α-1抗胰蛋白酶缺陷是一種遺傳性常染色體共顯性基因病癥，其導(dǎo)致α1-抗胰蛋白酶(A1AT)產(chǎn)生不足，從而引起肺病及肝病且發(fā)病頻率為每1,500至3,500位個體中約有1例。α-1抗胰蛋白酶缺陷最通常會影響全世界具有歐洲血統(tǒng)的人。α-1抗胰蛋白酶(α1-抗胰蛋白酶、α-1蛋白酶抑制劑、A1AT或AAT)是屬于絲氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpin)超家族的蛋白酶抑制劑。正常的AAT蛋白主要在肝中由肝細(xì)胞合成且分泌至血液中。其生理學(xué)功能為抑制嗜中性粒細(xì)胞蛋白酶(neutrophilprotease)以保護(hù)宿主組織以免在炎性階段受到非特異性損傷。A1AT缺陷(AATD)在臨床上最重要的形式由Z突變引起。Z突變型等位基因(PiZ)經(jīng)由單一點(diǎn)突變使得突變型PiZ蛋白傾向于在肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中異常折疊，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)滯留。循環(huán)性蛋白酶活性喪失使得肺易受嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶所致的損傷，從而導(dǎo)致肺氣腫發(fā)展。每周使用純化人AAT來對AATD進(jìn)行AAT增強(qiáng)治療得到正常的AAT血漿水平，且預(yù)防受影響個體的肺損傷。盡管給予純化AAT能緩解由內(nèi)源分泌AAT喪失所引起的肺損傷，但AATD患者仍易患由過量異常折疊AAT蛋白的蓄積所引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)肝貯積病。12％至15％的AATD患者還發(fā)生肝病，其可能嚴(yán)重或致命、甚至于在嬰兒期發(fā)生。在AATD患者中，AAT蛋白在肝細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)累積會誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷及死亡，以及慢性肝損傷。臨床表現(xiàn)包括慢性肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)氨酶升高(transaminitis)、膽汁郁積、纖維化及甚至暴發(fā)性肝衰竭。目前不存在用于防止由AATD所致的肝病發(fā)作或減緩其進(jìn)展的特定治療。因?yàn)橛葾ATD造成的肝損傷經(jīng)由功能獲得機(jī)制發(fā)生，所以抑制或AAT基因表達(dá)將適用于防止AAT蛋白在肝中累積，藉此提供對AATD的治療性治療。已經(jīng)顯示雙鏈RNA分子(dsRNA)及其他RNAi觸發(fā)物會以高度保守的調(diào)控機(jī)制阻斷基因表達(dá)，其稱為RNA干擾(RNAi)。本發(fā)明提供用于抑制AAT基因體內(nèi)表達(dá)的AATRNA干擾(RNAi)觸發(fā)物及其組合物。本發(fā)明亦提供使用AATRNAi觸發(fā)物以治療AATD及由AATD引起的病狀及疾病(諸如慢性肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞癌及暴發(fā)性肝衰竭)的方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供能夠選擇性地且有效地減少AAT表達(dá)的α-1抗胰蛋白酶(AAT)基因特異性RNA干擾(RNAi)觸發(fā)分子。使用AATRNAi觸發(fā)物提供一種用于治療性治療與α-1抗胰蛋白酶缺陷相關(guān)的疾病的方法。此類方法包括向人類或動物給予靶向AAT的RNAi觸發(fā)物。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于抑制人類AAT基因表達(dá)的RNAi觸發(fā)分子。該RNAi觸發(fā)物包含至少兩個相互部分、實(shí)質(zhì)上或完全互補(bǔ)的序列。在一個實(shí)施方式中，兩個RNAi觸發(fā)物序列含有包含第一序列的正義鏈及包含第二序列的反義鏈。在另一實(shí)施方式中，兩個RNAi觸發(fā)物序列包含兩條共同包含第一序列的正義鏈，及包含第二序列的反義鏈，其中正義鏈與反義鏈一起形成部分雙鏈體(meroduplex)(表2及表4)。AATRNAi觸發(fā)物正義鏈包含與AATmRNA至少一部分具有至少90％相同性的序列。表1至表5中展示示例性AATRNAi觸發(fā)物正義鏈、反義鏈、序列對及部分雙鏈體。在一個實(shí)施方式中，反義鏈包含與由該AAT基因編碼的mRNA的一部分互補(bǔ)的核苷酸序列，且互補(bǔ)區(qū)域的長度最佳小于30個核苷酸。此外，較佳的是，本文所述的本發(fā)明RNAi觸發(fā)物的長度(雙鏈體長度)在約16至30個核苷酸的范圍內(nèi)，尤其在約18至28個核苷酸的范圍內(nèi)。尤其適用于本發(fā)明上下文的是約17、18、19、20、21、22、23或24個核苷酸的雙鏈體長度。正義鏈與反義鏈可具有相同長度或其可具有不同長度。例如，正義鏈與反義鏈的長度均可為19、20、21、22、23或24個核苷酸。舉例而言，正義鏈的長度可為21個核苷酸，而反義鏈的長度為23個核苷酸。19、21、22或23個核苷酸的雙鏈體段為最佳。RNAi觸發(fā)物在遞送至表達(dá)AAT基因的細(xì)胞時會抑制該AAT基因的體外或體內(nèi)表達(dá)。根據(jù)需要局部還是全身治療以及待治療的區(qū)域，可用許多方式給予本文所述的RNAi觸發(fā)分子或藥物組合物。給予可為局部的(例如藉由經(jīng)皮貼片)、經(jīng)肺，例如藉由吸入或吹入粉末或氣溶膠，包括藉由噴霧器：氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)表皮及經(jīng)皮、經(jīng)口或非經(jīng)腸。非經(jīng)腸給藥包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)注射或輸注；皮下，例如經(jīng)由植入式裝置；或顱內(nèi)，例如腦實(shí)質(zhì)內(nèi)、鞘內(nèi)或腦室內(nèi)給藥?？墒褂帽绢I(lǐng)域中所知的任何已知寡核苷酸遞送技術(shù)將本文所述的RNAi觸發(fā)分子遞送至目標(biāo)細(xì)胞或組織。核酸遞送方法包括(但不限于)封裝于脂質(zhì)體中、藉由離子電滲或藉由摻入其他載劑，諸如水凝膠、環(huán)糊精、可生物降解的納米膠囊，及生物黏性微球粒、蛋白性載體或DPC(WO2000/053722、WO2008/0022309、WO2011/104169及WO2012/083185，其各自以引用的方式并入本文中)。在一個實(shí)施方式中，AATRNAi觸發(fā)物與體內(nèi)遞送化合物一起提供。較佳的體內(nèi)遞送化合物包括MLP遞送聚合物。在另一較佳實(shí)施方式中，本發(fā)明的特征在于將AATRNAi觸發(fā)物體內(nèi)遞送至肝細(xì)胞的組合物，其包含：本文所述的AATRNAi觸發(fā)物，其偶聯(lián)于含有至少20個碳原子的疏水基團(tuán)諸如膽固醇(RNA觸發(fā)物-偶聯(lián)物)。附圖說明圖1.表1.靶向AATmRNA的RNAi觸發(fā)物的核心序列。圖2.表2.含有5'及3'延伸的RNAi觸發(fā)序列。大寫字母表示核糖核苷酸，小寫字母“c”“g”“a”及“u”表示2'O-甲基修飾的核苷酸，后接有“f”的大寫字母A、C、G、U表示2'-氟代核苷酸，“s”表示硫代磷酸酯，“dT”表示脫氧胸苷，(invdT)表示反向脫氧胸苷(3'-3'-連接)。圖3.表3.規(guī)范的(canonical)AATsiRNARNAi觸發(fā)物。大寫字母表示RNA核苷酸，小寫字母“c”“g”“a”及“u”表示2'O-甲基修飾的核苷酸，后接有“f”的大寫字母A、C、G、U表示2'-氟代核苷酸，“s”表示硫代磷酸酯，“dT”表示脫氧胸苷，且(invdT)表示反向脫氧胸苷(3'-3'-連接)。Tm為RNAi觸發(fā)物的解鏈溫度。圖4.表4.AAT部分雙鏈體RNAi觸發(fā)物。大寫字母表示RNA核苷酸，小寫字母“c”“g”“a”及“u”表示2'O-甲基修飾的核苷酸，后接有“f”的大寫字母A、C、G、U表示2'-氟代核苷酸，“s”表示硫代磷酸酯，“dT”表示脫氧胸苷，且(invdT)表示反向脫氧胸苷(3'-3'-連接)。Tm為RNAi觸發(fā)物的解鏈溫度。圖5.表5.AATUNARNAi觸發(fā)物。大寫字母表示RNA核苷酸，小寫字母“c”“g”“a”及“u”表示2'O-甲基修飾的核苷酸，后接有“f”的大寫字母A、C、G、U表示2'-氟代核苷酸，后接有“UNA”的大寫字母A、C、G、U表示2',3'-斷(解鎖)RNA核苷酸模擬物，“s”表示硫代磷酸酯，“dT”表示脫氧胸苷，且(invdT)表示反向脫氧胸苷(3'-3'-連接)。Tm為RNAi觸發(fā)物的解鏈溫度。圖6A-E.適用于體內(nèi)遞送本文所述的AATRNAi觸發(fā)物的MLP聚合物的列表。圖7.描繪使用不同濃度的所示RNAi觸發(fā)物在體外Hep3B細(xì)胞中的相對AAT表達(dá)的圖。圖8.描繪用鹽水或SEQID52/63的AATRNAi觸發(fā)物(AD00370)及MLP遞送聚合物(MLP)治療的PiZ小鼠的相對血清AAT水平的圖。圖9.將肝中的Z-AAT累積可視化的PAS-D染色。肝切片來自(A)在研究第1天處死的PiZ小鼠；(B)接受四次每兩周一次的鹽水載劑靜脈內(nèi)劑量的PiZ小鼠；(C)接受四次每兩周一次的8mg/kgLuc-RNAi觸發(fā)物對照物+8mg/kgMLP遞送聚合物的靜脈內(nèi)劑量的PiZ小鼠；(D)接受四次每兩周一次的8mg/kgSEQID52/63與8mg/kgMLP遞送聚合物的靜脈內(nèi)(IV)劑量的PiZ小鼠。圖10.來自PiZ小鼠的肝的可溶性及不溶性部分的Western印跡(Westernblot)分析。五周齡小鼠接受每兩周一次的鹽水、Luc-UNA(8mg/kgSEQID59/78與8mg/kgMLP遞送聚合物)或AAT-UNA(8mg/kgSEQID52/63與8mg/kgMLP遞送聚合物)的靜脈內(nèi)劑量，持續(xù)8周。圖11.來自PiZ小鼠的肝的可溶性及不溶性部分的Western印跡分析。五周齡小鼠接受四次每兩周一次的鹽水、Luc-UNA(8mg/kgSEQID59/78與8mg/kgMLP遞送聚合物)或AAT-UNA(8mg/kgSEQID52/63與8mg/kgMLP遞送聚合物)的靜脈內(nèi)劑量，持續(xù)8周。圖12.展示六月齡雌性PiZ小鼠的小球(globule)尺寸的柱狀圖，這些小鼠已接受單次的鹽水、Luc-UNARNAi觸發(fā)物(8mg/kgSEQID59/78與8mg/kgMLP遞送聚合物)或AAT-UNARNAI觸發(fā)物(8mg/kgSEQID52/63與8mg/kgMLP遞送聚合物)的靜脈內(nèi)劑量。將肝切成切片、在福爾馬林中處理以便組織學(xué)觀測，并用PAS-D染色以便對小球尺寸及由小球覆蓋的肝面積進(jìn)行數(shù)字化定量。圖13.展示在靈長類動物中重復(fù)給予AAT-RNAi觸發(fā)物及MLP遞送聚合物之后的AAT敲除的圖。向兩只猴子各自給予2.0mg/kgMLP遞送聚合物(MLP遞送肽)+4.0AAT-RNAi觸發(fā)物SEQID52/63(AAT-UNA)或3mg/kgMLP遞送聚合物(MLP遞送肽)+6mg/kgRNAi觸發(fā)物SEQID52/63(AAT-UNA)。第一劑在第1天給予。劑量均相隔六周。發(fā)明詳述附表1至5涉及用于形成根據(jù)本發(fā)明的AATRNAi觸發(fā)分子的較佳分子及序列。本文所述的AATRNAi觸發(fā)分子包含一或兩條正義鏈、及反義鏈，其各自含有約18個核堿基的核心序列。反義鏈核心序列與AATmRNA中存在的核苷酸序列(目標(biāo)序列)互補(bǔ)。正義鏈核心序列可與反義核心序列具有相同長度或其可具有不同長度。RNAi觸發(fā)物的正義與反義核心序列退火形成互補(bǔ)性雙鏈體區(qū)域或雙螺旋結(jié)構(gòu)。在互補(bǔ)性雙鏈體區(qū)域內(nèi)，正義鏈核心序列與反義核心序列至少90％互補(bǔ)或100％互補(bǔ)。對于部分雙鏈體(meroduplex)RNAi觸發(fā)物，正義鏈核心序列內(nèi)部帶切口，且提供兩個一起與反義鏈核心序列雜交的正義鏈序列。另外，正義鏈及反義鏈可獨(dú)立地在其核心序列的5'端、其核心序列的3'端或其核心序列的5'端與3'端含有1至6個核堿基的延伸。反義鏈延伸若有的話則可能與AATmRNA的相應(yīng)核苷酸或與正義鏈的任何相應(yīng)核苷酸互補(bǔ)或不互補(bǔ)。類似地，正義鏈延伸若有的話則可能與AATmRNA的相應(yīng)核苷酸或與反義鏈的任何相應(yīng)核苷酸一致或不一致。當(dāng)遞送至細(xì)胞時，本文所述的AATRNAi觸發(fā)物“敲除”或抑制正?；騔突變型等位基因AAT基因的表達(dá)。所描述的AATRNAi觸發(fā)物及方法可用以治療患有將受益于AAT表達(dá)減少或抑制的疾病或病癥的對象。向?qū)ο蠼o予治療有效量的任何一或多種所述AATRNAi觸發(fā)物。對將受益于AAT基因表達(dá)減少及/或抑制的對象的治療包括治療性及/或預(yù)防性治療。對象可為人類、患者或人類患者。所述AATRNAi觸發(fā)分子可用以提供對突變型AAT表達(dá)相關(guān)疾病的治療性治療的方法。這些方法包括向人類或動物給予靶向AAT的RNAi觸發(fā)物。表1中展示AATRNAi觸發(fā)物正義鏈及反義鏈核心序列。表2提供本文所述的具有5'或3'延伸的RNAi觸發(fā)物正義及反義鏈的說明性實(shí)例。本文提供具有經(jīng)修飾的核苷酸的RNAi觸發(fā)物正義及反義鏈，且具體揭示于附表3至5中，提供了本發(fā)明的經(jīng)修飾的RNAi觸發(fā)物正義及反義鏈的說明性實(shí)例。