 丹尼爾·弗里茨, 馬丁·孟, 萊娜·馬里恩·克蘭茲, 克斯廷·羅伊特爾 申請(qǐng)人:生物技術(shù)公司, 約翰·古騰堡大學(xué)美因茲醫(yī)學(xué)大學(xué)轉(zhuǎn)化腫瘤學(xué)公司, 約翰·古騰堡大學(xué)美因茲醫(yī)學(xué)大學(xué)