本文提供了用于治療腎臟疾病的組合物及方法。更具體地，本申請涉及用于治療、預(yù)防或延緩腎臟疾病發(fā)展的工具和方法。

發(fā)明背景

腎臟扮演著幾個(gè)關(guān)乎生命維系的角色：其通過移除廢物和多余的液體清潔血液，維持血液中鹽和礦物質(zhì)的平衡，并且?guī)椭{(diào)控血壓。當(dāng)腎臟受損時(shí)，廢產(chǎn)物和液體會(huì)在體內(nèi)堆積，導(dǎo)致關(guān)節(jié)水腫、嘔吐、疲勞、睡眠不佳及呼吸短促。如果置之不理，病變的腎臟可能最終完全停止發(fā)揮功能。腎臟功能的喪失是非常嚴(yán)重的狀況，且可能致命。

腎臟疾病通常被稱為腎病，可由多種原因?qū)е?。其一般特征為不能充分維持主要的腎臟功能性，伴隨腎小球過濾率的下降。通常，腎病可被劃分為急性腎衰竭和慢性腎病。

急性腎臟衰竭，也稱為急性腎衰或急性腎臟損傷，其在數(shù)小時(shí)或數(shù)天中迅速發(fā)展。急性腎臟損傷有三個(gè)主要原因：(1)流向腎臟的血液突然嚴(yán)重減少。大量失血、傷口或被稱為敗血癥的嚴(yán)重感染可減少流向腎臟的血液。體內(nèi)液體不足(脫水)也可損害腎臟。另外孕期綜合征如子癇或先兆子癇可導(dǎo)致急性腎臟衰竭。(2)由一些藥物、毒素或感染造成的損害。大多數(shù)人吃藥不會(huì)導(dǎo)致任何腎臟問題。但有長期嚴(yán)重健康問題的人們比其他人更容易因?yàn)槌运幃a(chǎn)生腎臟問題。有時(shí)會(huì)損害腎臟的藥物實(shí)例包括抗生素如慶大霉素和鏈霉素；止痛藥如萘普生和布洛芬；一些降壓藥如ACE抑制劑；或一些X光檢測中使用的染料。(3)阻止尿液流出腎臟的突然阻塞。腎結(jié)石、腫瘤、傷口或前列腺腫大可引起阻塞。

腎臟損傷及功能下降如果持續(xù)超過3個(gè)月則稱為慢性腎臟疾病(CKD)。慢性腎疾病尤其危險(xiǎn)，因?yàn)槟憧赡懿坏桨l(fā)生很嚴(yán)重且常常不可療愈的腎臟損傷時(shí)都不會(huì)有任何癥狀。(1型和2型)糖尿病和高血壓是CKD的最常見原因。其他原因?yàn)椋?1)免疫系統(tǒng)病況如狼瘡和慢性病毒疾病如HIV/AIDS，乙肝和丙肝；(2)腎臟自身內(nèi)部的尿道感染，稱為腎盂腎炎，當(dāng)感染愈合時(shí)可導(dǎo)致瘢痕形成。多次發(fā)作可導(dǎo)致腎臟損傷；(3)腎臟內(nèi)微小過濾器(腎小球)的炎癥；這可在鏈球菌感染及其他未知原因情況下發(fā)生。(4)多囊腎臟疾病，其中腎臟內(nèi)慢慢形成充滿液體的囊腫。這是遺傳腎臟疾病的最常見形式。(5)出生時(shí)存在的先天性缺陷通常是尿道阻塞的結(jié)果或影響腎臟的功能障礙。最常見之一涉及膀胱和尿道之間的類似瓣膜的機(jī)制。這些缺陷，有時(shí)可發(fā)現(xiàn)于嬰兒仍在子宮中時(shí)，常常可以由泌尿科醫(yī)生手術(shù)修復(fù)。(6)藥物和毒素，包括長期接觸某些藥物和化學(xué)品；過度使用NSAID(非甾體抗炎藥)，例如布洛芬和萘普生；和使用“街頭”靜脈藥物。

糖尿病腎病(DN)是導(dǎo)致終末期腎病(ESRD)的慢性腎臟衰竭的主要原因，并且全世界范圍內(nèi)其患病率仍在增加(1)。最近的研究甚至表明1型和2型糖尿病患者的死亡率與腎臟疾病的存在和嚴(yán)重程度相關(guān)(2,3)。另一方面，沒有DN將糖尿病患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)準(zhǔn)化為與一般人群相同的水平(4)。

到目前為止，DN的治療主要包括控制高血糖或在藥理學(xué)上抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)。然而，這些治療不改善腎臟功能，并沒有減輕ESRD的負(fù)擔(dān)(5,6)。因此，迫切需要新的DN的治療方法。因此，本發(fā)明的目的之一是克服或改善至少一項(xiàng)現(xiàn)有技術(shù)的劣勢，或提供有用的備選方案用于治療腎病如糖尿病性腎病(腎硬化)、高血壓引起的腎病、血管炎引起的腎病、狼瘡性腎炎、腎小球腎炎引起的腎病、腎小管間質(zhì)性疾病引起的腎病、阻塞性腎病、造影劑誘導(dǎo)的腎病、腎小球腎炎、急性腎小管壞死(ATN)和急性間質(zhì)性腎炎(AIN)。

發(fā)明概述

驚奇地，已發(fā)現(xiàn)可以通過向哺乳動(dòng)物施用神經(jīng)調(diào)節(jié)素來預(yù)防、延遲或治療哺乳動(dòng)物的腎臟損傷。

迄今為止，沒有顯示神經(jīng)調(diào)節(jié)素參與任何腎臟功能或病理學(xué)，更沒有任何跡象表明它們在腎病的預(yù)防性或治療性的治療中的潛力。

本發(fā)明具體而言包括以下編號(i)至(xvi)方面和實(shí)施方案中一個(gè)或多個(gè)的任一個(gè)或任何組合。

(i)神經(jīng)調(diào)節(jié)素(NRG)蛋白質(zhì)，用于在哺乳動(dòng)物中治療、預(yù)防和/或延緩腎病。

(ii)用于(i)或(ii)的NRG蛋白質(zhì)，其中所述腎病是腎變病或腎炎。

(iii)用于(i)的NRG蛋白質(zhì)，其中所述腎病是慢性腎病。

(iv)用于(i)的NRG蛋白質(zhì)，其中所述腎病是急性腎病。

(v)用于(i)至(iii)中任一項(xiàng)的NRG蛋白質(zhì)，其中所述腎病選自糖尿病性腎病(腎硬化)、高血壓引起的腎病、血管炎引起的腎病、狼瘡腎炎、腎小球性腎炎引起的腎病、腎小管間質(zhì)性疾病引起的腎病、阻塞性腎病、造影劑誘導(dǎo)的腎病、中毒性腎病、腎小球腎炎、急性腎小管壞死(ATN)和急性間質(zhì)性腎炎(AIN)。

(vi)用于(i)至(iv)中任一項(xiàng)的NRG蛋白質(zhì)，其中所述腎病的特征在于白蛋白質(zhì)尿、腎小球硬化和/或腎纖維化中的一種或多種。

(vii)用于(i)至(vi)中任一項(xiàng)的NRG蛋白質(zhì)，其中所述NRG蛋白質(zhì)抑制膠原合成和/或FSP-1合成，優(yōu)選地在腎小球系膜細(xì)胞中。

(viii)用于(i)至(vi)中任一項(xiàng)的NRG蛋白質(zhì)，其中所述NRG蛋白質(zhì)的施用防止腎功能的減少，如通過蛋白質(zhì)尿和/或白蛋白質(zhì)尿，GFR或S_cr(血清肌酸酐(mg/dL))所確定的。

(ix)用于(i)至(vi)中任一項(xiàng)的NRG蛋白質(zhì)，其中所述NRG蛋白質(zhì)的施用在例如急性或慢性腎損傷的病況中增加GFR，在例如慢性腎衰竭的病況中可延緩血液透析。

(x)用于(i)至(vii)中任一項(xiàng)的NRG蛋白質(zhì)，其中所述NRG蛋白質(zhì)是神經(jīng)調(diào)節(jié)素-1(NRG-1)蛋白質(zhì)、神經(jīng)調(diào)節(jié)素-2(NRG-2)蛋白質(zhì)、神經(jīng)調(diào)節(jié)素-3(NRG-3)蛋白質(zhì)、神經(jīng)調(diào)節(jié)素-4(NRG-4)蛋白質(zhì)或其混合物。

(xi)用于(i)至(ix)中任一項(xiàng)的NRG蛋白質(zhì)，其中所述NRG蛋白質(zhì)包含EGF樣結(jié)構(gòu)域。

(xii)用于(i)至(viii)中任一項(xiàng)的NRG蛋白質(zhì)，其中所述NRG蛋白質(zhì)是NRG1 1型蛋白質(zhì)。

(xiii)用于(i)至(x)中任一項(xiàng)的NRG蛋白質(zhì)，其中所述NRG蛋白質(zhì)每天施用。

(xiv)用于(i)至(xi)中任一項(xiàng)的NRG蛋白質(zhì)，其中所述NRG蛋白質(zhì)以0.01至100μg/kg體重的日劑量施用。

(xv)用于(i)至(xii)中任一項(xiàng)的NRG蛋白質(zhì)，其中所述哺乳動(dòng)物是人。

(xvi)編碼(i)至(xiii)中任一項(xiàng)的NRG蛋白質(zhì)的核酸，用于在哺乳動(dòng)物中治療、預(yù)防和/或延緩腎病。

(xvii)藥物組合物，其包含用于在哺乳動(dòng)物中治療、預(yù)防和/或延緩腎病的有效量的(i)至(xiii)中任一項(xiàng)的NRG蛋白質(zhì)或(xiv)的核酸。