表2至5中所示的經(jīng)修飾的RNAi觸發(fā)物鏈與表1中所示的未經(jīng)修飾的核心序列的關(guān)系由核心SEQID號表示。本發(fā)明的RNAi觸發(fā)物的這些成分的修飾在本文中作為修飾及/或修飾模式的實(shí)例來提供。RNAi觸發(fā)物(RNAitrigger，亦稱為dsRNAi觸發(fā)物)經(jīng)由RNA干擾(RNAi)的生物過程來抑制基因表達(dá)。RNAi觸發(fā)物包含雙鏈RNA或RNA樣結(jié)構(gòu)，其通常含有15-50個堿基對，較佳地18-26個堿基對，且具有與細(xì)胞內(nèi)經(jīng)表現(xiàn)的目標(biāo)基因中的編碼序列至少90％互補(bǔ)的核堿基序列。RNAi觸發(fā)物包括(但不限于)：短干擾性RNA(siRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短發(fā)夾RNA(shRNA)及切丁酶(dicer)底物(美國專利第8,084,599號、第8,349,809號及第8,513,207號)。本文所述的RNAi觸發(fā)物通過使反義鏈與一條正義鏈(對于規(guī)范的siRNARNAi觸發(fā)物及UNARNAi觸發(fā)物)或兩條正義鏈(對于部分雙鏈體RNAi觸發(fā)物)退火來形成。在一個較佳實(shí)施方式中，AATRNAi觸發(fā)物反義鏈包含SEQIDNo:1、2、3、4及5中所描繪的核酸序列。相應(yīng)AATRNAi觸發(fā)物正義鏈包含SEQIDNo:8、9、10、11及12中所描繪的核酸序列。因此，本發(fā)明的AATRNAi觸發(fā)分子尤其可包含選自由以下SEQID對組成的群的序列對：1/8、2/9、3/10、4/11及5/12。表1至5中提供互補(bǔ)對或部分雙鏈體(meroplex)(RNAi觸發(fā)物)，如由SEQID對或SEQID部分雙鏈體所示。如下文詳述，本文所述的RNAi觸發(fā)分子正義鏈及反義鏈各自包含核心序列及可選的，5'延伸、3'延伸，或5'延伸與3'延伸。如本文所用，在正義鏈核心序列或反義鏈核心序列的5'端或3'端的延伸包含1至5個核苷酸。正義鏈上的延伸核苷酸可能與或可能不與相應(yīng)反義鏈中的核苷酸(核心序列核苷酸或延伸核苷酸)互補(bǔ)(堿基配對)。相反地，反義鏈上的延伸核苷酸可能與或可能不與相應(yīng)正義鏈中的核苷酸(核心序列核苷酸或延伸核苷酸)互補(bǔ)(堿基配對)。在一個實(shí)施方式中，本文所述的AATRNAi觸發(fā)分子包含具有1至5個核苷酸長、較佳地1至2個核苷酸長的3'延伸的反義鏈。在一個實(shí)施方式中，反義鏈延伸核苷酸中的一或多者包含尿嘧啶或胸苷核苷酸或與相應(yīng)AATmRNA序列互補(bǔ)的核苷酸。在另一實(shí)施方式中，反義鏈延伸由dTdT或dTsdT組成，其中dT表示脫氧胸苷核苷酸，sdT表示具有5'硫代磷酸酯的脫氧胸苷核苷酸。在另一較佳實(shí)施方式中，本文所述的AATRNAi觸發(fā)分子包含具有1至5個核苷酸長、較佳地1至2個核苷酸長的3'延伸的正義鏈。在一個實(shí)施方式中，反義鏈延伸核苷酸中的一或多者包含腺苷、尿嘧啶或胸苷核苷酸、AT二核苷酸，或?qū)?yīng)于AATmRNA序列中核苷酸的核苷酸。在一個較佳實(shí)施方式中，3'正義鏈延伸由Af(invdT)組成，其中Af表示2'-氟代腺苷核苷酸，invdT表示反向(3'-3'-連接)脫氧胸苷核苷酸。在一個實(shí)施方式中，本文所述的AATRNAi觸發(fā)分子包含具有1至5個核苷酸長、較佳地1至2個核苷酸長的5'延伸的反義鏈。在一個實(shí)施方式中，反義鏈延伸核苷酸中的一或多者包含尿嘧啶或胸苷核苷酸或與相應(yīng)AATmRNA序列互補(bǔ)的核苷酸。在一個較佳實(shí)施方式中，反義鏈延伸由dT組成。在另一較佳實(shí)施方式中，本文所述的AATRNAi觸發(fā)分子包含具有1至5個核苷酸長、較佳地1至3個核苷酸長的5'延伸的正義鏈。在一個實(shí)施方式中，正義鏈延伸核苷酸中的一或多者包含尿嘧啶或腺苷核苷酸或?qū)?yīng)于AATmRNA序列中核苷酸的核苷酸。在一個較佳實(shí)施方式中，正義鏈延伸由5'UAU或5'uAu組成，其中u表示2'O-甲基-修飾的尿苷核苷酸。本文所述的RNAi觸發(fā)分子可在各正義鏈及反義鏈上獨(dú)立地含有3'及/或5'延伸。在一個實(shí)施方式中，正義鏈與反義鏈均含有3'及5'延伸，各自如上所述。在一個實(shí)施方式中，一條鏈的一個或多個3'延伸核苷酸與另一條鏈的一或多個5'延伸核苷酸堿基配對。在另一實(shí)施方式中，一條鏈的一個或多個3'延伸核苷酸與另一條鏈的一個或多個5'延伸核苷酸并不堿基配對。RNAi觸發(fā)物的正義及反義鏈可能含有或可能不含有相同數(shù)目的核苷酸堿基。反義及正義鏈可形成雙鏈體，其中5'端僅具有鈍端，3'端僅具有鈍端、5'與3'端均為鈍端，或5'與3'端均不為鈍端。在另一實(shí)施方式中，延伸中的核苷酸中的一或多者含有硫代磷酸酯、磷硫酰、反向脫氧核苷酸(3'至3'連接)核苷酸或經(jīng)核糖核苷酸或脫氧核苷酸修飾。在一些實(shí)施方式中，本文所述的RNAi觸發(fā)物的正義及反義鏈含有不同數(shù)目的核苷酸堿基。在一些實(shí)施方式中，本文所述的RNAi觸發(fā)物的正義鏈5'端與反義鏈3'端形成鈍端。在一些實(shí)施方式中，本文所述的RNAi觸發(fā)物的正義鏈3'端與反義鏈5'端形成鈍端。在一些實(shí)施方式中，本文所述的RNAi觸發(fā)物的兩端均形成鈍端。在一些實(shí)施方式中，本文所述的RNAi觸發(fā)物的兩端均非鈍端。如本文所用，鈍端系指雙鏈觸發(fā)分子的末端，其中兩條經(jīng)退火的鏈的末端核苷酸互補(bǔ)(形成互補(bǔ)堿基對)。在一些實(shí)施方式中，本文所述的RNAi觸發(fā)物的正義鏈5'端與反義鏈3'端形成翻口端(frayedend)。在一些實(shí)施方式中，本文所述的RNAi觸發(fā)物的正義鏈3'端與反義鏈5'端形成翻口端。在一些實(shí)施方式中，本文所述的RNAi觸發(fā)物的兩端形成翻口端。在一些實(shí)施方式中，本文所述的RNAi觸發(fā)物的兩端均非翻口端。如本文所用，翻口端系指雙鏈觸發(fā)分子的末端，其中兩條經(jīng)退火的鏈的末端核苷酸不互補(bǔ)(即形成非互補(bǔ)堿基對)。如本文所用，突出部分為在雙鏈RNAi觸發(fā)分子一條鏈的末段的一個或多個不成對核苷酸的段。不成對核苷酸可在正義鏈或反義鏈上，從而產(chǎn)生3'或5'突出部分。在一些實(shí)施方式中，RNAi觸發(fā)分子含有：鈍端及翻口端、鈍端及5'突出端、鈍端及3'突出端、翻口端及5'突出端、翻口端及3'突出端、兩個5'突出端、兩個3'突出端，或5'突出端及3'突出端。在一個較佳實(shí)施方式中，本發(fā)明的AATRNAi觸發(fā)分子包含選自由以下組成的群的序列對：SEQIDNO:15/23、15/24、16/28、17/30、18/31、19/36及19/38。在另一較佳實(shí)施方式中，本發(fā)明的AAT部分(雙鏈體)RNAi觸發(fā)分子包含選自如下的部分雙鏈體：SEQIDNO:15/25/41、15/26/42、15/27/43、16/29/44、18/32/45、18/33/46、18/34/47、18/35/48及19/37/49。RNAi觸發(fā)物(亦稱為dsRNAi觸發(fā)物)經(jīng)由RNA干擾(RNAi)的生物過程來抑制基因表達(dá)。RNAi觸發(fā)物包含雙鏈RNA或RNA樣結(jié)構(gòu)，其通常含有15-50個堿基對及較佳地18-25個堿基對，且具有與細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的目標(biāo)基因中的編碼序列一致(完全互補(bǔ))或幾乎一致(基本上互補(bǔ))的核堿基序列。RNAi觸發(fā)物包括(但不限于)：短干擾性RNA(siRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短發(fā)夾RNA(shRNA)、部分雙鏈體、含解鎖核酸的dsRNA及切丁酶底物(美國專利第8,084,599號、第8,349,809號及第8,513,207號)。本文所述的AATRNAi觸發(fā)分子可包含天然存在的核苷酸或可包含至少一種經(jīng)修飾的核苷酸或核苷酸模擬物。本文所述的RNAi觸發(fā)物正義及反義鏈可通過本領(lǐng)域中成熟的方法來合成及/或修飾。核苷酸堿基(或核堿基)為雜環(huán)嘧啶或嘌呤化合物，其為所有核酸的成分且包括腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)。核苷為某些嘧啶或嘌呤堿基的核糖基或脫氧核糖基衍生物。其因缺乏磷酸化而成為與核苷酸相關(guān)的糖基胺或N-糖苷。其亦常規(guī)地包括核苷類似物中，其中糖基基團(tuán)連接于碳而非氮(‘C-核苷’)。核苷酸是通過用磷酸酯化核苷的3'或5'羥基在形式上獲得的化合物。其為核酸單體。如本文所用，“G”、“C”、“A”、“U”及“T”或“dT”各自一般而言表示分別含有鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、尿嘧啶及脫氧胸苷作為堿基的核堿基、核苷、核苷酸或核苷酸模擬物。并且，如本文所用，術(shù)語“核糖核苷酸”或“核苷酸”亦可指經(jīng)修飾的核苷酸或核苷酸模擬物，如下文進(jìn)一步詳述，或替代性置換部分。包含此類置換部分的序列為本文所述的實(shí)施方式。對于本文所述的RNAi觸發(fā)分子，核苷或核苷酸堿基可由含磷酸酯(天然)或不含磷酸酯(非天然)的共價核苷間鍵連接，即RNAi觸發(fā)分子可具有天然或非天然的寡核苷酸主鏈。在另一實(shí)施方式中，RNAi觸發(fā)物在兩個核苷酸堿基間含有非標(biāo)準(zhǔn)(非磷酸酯)鍵。在一個較佳實(shí)施方式中，RNAi觸發(fā)分子的一或多個核苷酸為經(jīng)修飾的核苷酸。在另一實(shí)施方式中，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的核苷酸經(jīng)修飾。經(jīng)修飾的核苷酸包括(但不限于)：2'修飾、2'-O-甲基核苷酸(在本文中以核苷酸序列中的小寫字母‘n’表示)、2'-脫氧-2'-氟代核苷酸(在本文中以Nf表示，在本文中亦以2'氟代核苷酸表示)、2'-脫氧核苷酸(在本文中以dN表示)、2'-氨基核苷酸、2'-烷基核苷酸、末端3'至3'連接、反向脫氧胸苷(在本文中以invdT表示)、包含5'-硫代磷酸酯基的核苷酸(在本文中以在核苷酸的前的小寫字母‘s’表示，如在sN中)、硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯基、包含非天然堿基的核苷酸、鎖核苷酸、橋連核苷酸、肽核酸、2',3'-斷核苷酸模擬物(解鎖核苷酸，在本文中以NUNA表示)、嗎啉基核苷酸及無堿基核苷酸。不必要使既定化合物中的所有位置均得到均勻修飾。相反地，可將一個以上修飾加入單一RNAi觸發(fā)物化合物中或甚至其單一核苷酸中?？蓪⒑颂?'修飾與經(jīng)修飾的核苷連接組合。較佳經(jīng)修飾的核苷間連接或主鏈包括(例如)硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基及其他烷基膦酸酯(包括3'-亞烷基膦酸及手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基氨基磷酸酯及氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰基氨基磷酸酯(thionophosphoramidates)、硫羰基烷基磷酸酯(thionoalkyl-phosphonates)、硫羰基烷基磷酸三酯，及具有正常3'-5'連接的硼代磷酸酯、其2'-5'連接的類似物及具有反極性的那些，其中相鄰核苷單元對為3'-5'連接至5'-3'或2'-5'連接至5'-2'。亦包括多種鹽、混合鹽及無酸形式。較佳的不包括磷原子的經(jīng)修飾的核苷間連接或主鏈(即寡核苷)具有通過短鏈烷基或環(huán)烷基糖間連接、混合雜原子及烷基或環(huán)烷基糖間連接或一或多個短鏈雜原子或雜環(huán)糖間連接形成的主鏈。其包括具有嗎啉基連接的那些(部分地由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主鏈；硫化物、亞砜及砜主鏈；甲醛乙酰基(formacetyl)及硫代甲醛乙?；麈?；含亞甲基甲醛乙?；傲虼兹┮阴；闹麈?；含有烯烴的主鏈；氨基磺酸酯主鏈；亞甲基亞氨基及亞甲基肼基主鏈；磺酸酯及磺酰胺主鏈；酰胺主鏈；及具有混合N、O、S及CH2組成部分的其他物質(zhì)。在另一實(shí)施方式中，本文所述的AATRNAi觸發(fā)分子為具有經(jīng)修飾的核苷酸的規(guī)范siRNA。表3中展示適于形成具有經(jīng)修飾的核苷酸的AAT規(guī)范siRNARNAi觸發(fā)物的示例性序列。示例性AAT規(guī)范siRNARNAi觸發(fā)物為以下SEQID對：50/62、50/63、53/67、54/69、55/70、56/75及56/77。在另一實(shí)施方式中，本文所述的AATRNAi觸發(fā)分子為具有經(jīng)修飾的核苷酸的部分雙鏈體。表4中展示適于形成具有經(jīng)修飾的核苷酸的AAT部分雙鏈體RNAi觸發(fā)物的示例性序列。示例性AAT部分雙鏈體RNAi觸發(fā)物為以下SEQID部分雙鏈體：50/64/81、50/65/82、50/66/83、53/68/84、55/71/85、55/72/86、55/73/87、55/74/88及56/76/89。AATRNAi觸發(fā)物反義鏈較佳地含有至少一個“解鎖核苷酸”(UNA)、AATUNARNAi觸發(fā)物。UNA為無環(huán)RNA模擬物，亦稱2',3'-斷-RNA，其中不存在C2'-C3'核糖鍵。