所附權(quán)利要求書也明確地包括在說明書中。

附圖簡述

圖1：與非糖尿病同窩幼仔相比，治療和未治療的糖尿病小鼠中的血糖情況。與用NRG-1治療或未治療的對照小鼠相比，未治療的糖尿病小鼠顯示高血糖癥(p<0.001)。糖尿病動(dòng)物的胰島素治療導(dǎo)致正常的血糖濃度。NRG-1對血糖無影響。*對比對照；#對比對照+NRG-1；$對比對比+INS。

圖2：腎臟功能的尿液標(biāo)志物。A，在誘導(dǎo)糖尿病后14周，在STZ治療的動(dòng)物中誘導(dǎo)產(chǎn)生微白蛋白尿(p<0.05)。胰島素和NRG-1的治療完全阻止了尿白蛋白的增加(分別為p<0.01，p<0.05)。B，與對照動(dòng)物相比，糖尿病動(dòng)物中尿NGAL濃度顯著更高(p<0.001)。胰島素治療阻止了這種上調(diào)(p<0.001)，而在NRG-1治療的糖尿病組中尿NGAL減少的趨勢并不顯著。

圖3：A，如Masson三色染色顯示，與STZ治療小鼠相反，非糖尿病對照動(dòng)物中不存在腎小球硬化(p<0.001)。通過用胰島素或NRG-1治療動(dòng)物可預(yù)防腎小球瘢痕形成(p<0.001)。顯示了每組的代表性Masson三色染色的腎小球，其中綠色染色指示結(jié)締組織。B，腎小球內(nèi)ErbB4受體的存在情況。代表性腎小球中的棕色染色指示ErbB4，與空白染色相比。

圖4：用NRG-1治療的腎小球系膜細(xì)胞中Akt和Erk的磷酸化情況。

圖5：通過NRG-1治療阻止糖尿病小鼠中纖維化標(biāo)志物的上調(diào)。A，未治療的糖尿病動(dòng)物的腎臟中，F(xiàn)SP-1的mRNA表達(dá)顯著增加(p<0.001)，這被NRG-1治療所阻止(p<0.01)。B，STZ治療的動(dòng)物中增加的IV型膠原合成(p<0.001)顯著受到胰島素和NRG-1的下調(diào)(p<0,01)。

圖6：腎小球系膜細(xì)胞中，NRG-1特異性受體的存在情況及NRG-1對Ang II刺激的膠原合成的抑制。A，腎小球系膜細(xì)胞中ErbB2、ErbB3和ErbB4的存在情況。B，腎小球系膜細(xì)胞中48小時(shí)期間，NRG-1阻止通過Ang II的膠原1a1的合成(p<0.001)。

圖7：神經(jīng)調(diào)節(jié)素片段(SEQ ID NO：1)和人神經(jīng)調(diào)節(jié)素-1(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列。

圖8：未治療或用NRG-1治療的對照和CIN-組中的血漿肌酸酐情況。CIN治療的動(dòng)物的血漿肌酸酐顯著增加，其被NRG-1治療完全阻止。NRG-1對健康對照動(dòng)物的血漿肌酸酐濃度沒有影響。*P<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

圖9：對未治療或用NRG-1治療的小鼠禁水24小時(shí)以激活腎血管緊張素系統(tǒng)(對照)的腎小球?yàn)V過率(GFR)。結(jié)果顯示NRG-1誘導(dǎo)GFR顯著增加。*P<0.05。

圖10：未治療或用NRG-1治療的，阻塞腎臟(UUO)與對側(cè)腎臟的重量對比。與對照腎相比，阻塞腎臟顯示重量顯著增加。NRG-1治療不影響腎臟重量。*P<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

圖11：與未治療或用NRG-1治療的UUO動(dòng)物相比，假手術(shù)動(dòng)物中的血漿肌酸酐濃度。

圖12：對照和阻塞腎臟中炎癥和纖維化標(biāo)志物的相對mRNA水平。左腎阻塞7天導(dǎo)致TGF-β、ICAM-1和VCAM-1、炎癥標(biāo)志物的顯著上調(diào)及前膠原1a1、3a1和纖連蛋白的上調(diào)，這表明腎纖維化的發(fā)展。NRG-1治療保護(hù)阻塞腎臟免于TGF-β、ICAM-1和前膠原3a1的mRNA的合成。*P<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

發(fā)明詳述

如本文所使用的，單數(shù)形式的“一”、“一個(gè)”和“這個(gè)”包括單數(shù)和復(fù)數(shù)的指代物，除非上下文清楚地另外指出。

本文使用的術(shù)語“包含有”、“包含”和“包含如下”與“包括有”、“包括”或“含有”、“含”同義，并且是包括性的或開放式的，不排除其他未提到的成員、元素或方法步驟。應(yīng)當(dāng)理解，本文使用的術(shù)語“包含有”、“包含”和“包含如下”包括術(shù)語“由...組成”、“組成”和“由如下組成”以及術(shù)語“基本上由...組成”、“基本上組成”和“基本上由如下組成”。

列舉數(shù)值范圍端點(diǎn)包括歸入相應(yīng)范圍內(nèi)的所有數(shù)字和分?jǐn)?shù)，以及所述的端點(diǎn)。

當(dāng)在本文中使用，提及可測量的值例如參數(shù)、量、持續(xù)時(shí)間等時(shí)，術(shù)語“約”或“大約”意在涵蓋+/-20％或更少，優(yōu)選+/-10％或更少、更優(yōu)選+/-5％或更少、還更優(yōu)選+/-1％或更少的變化，只要這些變化適于在所公開的發(fā)明中進(jìn)行。應(yīng)當(dāng)理解，修飾語“約”或“大約”所指的值本身也是具體優(yōu)選地公開的。

雖然術(shù)語“一個(gè)或多個(gè)”或“至少一個(gè)”，例如一組成員中的一個(gè)或多個(gè)或者至少一個(gè)成員本身是清楚的，但是借助于進(jìn)一步的示例，該術(shù)語尤其包括對任何一個(gè)所述成員或者對任何兩個(gè)或更多個(gè)所述成員的指代，例如任何≥3、≥4、≥5、≥6或≥7個(gè)所述成員，等等，直到所有所述成員。

本說明書中引用的所有參考文獻(xiàn)都通過引用整體并入本文。具體而言，本文中具體提及的所有參考文獻(xiàn)的教導(dǎo)都通過引用并入本文。

除非另有定義，在公開本發(fā)明中使用的所有術(shù)語，包括技術(shù)和科學(xué)術(shù)語，都具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義。進(jìn)一步的指導(dǎo)將術(shù)語定義也包括在內(nèi)以使本發(fā)明的教導(dǎo)更好地得到理解。

在下面的段落中，更詳細(xì)地定義了本發(fā)明的不同方面。如此定義的每個(gè)方面都可以與任何其他方面或多個(gè)方面組合，除非清楚地另有指出。具體而言，任何表示為優(yōu)選或有利的特征可以與任何其他表示為優(yōu)選或有利的特征組合。

描述重組DNA技術(shù)的一般原理的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)包括Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，vol.1-3,ed.Sambrook等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；Current Protocols in Molecular Biology，ed.Ausubel等人，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York，1992(定期更新)(“Ausubel等人1992”)；Innis等，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，Academic Press：San Diego，1990。微生物學(xué)的通用原理闡述于例如Davis，BD等人，Microbiology，第3版，Harper&Row，publishers，Philadelphia，Pa.(1980)。

貫穿整個(gè)說明書的“一個(gè)實(shí)施方案”或“實(shí)施方案”意味著結(jié)合實(shí)施方案描述的特定特征、結(jié)構(gòu)或特性包括在本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方案中。因此，貫穿本說明書的各個(gè)地方出現(xiàn)的短語“在一個(gè)實(shí)施方案中”或“在實(shí)施方案中”不一定全部指代相同的實(shí)施方案，而是可以指代不同實(shí)施方案。此外，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，特定特征、結(jié)構(gòu)或特性可以以對于本領(lǐng)域技術(shù)人員從本公開顯而易見的任何合適的方式組合。另外，盡管本文描述的一些實(shí)施方案包括其他實(shí)施方案中的一些特征而不包括其他特征，但是如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，不同實(shí)施方案的特征的組合意欲在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并且形成不同的實(shí)施方案。例如，在所附權(quán)利要求中，任何要求保護(hù)的實(shí)施方案可以以任何組合使用。

在以下本發(fā)明的詳細(xì)描述中，引用了形成了其一部分的附圖，并且其中通過僅示例顯示可以實(shí)踐本發(fā)明的特定實(shí)施方案而示出。應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下，可以利用其他實(shí)施方案并且可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)或邏輯改變。因此，下面的詳細(xì)描述不應(yīng)被理解為限制性的，并且本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求來限定。

在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及神經(jīng)調(diào)節(jié)素(NRG)蛋白質(zhì)或其功能片段或同源物，用于在哺乳動(dòng)物中治療，預(yù)防和/或延緩腎病的方法中。

如本文所使用的，術(shù)語“治療”或“療法”指代治療性處理。本文所使用的術(shù)語“治療”、“處理”等還包括在確定時(shí)改善或消除疾病或病況的發(fā)展，或者減輕所述疾病或病況的特征癥狀。術(shù)語“阻止”或“預(yù)防”是指預(yù)防措施，其中目的在于防止或減緩(減輕)不期望的生理變化或障礙。如本文所使用的，根據(jù)患者的狀況，這些術(shù)語還包括預(yù)防疾病或病況或者與疾病或病況相關(guān)癥狀的發(fā)作，包括在罹患所述疾病或病況之前減少疾病或病況或與其相關(guān)的癥狀的嚴(yán)重性。在罹患之前的這種預(yù)防或減少是指將本發(fā)明的化合物或組合物施用于在接收施用時(shí)還未罹患疾病或病況的患者?！邦A(yù)防”還包括例如在一段時(shí)間的改善之后，防止疾病或病況或者與其相關(guān)的癥狀的再次發(fā)作或復(fù)發(fā)預(yù)防。術(shù)語“延遲”或“延緩”同樣可以指推遲疾病或癥狀的發(fā)作，以及減緩疾病或癥狀的進(jìn)展?！靶枰委煛笔茉囌呃缛嘶騽?dòng)物包括從給定病況的治療中受益的那些。

如本文所詳述，神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)、其功能片段或同源物可用于在哺乳動(dòng)物中治療、預(yù)防和/或延緩腎病，和/或用于在哺乳動(dòng)物中治療，預(yù)防和/或延緩腎病的發(fā)作或進(jìn)展。涵蓋神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)、其功能片段或同源物可用于治療和預(yù)防原發(fā)癥狀的腎病以及治療和預(yù)防繼發(fā)性腎病，任選與其他不直接治療或預(yù)防腎病的藥物組合。

如本文所使用的，術(shù)語“腎病”是指腎臟疾病(也稱為腎或腎臟功能障礙，其也可以互換地稱為腎或腎臟衰竭或功能不全)，通常包括其中腎組織的功能性不足的狀態(tài)，疾病和病況，尤其是其中腎排泄功能受損的那些。腎功能障礙的表現(xiàn)和癥狀可包括但不限于以下情況中的一種或多種：血液中尿素和/或氮水平升高；低于正常肌酸酐清除率而高于血液中的正常肌酸酐水平；低于正常游離水清除率；體積過載和腫脹；酸水平異常；高于血液中鉀、鈣和/或磷酸鹽的正常水平；排尿變化(例如體積，滲透壓)；微白蛋白尿癥或巨白蛋白尿癥；腎酶如γ-谷氨酰基合成酶的活性改變；無力；皮疹或瘙癢；惡心；呼吸困難；腎臟減??；血尿和貧血。如本文所使用的，腎病被視為包括稱為急性腎衰竭或腎臟衰竭(急性腎疾病或腎臟疾病或損傷，例如急性腎臟損傷或“AKI”)或者慢性腎衰竭或腎臟衰竭(慢性腎疾病或腎臟疾病)的主要類型。雖然在急性腎衰竭中進(jìn)展一般很快(例如，幾天至幾周)，但是如果腎衰竭持續(xù)至少3個(gè)月且其進(jìn)展可能要花幾年的時(shí)間，則在傳統(tǒng)意義上認(rèn)為這種腎衰竭是慢性的。如本文所使用的，腎病可指腎變病，即非炎性腎病，或腎炎，即炎性腎病。對急性和慢性腎臟疾病的診斷在本領(lǐng)域已知，這樣可容易地鑒定出患有腎病的受試者。進(jìn)一步的指導(dǎo)表明腎病通常除其他外還涉及腎小球?yàn)V過率(GFR)的降低。急性和慢性腎病可以定義如下。

使用下文所述的“RIFLE”(風(fēng)險(xiǎn)、損傷、衰竭、損失、終末期腎病)分期系統(tǒng)，可將急性腎功能障礙或衰竭分期(分類，分級)為5個(gè)不同的階段(基于Lameire等人。2005，Lancet 365：417-430)：

可如下文所述基于GFR對慢性腎功能障礙或衰竭進(jìn)行分期(分類，分級)(基于Levey等人2005，Kidney Int 67：2089-2100)：

1期：GFR＝90mL/min(GFR正?；蛏?

2期：GFR＝60-89mL/min(輕度GFR降低)

3期：GFR＝30-59mL/min(中等GFR降低)

4期：GFR＝15-29mL/min(嚴(yán)重GFR降低)

5期：GFR<15mL/min(腎衰竭)

如本文所描述的需要治療或預(yù)防的腎病的起因并不關(guān)鍵。在具體的實(shí)施方案中，所述腎病選自包括如下或由如下組成的組：糖尿病性腎病(腎硬化)、高血壓引起的腎病、血管炎引起的腎病、狼瘡性腎炎、腎小球腎炎引起的腎病、腎小管間質(zhì)性疾病引起的腎病、阻塞性腎病、造影劑誘導(dǎo)的腎病、腎小球腎炎、急性腎小管壞死(ATN)和急性間質(zhì)性腎炎(AIN)。這些病況列表全部屬于一般類別的腎病。然而，腎病在一些情況下可以繼發(fā)于受試者罹患的原發(fā)病況。例如，糖尿病人經(jīng)常發(fā)展繼發(fā)性腎病，這被稱為“糖尿病性腎病”。雖然上文列出的病況在一些臨床方面可能不同，但所有這些的共同之處是腎臟的功能不足。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腎病是糖尿病性腎病。

例如蛋白尿、腎小球硬化或腎纖維化可能與腎功能不足相關(guān)。因此，在具體實(shí)施方案中，本文提及的腎病的特征在于白蛋白尿、腎小球硬化和/或腎纖維化中的一種或多種。在具體的實(shí)施方案中，所述腎病的特征在于白蛋白尿。在其他實(shí)施方案中，所述腎病的特征在于腎小球硬化。在其他實(shí)施方案中，所述腎病的特征是腎纖維化。在具體實(shí)施方案中，所述腎病的特征在于白蛋白尿和腎小球硬化。在具體實(shí)施方案中，所述腎病的特征在于白蛋白尿和腎纖維化。在具體實(shí)施方案中，腎病的特征在于腎小球硬化和腎纖維化。在其他實(shí)施方案中，腎病的特征在于白蛋白尿、腎小球硬化和腎纖維化。

本文已經(jīng)確定的是，施用神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)對減輕，預(yù)防或治療患有輕度或重度GFR的哺乳動(dòng)物是有效的。因此，在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療患有輕度或重度GFR的哺乳動(dòng)物的工具和方法，其包括向所述哺乳動(dòng)物施用神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)。

如本文所詳述的治療方法的效果是腎病發(fā)生的減少或預(yù)防。該效應(yīng)可以不同的方式評估。已經(jīng)用于評估腎臟疾病進(jìn)展的標(biāo)準(zhǔn)和/或終點(diǎn)的實(shí)例包括但不限于進(jìn)展為腎臟衰竭(GFR<15ml/min每1.73m²或開始透析或移植)，蛋白尿和/或白蛋白尿，GFR或S_cr(血清肌酸酐(mg/dL))水平的變化。因此，在具體的實(shí)施方案中，提供了方法和組合物，其中向哺乳動(dòng)物施用神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)以確保所述患者中按這些標(biāo)準(zhǔn)中一種或多種所確定的腎臟疾病進(jìn)展有所降低或防止其增加。

本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，向哺乳動(dòng)物施用神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)預(yù)防或減少腎纖維化，這由腎纖維化標(biāo)志物FSP-1和指示膠原合成的IV型膠原RNA的上調(diào)被減少或阻止而確定。還發(fā)現(xiàn)尿FSP-1可指示腎臟功能。因此，在具體的實(shí)施方案中，提供了方法和組合物，其中向哺乳動(dòng)物施用神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)抑制膠原合成，優(yōu)選地膠原IV合成和/或FSP-1合成。如本文所使用的，“合成”指代蛋白質(zhì)表達(dá)。蛋白質(zhì)合成的抑制可以涉及蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄抑制和/或蛋白質(zhì)編碼mRNA的翻譯抑制，二者都可以通過常規(guī)技術(shù)來測定，例如分別為蛋白質(zhì)印跡或Q-PCR。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，對膠原合成，優(yōu)選膠原IV型合成和/或FSP-1合成的抑制涉及對各自基因的轉(zhuǎn)錄的抑制或減少。這些基因中的一個(gè)或兩個(gè)的抑制優(yōu)選發(fā)生在腎細(xì)胞中，更優(yōu)選發(fā)生于腎小球細(xì)胞或腎小球系膜細(xì)胞中，甚至更優(yōu)選地發(fā)生于腎小球系膜細(xì)胞中。因此，在本文涵蓋的方法的具體實(shí)施方案中，神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)抑制胞腎細(xì)胞中的膠原，優(yōu)選膠原IV和/或FSP-1合成。更具體地，所述細(xì)胞為腎小球細(xì)胞。在本文涵蓋的方法的具體實(shí)施方案中，神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)抑制腎小球系膜細(xì)胞中的膠原，優(yōu)選膠原IV，和/或FSP-1合成。