由于不存在核糖2',3'鍵，UNA為可撓的，從而可調(diào)節(jié)親和力及特異性。UNA顯示對互補(bǔ)鏈的結(jié)合親和力減小，導(dǎo)致雙鏈體的熱穩(wěn)定性降低。UNA可位于沿著RNAi觸發(fā)物的堿基鏈的任一處。本文所述的RNAi觸發(fā)物較佳含有位于位置6或7(編號包括5'dT核苷酸延伸)的UNA。表5中展示適于形成AATUNARNAi觸發(fā)物的示例性序列。示例性AATUNARNAi觸發(fā)物為以下SEQID對：51/63、52/63、57/77及58/77。經(jīng)修飾的核堿基包括其他合成及天然的核堿基，諸如5-取代嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6及O-6取代的嘌呤(包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶)、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤及鳥嘌呤的6-甲基及其他烷基衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤的2-丙基及其他烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶及2-硫代胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶及胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶及胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-鹵代、8-氨基、8-巰基、8-硫代烷基、8-羥基及其他8-取代腺嘌呤及鳥嘌呤、5-鹵代，尤其5-溴代、5-三氟甲基及其他5-取代脲嘧啶類及胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤、7-去氮鳥嘌呤及7-去氮腺嘌呤及3-去氮鳥嘌呤及3-去氮腺嘌呤。在一個實(shí)施方式中，本文所述的AATRNAi觸發(fā)物包含偶聯(lián)于RNAi觸發(fā)物的靶向部分。我們已發(fā)現(xiàn)RNAi觸發(fā)物偶聯(lián)于靶向部分(其中靶向部分包含疏水基)或半乳糖簇有助于RNAi觸發(fā)物體內(nèi)靶向肝臟。RNAi觸發(fā)物-靶向部分偶聯(lián)物通過將RNAi觸發(fā)物共價連接于靶向部分來形成。可將靶向部分連接于RNAi觸發(fā)物正義鏈或反義鏈的3'或5'端。較佳將靶向部分連接于RNAi觸發(fā)物正義鏈5'端。在一個實(shí)施方式中，靶向部分由疏水基組成。更特定言的，RNAi觸發(fā)物靶向部分由具有至少20個碳原子的疏水基組成。用作靶向部分的疏水基在本文中稱為疏水性靶向部分。疏水性靶向部分較佳為僅含有碳及氫原子的烴。然而，可允許維持疏水性的取代或雜原子，例如氟。適于用作靶向部分的疏水基可選自由以下組成的群：烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基及芳炔基，其各自可為直鏈、支鏈或環(huán)狀，膽固醇、膽固醇衍生物、固醇、類固醇及類固醇衍生物。示例性的適合的疏水基可選自包含以下的群：膽固醇、膽固醇衍生物、二膽固醇、生育酚、二生育酚、二癸基、二(十二烷基)、二(十八烷基)、二(十二烷基)、二(十八烷基)、類異戊二烯及膽酰胺。在另一實(shí)施方式中，靶向部分包含半乳糖靶向部分或半乳糖簇靶向部分。如本文中使用，半乳糖簇包含具有二至四種通常三種末端半乳糖衍生物的分子。如本文所用，術(shù)語半乳糖衍生物包括半乳糖以及與對脫唾液酸糖蛋白受體的親和力等于或大于半乳糖的衍生物。適用于將寡核苷酸及其他分子體內(nèi)靶向肝臟的半乳糖或半乳糖簇為本領(lǐng)域所熟知。本領(lǐng)域常見的其他術(shù)語包括三天線半乳糖、三化合價半乳糖及半乳糖三聚體。較佳的半乳糖衍生物為N-乙?；?半乳糖胺(GalNAc)。其他對脫唾液酸糖蛋白受體具有親和力的糖類可選自包含以下的清單：半乳糖、半乳糖胺、N-甲?；肴樘前贰-乙酰半乳糖胺、N-丙?；?半乳糖胺、N-正丁?；肴樘前芳癗-異丁?；肴樘前?。在一個實(shí)施方式中，靶向部分偶聯(lián)于AATRNAi觸發(fā)物正義鏈的5'端。在另一較佳實(shí)施方式中，靶向部分偶聯(lián)于具有UAU延伸的AATRNAi觸發(fā)物正義鏈的5'端。較佳靶向部分為膽固醇基衍生物。較佳UAU延伸為uAu延伸。在又一實(shí)施方式中，膽固醇基衍生物經(jīng)由接頭連接于AATRNAi觸發(fā)物正義鏈的5'端。示例性接頭包括烷基及PEG基。較佳PEG接頭為三甘醇連接。具有膽固醇基靶向部分的示例性AATRNAi觸發(fā)物包括：以下SEQID對或部分雙鏈體：50/63、56/77、50/64/81、50/65/82、50/66/83、53/68/84、55/71/85、55/72/86、55/73/87、55/74/88、56/76/89、51/63、52/63、57/77及58/77。本文所述的RNAi觸發(fā)分子可合成為在5'端具有反應(yīng)性基團(tuán)，諸如胺基。反應(yīng)性基團(tuán)隨后可用于使用本領(lǐng)域中典型的方法來連接靶向部分。如本文所用，術(shù)語“序列”指由使用標(biāo)準(zhǔn)核苷酸命名法提及的序列描述的核苷酸鏈。然而，如本文詳述，該“構(gòu)成序列的鏈”亦可包含修飾，如經(jīng)修飾的核苷酸及核苷酸模擬物。如本文所用，且除非另有規(guī)定，否則術(shù)語“互補(bǔ)/互補(bǔ)性”當(dāng)用于相對于第二核苷酸序列(例如RNAi觸發(fā)物反義鏈)來描述第一核苷酸序列(例如RNAi觸發(fā)物正義鏈或AATmRNA)時，是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一定條件下與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸雜交并形成雙鏈體或雙螺旋結(jié)構(gòu)的能力?；パa(bǔ)序列包括沃森-克里克堿基對或非沃森-克里克堿基對，且包括天然或經(jīng)修飾的核苷酸或核苷酸模擬物，只要滿足上述關(guān)于其雜交能力的要求。完美或完全互補(bǔ)是指第一多核苷酸的連續(xù)序列中所有堿基均將與第二多核苷酸的連續(xù)序列中相同數(shù)目的堿基雜交。連續(xù)序列可包含第一或第二核苷酸序列的全部或一部分。部分互補(bǔ)是指在核堿基序列雜交對中存在一或多個不匹配堿基對。如本文所用的基本互補(bǔ)，當(dāng)涉及本文所述的RNAi觸發(fā)物時，是指在核堿基序列在雜交對中存在1至3個不匹配堿基對。關(guān)于在RNAi觸發(fā)物的正義鏈與反義鏈之間或在RNAi觸發(fā)物的反義鏈與AATmRNA的序列之間的堿基匹配，在本文中可使用術(shù)語“互補(bǔ)”、“完全互補(bǔ)”及“基本上互補(bǔ)”。我們描述用于抑制細(xì)胞、細(xì)胞群、組織或?qū)ο笾械腁AT表達(dá)的組合物及方法，該方法包括：向?qū)ο蠼o予治療有效量的本文所述的AATRNAi觸發(fā)物，由此抑制對象中的AAT表達(dá)。沉默、減少、抑制、下調(diào)或敲除基因表達(dá)(只要其指AAT基因)是指當(dāng)用本文所述的AATRNAi觸發(fā)物處理AAT基因轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞、細(xì)胞群、組織或?qū)ο髸r，與未如此治療的第二細(xì)胞、細(xì)胞群、組織或?qū)ο笙啾?，該?xì)胞、細(xì)胞群、組織或?qū)ο笾蠥TT基因的表達(dá)減少，所述減少可通過從細(xì)胞、細(xì)胞群、組織或?qū)ο笾蠥TT基因轉(zhuǎn)錄的RNA水平或自mRNA翻譯的多肽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞單位的水平測得。此外，本發(fā)明涉及一種抑制細(xì)胞、組織或生物體中的AAT基因表達(dá)的方法，其包括以下步驟：將如本文定義的RNAi觸發(fā)物引入該細(xì)胞、組織或生物體中；及將該細(xì)胞、組織或生物體維持足以達(dá)成AAT的mRNA轉(zhuǎn)錄物降解的時間，由此抑制給定細(xì)胞中的AAT表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，我們描述藥物組合物，其包含至少一種所述的AATRNAi觸發(fā)物。這些藥物組合物尤其適用于抑制細(xì)胞、組織或生物體中的AAT基因表達(dá)。所述的藥物組合物可用以治療患有將受益于AAT表達(dá)減少或抑制的疾病或病癥的對象。所述的藥物組合物可用以治療處于產(chǎn)生將受益于AAT表達(dá)減少或抑制的疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)中的對象。將受益于AAT表達(dá)減少或抑制的疾病及/或病癥可選自包含以下的清單：AATD、慢性肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞癌和暴發(fā)性肝衰竭。較佳地，對象為哺乳動物，最佳為人類患者。在一個實(shí)施方式中，該方法包括向待治療哺乳動物給予包含本文所述的AATRNAi觸發(fā)分子的組合物。上述藥物組合物亦可包含一或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑(包括載劑、運(yùn)載體、稀釋劑及/或遞送聚合物)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供治療、預(yù)防或管理與AATD相關(guān)(包括AATD)的臨床表現(xiàn)的方法。所述方法包括向需要此治療、預(yù)防或管理的對象給予治療或預(yù)防有效量的一或多種本文所述的AATRNAi觸發(fā)物。較佳地，該對象為哺乳動物，最佳為人類患者。在一個實(shí)施方式中，該方法包括向待治療哺乳動物給予包含本文所述的AATRNAi觸發(fā)分子的組合物。術(shù)語“治療(treat)”、“治療(treatment)”及其類似術(shù)語在本發(fā)明的上下文中是指減輕或緩解與AATD相關(guān)的病癥。所述的AATRNAi觸發(fā)物及方法可用以治療或預(yù)防患有將受益于AAT表達(dá)減少或抑制的疾病或病癥的對象的至少一種癥狀。向該對象給予治療有效量的任何一或多種所述RNAi觸發(fā)物，藉此治療該癥狀。向該對象給予預(yù)防有效量的任何一或多種所述RNAi觸發(fā)物，藉此預(yù)防該至少一種癥狀。在一些實(shí)施方式中，相對于未接受該AATRNAi觸發(fā)物的對象，經(jīng)給予所述AATRNAi觸發(fā)物的對象的AAT的基因表達(dá)水平及/或mRNA水平減少至少約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％。對象的基因表達(dá)水平及/或mRNA水平可在對象的細(xì)胞、細(xì)胞群及/或組織中減小。在一些實(shí)施方式中，相對于未接受AATRNAi觸發(fā)物的對象，經(jīng)給予所述AATRNAi觸發(fā)物的對象的AAT蛋白水平減少至少約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％。對象的蛋白水平可在對象的細(xì)胞、細(xì)胞群、組織、血液及/或其他體液中減少?；虮磉_(dá)、mRNA或蛋白水平的減少可通過任何在本領(lǐng)域中已知的方法來評估。AATmRNA水平及/或蛋白水平的減小或降低在本文中總稱為AAT減少或降低或AAT表達(dá)抑制或減少。當(dāng)提及RNAi觸發(fā)物時，“引入細(xì)胞中”是指將RNAi觸發(fā)物功能性遞送至細(xì)胞中。功能性遞送是指將RNAi觸發(fā)物遞送至細(xì)胞且具有預(yù)期生物活性，即對基因表達(dá)的序列特異性抑制。給予至哺乳動物血管系統(tǒng)的許多分子(包括RNAi觸發(fā)分子)通常會由肝自身體清除。RNAi觸發(fā)物由肝臟清除，但RNAi觸發(fā)物降解或以其他方式處理以從身體移除且其中RNAi觸發(fā)物不導(dǎo)致基因表達(dá)的序列特異性抑制，這不被視為功能性遞送。給藥途徑為使RNAi觸發(fā)物接觸身體的路徑。一般而言，給予藥物及核酸以治療哺乳動物的方法為本領(lǐng)域中所熟知，且可應(yīng)用于本文所述的組合物的給予。本發(fā)明的化合物可經(jīng)由任何適合途徑、以針對具體途徑適當(dāng)定制的制劑來給予。因此，本發(fā)明的化合物可藉由注射給予，例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)給予。因此，本發(fā)明亦提供包含藥學(xué)上可接受的載劑或賦形劑的藥物組合物?？墒褂帽绢I(lǐng)域中已知的寡核苷酸遞送技術(shù)將本文所述的AATRNAi觸發(fā)分子或組合物遞送至細(xì)胞、細(xì)胞群、組織或?qū)ο?。一般而言，在本領(lǐng)域中已知的任何適用于遞送核酸分子(體外或體內(nèi))的方法均可適用于本發(fā)明的RNAi觸發(fā)物。舉例而言，遞送可藉由局部給予(例如直接注射、植入或局部給予)、全身性給予，或皮下、靜脈內(nèi)、經(jīng)口、腹膜內(nèi)，或非經(jīng)腸途徑，包括顱內(nèi)(例如腦室內(nèi)、腦實(shí)質(zhì)內(nèi)及鞘內(nèi))、肌肉內(nèi)、經(jīng)皮、氣道(氣霧劑)、經(jīng)鼻、經(jīng)直腸或局部(包括經(jīng)頰及舌下)給予來實(shí)現(xiàn)。在某些實(shí)施方式中，藉由皮下或靜脈內(nèi)輸注或注射來給予組合物。RNAi觸發(fā)物可與脂質(zhì)、納米粒子、聚合物、脂質(zhì)體、微胞、DPC或本領(lǐng)域中可用的其他遞送系統(tǒng)組合。