在具體實(shí)施方案中，本申請涵蓋了對腎病的預(yù)防，更具體地為在易發(fā)展腎病的受試者中的預(yù)防。對腎病易感的受試者的實(shí)例包括與已知誘導(dǎo)急性腎臟損傷的一種或多種因素接觸的受試者，例如：(1)流向腎臟的血液突然嚴(yán)重減少。大量失血，傷口或稱為敗血癥的不良感染可以減少流向腎臟的血液。身體中液體不足(脫水)也可以損害腎臟。另外孕期綜合征如子癇或先兆子癇可導(dǎo)致急性腎臟衰竭。(2)由一些藥物、毒素或感染造成的損害，尤其是對有長期嚴(yán)重健康問題的受試者?？烧T導(dǎo)腎病的藥物實(shí)例包括抗生素如慶大霉素和鏈霉素；止痛藥如萘普生和布洛芬；一些降壓藥如ACE抑制劑；或一些X光檢測中使用的染料。(3)阻止尿液流出腎臟的突然阻塞。腎臟結(jié)石、腫瘤、傷口或前列腺腫大可引起阻塞。另外或可選地，易患腎病的受試者包括患有糖尿病或高血壓的受試者。另外或可選地，易患腎病的受試者包括患有疾病或與已知誘導(dǎo)慢性腎臟損傷的一種或多種因素接觸的受試者，例如(1)免疫系統(tǒng)病況如狼瘡和慢性病毒疾病如HIV/AIDS，乙肝和丙肝；(2)腎臟自身內(nèi)部的尿道感染，稱為腎盂腎炎，當(dāng)感染愈合時(shí)可導(dǎo)致瘢痕形成。多次發(fā)作可導(dǎo)致腎臟損傷；(3)腎臟內(nèi)微小過濾器(腎小球)中的炎癥；這可在鏈球菌感染及其他未知原因情況下發(fā)生。(4)多囊腎臟病，其中腎臟內(nèi)慢慢形成充滿液體的囊腫，這是繼承性腎臟疾病的最常見形式。(5)出生時(shí)存在的先天性缺陷通常是尿道阻塞的結(jié)果或影響腎臟的功能障礙。最常見之一涉及膀胱和尿道之間的類似瓣膜的機(jī)制。這些缺陷有時(shí)可發(fā)現(xiàn)于嬰兒仍在子宮中時(shí)，常常可以由泌尿科醫(yī)生手術(shù)修復(fù)。(6)藥物和毒素，包括長期接觸某些藥物和化學(xué)品；過度使用NSAID(非甾體抗炎藥)，例如布洛芬和萘普生；和使用“街頭”靜脈藥物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，涵蓋由于一種或多種這些因素而患有腎病的患者也將通過本文所述的治療方法進(jìn)行治療。

不受理論的束縛，據(jù)信神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)激活多種信號傳導(dǎo)途徑，例如Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和Erk信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，這樣確保了其對本文觀察的腎病的作用。因此，在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)用于減少、預(yù)防或治療腎病，其中所述神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)激活A(yù)kt和/或Erk信號傳導(dǎo)途徑。用于鑒定信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活的方法是本領(lǐng)域公知的。Akt和Erk信號傳導(dǎo)途徑在本領(lǐng)域中也是眾所周知的。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員有充分的能力評價(jià)這些途徑中任一途徑的激活。根據(jù)進(jìn)一步的指導(dǎo)，這些途徑的激活可以通過例如測量磷酸化Akt或Erk來確定。在本文中，Akt或Erk的磷酸化(或磷酸化的增加)分別表示Akt和Erk途徑的激活(或激活的增加)。一個(gè)或兩個(gè)這些途徑的激活優(yōu)選發(fā)生在腎細(xì)胞中，更優(yōu)選發(fā)生在腎小球細(xì)胞或腎小球系膜細(xì)胞中，甚至更優(yōu)選發(fā)生在腎小球系膜細(xì)胞中。

如本文所使用的，術(shù)語“神經(jīng)調(diào)節(jié)素”是指神經(jīng)調(diào)節(jié)素家族的蛋白質(zhì)。神經(jīng)調(diào)節(jié)素或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白是具有四種結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)的家族，其是EGF蛋白質(zhì)家族的一部分。神經(jīng)調(diào)節(jié)素家族包括：(1)神經(jīng)調(diào)節(jié)素1(NRG-1)，具有源自可變剪接的多個(gè)同種型：I型NRG-1；備選名稱：Heregulin，NEU分化因子(NDF)或乙酰膽堿受體誘導(dǎo)活性(ARIA)；II型NRG-1；備選名稱：膠質(zhì)生長因子-2(GGF2)；III型NRG-1；備選名稱：感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元衍生因子(SMDF)；IV型NRG-1；V型NRG-1；VI型NRG-1；(2)神經(jīng)調(diào)節(jié)素-2(NRG-2)；(3)神經(jīng)調(diào)節(jié)素-3(NRG-3)；(4)神經(jīng)調(diào)節(jié)素-4(NRG-4)。

在特定實(shí)施方案中，本文所提及的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)可以是一種或者兩種或更多種上述家族成員中的混合物。應(yīng)當(dāng)理解，本文所指的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)優(yōu)選是成熟的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白(即，包含EGF樣結(jié)構(gòu)域的裂解的前神經(jīng)調(diào)節(jié)素)，其可含有或不含信號肽，但優(yōu)選為不含信號肽。本文提及的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)可以是天然存在的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)，例如從特定宿主分離的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)。備選地，本文所指的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)可以(在例如大腸桿菌、酵母、CHO細(xì)胞系或其他宿主中)重組產(chǎn)生。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文所使用的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)是NRG-1。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文所使用的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)是I型NRG-1(heregulin)。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文所用的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)是NRG-1優(yōu)選I型NRG-1的β同種型，即Iβ型NRG-1。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文所用的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)是NRG-1優(yōu)選I型NRG-1的β1同種型，即Iβ1型NRG-1。

在具體實(shí)施方案中，本文提及的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)是人神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文所用的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)是人NRG-1。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文所用的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)是I型人NRG-1(heregulin)。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文所用的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)是人NRG-1優(yōu)選I型人NRG-1的β同種型，即Iβ型人NRG-1。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文所用的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)是人NRG-1優(yōu)選I型人NRG-1的β1同種型，即Iβ1型人NRG-1。

本申請還涵蓋神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)，例如人神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的同源物、直向同源物或功能片段或變體的用途。術(shù)語“直向同源物”、“同源物”、“功能變體”和“功能片段”是本領(lǐng)域熟知的。根據(jù)進(jìn)一步的指導(dǎo)，本文使用的蛋白質(zhì)的“同源物”是相同物種的蛋白質(zhì)，其執(zhí)行與其同源的蛋白質(zhì)相同或相似的功能。同源蛋白質(zhì)可以在結(jié)構(gòu)上相關(guān)但這并不必需這樣，或者僅部分地在結(jié)構(gòu)上相關(guān)。如本文所使用的蛋白質(zhì)的“直向同源物”是不同物種的蛋白質(zhì)，其執(zhí)行與其直向同源物的蛋白質(zhì)相同或相似的功能。直向同源蛋白質(zhì)可以在結(jié)構(gòu)上相關(guān)但這并不必需這樣，或者僅部分地在結(jié)構(gòu)上相關(guān)。如本文所使用的蛋白質(zhì)的“功能變體”或“功能片段”是指此蛋白質(zhì)的變體或片段，其至少部分地保留或模擬該蛋白質(zhì)的活性。功能變體或片段可以包括突變體(其可以是插入，刪除或置換突變體)，包括多形體等。功能變體或片段可以是天然存在或人造的。在本發(fā)明的上下文中，功能片段是指可結(jié)合并激活同宗(cognate)ErbB受體的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)片段。類似地，功能變體或同源物是指可以結(jié)合并激活同宗ErbB受體的分子。

在具體實(shí)施方案中，本文提及的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的同源物、直向同源物、功能變體或功能片段與一種或多種人神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)具有至少80％、更優(yōu)選至少85％、甚至更優(yōu)選至少90％，例如至少95％的序列同一性。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)提及序列比對時(shí)，序列同一性將基于待比對的最短序列來確定。例如，短于神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)全長蛋白質(zhì)的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)片段的序列比對將基于片段的長度來確定。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文提及的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的同源物、直向同源物、功能變體或功能片段與人NRG-1具有至少80％、更優(yōu)選至少85％、甚至更優(yōu)選至少90％，例如至少95％的序列同一性。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文提及的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的同源物、直向同源物、功能變體或功能片段與I型人NRG-1(heregulin)具有至少80％、更優(yōu)選至少85％、甚至更優(yōu)選至少90％，例如至少95％的序列同一性。在一個(gè)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文提及的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的同源物、直向同源物、功能變體或功能片段與人NRG-1，優(yōu)選I型人NRG-1的β同種型，即Iβ型人NRG-1(其對應(yīng)于NRG-1的N-末端片段)具有至少80％、更優(yōu)選至少85％、甚至更優(yōu)選至少90％，例如至少95％的序列同一性，或與其完全同一。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文提及的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的同源物、直向同源物、功能變體或功能片段與人NRG-1，優(yōu)選I型人NRG-1的β1同種型，即Iβ1型人NRG-1具有至少80％、更優(yōu)選至少85％、甚至更優(yōu)選至少90％，例如至少95％的序列同一性。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文提及的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的同源物、直向同源物、功能變體或功能片段與SEQ ID NO：2具有至少80％、更優(yōu)選至少85％、甚至更優(yōu)選至少90％，例如至少95％，更具體是100％的序列同一性。在具體的實(shí)施方案中，本文提及的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)、功能片段、功能變體、直向同源物或同源物，例如人神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)、功能片段、功能變體、直向同源物或同源物包括EGF樣結(jié)構(gòu)域，基本上由EGF樣結(jié)構(gòu)域構(gòu)成或者由EGF樣結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。EGF樣結(jié)構(gòu)域是本領(lǐng)域熟知的，并且可以通過涉及序列比對的常規(guī)技術(shù)容易地鑒定。蛋白質(zhì)的BLAST分析也輸出保守結(jié)構(gòu)域，使得可以容易地評估EGF樣結(jié)構(gòu)域的存在情況。所有神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的EGF樣結(jié)構(gòu)域也已經(jīng)在例如蛋白質(zhì)和核酸數(shù)據(jù)庫中注釋，其可以在例如ncbi網(wǎng)站上進(jìn)行訪問。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定本文提及的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)、功能片段、功能變體、直向同源物或同源物是否包含EGF樣結(jié)構(gòu)域。