RNAi觸發(fā)物亦可化學(xué)偶聯(lián)于靶向部分、脂質(zhì)(包括(但不限于)膽固醇及膽固醇基衍生物)、納米粒子、聚合物、脂質(zhì)體、微胞、DPC(WO2000/053722、WO2008/0022309、WO2011/104169及WO2012/083185，其各自以引用的方式并入本文中)，或本領(lǐng)域中可用的其他遞送系統(tǒng)。如本文所用，“藥物組合物”包含藥理學(xué)有效量的至少一種RNAi觸發(fā)物及藥學(xué)上可接受的載劑及可選的賦形劑。一或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。藥學(xué)上可接受的賦形劑(賦形劑)為除活性醫(yī)藥成分(API，治療產(chǎn)品，例如AATRNAi觸發(fā)物)以外的已適當(dāng)評價安全性且有意地包括在藥物遞送系統(tǒng)中的物質(zhì)。在預(yù)期劑量下賦形劑不會發(fā)揮或不會意欲發(fā)揮治療作用。賦形劑可用于a)幫助在制造期間加工藥物遞送系統(tǒng)，b)保護(hù)、支持或增強(qiáng)API的穩(wěn)定性、生物利用度或患者可接受性，c)有助于產(chǎn)品鑒別，及/或d)在儲存或使用期間增強(qiáng)API的總體安全性、效用、遞送的任何其他屬性。賦形劑包括(但不限于)：吸收促進(jìn)劑、防黏劑、消泡劑、抗氧化劑、黏合劑、黏合劑、緩沖劑、載劑、包衣劑、著色劑、遞送增強(qiáng)劑、聚葡萄糖、右旋糖、稀釋劑、崩解劑、乳化劑、增量劑、填料、香料、助流劑、保濕劑、潤滑劑、油類、聚合物、防腐劑、鹽水、鹽、溶劑、糖、懸浮劑、緩釋基質(zhì)、甜味劑、增稠劑、張力劑、運(yùn)載體、憎水劑及潤濕劑。藥學(xué)上可接受的賦形劑可為或可不為惰性物質(zhì)。藥物組合物可含有其他在藥物組合物中常見的其他附加組分。藥學(xué)上活性物質(zhì)可包括(但不限于)：抗瘙癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或消炎劑(例如抗組織胺、苯海拉明(diphenhydramine)等)。亦設(shè)想表達(dá)或包含本文定義的RNAi觸發(fā)物的細(xì)胞、組織或離體器官可用作“藥物組合物”。如本文所用，“藥理學(xué)有效量”、“治療有效量”或簡單地“有效量”是指產(chǎn)生所需藥理、治療或預(yù)防結(jié)果的RNAi觸發(fā)物的量。在一個實(shí)施方式中，將AATRNAi觸發(fā)物-靶向部分偶聯(lián)物與MLP遞送聚合物(賦形劑)共給予。共給予是指將AATRNAi觸發(fā)物及遞送聚合物給予哺乳動物以使其同時存在于哺乳動物中。AATRNAi觸發(fā)物-靶向部分偶聯(lián)物與遞送聚合物可同時給予或其可依次遞送。對于同時給予，其可在給予之前混合。對于依次給予，可首先給予AATRNAi觸發(fā)物-靶向部分偶聯(lián)物或遞送聚合物。在一個較佳實(shí)施方式中，本發(fā)明的特征在于將AATRNAi觸發(fā)物遞送至體內(nèi)肝細(xì)胞的藥物組合物，其包含：a)AATRNAi觸發(fā)物與含有至少20個碳原子的疏水基諸如膽固醇的偶聯(lián)物(RNA觸發(fā)物-偶聯(lián)物)，及b)MLP遞送聚合物。MLP遞送聚合物及RNA觸發(fā)物-偶聯(lián)物分別合成，且可在獨(dú)立容器或單一容器中提供。在一個較佳實(shí)施方式中，AATRNAi觸發(fā)物不偶聯(lián)于遞送聚合物。MLP遞送聚合物如本文所用的蜂毒素樣肽MLP為小型兩親性膜活性肽，其包含約23至約32個來源于天然存在的蜂毒肽即蜂毒素的氨基酸，如WO2012/083185中所述。天然存在的蜂毒素含有26個氨基酸，且在氨基末端主要具有疏水性且在羧基末端主要具有親水性(陽離子性)。本文所述的MLP可自生物來源分離得到或其可為合成的。合成聚合物是通過化學(xué)方法“人工”調(diào)配或制造且并非通過天然存在的生物過程產(chǎn)生。如本文所用，MLP涵蓋可見于例如以下物種的毒液中的蜂毒素家族的天然存在的蜂毒肽：小蜜蜂(Apisflorea)、意大利蜂(Apismellifera)、中華蜜蜂(Apiscerana)、排蜂(Apisdorsata)、額斑黃胡蜂(Vespulamaculifrons)、大胡蜂(Vespamagnifica)、黃腳虎頭蜂(Vespavelutina)、長腳蜂屬物種(Polistessp.)HQL-2001及亞非馬蜂(Polisteshebraeus)。如本文所用，MLP亦涵蓋具有與天然存在的蜂毒素肽一致或類似的氨基酸序列的合成肽。示例性MLP氨基酸序列包括圖6中所示的那些。除保留蜂毒素固有的高膜活性的氨基酸以外，亦可將1至8個氨基酸添加至肽的氨基或羧基末端。特定言的，可將半胱氨酸殘基加至氨基或羧基末端。圖1中的清單并非窮舉，可容易地設(shè)想其他保守性氨基酸取代。合成MLP可含有天然存在的L型氨基酸或?qū)τ钞悩?gòu)的D型氨基酸(反構(gòu)型，inverso)。然而，MLP應(yīng)含有基本上所有L型或所有D型氨基酸，但可具有附于氨基或羧基末端的相反立體中心的氨基酸。MLP氨基酸序列亦可逆轉(zhuǎn)(reversed)(逆向，retro)。逆向MLP可具有L型氨基酸或D型氨基酸(逆式反構(gòu)型，retroinverso)。除遮蔽劑以外MLP可具有修飾基團(tuán)，其增強(qiáng)組織靶向或有助于體內(nèi)循環(huán)，連接于肽的氨基末端或羧基末端。然而，如本文所用，MLP不包括含有兩種以上相互共價連接彼此或與另一聚合物或支架共價連接的MLP肽的鏈或聚合物。在一個實(shí)施方式中，MLP包含小蜜蜂(小的或矮的蜜蜂)蜂毒素、意大利蜂(西方或歐洲或大的蜜蜂)、排蜂(巨大蜜蜂)、中華蜜蜂(東方蜜蜂)或其衍生物。較佳MLP包含以下序列：Xaa1-Xaa2-Xaa3-Ala-Xaa5-Leu-Xaa7-Val-Leu-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Leu-Pro-Xaa15-Leu-Xaa17-Xaa18-Trp-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26，其中：Xaa1為亮氨酸、D-亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、纈氨酸、丙氨酸、二甲基甘氨酸、甘氨酸、組氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸，Xaa2為異亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或纈氨酸，Xaa3為甘氨酸、亮氨酸或纈氨酸，Xaa5為異亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或纈氨酸，Xaa7為賴氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、精氨酸或組氨酸，Xaa10為丙氨酸、蘇氨酸或亮氨酸，Xaa11為蘇氨酸或半胱氨酸，Xaa12為甘氨酸、亮氨酸或色氨酸，Xaa15為蘇氨酸或丙氨酸，Xaa17為異亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或纈氨酸，Xaa18為絲氨酸或半胱氨酸，Xaa20為異亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或纈氨酸，Xaa21為賴氨酸或丙氨酸，Xaa22為天冬酰胺或精氨酸，Xaa23為賴氨酸或丙氨酸，Xaa24為精氨酸或賴氨酸，Xaa25為賴氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺，Xaa26為可選的且若有的話則為谷氨酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺-NH2或半胱氨酸-NH2；且且Xaa21、Xaa23及Xaa25中的至少兩者為賴氨酸。在另一實(shí)施方式中，MLP包含以下序列：Xaa1-Xaa2-Xaa3-Ala-Xaa5-Leu-Xaa7-Val-Leu-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Leu-Pro-Xaa15-Leu-Xaa17-Ser-Trp-Xaa20-Lys-Xaa22-Lys-Arg-Lys-Xaa26，其中：Xaa1為亮氨酸、D-亮氨酸、正亮氨酸或酪氨酸，Xaa2為異亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或纈氨酸，Xaa3為甘氨酸、亮氨酸或纈氨酸，Xaa5為異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或正亮氨酸，Xaa7為賴氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、精氨酸或組氨酸，Xaa10為丙氨酸、蘇氨酸或亮氨酸，Xaa11為蘇氨酸或半胱氨酸，Xaa12為甘氨酸、亮氨酸或色氨酸，Xaa15為蘇氨酸或丙氨酸，Xaa17為異亮氨酸、亮氨酸或正亮氨酸，Xaa20為異亮氨酸、亮氨酸或正亮氨酸，Xaa22為天冬酰胺或精氨酸，且Xaa26為谷氨酰胺或半胱氨酸。在另一實(shí)施方式中，MLP包含以下序列：Xaa1-Xaa2-Gly-Ala-Xaa5-Leu-Lys-Val-Leu-Ala-Xaa11-Gly-Leu-Pro-Thr-Leu-Xaa17-Ser-Trp-Xaa20-Lys-Xaa22-Lys-Arg-Lys-Xaa26，其中：Xaa1、Xaa2、Xaa5、Xaa17及Xaa20獨(dú)立地為異亮氨酸、亮氨酸或正亮氨酸，Xaa11為蘇氨酸或半胱氨酸，Xaa22為天冬酰胺或精氨酸，且Xaa26為谷氨酰胺或半胱氨酸。在另一實(shí)施方式中，MLP包含：Leu-Ile-Gly-Ala-Ile-Leu-Lys-Val-Leu-Ale-Thr-Gly-Leu-Pro-Thr-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Asn-Lys-Arg-Lys-Gln。本文所述的MLP具有膜活性，因此能夠破壞質(zhì)膜或溶酶體/胞吞膜。如本文所用，膜活性肽為表面活性的兩親性肽，其能夠在生物膜上誘導(dǎo)以下作用中的一或多者：允許非膜可滲透性分子進(jìn)入細(xì)胞或穿過膜的膜改變或破壞、在膜中形成孔、膜分裂、或膜破壞或溶解。如本文所用，膜或細(xì)胞膜包含脂質(zhì)雙層。膜改變或破壞在功能上可由肽在至少一種以下分析中的活性來定義：紅血球溶解(溶血)、脂質(zhì)體滲漏、脂質(zhì)體融合、細(xì)胞融合、細(xì)胞溶解及胞內(nèi)釋放。將優(yōu)先地引起質(zhì)膜上的胞內(nèi)體或溶酶體破壞的肽視為具有胞內(nèi)溶解性。膜活性肽對細(xì)胞膜的影響可為短暫的。膜活性肽對膜具有親和力且會導(dǎo)致雙層結(jié)構(gòu)發(fā)生變性或變形。RNAi觸發(fā)物遞送至細(xì)胞由以下介導(dǎo)：MLP破壞或去穩(wěn)定化質(zhì)膜或內(nèi)囊膜(諸如胞內(nèi)體或溶酶體)，包括在膜中形成孔，或破壞胞內(nèi)體或溶酶體囊泡，藉此允許囊泡的內(nèi)容物釋放至細(xì)胞質(zhì)中。MLP的膜活性經(jīng)可逆地遮蔽以得到MLP遞送聚合物。經(jīng)由遮蔽劑可逆地連接MLP的伯胺來實(shí)現(xiàn)遮蔽。遮蔽劑的必要的特征在于，呈聚集形式時，其會抑制MLP的膜活性且提供體內(nèi)肝細(xì)胞靶向。如本文所用，若經(jīng)修飾的MLP(MLP遞送聚合物)不顯示膜活性且顯示細(xì)胞特異性(即肝細(xì)胞)體內(nèi)靶向，則MLP經(jīng)遮蔽。若將遮蔽劑連接于肽的鍵斷裂引起MLP上的胺恢復(fù)，藉此恢復(fù)膜活性，則MLP經(jīng)可逆地遮蔽。遮蔽劑的必要特征在于，遮蔽劑經(jīng)由生理學(xué)上不穩(wěn)定的可逆鍵共價結(jié)合于MLP。藉由使用生理學(xué)上不穩(wěn)定的可逆連接或鍵，遮蔽劑可自MLP體內(nèi)裂解，藉此使MLP失去遮蔽且使失去遮蔽的MLP恢復(fù)活性。將足夠數(shù)目的遮蔽劑連接于MLP以實(shí)現(xiàn)所需的不活化程度。藉由連接遮蔽劑來修飾MLP的所需水平使用適當(dāng)?shù)碾幕钚苑治鰜砣菀椎販y定。舉例而言，若MLP在既定分析中具有膜活性，則將足夠水平的遮蔽劑連接于MLP以在該分析中實(shí)現(xiàn)所需水平的膜活性抑制。較佳修飾MLP肽群體上≥80％或≥90％的伯胺基團(tuán)，通過在無任何遮蔽劑存在下肽上伯胺的量來測定。亦為遮蔽劑的較佳特征的是，遮蔽劑連接于肽減少聚合物的正電荷，因此形成更中性的遞送聚合物。需要遮蔽肽保留水溶性。MLP遞送聚合物包含通過肽上的伯胺與含脫唾液酸糖蛋白受體(ASGPr)配體的遮蔽劑的反應(yīng)可逆修飾的MLP，其中該可逆修飾在生理學(xué)上不穩(wěn)定，如2012/083185中所述。如本文所用，遮蔽劑包含較佳地中性(不帶電)的具有ASGPr配體及胺反應(yīng)性基團(tuán)的化合物，其中胺反應(yīng)性基團(tuán)與肽上的胺的反應(yīng)使得ASGPr配體經(jīng)由可逆的生理學(xué)上不穩(wěn)定的共價鍵連接于肽。若修飾基團(tuán)的裂解恢復(fù)了該胺，則胺經(jīng)可逆地修飾。較佳的含ASGPr配體的遮蔽劑具有中性電荷且包含ASGPr配體，諸如半乳糖胺或半乳糖胺衍生物，其具有雙取代的順丁烯二酸酐胺反應(yīng)性基團(tuán)。膜活性多胺可在過量遮蔽劑存在下偶聯(lián)于遮蔽劑?？稍诮o予遞送聚合物之前，從偶聯(lián)的遞送聚合物移除過量遮蔽劑。半乳糖及半乳糖衍生物已經(jīng)由其與肝細(xì)胞表面上表達(dá)的脫唾液酸糖蛋白受體(ASGPr)的結(jié)合而用于將分子體內(nèi)靶向肝細(xì)胞。