在具體的實(shí)施方案中，本文提及的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的含有EGF樣結(jié)構(gòu)域的同源物、直向同源物、功能變體或功能片段與人神經(jīng)調(diào)節(jié)素具有至少80％、更優(yōu)選至少85％、甚至更優(yōu)選至少90％，例如至少95％的序列同一性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文提及的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的含有EGF樣結(jié)構(gòu)域的同源物、直向同源物、功能變體或功能片段與人NRG-1具有至少80％、更優(yōu)選至少85％、甚至更優(yōu)選至少90％，例如至少95％的序列同一性。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文提及的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的含有EGF樣結(jié)構(gòu)域的同源物、直向同源物、功能變體或功能片段與I型人NRG-1(heregulin)具有至少80％、更優(yōu)選至少85％、甚至更優(yōu)選至少90％，例如至少95％的序列同一性。在一個(gè)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文提及的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的含有EGF樣結(jié)構(gòu)域的同源物、直向同源物、功能變體或功能片段與人NRG-1，優(yōu)選I型人NRG-1的β同種型，即Iβ型人NRG-1具有至少80％、更優(yōu)選至少85％、甚至更優(yōu)選至少90％，例如至少95％的序列同一性。神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的功能性變體的實(shí)例提供于US2014031284、WO03/099300、US537060和US6,136,558中。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本文提及的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的含有EGF樣結(jié)構(gòu)域的同源物、直向同源物、功能變體或功能片段與人NRG-1，優(yōu)選I型人NRG-1的β1同種型，即Iβ1型人NRG-1具有至少80％、更優(yōu)選至少85％、甚至更優(yōu)選至少90％，例如至少95％的序列同一性。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，如本文中所提及的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的功能片段對應(yīng)于人神經(jīng)調(diào)節(jié)素-1或Heregulin-β1的EGF結(jié)構(gòu)域的序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文提及的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的功能片段與SEQ ID NO：1的序列具有至少80％、更優(yōu)選至少85％、甚至更優(yōu)選至少90％，如例如至少95％的序列同一性，更具體地具有100％的序列同一性。

在具體的實(shí)施方案中，神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的同源物是能夠結(jié)合并激活ErbB4受體的蛋白質(zhì)或化合物?？苫谄浣Y(jié)合并激活ErbB4受體的能力鑒定出的蛋白質(zhì)和分子的實(shí)例是激活性抗體或小分子。在具體實(shí)施方案中，這些分子特異性激活ErbB4受體。

本文教導(dǎo)的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)可以以單體形式或者以多聚體或多價(jià)形式使用，優(yōu)選以二聚體或二價(jià)形式使用。神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的二聚體已知不是天然存在的，因此，在本文中被稱為合成或工程化的。在特定實(shí)施方案中，神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)以二聚體形式使用。如本文所述的神經(jīng)調(diào)節(jié)素多聚體或二聚體包含以單體形式的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)及一個(gè)或多個(gè)相同的或另一種ErbB2、ErbB3或ErbB4配體。神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)二聚體的單體可以是相同的(即神經(jīng)調(diào)節(jié)素同二聚體)或不同的(即神經(jīng)調(diào)節(jié)素異二聚體)。因此，本文涵蓋包含以下神經(jīng)調(diào)節(jié)素二聚體的非限制性實(shí)例：NRG2b-NRG2b、NRG2b-NRG2a、NRG2b-NRG1B3、NRG2b-NRG1α、NRG2b-NRG1B、NRG2b-NRG2、NRG2b-NRG3、NRG2b-NRG4、NRG2a-NRG2a、NRG2a-NRG1B3、NRG2a-NRG1α、NRG2a-NRG1B、NRG2a-NRG2、NRG2a-NRG3、NRG2a-NRG4、NRG1B3-NRG1B3、NRG1B3-NRG1α、NRG1B3-NRG1B、NRG1B3-NRG2、NRG1B3-NRG3、NRG1B3-NRG4、NRG1a-NRG1α、NRG1a-NRG1B、NRG1a-NRG2、NRG1a-NRG3、NRG1a-NRG4、NRG1B-NRG1B、NRG1B-NRG2、NRG1B-NRG3、NRG1B-NRG4、NRG2-NRG2、NRG2-NRG3、NRG2-NRG4、NRG3-NRG3、NRG3-NRG4和NRG4-NRG4。本文所述的神經(jīng)調(diào)節(jié)素二聚體中的這些神經(jīng)調(diào)節(jié)素單體通常通過連接子連接。連接子可以包括卷曲螺旋、肽間隔子、水溶性柔性聚合物(例如聚環(huán)氧乙烷、葡聚糖、聚丙烯酸和聚丙烯酰胺)，或其組合。神經(jīng)調(diào)節(jié)素二聚體可以用例如美國申請US 2013/0196911中段落104至107描述的方法生產(chǎn)，其具體地通過引用并入本文，或以本領(lǐng)域其他方法生產(chǎn)。用于生產(chǎn)配體二聚體如神經(jīng)調(diào)節(jié)素二聚體的方法是本領(lǐng)域中已知的，并描述于例如PCT申請WO2010033249中，其具體地通過引用并入本文。

用于比較序列和確定序列同一性的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，序列同一性的百分比是指對這些序列比對后兩個(gè)序列之間相同的核酸或氨基酸的百分比?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的多種不同程序和算法進(jìn)行比對并計(jì)算同一性百分比。優(yōu)選的比對算法包括BLAST(Altschul，1990；例如可在NCBI網(wǎng)站獲得)和Clustal(在Chenna，2003中綜述；例如可在EBI網(wǎng)站獲得)。優(yōu)選地，BLAST被用于計(jì)算兩個(gè)序列之間的同一性百分比，例如由Tatusova和Madden 1999(FEMS Microbiol Lett 174：247-250)描述的“Blast 2sequences”算法進(jìn)行，例如使用已發(fā)表的默認(rèn)設(shè)置或其他合適的設(shè)置計(jì)算(例如對于BLASTN算法：缺口打開成本＝5，缺口延伸成本＝2，錯(cuò)配罰分＝-2，匹配得分＝1，缺口x_dropoff＝50，期望值＝10.0，字段大小＝28；或?qū)τ贐LASTP算法：矩陣＝Blosum62，缺口打開成本＝11，缺口延伸成本＝1，期望值＝10.0，字段大?。?)。

在具體實(shí)施方式中，如本文提及的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)或者神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的同源物、直向同源物、功能變體或功能片段包含如下多肽，基本上由如下多肽組成，由如下多肽組成，所述多肽具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列，或具有與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列的多肽有至少80％、更優(yōu)選至少85％、甚至更優(yōu)選至少90％,，例如至少95％的序列同一性。

本文所述的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)，本文所提及的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的同源物、直向同源物、功能變體或功能片段任選與藥物可接受載體一起可以通過任何合適的應(yīng)用形式施用，如i.d.、i.v.、i.p.、i.m.、鼻內(nèi)、口服、皮下等方式，并可在任何合適的遞送裝置中施用(O.Hagan等人，Nature Reviews，Drug Discovery 2(9)，(2003)，727-735)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)優(yōu)選配制成用于靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或肌內(nèi)施用(參見例如“Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations”，Sar-faraz Niazi，CRC Press Inc，2004)。因此，本發(fā)明還涉及包含本文所述的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)，本文所提及的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的同源物、直向同源物、功能變體或功能片段的藥用組合物，任選地與藥物可接受載體一起，用于在哺乳動(dòng)物中治療、預(yù)防和/或延緩腎病。如本文所使用的，“賦形劑”包括任何及所有的溶劑、稀釋劑、緩沖液(例如中性緩沖鹽水或磷酸緩沖鹽溶液)、溶合劑、膠體、分散基質(zhì)、媒介物、填充劑、螯合劑(例如EDTA或谷胱甘肽)、氨基酸(例如甘氨酸)、蛋白質(zhì)、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、潤濕劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、風(fēng)味劑、芳香劑、增稠劑、用于實(shí)現(xiàn)儲(chǔ)庫效應(yīng)的試劑、包衣、抗真菌劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、張力控制劑，吸收延遲劑等。這些基質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域公知的。這些材料應(yīng)是無毒的，并且不應(yīng)干擾到神經(jīng)調(diào)節(jié)素的活性。

在一方面，本發(fā)明還涉及包含有效量的如本文別處所定義的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)，其同源物、直向同源物、功能變體或功能片段的藥用組合物，用于在哺乳動(dòng)物中治療、預(yù)防和/或延緩腎病。

如本文所使用的，術(shù)語“有效量”指代蛋白質(zhì)(或核酸)或組合物如藥物組合物在其所施用的受試者中達(dá)到治療或預(yù)防效果的量或劑量。有效量是能夠在施用所述蛋白質(zhì)、核酸或組合物的組織、系統(tǒng)、動(dòng)物或人體中引發(fā)生物學(xué)或藥物應(yīng)答的量，具體而言是可以預(yù)防或減輕所治療的疾病或病況的一種或多種局部或全身癥狀或特征的量。