如本文所用，ASGPr配體(或ASGPr配體)包含半乳糖及對ASGPr的親和力等于或大于半乳糖的半乳糖衍生物。半乳糖靶向部分對ASGPr的結(jié)合有助于遞送聚合物對肝細(xì)胞的細(xì)胞特異性靶向及遞送聚合物向肝細(xì)胞中的胞吞。ASGPr配體可選自包含以下的群：乳糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、半乳糖胺、N-甲?；肴樘前?、N-乙酰基-半乳糖胺、N-丙?；肴樘前贰-正丁?；肴樘前芳癗-異丁?；?半乳糖胺(Iobst,S.T.及Drickamer,K.J.B.C.1996,271,6686)。ASGPr配體可為單體的(例如具有單個半乳糖胺)或多聚的(例如具有多個半乳糖胺)。較佳遮蔽劑包含中性親水性雙取代的烷基順丁烯二酸酐：其中R1包含不帶電的脫唾液酸糖蛋白受體配體。較佳烷基為甲基或乙基。經(jīng)取代的烷基順丁烯二酸酐的實(shí)例由2-丙酸-3-烷基順丁烯二酸酐衍生物組成。中性親水性2-丙酸-3-烷基順丁烯二酸酐衍生物如下形成：通過中性親水基經(jīng)由2-丙酸-3-烷基順丁烯二酸酐γ-羧基連接于2-丙酸-3-烷基順丁烯二酸酐來形成。其中R1包含中性ASGPr配體且n＝0或1。在一個實(shí)施方式中，ASGPr配體經(jīng)由短PEG接頭連接于酐。ASGPr配體經(jīng)由對ASGPr的親和力來提供靶向功能。較佳ASGPr配體含有對ASGPr具有親和力的糖類，包括(但不限于)：半乳糖、N-乙?；?半乳糖胺及半乳糖衍生物。本領(lǐng)域中熟知對ASGPr具有親和力的半乳糖衍生物。本發(fā)明包括組成如下的偶聯(lián)物遞送系統(tǒng)：N-T及MLP-(L-M)x，其中N為AATRNAi觸發(fā)物，T包含具有20或20個以上碳原子的疏水基，MLP為如本文所述的蜂毒素樣肽，且M含有經(jīng)由生理學(xué)上不穩(wěn)定的可逆馬來酰胺鍵L與MLP共價連接的如本文所述的ASGPr配體。L裂解恢復(fù)MLP上未經(jīng)修飾的胺。x為大于1的整數(shù)。更特定言的，x值大于MLP群體上伯胺數(shù)目的80％及最多達(dá)100％。如本文所用，MLP-(L-M)x為MLP遞送聚合物。足夠百分比的MLP伯胺經(jīng)修飾以抑制肽的膜活性且提供肝細(xì)胞靶向。較佳地，x值大于MLP群體上伯胺數(shù)目的80％且更佳大于90％，所述伯胺數(shù)目通過在無任何遮蔽劑存在下MLP群體上的胺量來測定。應(yīng)注意，單個MLP通常含有3至5個伯胺(氨基端(若未經(jīng)修飾)且通常含有2至4個賴氨酸殘基)。呈未經(jīng)修飾的狀態(tài)時，MLP具有膜活性。然而，MLP遞送聚合物MLP-(L-M)x不具有膜活性。藉由連接M對MLP伯胺的可逆修飾可逆地抑制MLP膜活性或使MLP膜活性失活。在可逆鍵L裂解時，未經(jīng)修飾的胺恢復(fù)，藉此使MLP還原至其未經(jīng)修飾的膜活性狀態(tài)。MLP-(L-M)x(即一種ASGPr靶向可逆地遮蔽的膜活性聚合物)及T-N(即一種RNAi觸發(fā)物-偶聯(lián)物)為分別合成或制造。T與N均不直接或間接地共價連接于MLP、L或M。對于RNAi-觸發(fā)物的體內(nèi)肝遞送，不需要RNAi觸發(fā)物或RNAi-觸發(fā)物-偶聯(lián)物與遮蔽或失去遮蔽的聚合物的靜電性或疏水性締合。遮蔽聚合物及RNAi-觸發(fā)物偶聯(lián)物可在同一容器中或在獨(dú)立容器中提供。其可在給予的前便經(jīng)組合、共給予或依次給予。在一個方面中，我們描述了用于抑制AAT基因表達(dá)的藥物組合物，其包含本文所述的AATRNAi觸發(fā)物。在一個實(shí)施方式中，RNAi觸發(fā)物在未經(jīng)緩沖的溶液中給予。在一個實(shí)施方式中，未經(jīng)緩沖的溶液為鹽水或水。在一個實(shí)施方式中，RNAi觸發(fā)物與緩沖溶液一起給予。在一個實(shí)施方式中，緩沖溶液包含乙酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶谷蛋白、碳酸鹽或磷酸鹽或其任何組合。在另一實(shí)施方式中，緩沖溶液為磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。根據(jù)本文所述的方法及用途給予所述AATRNAi觸發(fā)物可使患有將受益于AAT表達(dá)抑制或減少的病癥(諸如AATD)的對象的此類疾病或病癥的嚴(yán)重度、病征、癥狀及/或標(biāo)記物減少?？衫缃逵闪繙y疾病進(jìn)展、疾病緩解、癥狀嚴(yán)重度、疼痛減輕、生活質(zhì)量、維持治療效果所需的藥物劑量、疾病標(biāo)記物水平或適于對正在進(jìn)行治療或針對性預(yù)防的既定疾病的任何其他合適可量測參數(shù)來評估疾病的治療或預(yù)防功效。如本文使用的“治療有效量”包括當(dāng)給予患有AATD的對象時，AATRNAi觸發(fā)物或共同治療足以有效治療疾病(例如通過減小、改善或維持現(xiàn)有疾病或一或多種病征來達(dá)成)的量?！爸委熡行Я俊笨梢旳ATRNAi觸發(fā)物、共同治療、如何給予該觸發(fā)物、疾病及其嚴(yán)重度及病史、年齡、體重、家族史、基因組成、先前或伴隨治療(若有的話)的類型及待治療對象的其他個體特征而變化。如本文使用的“預(yù)防有效量”包括當(dāng)給予患有AATD但尚末(或目前)經(jīng)歷或呈現(xiàn)疾病癥狀的對象及/或處于產(chǎn)生AATD的風(fēng)險(xiǎn)中的對象時，AATRNAi觸發(fā)劑或共同治療足以預(yù)防或改善疾病或疾病的一或多種癥狀的量。改善疾病包括減緩疾病過程或減小以后產(chǎn)生的疾病的嚴(yán)重度。在一個實(shí)施方式中，劑量可為：0.0005、0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.125、0.15、0.175、0.2、0.225、0.25、0.275、0.3、0.325、0.35、0.375、0.4、0.425、0.45、0.475、0.5、0.525、0.55、0.575、0.6、0.625、0.65、0.675、0.7、0.725、0.75、0.775、0.8、0.825、0.85、0.875、0.9、0.925、0.95、0.975、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、31、32、33、34、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50mg/kg。介于所述值之間的值亦為本發(fā)明的部分。在另一實(shí)施方式中，劑量可為：0.1至50、0.25至50、0.5至50、0.75至50、1至50、1.5至50、2至50、2.5至50、3至50、3.5至50、4至50、4.5至50、5至50、7.5至50、10至50、15至50、20至50、20至50、25至50、25至50、30至50、35至50、40至50或45至50mg/kg。在另一實(shí)施方式中，劑量可為：0.1至45、0.25至45、0.5至45、0.75至45、1至45、1.5至45、2至45、2.5至45、3至45、3.5至45、4至45、4.5至45、5至45、7.5至45、10至45、15至45、20至45、20至45、25至45、25至45、30至45、35至45或40至45mg/kg。在另一實(shí)施方式中，劑量可為：0.1至40、0.25至40、0.5至40、0.75至40、1至40、1.5至40、2至40、2.5至40、3至40、3.5至40、4至40、4.5至40、5至40、7.5至40、10至40、15至40、20至40、20至40、25至40、25至40、30至40或35至40mg/kg。在另一實(shí)施方式中，劑量可為：0.1至30、0.25至30、0.5至30、0.75至30、1至30、1.5至30、2至30、2.5至30、3至30、3.5至30、4至30、4.5至30、5至30、7.5至30、10至30、15至30、20至30、20至30、25至30mg/kg。在另一實(shí)施方式中，劑量可為：0.1至20、0.25至20、0.5至20、0.75至20、1至20、1.5至20、2至20、2.5至20、3至20、3.5至20、4至20、4.5至20、5至20、7.5至20、10至20或15至20mg/kg。在另一實(shí)施方式中，劑量可為：0.01至10、0.05至10、0.1至10、0.2至10、0.3至10、0.4至10、0.5至10、1至10、1.5至10、2至10、2.5至10、3至10、3.5至10、4至10、4.5至10、5至10、5.5至10、6至10、6.5至10、7至10、7.5至10、8至10、8.5至10、9至10或9.5至10mg/kg。在另一實(shí)施方式中，劑量可為：0.01至5、0.05至5、0.1至5、0.2至5、0.3至5、0.4至5、0.5至5、1至5、1.5至5、2至5、2.5至5、3至5、3.5至5、4至5或4.5至5mg/kg。在另一實(shí)施方式中，劑量可為：0.01至2.5、0.05至2.5、0.1至2.5、0.2至2.5、0.3至2.5、0.4至2.5、0.5至5、1至2.5、1.5至2.5或2至2.5mg/kg。在一個實(shí)施方式中，一次性給予AATRNAi觸發(fā)物。在另一實(shí)施方式中，重復(fù)給予AATRNAi觸發(fā)物(即重復(fù)劑量方案或多劑量方案)。對于重復(fù)給予，可每天一次、每隔一天、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次、每周兩次、每周一次、每兩周一次、每三周一次、每四周一次、每四(4)周至十四(14)周一次、每月兩次、每月一次、每兩月一次、每三個月以下一次或每四個月或更長時間一次對對象給予AATRNAi觸發(fā)物。介于上述值之間的值亦為本發(fā)明的部分。在另一實(shí)施方式中，必要時可給予AAT觸發(fā)物。在另一實(shí)施方式中，初始治療方案可包括以初始時間間隔重復(fù)給予及以較小頻率進(jìn)行后續(xù)給予。舉例而言，在每周或每兩周一次給予一至六個月之后，其后可每月一次或更少地進(jìn)行給予。初始時間間隔可為設(shè)定的給藥次數(shù)、設(shè)定的時間跨度，或直至量測到確定的AAT降低為止。對于任何給藥方案，無論單次或重復(fù)，可使用任一上述量。對于重復(fù)給藥，相同劑量或不同劑量可用于各次給藥。本發(fā)明亦提供包含至少一種本文所述的RNAi觸發(fā)物的細(xì)胞。細(xì)胞較佳為哺乳動物細(xì)胞，諸如人類細(xì)胞。此外，包含本文定義的RNAi觸發(fā)分子的組織及/或非人類生物體為本發(fā)明的實(shí)施方式，藉此該非人類生物體尤其適用于研究目的或適用作研究工具，例如在藥物測試中。上文提供的本發(fā)明的實(shí)施方式及條目現(xiàn)說明于以下非限制性實(shí)施例中。實(shí)施例實(shí)施例1.RNAi觸發(fā)物序列的鑒別。用于鑒別前導(dǎo)UNA以靶向AAT的選擇方法以計(jì)算機(jī)模擬(insilico)方法開始，以在AAT基因變體中鑒別保守序列。起初針對在11種已知的人類AAT變體中具有精確互補(bǔ)序列的17-核苷酸序列中篩選AATcDNA序列。淘汰已知具有制造挑戰(zhàn)的序列，諸如具有五(5)個或五個以上連串的鳥嘌呤或胞嘧啶者，及基于已知siRNA參數(shù)預(yù)測為具有較差RNAi活性的那些。亦淘汰包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)且其中在19聚體序列的2至18位的主要等位基因頻率大于0.2的序列。接著對序列進(jìn)行交叉物種反應(yīng)性分析以選擇將與食蟹猴(cynomolgusmonkey)AAT交叉反應(yīng)的候選物。計(jì)算機(jī)模擬分析得到840種19聚體序列，及939種17聚體序列。接著評價這些序列的特異性以避免針對人類及食蟹猴基因組的脫靶作用。淘汰在含脫靶基因的任一siRNA鏈的2-7位含有保守miRNA種子區(qū)的序列。接著選擇47種候選序列以用于產(chǎn)生RNAi觸發(fā)分子。實(shí)施例2.RNAi觸發(fā)物的合成。A)合成。在用于寡核苷酸合成的固相上根據(jù)亞磷酰胺技術(shù)合成RNAi觸發(fā)分子。根據(jù)規(guī)模，使用MerMade96E(Bioautomation)或MerMade12(Bioautomation)。在由控制孔玻璃(CPG，對于dT為且對于反向dT為獲自PrimeSynthesis公司，阿斯頓(Aston)，PA，USA)制成的固體支持物上進(jìn)行合成。所有2'-修飾的RNA亞磷酰胺以及輔助試劑均購自賽默飛世爾科學(xué)公司(ThermoFisherScientific，密爾沃基(Milwaukee)，WI，USA)。特定而言，使用以下2'-O-甲基亞磷酰胺：(5'-O-二甲氧基三苯甲基-N6-(苯甲?；?-2'-O-甲基-腺苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基氨基)亞磷酰胺、5'-O-二甲氧基-三苯甲基-N4-(乙?；?-2'-O-甲基-胞苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基氨基)亞磷酰胺、(5'-O-二甲氧基三苯甲基-N2-(異丁?；?-2'-O-甲基-鳥苷-3'-O-(2-氰基-乙基-N,N-二異丙基氨基)亞磷酰胺及5'-O-二甲氧基-三苯甲基-2'-O-甲基-尿苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基氨基)亞磷酰胺。2'-脫氧-2'-氟-亞磷酰胺攜帶與2'-O-甲基RNA酰胺(amidite)相同的保護(hù)基。