在一個(gè)實(shí)施方案中，如本文別處定義的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)、同源物、直向同源物、功能變體或功能片段將以0.01至100μg/kg，即0.01至100μg/kg其要施用的受試者體重的濃度范圍施用，優(yōu)選為0.05至50μg/kg，更優(yōu)選為0.1至10μg/kg。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如本文別處定義的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)、同源物、直向同源物、功能變體或功能片段以0.01至100μg/kg/天，即以每天0.01至100μg/kg其要施用的受試者體重的濃度范圍施用，優(yōu)選為0.05至50μg/kg/天，更優(yōu)選為0.1至10μg/kg/天。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如本文別處定義的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)、同源物、直向同源物、功能變體或功能片段將以0.01至100μg/kg/周，即以每周0.01至100μg/kg其要施用的受試者體重的濃度范圍施用，優(yōu)選0.05至50μg/kg/周，更優(yōu)選0.1至10μg/kg/周。

在一個(gè)實(shí)施方案中，如本文別處定義的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)、同源物、直向同源物、功能變體或功能片段將以10至1000pmol/kg，即10至1000pmol/kg其要施用的受試者體重的濃度范圍施用，優(yōu)選為30至500pmol/kg，更優(yōu)選為50至100pmol/kg。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如本文別處定義的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)、同源物、直向同源物、功能變體或功能片段將以10至1000pmol/kg/天，即每天以10至1000pmol/kg其要施用的受試者體重的濃度范圍施用，優(yōu)選為30至500pmol/kg/天，更優(yōu)選為50至100pmol/kg/天。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如本文別處定義的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)、同源物、直向同源物、功能變體或功能片段將以10至1000pmol/kg/周，即每周以10至1000pmol/kg其要施用的受試者體重的濃度范圍施用，優(yōu)選30至500pmol/kg/周，更優(yōu)選50至100pmol/kg/周。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，治療的持續(xù)時(shí)間可以根據(jù)所需的結(jié)果而改變，例如是為了改善一種或多種癥狀，或是完全治愈等。例如，可以僅施用一次神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)，例如包含神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的藥物組合物。備選地，可以在指定的持續(xù)時(shí)間內(nèi)每天施用神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)，例如在2、3、4、5、6、7或更多天內(nèi)或至少在以上持續(xù)時(shí)間內(nèi)，這些天可以是連續(xù)的也可以不連續(xù)。也可以每天多次施用神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)，例如每天施用至少2、3、4、5、6、7次或更多次。也可以例如每周多次施用神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)，例如每周至少2、3、4次或更多次。也可以例如每周、每2、3、4或更多周施用神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)。亦可以例如每月、每2、3、4或更多月施用神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解，神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的施用形式可以變化。例如，可以單次快注或備選地在延長的時(shí)間段內(nèi)施用神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)，如包含神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的藥物組合物。例如，可以以點(diǎn)滴形式施用神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)，施用時(shí)間持續(xù)數(shù)分鐘或數(shù)小時(shí)，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多分鐘，例如10、20、30、40、50、60或更多分鐘，例如0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4或更多小時(shí)，如4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或更多小時(shí)。

在具體的實(shí)施方案中，通過以0.3-1.0ug/kg/天IV給藥5天，每次滴注10小時(shí)施用神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)來治療患有腎病如糖尿病性腎病的患者。在具體實(shí)施方案中，所述治療包括首先施用較低劑量(0.3-0.7ug/kg/天)，隨后施用略高劑量(0.5-1.0ug/kg/天)。在另外的具體實(shí)施方案中，對于患有以GFR嚴(yán)重減少(15-30ml/min)為特征的糖尿病性腎病的患者，通過IV給藥，0.6ug/kg/天的神經(jīng)調(diào)節(jié)素-1(5天，10小時(shí)滴注)，隨后為0.8ug/kg(每周，10分鐘滴注，20周)向有需要的患者施用神經(jīng)調(diào)節(jié)素。在具體的實(shí)施方案中，對于患有特征在于正常GFR或輕度降低的GFR(GFR>60ml/min)和白蛋白尿的糖尿病性腎病的患者，通過IV給藥，0.8ug/kg/天的神經(jīng)調(diào)節(jié)素-1(每周，10分鐘滴注，20周)向有需要的患者施用神經(jīng)調(diào)節(jié)素。

在另一方面，本發(fā)明涉及包含編碼如本文所述的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)，本文提及的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的同源物、直向同源物、功能變體或功能片段的核酸序列的核酸，用于在哺乳動(dòng)物中治療、預(yù)防和/或延遲腎病。優(yōu)選地，所述核酸是真核表達(dá)載體，其包含編碼如本文所述的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)，本文提及的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)的同源物、直向同源物、功能變體或功能片段的核酸序列。這些載體是本領(lǐng)域熟知的，并且可包括調(diào)節(jié)元件或組織特異性啟動(dòng)子，使編碼序列的表達(dá)可以得到調(diào)節(jié)，例如可進(jìn)行組織特異性表達(dá)，也可進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)或二者的組合。

此外，本發(fā)明涉及用于如上所述地治療、預(yù)防和/或延緩腎病的方法，包括向有需要的受試者施用如本文別處定義的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)，其同源物、直向同源物、功能變體或功能片段，或者編碼本文別處定義的此蛋白質(zhì)的核酸。在具體實(shí)施方案中，所述方法由此治療、預(yù)防和/或延遲腎病。在另外的實(shí)施方案中，所述方法包括確定受試者的腎病情況或腎病的易感性，然后施用如本文別處定義的所述神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)，其同源物、直向同源物、功能變體或功能片段。在本文提供的方法中所涵蓋的腎病的類型在別處有詳細(xì)描述。

此外，本發(fā)明涉及本文別處定義的神經(jīng)調(diào)節(jié)素蛋白質(zhì)，其同源物、直向同源物、功能變體或功能片段，或者編碼本文別處定義的此蛋白質(zhì)的核酸在制備用于治療、預(yù)防和/或延遲腎病的藥物中的用途。

本發(fā)明的方面和實(shí)施方案進(jìn)一步由以下非限制性實(shí)施例支持。

實(shí)施例

實(shí)施例1:預(yù)防I型糖尿病相關(guān)腎病

在I型糖尿病的動(dòng)物模型中確定神經(jīng)調(diào)節(jié)素預(yù)防腎病，特別是糖尿病腎病的能力。

動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)室繁殖的雄性載脂蛋白(Apo)E缺陷小鼠最初獲自Jax Laboratories。在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)小鼠，有12小時(shí)的光照-黑暗循環(huán)，小鼠可隨意獲得正常食物和飲用水。所進(jìn)行的所有實(shí)驗(yàn)都通過Antwerp大學(xué)的動(dòng)物倫理委員會(huì)(ECD)批準(zhǔn)，符合由美國國立衛(wèi)生研究院出版的“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南”(NIH出版號85-23，修訂于1996年)。

I型糖尿病的誘導(dǎo)

16周齡ApoE小鼠(n＝62)連續(xù)5天接受腹膜內(nèi)注射的鏈脲霉素(STZ，60mg/kg，Sigma Aldrich)(溶于檸檬酸鹽緩沖液(0.05M)中)。在STZ注射前，對小鼠禁食6小時(shí)。初次注射后2周，小鼠發(fā)生高血糖。將血糖水平不達(dá)到高于300mg/dl的小鼠從研究中排除。

腎功能標(biāo)志物

在第14周，處死前一天，收集代謝籠中每只動(dòng)物的24小時(shí)尿。處死時(shí)，在終末麻醉下通過心臟穿刺獲得血液樣品，并收集于肝素中。離心血液樣品，分離血漿。根據(jù)制造商的操作流程進(jìn)行微量白蛋白尿(Bethyl Laboratories)和嗜中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL，Abcam)的ELISA實(shí)驗(yàn)。測量尿和血肌酸酐，以確定肌酸酐清除率。通過比色Jaffé方法分析尿肌酸酐，通過自動(dòng)分析儀(Siemens Vista 1500)確定血漿肌酸酐。

腎損傷和ErbB受體存在情況的組織學(xué)評估

稱量左腎將其固定于4％緩沖福爾馬林中，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)⑵浒裨谑炛幸赃M(jìn)行組織染色。用Masson三色染色腎切片(5μm)以測定腎小球硬化的程度。通過光學(xué)顯微鏡(Olympus U-TU1X-2，Japan)以40x放大倍數(shù)對每個(gè)腎臟捕獲20張外部皮層腎小球橫截面的圖像。如先前所述(7)，通過使用ImageJ進(jìn)行無偏組織學(xué)定量。腎小球陽性表示為陽性染色百分比與腎小球簇面積的比率。

用抗ErbB4抗體(ErbB4(C-18)：sc-283，Santa Cruz)進(jìn)行免疫組織學(xué)染色，確定腎小球簇區(qū)域中NRG-1特異性受體ErbB4的存在。為了避免二抗非特異性結(jié)合的假陽性結(jié)果，將ErbB4染色的腎臟與僅與二抗孵育的空白染色的圖像進(jìn)行比較。

腎系膜細(xì)胞

購入小鼠腎小球系膜細(xì)胞(P10628，Innoprot)并根據(jù)制造商操作流程培養(yǎng)。簡言之，在達(dá)到37℃的水浴中解凍細(xì)胞，并鋪板于聚-L賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，其中含有補(bǔ)充10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)。每2至3天更換一次培養(yǎng)基。