5'-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2',3'-斷-尿苷、2'-苯甲酰基-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷酰胺購自連接技術(shù)有限公司(LinkTechnologiesLTD，蘇格蘭)。將所有酰胺均溶解于無水乙腈(50mM)中且添加分子篩為了在寡聚物的5'端引入TEG-膽固醇，采用來自GRC公司(GlenResearch，斯特靈(Sterling)，VA，USA)的1-二甲氧基三苯甲基氧基-3-O-(N-膽固醇基-3-氨丙基)-三甘醇-甘油基-2-O-(2-氰基乙基)-(N,N,-二異丙基)-亞磷酰胺。在未對合成循環(huán)進(jìn)行任何修飾的情況下引入5'-修飾。將5-苯甲硫基-1H-四唑(BTT，250mM于乙腈中)用作活化物溶液。連接時間為10分鐘(RNA)、180秒(膽固醇)、90秒(2'OMe及UNA)及60秒(2'F及DNA)。為了引入硫代磷酸酯連接，采用100mM3-苯基1,2,4-二噻唑啉-5-酮(POS，獲自PolyOrg公司，萊明斯特(Leominster)，MA，USA)于無水乙腈中的溶液。參見表1-5(圖1-5)。關(guān)于B.支持物結(jié)合寡聚物的切割及脫保護(hù)。在固相合成結(jié)束之后，在室溫下用1:1體積的40重量％甲胺于水中的溶液及28％氫氧化銨溶液(Aldrich)處理經(jīng)干燥的固體支持物2小時。蒸發(fā)溶液且使固體殘留物在水中重構(gòu)(參見下文)。C.純化。藉由使用WatersXBridgeBEH300C45u制備柱及ShimadzuLC-8系統(tǒng)的反相HPLC純化含有寡聚物的粗膽固醇。緩沖劑A為100mMTEAA(pH7.5)且含有5％乙腈，且緩沖劑B為100mMTEAA且含有95％乙腈。采用45％B至55％B的梯度，歷時25分鐘。記錄在260nm下的UV跡線。接著在使用填充有SephadexG-25介質(zhì)的GEHealthcareXK16/40柱的尺寸排阻HPLC上，用100mM碳酸氫銨(pH6.7)及20％乙腈的運(yùn)行緩沖劑，運(yùn)行適當(dāng)部分。藉由使用TKSgelSuperQ-5PW13u柱及ShimadzuLC-8系統(tǒng)的陰離子交換HPLC純化其他粗寡聚物。緩沖劑A為20mMTris、5mMEDTA(pH9.0)且含有20％乙腈，緩沖劑B與緩沖劑A相同并添加有1.5M氯化鈉。采用32.5％B至42.5％B的梯度，歷時25分鐘。記錄在260nm下的UV跡線。匯集適當(dāng)部分，接著在如對含有膽固醇的寡聚物所用的所述尺寸排阻HPLC上運(yùn)行。D.退火。藉由在0.2×PBS(磷酸鹽緩沖鹽水，1×，康寧公司(Corning，Cellgro)中合并等摩爾的RNA溶液(正義及反義)來混合互補(bǔ)鏈以形成RNAi觸發(fā)物。將此溶液放入70℃熱混合器中，加熱至95℃，保持在95℃5分鐘，且緩慢冷卻至室溫。一些RNAi觸發(fā)物經(jīng)凍干且儲存在-15℃至-25℃下。藉由在UV-Vis光譜計(jì)上在0.2×PBS中量測溶液吸光度來測定雙鏈體濃度。接著將在260nm下的溶液吸光度乘以轉(zhuǎn)換因子及稀釋因子以測定雙鏈體濃度。除非另有說明，否則所有轉(zhuǎn)換因子均為0.037mg/(mL·cm)。對于一些試驗(yàn)，采用0.0502mg/(mL·cm)的轉(zhuǎn)換因子。實(shí)施例3.蜂毒素樣肽(MLP)遞送聚合物。A)蜂毒素樣肽(MLP)的合成。所有MLP均使用本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的肽合成技術(shù)制備。適合的MLP可為所有L-型基酸、所有D型氨基酸(反構(gòu)型)。與L或D型無關(guān)地，MLP序列可逆轉(zhuǎn)(逆向)。B)CDM-NAG(N-乙酰半乳糖胺)的合成。向CDM(300mg，0.16mmol)于50mL二氯甲烷中的溶液中添加乙二酰氯(2g，10重量當(dāng)量)及二甲基甲酰胺(5μl)。使反應(yīng)進(jìn)行過夜，此后藉由旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)來移除過量乙二酰氯及二氯甲烷以得到CDM酰氯(CDMacidchloride)。將酰氯溶解于1mL二氯甲烷中。向此溶液中添加含1.1摩爾當(dāng)量(氨基乙氧基)乙氧基-2-(乙酰氨基)-2-脫氧-β-D-吡喃半乳糖苷(即氨基雙乙氧基-乙基NAG)及吡啶(200μl，1.5當(dāng)量)的10mL二氯甲烷。接著攪拌該溶液1.5小時。接著移除溶劑，并將所得固體溶解于5mL水中，且使用反相HPLC以0.1％TFA水/乙腈梯度進(jìn)行純化。R1包含中性ASGPr配體。較佳地遮蔽劑不帶電。n為1至10的整數(shù)。如上所示，PEG間隔基可位于酐基與ASGPr配體之間。較佳的PEG間隔基含有1-10個亞乙基單元。替代性地，可在酐與N-乙酰半乳糖胺之間使用烷基間隔基。n為0至6的整數(shù)?？稍隰cN-乙酰半乳糖胺之間使用其他間隔基或接頭。然而，親水性、中性(較佳地不帶電的)間隔基或接頭為較佳。C)MLP遞送聚合物(即遮蔽)的形成。使MLP與CDM-NAG遮蔽劑反應(yīng)以得到MLP遞送聚合物。首先將MLP組分在HEPES水溶液(鈉鹽，GMP級，約430mg/mL)中溶解至最終濃度8.5mg/mL。接著將MLP溶液冷卻至4℃，且檢查外觀(無可見微粒的透明至淺黃色溶液)且藉由UV分光光度測定法檢測濃度。在4℃下將CDM-NAG溶解于水中，至約75mg/mL的最終濃度。檢查溶液外觀(無可見微粒的透明至淺黃色溶液)且藉由UV分光光度測定法檢測濃度。將溶液中的MLP與溶液中的CDM-NAG以CDM-NAG與MLP呈5:1(w/w)的比率混合。CDM-NAG溶液的添加速率為每分鐘約0.3L，同時攪拌。在所有CDM-NAG溶液均已添加至MLP溶液中之后，攪拌混合物30分鐘。為了穩(wěn)定化MLP遞送聚合物，藉由添加1M氫氧化鈉水溶液將pH值增大至9.0±0.2。雙取代的順丁烯二酸酐遮蔽劑與肽的反應(yīng)得到具有由以下表示的結(jié)構(gòu)的化合物：其中R為MLP，R1包括ASGPr配體(例如NAG)。使用剩余游離胺的比色三硝基苯磺酸(TNBS)分析以確定MLP被CDM-NAG充分遮蔽，少于總數(shù)10％的MLP胺保持未經(jīng)修飾。藉由針對10mM、pH9.2碳酸鹽緩沖液進(jìn)行滲濾以移除過量CDM-NAG來純化MLP遞送聚合物。滲濾方法交換約10倍體積的碳酸鹽緩沖液/體積遮蔽MLP反應(yīng)溶液且保持在2-8℃下。組分量(標(biāo)稱)MLP-EX1乙酸鹽30g/LCDM-NAGa25g/L碳酸鈉0.3g/L碳酸氫鈉0.6g/L水1000g/La-假設(shè)五(5)個CDM-NAG部分/MLP將MLP遞送聚合物用聚葡萄糖進(jìn)一步調(diào)配至10％w/v且儲存在2℃至8℃下。對于一些試驗(yàn)，在使用之前凍干此溶液。D)注射液。藉由混合RNAi觸發(fā)物與MLP遞送聚合物來形成注射液。將凍干的MLP遞送聚合物溶解于水中，并與RNAi觸發(fā)物混合。接著用生理鹽水稀釋該溶液至正確注射濃度。實(shí)施例4.siRNA的體外篩選。將藉由計(jì)算機(jī)模擬分析(實(shí)施例1)鑒別的候選序列篩選為經(jīng)化學(xué)修飾的體外規(guī)范siRNA篩選。將計(jì)算機(jī)模擬鑒別的潛在AATRNAi觸發(fā)物中的四十六種合成為規(guī)范siRNA，并針對體外功效進(jìn)行篩選。將人類肝細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep3B細(xì)胞以約10,000個細(xì)胞/孔接種于96孔格式中。使用LipofectamineRNAiMax(生命技術(shù)公司(LifeTechnologies)，0.3μL/孔)將46種siRNA中的每一者均以兩種濃度即1nM及10nM進(jìn)行一式三份地轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后二十四小時，裂解細(xì)胞，產(chǎn)生cDNA(TaqManCells-to-CTGeneExpression套組，生命技術(shù)公司(LifeTechnologies))。藉由qRT-PCR與TaqMan化學(xué)基分析(生命技術(shù)公司)對人類AAT(分析ID：Hs01097800_m1)來評估AAT基因敲除，針對內(nèi)源對照物人類親環(huán)素A(PPIA，4326316E)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。在46種體外測試的siRNA中，五種顯示至少80％的AAT敲除。對其進(jìn)行選擇以便進(jìn)一步分析。使用相同的細(xì)胞及轉(zhuǎn)染條件來產(chǎn)生十點(diǎn)的EC50曲線，siRNA濃度在0.001-1nM的范圍內(nèi)。另外，五種最有效的規(guī)范siRNA中的每一者經(jīng)重新設(shè)計(jì)且合成為相應(yīng)部分雙鏈體RNAi觸發(fā)物、UNARNAi觸發(fā)物及鎖核酸(LNA)RNAi觸發(fā)物。藉由體外敲除分析、藉由兩點(diǎn)濃度(在1nM及0.1nM下)分析與十點(diǎn)ED50測定，再次考查所得RNAi觸發(fā)物。選擇其中最有效者用于進(jìn)一步體內(nèi)研究。其中最強(qiáng)效的SEQID50/62靶向AATmRNA中的第1142-1160位，且具有0.01nM的EC50。血清因子VII(F7)活性測定。藉由將血液收集至微量離心管中來制備動物血清樣本。用顯色方法使用BIOPHENVII套組(HyphenBioMed/Aniara公司，梅森(Mason)，OH)按照制造商建議來測定血漿中的F7活性。使用TecanSafire2酶標(biāo)儀在405nm下測定比色顯影的吸光度。實(shí)施例5.小鼠AATD模型中RNAi觸發(fā)物功效的體內(nèi)分析。為了評價候選RNAi觸發(fā)物的體內(nèi)功效，使用轉(zhuǎn)基因PiZ小鼠模型(PiZ小鼠)。PiZ小鼠攜帶人類PiZAAT突變型等位基因及模型人類AATD(Carlson等人，JournalofClinicalInvestigation1989)。如上所指出，針對與人類及食蟹猴AAT而非與大鼠或小鼠AAT的相互作用來計(jì)算機(jī)模擬選擇AATRNAi觸發(fā)物。使用MLP遞送聚合物將膽固醇靶向性RNAi觸發(fā)物遞送至PiZ小鼠。各小鼠接受向尾靜脈的200-250μL溶液的靜脈內(nèi)(IV)注射，該溶液含有8或2mg/kgRNAi觸發(fā)物+8mg/kgMLP遞送聚合物(分別為1:1或0.25:1w/wRNAi觸發(fā)物:遞送聚合物)的劑量。藉由使用hAATELISA(Abcam)分析小鼠血清，監(jiān)測血清中的人類AAT蛋白(hAAT)含量直至hAAT表達(dá)水平返回至基線為止。對于標(biāo)準(zhǔn)化，將在某一時點(diǎn)的各動物的AAT水平除以該動物的治療前表達(dá)水平(在這種情況下為在第1天時)，以測定“針對第1天標(biāo)準(zhǔn)化”的表達(dá)率。接著針對鹽水對照組，通過將個體動物“針對第1天標(biāo)準(zhǔn)化”的比率除以鹽水對照組中所有小鼠的平均“針對第1天標(biāo)準(zhǔn)化”的比率來標(biāo)準(zhǔn)化特定時點(diǎn)的表達(dá)。這使得各時點(diǎn)的表達(dá)相對于對照組中的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化。實(shí)驗(yàn)誤差以標(biāo)準(zhǔn)偏差形式給出。mRNA定量。如下自PiZ小鼠肝分離RNA。在處死時，使用液氮將一至三片肝切片在1.5mL微量離心管中速凍。將各小鼠的一片肝切片轉(zhuǎn)移至15mL錐形管中的2mLTRIReagentRT(MolecularResearchCenter公司,辛辛那提(Cincinnati)，OH)中。按照制造商建議的方案分離總RNA。簡言之，用組織均質(zhì)機(jī)處理TRIReagentRT中的肝切片，持續(xù)約30秒。將1mL勻漿添加至50μL4-溴苯甲醚中，混合，并通過離心分離各相。移除0.25-0.5mL水相，用異丙醇沉淀，并離心。用75％乙醇洗滌所得沉淀且將其懸浮于0.3-0.7mL無核酸酶的水中。使用高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄套組(生物技術(shù)公司，格蘭德艾蘭(GrandIsland)，NY)逆轉(zhuǎn)錄總RNA(約500ng)。接著1:5稀釋cDNA，并使用5'核酸外切酶化學(xué)與用于人類α-1抗胰蛋白酶的市售FAM標(biāo)記的分析物(AssayIDHs01097800_m1,LifeTechnologies)、用于小鼠β-肌動蛋白的VIC標(biāo)記的內(nèi)源對照分析物(生命技術(shù)公司)及VeriQuestMasterMix(昂飛公司(Affymetrix)，圣克拉拉(SantaClara)，CA)進(jìn)行多重RT-qPCR。使用相對定量的比較性CT方法(Livak及Schmittgen，2001)來分析基因表達(dá)資料。表7.PiZ小鼠體內(nèi)過程。實(shí)施例6.篩選AATsiRNARNAi觸發(fā)物及AAT敲除時程。向如上所述的PiZ小鼠給予膽固醇偶聯(lián)的規(guī)范siRNARNAi觸發(fā)物。各小鼠接受2mg/kgRNAi觸發(fā)物與8mg/kgMLP遞送聚合物的單次靜脈內(nèi)(IV)劑量。監(jiān)測血清中的人類AAT蛋白水平直至29天。表8中展示敲除水平及反應(yīng)持續(xù)時間。在給予SEQID50/63及SEQID56/77之后，hAAT血清蛋白水平降低95％以上。表8.在給予2mg/kgsiRNA與8mg/kgMLP遞送聚合物之后PiZ小鼠中的血清hAAT蛋白水平。針對第1天及鹽水對照物標(biāo)準(zhǔn)化AAT水平。實(shí)施例7.