通過蛋白質(zhì)印跡分析腎小球系膜細(xì)胞中ErbB受體的存在。為了評估膠原合成情況，在無血清DMEM中培養(yǎng)24小時(shí)后，在存在或不存在rhNRG-1β的情況下用血管緊張素II(Ang II，100nM，Sigma Aldrich)刺激腎小球系膜細(xì)胞24、48和72小時(shí)。通過實(shí)時(shí)PCR測量膠原RNA表達(dá)。

蛋白質(zhì)印跡

將腎小球系膜細(xì)胞收集在由20mM Tris，137mM NaCl，10％(vol/vol)甘油，1％(vol/vol)Nonidet P-40和2mM乙二胺四乙酸組成并補(bǔ)充有蛋白酶和磷酸酶抑制劑(完全；分別來自Roche和Sigma)的裂解緩沖液中。如先前所述(8)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。簡言之，將細(xì)胞裂解物進(jìn)行熱變性并加樣于4-12％NuPage凝膠(Invitrogen)上。電泳后，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。用5％BSA封閉膜并加入一抗孵育，然后應(yīng)用辣根過氧化物酶綴合二抗。使用的抗體是ErbB2、ErbB3和ErbB4(Santa Cruz，Abcam)。

RNA提取和實(shí)時(shí)PCR

從腎臟或腎小球系膜細(xì)胞中分離總RNA。處死小鼠時(shí)將其右腎在液氮中速凍。然后使用Polytron勻漿器(Pt 2100；Kinematica，Littau，Switzerland)勻漿腎臟組織，并用GenElute Mammalian Total RNA Miniprep試劑盒(Sigma Aldrich)制備獲得RNA。通過Absolutely Microprep RNA試劑盒(Agilent)提取腎小球系膜細(xì)胞RNA。使用隨機(jī)六聚體(TaqMan Reverse Transcription Reagents，Applied Biosystems)將總RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用TaqMan實(shí)時(shí)PCR(Life Technologies)在全腎組織中分析IV型膠原(Mm01210125_m1，Col4a1)和成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1(Mm01210125_m1，s100a4)的mRNA表達(dá)。在腎小球系膜細(xì)胞中，通過I型膠原(Mm00801666_g1，Col1a1)的表達(dá)來確定膠原合成情況。

數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。通過應(yīng)用單因素ANOVA加上用于多重比較的Bonferroni校正來分析組間差異。使用ImageJ 1.42軟件對蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行密度計(jì)量分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性定義為P<0.05。使用GraphPad Prism 5和IBM SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行所有統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié)果

將血糖水平超過300mg/dL的動(dòng)物視為有糖尿病。

將糖尿病小鼠隨機(jī)分為不同治療組，分別是(i)胰島素(n＝22，0.005U/kg·天，Linshin Canada)，(ii)rhNRG-1β(n＝19，20μg/kg·天，i.p.，PreProtech)，或(iii)無治療(n＝21)，持續(xù)14周。重組人Heregulin-β1(HRG1-β1)是僅由Heregulin-β1的EGF結(jié)構(gòu)域(為對應(yīng)于SEQ ID NO：1的65個(gè)氨基酸殘基)組成的7.5kDa多肽。

對照非糖尿病ApoE同窩幼仔(n＝24)僅接受檸檬酸鹽緩沖液，并被隨機(jī)分成接受(i)治療或(ii)無治療，持續(xù)14周。每周監(jiān)測動(dòng)物的體重和血糖(用OneTouch葡萄糖計(jì))。如圖1所示，對小鼠施用STZ導(dǎo)致在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中其與其非糖尿病同窩幼仔相比，血糖濃度顯著增加。胰島素治療使高血糖顯著向?qū)φ账綔p少，而NRG-1對對照組和糖尿病動(dòng)物的血糖都沒有影響。

腎功能的尿標(biāo)志物

14周后，在未治療的糖尿病動(dòng)物中有微白蛋白尿(0.0925±0.0187對0.196±0.0323μg/24h，p<0.05)，暗示腎小球基底膜的損傷。胰島素和NRG-1都阻止了微白蛋白尿的發(fā)展(分別為0.196±0.0323對0.0985±0.0191μg/24h，p<0.01和0.196±0.0323對0.109±0.0129μg/24h，p<0.05)(圖2A)。當(dāng)測定尿NGAL濃度時(shí)觀察到類似的趨勢(圖2B)。由于NGAL是腎小管對腎臟損傷發(fā)生響應(yīng)而合成的，所以其是腎臟功能障礙的早期標(biāo)志物。任何組中的肌酸酐清除率都沒有受到妨礙。

腎損傷的組織學(xué)評估和ErbB受體存在情況

糖尿病性腎病的特征在于腎小球的逐漸瘢痕形成，其由在腎病從剛露苗頭到十分明顯的進(jìn)展過程的早期發(fā)生(10)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(ECM)的積累引起(9)。使用Masson三色染色進(jìn)行組織學(xué)染色(其能染色富含膠原的纖維化區(qū)域)顯示在未治療的糖尿病動(dòng)物中存在腎小球硬化(1.10±0.208對3.63±0.504％/μm²，p<0.001)。胰島素治療以及NRG-1治療完全阻止了腎小球瘢痕形成(3.63±0.504對1.64±0.298％/μm²，p<0.001和3.63±0.504對0.936±0.146％/μm²，p<0.001)(圖3A)。ApoE對照小鼠腎臟的免疫組織學(xué)染色顯示腎小球中存在ErbB4受體(圖3B)。腎重量/脛骨長度比在五組中沒有差異(數(shù)據(jù)未顯示)。

下游通路的激活

Erk和Akt通路作用于神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白下游。用NRG-1刺激腎小球系膜細(xì)胞導(dǎo)致Erk和AKT的磷酸化，從而激活各自的途徑，如圖4所示。

纖維化標(biāo)志物的RNA表達(dá)

IV型膠原和FSP-1是腎纖維化的標(biāo)志物。如圖5所示，相比于對照小鼠，在未治療的糖尿病小鼠中FSP-1和IV型膠原的RNA合成在腎臟中的表達(dá)顯著增加(1.00±0.0798對3.34±0.630，p<0.001和1.00±0.085對2.47±0.283，p<0.001)。NRG-1以及胰島素完全阻止了這兩種纖維化標(biāo)志物的上調(diào)(分別為3.34±0.630對1.662±0.167，p<0.01和2.47±0.283對1.54±0.206p<0.01)。

腎臟腎小球系膜細(xì)胞

為了揭示NRG-1保護(hù)腎臟的可能機(jī)制，我們對腎小球系膜細(xì)胞進(jìn)行研究。腎小球系膜細(xì)胞負(fù)責(zé)ECM蛋白質(zhì)的合成(11,12)，并因此在腎小球硬化的發(fā)展中起作用。圖5顯示NRG-1受體ErbB2、ErbB3和ErbB4由這些細(xì)胞表達(dá)(圖6A)。由Ang II刺激腎小球系膜細(xì)胞中合成膠原1a1，這在48小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)受到NRG-1的顯著抑制(1.14±0.0390對0.824±0.181，p<0.001)(圖6B)。

該實(shí)驗(yàn)和上述實(shí)驗(yàn)在此首次顯示，用NRG-1治療可以預(yù)防腎病，特別是糖尿病性腎病。NRG-1不影響葡萄糖水平，這提示其對腎臟有直接效應(yīng)。在體內(nèi)，已經(jīng)顯示NRG-1防止腎小球基底膜損傷(蛋白尿降低)、腎小管損傷(尿液中NGAL水平降低)和腎小球硬化。在體外，本文已經(jīng)顯示NRG-1激活腎小球系膜細(xì)胞中存在的ErbB受體。此外，腎小球膜細(xì)胞中的血管緊張素II誘導(dǎo)的膠原合成被NRG-1減弱，這意味著在腎纖維化進(jìn)程中腎小球系膜細(xì)胞和NRG-1之間相互作用扮演著重要的角色。這些發(fā)現(xiàn)支持NRG-1作為治療劑用于預(yù)防、治療和/或延緩腎病的作用；如糖尿病性腎病，這是終末期腎病的主要原因。

實(shí)施例2：預(yù)防造影劑誘導(dǎo)的腎病

在如下所述的造影劑誘導(dǎo)的腎病小鼠模型中證實(shí)神經(jīng)調(diào)節(jié)素對造影劑誘導(dǎo)腎病的作用。

動(dòng)物

9周齡雄性C57Bl/6小鼠購自Charles River。在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)小鼠，有12小時(shí)的光照-黑暗循環(huán)，小鼠可隨意獲得正常食物和飲用水。所進(jìn)行的所有實(shí)驗(yàn)都由Antwerp大學(xué)的動(dòng)物倫理委員會(huì)(ECD)批準(zhǔn)，符合由美國國立衛(wèi)生研究院出版的“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南”(NIH出版號85-23，修訂于1996年)。

造影劑誘導(dǎo)腎病(CIN)模型

通過腹膜內(nèi)(i.p.)注射造影劑基質(zhì)在小鼠中誘導(dǎo)急性腎病。為了使腎臟對造影劑敏感，首先對小鼠禁水并用吲哚美辛和L-NAME(NG-硝基-L-精氨酸甲酯)進(jìn)行預(yù)處理。實(shí)踐中，在限制水過夜后注射造影劑基質(zhì)之前1小時(shí)，10只動(dòng)物接受了吲哚美辛(10mg/kg，DMSO，i.p.，Sigma-aldrich)和L-NAME(10mg/kg，i.p.，Sigma-aldrich)注射1小時(shí)，其后注射造影劑基質(zhì)(3mg碘/kg，Visipaque)。將這10只小鼠分為2組：未治療CIN組(n＝5)和NRG-1(n＝5，20μg/kg，i.p.)治療CIN組。將用緩沖液治療的10只C57Bl/6小鼠作為對照動(dòng)物。5只對照小鼠未接受治療，5只接受2次NRG-1注射的治療：分別在接觸造影劑基質(zhì)或緩沖溶液之前24小時(shí)和2小時(shí)進(jìn)行。誘導(dǎo)CIN后24小時(shí)，處死小鼠，收集血液和腎臟用于進(jìn)一步分析。