篩選AAT部分雙鏈體RNAi觸發(fā)物及AAT敲除時程。向如上所述的PiZ小鼠給予膽固醇偶聯(lián)的部分雙鏈體RNAi觸發(fā)物。各小鼠接受8或2mg/kgRNAi觸發(fā)物與8mg/kgMLP遞送聚合物的單次靜脈內(nèi)(IV)劑量。監(jiān)測血清中的人類AAT蛋白水平直至39天。表10中展示敲除水平及反應(yīng)持續(xù)時間。表9.在給予8mg/kg部分雙鏈體RNAi觸發(fā)物與8mg/kgMLP遞送聚合物之后PiZ小鼠體內(nèi)的血清FVII水平。針對第3天及鹽水對照物標(biāo)準(zhǔn)化FVII水平。治療FVII活性鹽水1.00±0.06SEQID61/80(FVII)0.15±0.20SEQID50/64/811.18±0.17SEQID50/65/821.29±0.26SEQID50/66/831.12±0.47SEQID56/76/891.24±0.20SEQID55/72/861.33±0.09表10.在給予8mg/kg部分雙鏈體RNAi觸發(fā)物與8mg/kgMLP遞送聚合物之后PiZ小鼠中的血清hAAT蛋白水平。針對第1天及鹽水對照物標(biāo)準(zhǔn)化AAT水平。實(shí)施例8.體內(nèi)篩選AATUNARNAi觸發(fā)物及AAT敲除時程。向如上所述的PiZ小鼠給予膽固醇偶聯(lián)的UNARNAi觸發(fā)物。各小鼠接受8或2mg/kgRNAi觸發(fā)物與8mg/kgMLP遞送聚合物的單次靜脈內(nèi)(IV)劑量。監(jiān)測血清中的人類AAT蛋白水平40天。表11.在給予8或2mg/kgUNARNAi觸發(fā)物與8mg/kgMLP遞送聚合物之后PiZ小鼠中的血清hAAT蛋白水平。針對第1天及鹽水對照物標(biāo)準(zhǔn)化AAT水平。a規(guī)范siRNA對照物在給予規(guī)范siRNASEQID50/63及UNASEQID52/63之后hAAT血清蛋白水平降低95％以上。注射后7天(第8天)觀測到最大敲除。用UNASEQID52/63的情況下，敲除持續(xù)21天以上(第22天)保持80％以上的減少。UNARNAi觸發(fā)物的敲除持續(xù)時間長于具有相同序列SEQID50/63的規(guī)范chol-siRNA。實(shí)施例9.肝mRNA分析。向如上所述的PiZ小鼠給予AATRNAi觸發(fā)物。各小鼠接受6mg/kgRNAi觸發(fā)物與6mg/kgMLP遞送聚合物的單次靜脈內(nèi)(IV)劑量。在第3天及第10天測定肝hAATmRNA產(chǎn)生。mRNA水平降低與血清hAAT蛋白水平降低相關(guān)，除了mRNA減少比蛋白質(zhì)減少早幾天以外。在PiZ小鼠中，在SEQID52/63與MLP遞送聚合物的單次劑量之后第3天及第10天測定肝hAATmRNA產(chǎn)生水平。觀測到肝hAATmRNA水平持續(xù)降低，其與觀測到的血清hAAT蛋白水平降低相關(guān)。表12.在給予6mg/kgSEQID52/63RNAi觸發(fā)物或siLucsiRNA對照物與6mg/kgMLP遞送聚合物之后PiZ小鼠中的血清hAAT蛋白水平。針對第1天及鹽水對照物標(biāo)準(zhǔn)化血清hAAT水平。表13.在給予6mg/kgSEQID52/63RNAi觸發(fā)物或siLucsiRNA對照物與6mg/kgMLP遞送聚合物之后PiZ小鼠中的肝hAATmRNA水平。相對于小鼠β-肌動蛋白mRNA水平表述AATmRNA水平。實(shí)施例10.SEQID52/63RNAi觸發(fā)物的體內(nèi)劑量反應(yīng)。向如上所述的PiZ小鼠給予不同量的UNASEQID52/63。各小鼠接受SEQID52/63與4或8mg/kgMLP遞送聚合物的單次靜脈內(nèi)(IV)劑量。監(jiān)測血清中的人類AAT蛋白水平35天。根據(jù)SEQID52/63劑量與MLP遞送聚合物的劑量，hAAT敲除水平在很大程度上具有劑量依賴性(圖8)。表14.針對第1天及鹽水對照組標(biāo)準(zhǔn)化的PiZ小鼠中的血清hAAT水平實(shí)施例11.SEQID52/63RNAi觸發(fā)物的體內(nèi)劑量反應(yīng)。向如上所述的PiZ小鼠給予不同量的UNASEQID52/63。各小鼠接受SEQID52/63與2、4或8mg/kgMLP遞送聚合物的單次靜脈內(nèi)(IV)劑量。監(jiān)測血清中的人類AAT蛋白水平36天。增大的UNA劑量一般會引起所用各含量MLP遞送聚合物賦形劑的敲除的水平及持續(xù)時間增大。表15.在給予不同劑量的SEQID52/63UNARNAi觸發(fā)物與不同劑量的MLP遞送聚合物之后PiZ小鼠中的血清hAAT蛋白水平。針對第1天及鹽水對照物標(biāo)準(zhǔn)化AAT水平。實(shí)施例12.用SEQID52/63RNAi觸發(fā)物治療的PiZ轉(zhuǎn)基因小鼠的肝組織學(xué)。為了進(jìn)一步評價肝中hAAT敲除的功效，評估在給予SEQID52/63RNAi觸發(fā)物與MLP遞送聚合物之后的雄性PiZ小鼠的肝樣本的組織學(xué)變化。如上所述向PiZ小鼠給予UNASEQID52/63。各小鼠接受每兩周一次的8mg/kgSEQID52/63與8mg/kgMLP遞送聚合物的靜脈內(nèi)(IV)劑量的給予，持續(xù)8周。每周對小鼠放血以監(jiān)測血清中的hAAT水平，且在給予SEQID52/63與MLP遞送聚合物后第57天將小鼠處死。收集肝樣本，將其固定于10％中性緩沖的福爾馬林中，并用石蠟包埋。藉由H&E染色評估炎性浸潤。每兩周一次用8mg/kgSEQID52/63與8mg/kgMLP遞送聚合物注射8周的PiZ小鼠具有正常形態(tài)、無可測炎性浸潤性及極罕見的小Z-hAAT小球。每兩周一次用鹽水注射的PiZ小鼠在受損或死亡肝細(xì)胞周圍具有顯著小球累積以及炎性浸潤。Z-hAAT聚集通過對肝切片進(jìn)行淀粉酶抗性過碘酸希夫(PAS-D)染色來可視化。在進(jìn)行PAS染色之前，糖原經(jīng)淀粉酶消化使Z-AAT蛋白累積或“小球”得到陽性染色。接受四次每兩周一次的8mg/kgSEQID52/63與8mg/kgMLP遞送聚合物的靜脈內(nèi)(IV)劑量歷經(jīng)8周過程的PiZ小鼠顯示，與接受鹽水或LucUNARNAi觸發(fā)物59/78對照注射劑(熒光素酶RNAi觸發(fā)物：dTCfgAfaGfUUNAAfcUfcAfgCfgUfaAfgdTsdT，SEQID59；(Chol-TEG)uAuCfuUfaCfgCfuGfaGfuAfcUfuCfgAf(invdT)，SEQID78)的PiZ小鼠相比，細(xì)胞內(nèi)AAT小球減少。從用PAS-D染色的肝樣品數(shù)字化定量小球數(shù)目、小球尺寸及由小球覆蓋的肝的面積。較之注射鹽水的對照物，以AAT-UNA治療的小鼠的小球要少85％、小球要小85％，且由小球覆蓋的肝的面積要小96％(圖10)。實(shí)施例13.分析PiZ小鼠肝組織中的可溶性及不溶性Z-hAAT蛋白。進(jìn)一步分析來自用SEQID52/63RNAi效應(yīng)物治療的PiZ小鼠的均質(zhì)化肝組織，以確定預(yù)期多為單體蛋白質(zhì)的可溶性Z-hAAT，與不溶性Z-hAAT聚合物是否均有效減少。采用改進(jìn)的Western印跡方案，以如前所述的非變性條件分離可溶性與不溶性Z-hAAT部分(Mueller等人，MolecularTherapy2012)。經(jīng)給予四次每兩周一次的8mg/kgSEQID52/63與8mg/kgMLP遞送聚合物的靜脈內(nèi)(IV)劑量持續(xù)8周的PiZ小鼠顯示，與經(jīng)給予四次每兩周一次的鹽水靜脈內(nèi)(IV)劑量的PiZ小鼠相比，可溶性Z-hAAT減少99％且不溶性Z-hAAT減少79％(圖11)。表16.針對經(jīng)注射鹽水的小鼠標(biāo)準(zhǔn)化的PiZ小鼠的肝溶解產(chǎn)物中可溶性及不溶性Z-hAAT蛋白的平均水平實(shí)施例14.在PiZ小鼠中單次注射SEQID52/63RNAi觸發(fā)物所致的反應(yīng)的體內(nèi)持續(xù)時間。如上所述，向6月齡雌性PiZ小鼠給予鹽水、8mg/kgLuc-UNA+8mg/kgMLP遞送聚合物或8mg/kgAATRNAi觸發(fā)物SEQID52/63+8mg/kgMLP遞送聚合物的單次靜脈內(nèi)劑量。監(jiān)測血清中的人類AAT蛋白水平29天。在指定時間，收集血樣且藉由ELISA分析其hAAT。在給予觸發(fā)物的前收集第1天樣本。在mRNA分析中，在第3、8、15、22及29天中的每一天處死3至4只小鼠。對于處死的小鼠，進(jìn)行心臟穿刺(cardicstick)以便AATELISA血清分離(200μl血清)。收集一半左側(cè)肝葉且在液氮中速凍以便分離RNA。將左葉的其余部分包埋入石蠟塊中以便進(jìn)行以蘇木色素染色為復(fù)染的PAS-D染色。經(jīng)給予AATRNAi觸發(fā)物SEQID52/63的小鼠內(nèi)血清hAAT水平在第8天減少95％且至第29天仍保持減少，此時減少79％。在第3、8、15、22或29天，處死經(jīng)給予AATRNAi觸發(fā)物SEQID52/63的小鼠。在第29天，處死使經(jīng)給予鹽水或Luc-RNAi觸發(fā)物(SEQID59/78)的小鼠。藉由RT-qPCR測定肝中hAATmRNA水平。經(jīng)給予UNASEQID52/63的小鼠內(nèi)hAATmRNA在第3天減少97％且至第29天仍保持減少，此時水平降低56％。用PAS-D染色的肝樣品來數(shù)字化定量小球尺寸及由小球覆蓋的肝的面積。以AAT-UNA治療的小鼠在第15天小球小了70％且在第29天小球小了62％。由小球覆蓋的肝的面積在第15天減少83％且在第29天減少72％(圖12)。表17.在給予鹽水、Luc-RNAi觸發(fā)物SEQID59/78或AATRNAi觸發(fā)物SEQID52/63的一次注射之后PiZ小鼠中的血清hAAT水平。表18.在給予鹽水、Luc-RNAi觸發(fā)物SEQID59/78或AATRNAi觸發(fā)物SEQID52/63的一次注射之后，PiZ小鼠中的相對hAATmRNA水平。實(shí)施例15.在藉由MLP遞送聚合物遞送AATRNA觸發(fā)分子之后靈長類動物中的α-1抗胰蛋白酶(AAT)的敲除。如上所述制備MLP遞送聚合物及RNAi觸發(fā)物，并將其合并于的藥學(xué)上可接受的緩沖劑中。在第1天，對食蟹猴(cynomolgusmacaque)(食蟹獼猴(Macacafascicularis))靈長類動物(雄性及雌性，3至9kg)以不同劑量組合共注射MLP遞送聚合物與AATUNARNAi觸發(fā)物SEQID52/63。所注射的劑量組合為：2.0mg/kgMLP遞送聚合物+4.0RNAi觸發(fā)物(n＝3)、3mg/kgMLP遞送聚合物+1.5mg/kgRNAi觸發(fā)物(n＝2)、3.0mg/kgMLP遞送聚合物+3.0mg/kgRNAi觸發(fā)物(n＝3)、3.0mg/kgMLP遞送聚合物+6.0mg/kgRNAi觸發(fā)物(n＝2)、6.0mg/kgMLP遞送聚合物+12mg/kgRNAi觸發(fā)物(n＝3)(用0.050s轉(zhuǎn)換因子確定RNAi觸發(fā)物濃度)及12mg/kgMLP遞送聚合物+6.0mg/kgRNAi觸發(fā)物(n＝12)。對于各次注射，使用22至25號靜脈導(dǎo)管將MLP遞送聚合物+RNAi觸發(fā)物(2ml/kg)注射于隱靜脈中。在指定時點(diǎn)，抽取血樣且分析其AAT及毒性標(biāo)記物。自股靜脈采血，且使靈長類動物在所有采血的前禁食隔夜。在Meriter實(shí)驗(yàn)室或BASi在自動化學(xué)分析器上進(jìn)行關(guān)于血液尿素氮(BUN)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)及肌酸酐的血液測試。在CobasIntegra400(羅氏診斷公司，RocheDiagnostics)上根據(jù)制造商建議測定AAT水平。在所有劑量組合下均觀測到AAT顯著敲除。在2mg/kg、3mg/kg或6mg/kgMLP的劑量下未觀測到毒性，但在12mg/kgMLP下，在注射后肝酶(ALT及AST)以及BUN及肌酸酐有所升高。表19.NHP的AAT敲除百分比表20.尿素氮(mg/dL)表21.肌酸酐(mg/dL)表22.丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(U/L)表23.天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(U/L)實(shí)施例16.重復(fù)給予。以六周間隔給予食蟹猴靈長類動物以五劑RNAi觸發(fā)物+MLP遞送聚合物。各劑以MLP與RNAi觸發(fā)物呈1:2的重量與重量比含有MLP遞送聚合物及AAT-RNAi觸發(fā)物SEQID52/63。第一次注射在第1天。所注射的劑量組合為：2.0mg/kgMLP遞送聚合物+4.0RNAi觸發(fā)物(n＝2)及3mg/kgMLP遞送聚合物+6mg/kgRNAi觸發(fā)物(n＝2)。在整個研究過程中，以一定間隔采血，且如所述測定血清中的AAT水平。以六周間隔重復(fù)給藥使血清AAT水平在對靈長類動物用3mg/kgMLP遞送聚合物+6mg/kgRNAi觸發(fā)物進(jìn)行第一次治療之后二至三十周減小約80-90％。在用2.0mg/kgMLP遞送聚合物+4.0RNAi觸發(fā)物對靈長類動物進(jìn)行第一次治療之后，血清AAT減小80％，且在第四次治療之后減小85％。在用2.0mg/kgMLP遞送聚合物+4.0RNAi觸發(fā)物進(jìn)行的各次治療之后六周測定的血清AAT水平反彈小于各次其他治療(圖13)。