單側(cè)輸尿管阻塞(UUO)

12只C57Bl/6小鼠經(jīng)歷7天的左腎的輸尿管阻塞。簡言之，用氯胺酮和賽拉嗪的混合物(分別為100mg/kg、10mg/kg)麻醉小鼠。在左腹部切口并分離輸尿管。在2點(diǎn)之間結(jié)扎輸尿管并在中間切斷，以確保阻塞能長期保持。6只小鼠未治療，而6只小鼠在UUO步驟前24小時(shí)開始每日用NRG-1(20μg/kg，i.p.)治療。結(jié)扎后6天，將動(dòng)物置于代謝籠中24小時(shí)以收集尿液，并在UUO后7天處死。收集其血液和雙側(cè)腎臟。分析阻塞的腎臟的炎癥和纖維化情況，而每只動(dòng)物的對側(cè)腎臟則充當(dāng)對照。為測量腎臟功能標(biāo)志物，加入未治療(n＝5)或用NRG-1(n＝5)治療的2組動(dòng)物作為對照動(dòng)物，其經(jīng)歷假手術(shù)操作而無左腎輸尿管阻塞。

腎臟功能標(biāo)志物

離心血液樣品，分離血漿。測量尿和血肌酸酐，以確定肌酸酐清除率。通過自動(dòng)分析儀(Siemens Vista 1500)進(jìn)行酶反應(yīng)分析肌酸酐。

腎損傷的組織學(xué)評估

稱重CIN模型的左腎以及UUO模型的左腎和右腎，并且在4％緩沖的福爾馬林中部分固定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟將其包埋在石蠟中用于組織染色。用高碘酸席夫堿(PAS)染色腎臟切片(5μm)以評價(jià)總體腎形態(tài)，用Sirius Red測定腎小球硬化的程度，使用3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物試劑盒分析嗜中性粒細(xì)胞浸潤，用Mac-3(M3/84，Santa Cruz)對炎性細(xì)胞進(jìn)行染色。

RNA提取和實(shí)時(shí)PCR

在處死時(shí)，將來自CIN-小鼠的右腎和來自UUO動(dòng)物的左右腎的半個(gè)快速冷凍在液氮中。然后使用Polytron勻漿器(Pt 2100；Kinematica，Littau，Switzerland)將腎組織勻漿，并通過GenElute Mammalian Total RNA Miniprep試劑盒(Sigma Aldrich)制備獲得RNA。使用隨機(jī)六聚體(TaqMan Reverse Transcription Reagents，Applied Biosystems)將總RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用TaqMan實(shí)時(shí)PCR(Life Technologies)分析整個(gè)腎臟組織中前膠原1a1(Col Ia1，Mm00801666_g1)、前膠原3a1(Col IIIa1，Mm01254476_m1)、纖連蛋白-1(Mm01256744_m1)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1，Mm01178820_m1)、細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1，Mm00516023_m1)和血管細(xì)胞粘附蛋白分子-1(VCAM-1，Mm01320970_m1)相對β-肌動(dòng)蛋白(Mm00607939_s1，Life Technologies)的mRNA表達(dá)。

數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。通過應(yīng)用單因素ANOVA加上用于多重比較的Bonferroni校正來分析組間差異。使用ImageJ 1.42軟件對蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行密度計(jì)量分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性定義為P<0.05。使用GraphPad Prism 5和IBM SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行所有統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié)果

造影劑誘導(dǎo)的腎病

在4組中腎臟重量沒有差異(數(shù)據(jù)未顯示)。用造影劑注射后24小時(shí)的血漿肌酸酐測量顯示未治療CIN組中有顯著增加。血漿中肌酸酐的積累提示腎臟的腎小球?yàn)V過率降低。用NRG-1治療這些動(dòng)物阻止血漿肌酸酐積累，從而保護(hù)腎臟避免發(fā)生造影劑誘導(dǎo)的腎衰竭，如圖8所示。

這些實(shí)驗(yàn)表明NRG-1防范急性造影劑誘導(dǎo)的腎衰竭，因此可以應(yīng)用于預(yù)防所述衰竭。

在先前的實(shí)驗(yàn)中，由于動(dòng)物在注射造影劑后停止產(chǎn)生尿液，因此不能確定造影劑處理的動(dòng)物的肌酸酐清除率。然而，這些實(shí)驗(yàn)中的對照組(在24小時(shí)內(nèi)大量飲水)確實(shí)產(chǎn)生了尿液，因此使得我們能計(jì)算這些小鼠的肌酸酐清除率。有趣的是，如圖9所示，NRG-1在這些條件下增加肌酸酐清除率。

這是非常重要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因?yàn)槠浔砻髟诩せ畹哪I血管緊張素系統(tǒng)(這里由水剝奪引起)的條件下，NRG-1增加腎小球?yàn)V過率。這在臨床上非常重要，因?yàn)檫@表明NRG-1可用作增加腎小球?yàn)V過率(GFR)的藥物。這可能在嚴(yán)重急性腎損傷的病癥中或在慢性腎衰竭以延遲血液透析的病癥中是有用的。到目前為止，還沒有藥物可用于增加GFR。

輸尿管結(jié)扎誘導(dǎo)的腎纖維化

阻塞的腎臟重量顯著高于對側(cè)對照腎臟，這一點(diǎn)不依賴于NRG-1治療(圖10)。

圖11顯示血漿肌酸酐在UUO中增加，表明腎小球腎功能降低。NRG-1顯著阻止這種增加。

在mRNA水平上對炎癥標(biāo)記物的分析顯示與對側(cè)腎臟相比，腎結(jié)扎的腎臟中TGF-β、ICAM-1和VCAM-1如何顯著上調(diào)。此外，纖維化標(biāo)志物，包括前膠原1a1、3a1和纖連蛋白mRNA在UUO腎臟中顯著更高。用NRG-1治療對對照腎臟沒有影響，但在阻塞的腎臟中顯著減少TGF-β、ICAM-1和前膠原3a1(圖12)。

這表明NRG-1能防范“急性”輸尿管結(jié)扎誘導(dǎo)的腎臟炎癥和纖維化。

參考文獻(xiàn)

(1)U.S.Renal Data System,USRDS 2012.Annual data report:atlas of chronic kidney disease and end-stage renal disease in the United States.National Institutes of Health,National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases,Bethesda,MD.Accessed 06 January 2013

(2)PH Groop et al.,The Presence and Severity of Chronic Kidney Disease Predicts All-Cause Mortality in Type 1Diabetes,Diabetes,58(7):1651-1658(2009)

(3)M Afkarian et al.,Kidney Disease and Increased Mortality Risk in Type 2 Diabetes,JASN,24(2):302-308(2013)

(4)TJ Orchard,AM Secrest,RG Miller,T Costacou,In the absence of renal disease,20 year mortality risk in type 1 diabetes is comparable to that of the general population:a report from the Pittsburgh Epidemiology of Diabetes Complications Study,Diabetologia,53(11):2312–2319(2010)

(5)IH de Boer et al.,Temporal trends in the prevalence of diabetic kidney disease in the United States,JAMA,305:2532–2539(2011)

(6)ET Rosolowsky et al.,Risk for ESRD in type 1 diabetes remains high despite renoprotection,J Am SocNephrol,22:545–553(2011)

(7)GP Rangan,GH Tesch,Methods in Renal Research,Quantification of Renal Pathology by Image Analysis,Nephrology,12:553-558(2007)

(8)Lemmens K,Doggen K,De Keulenaer GW.,Activation of the neuregulin/erbb system during physiological ventricular remodeling in pregnancy.American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology,300:H931-H942(2011)

(9)Y Qian,E Feldman,S Pennathur,M Kretzler,FC Brosius,From Fibrosis to Sclerosis,Mechanisms of Glomerulosclerosis in Diabetic Nephropathy,Diabetes,57:1439-1445(2008)

(10)MS Simonson,Phenotypic transitions and fibrosis in diabetic nephropathy,Kidney International,71:846-854(2007)

(11)MA Haralson,Collagen polymorphism in cultured rat kidney mesangial cells,Lab Invest 57:513–523(1987)

(12)N Ardaillou,G Bellon,M-P Nivez,S Rakotoarison,R Ardaillou,Quantification of collagen synthesis by cultured human glomerular cells,BiochemBiophys Res Comm,991:445–452(1989)

(13)Khan AM,Maderdrut JL,Li M,Toliver HL,Coy DH,Simon EE,Batuman V.Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide preventscontrast-induced nephropathy in a novel mouse model.Physiol Rep.2013 Nov；1(6):e00163.doi:10.1002/phy2.163.Epub 2013 Nov 19.

(14)Kodama A,Watanabe H,Tanaka R,Tanaka H,Chuang VT,Miyamoto Y,Wu Q,Endo M,Hamasaki K,Ishima Y,Fukagawa M,Otagiri M,Maruyama T.A human serum albumin-thioredoxin fusion protein prevents experimental contrast-induced nephropathy.Kidney Int.2013 Mar；83(3):446-54.doi:10.1038/ki.2012.429.Epub 2013 Jan