序列表<110>箭頭藥業(yè)股份有限公司(ArrowheadMadisonInc.)C·I·伍德爾(Wooddell,ChristineI)D·L·路易斯(Lewis,DavidL)D·H·維基菲爾德(Wakefield,DarrenH)S·B·坎納(Kanner,StevenB)L·埃爾米達(dá)(Almeida,Laurn)<120>用于抑制α-1抗胰蛋白酶基因表達(dá)的組合物及方法<130>30624US1<150>62013288<151>2014-06-17<160>184<210>1<211>18<212>RNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的反義鏈<400>1ggaacuuggugaugauau18<210>2<211>18<212>RNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的反義鏈<400>2gaucauagguuccaguaa18<210>3<211>18<212>RNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的反義鏈<400>3acagccuuaugcacggcc18<210>4<211>18<212>RNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的反義鏈<400>4ucgauggucagcacagcc18<210>5<211>18<212>RNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的反義鏈<400>5caaaggguuuguugaacu18<210>6<211>18<212>RNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的反義鏈<400>6cgaaguacucagcguaag18<210>7<211>18<212>RNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的反義鏈<400>7gaguuggcacgccuuugc18<210>8<211>18<212>RNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的正義鏈<400>8auaucaucaccaaguucc18<210>9<211>18<212>RNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的正義鏈<400>9uuacuggaaccuaugauc18<210>10<211>18<212>RNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的正義鏈<400>10ggccgugcauaaggcugu18<210>11<211>18<212>RNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的正義鏈<400>11ggcugugcugaccaucga18<210>12<211>18<212>RNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的正義鏈<400>12aguucaacaaacccuuug18<210>13<211>19<212>RNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的正義鏈<400>13cuuacgcugaguacuucga19<210>14<211>19<212>RNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的正義鏈<400>14gcaaaggcgugccaacuca19<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的反義鏈<220><221>修飾堿基<222>(2)..(19)<223>/mod_base=“2'-羥基相應(yīng)核苷”<400>15tggaacuuggugaugauautt21<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的反義鏈<220><221>修飾堿基<222>(2)..(19)<223>/mod_base=“2’-羥基相應(yīng)核苷”<400>16tgaucauagguuccaguaatt21<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的反義鏈<220><221>修飾堿基<222>(2)..(19)<223>/mod_base=“2’-羥基相應(yīng)核苷”<400>17tacagccuuaugcacggcctt21<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的反義鏈<220><221>修飾堿基<222>(2)..(19)<223>/mod_base=“2’-羥基相應(yīng)核苷”<400>18tucgauggucagcacagcctt21<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的反義鏈<220><221>修飾堿基<222>(2)..(19)<223>/mod_base=“2’-羥基相應(yīng)核苷”<400>19tcaaaggguuuguugaacutt21<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的反義鏈<220><221>修飾堿基<222>(2)..(19)<223>/mod_base=“2’-羥基相應(yīng)核苷”<400>20tcgaaguacucagcguaagtt21<210>21<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的反義鏈<220><221>修飾堿基<222>(1)..(19)<223>/mod_base=“2’-羥基相應(yīng)核苷”<400>21ucgaaguacucagcguaagtt21<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的反義鏈<220><221>修飾堿基<222>(2)..(19)<223>/mod_base=“2’-羥基相應(yīng)核苷”<400>22tgaguuggcacgccuuugctt21<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的正義鏈<220><221>修飾堿基<222>(1)..(19)<223>/mod_base=“2’-羥基相應(yīng)核苷”<400>23auaucaucaccaaguuccat20<210>24<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的正義鏈<220><221>修飾堿基<222>(1)..(22)<223>/mod_base=“2’-羥基相應(yīng)核苷”<400>24uauauaucaucaccaaguuccat23<210>25<211>12<212>RNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的正義鏈<400>25uauauaucauca12<210>26<211>13<212>RNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的正義鏈<400>26uauauaucaucac13<210>27<211>14<212>RNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的正義鏈<400>27uauauaucaucacc14<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的正義鏈<220><221>修飾堿基<222>(1)..(19)<223>/mod_base=“2’-羥基相應(yīng)核苷”<400>28uuacuggaaccuaugaucat20<210>29<211>13<212>RNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的正義鏈<400>29uauuuacuggaac13<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的正義鏈<220><221>修飾堿基<222>(1)..(19)<223>/mod_base=“2’-羥基相應(yīng)核苷”<400>30ggccgugcauaaggcuguat20<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的正義鏈<220><221>修飾堿基<222>(1)..(19)<223>/mod_base=“2’-羥基相應(yīng)核苷”<400>31ggcugugcugaccaucgaat20<210>32<211>12<212>RNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的正義鏈<400>32uauggcugugcu12<210>33<211>13<212>RNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的正義鏈<400>33uauggcugugcug13<210>34<211>14<212>RNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的正義鏈<400>34uauggcugugcuga14<210>35<211>11<212>RNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的正義鏈<400>35uauggcugugc11<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>dsRNA的正義鏈<220><221>修飾堿基<222>(1)..(19)<223>/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10>132<211>26<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<400>132LeuLeuGlyAlaLeuLeuLysValLeuAlaThrGlyLeuProThrLeu151015LeuSerTrpLeuLysAsnLysArgLysGln2025<210>133<211>26<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<220><221>misc_feature<222>2,5,17,20<223>Xaa為Nle<400>133LeuXaaGlyAlaXaaLeuLysValLeuAlaThrGlyLeuProThrLeu151015XaaSerTrpXaaLysAsnLysArgLysGln2025<210>134<211>26<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<400>134LeuValGlyAlaValLeuLysValLeuAlaThrGlyLeuProThrLeu151015ValSerTrpValLysAsnLysArgLysGln2025<210>135<211>26<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<400>135GlyLeuGlyAlaLeuLeuLysValLeuAlaCysGlyLeuProThrLeu151015LeuSerTrpLeuLysAsnLysArgLysGln2025<210>136<211>26<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<220><221>misc_feature<222>2,5,17,20<223>Xaa為Nle<400>136GlyXaaGlyAlaXaaLeuLysValLeuAlaCysGlyLeuProThrLeu151015XaaSerTrpXaaLysAsnLysArgLysGln2025<210>137<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<400>137CysGluAspAspLeuLeuLeuGlyAlaIleLeuLysValLeuAlaThr151015GlyLeuProThrLeuIleSerTrpIleLysAsnLysArgLysGln202530<210>138<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<400>138CysLeuValValLeuIleValValAlaIleLeuLysValLeuAlaThr151015GlyLeuProThrLeuIleSerTrpIleLysAsnLysArgLysGln202530<210>139<211>26<212>PRT<213>意大利蜂(Apismellifera)<400>139GlyIleGlyAlaValLeuLysValLeuThrThrGlyLeuProAlaLeu151015IleSerTrpIleLysArgLysArgGlnGln2025<210>140<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<400>140CysLeuIleGlyAlaIleLeuLysValLeuAlaThrGlyLeuProThr151015LeuIleSerTrpIleLysAsnLysArgLysGln2025<210>141<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<220><221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>Xaa為Nle<400>141CysXaaIleGlyAlaIleLeuLysValLeuAlaThrGlyLeuProThr151015LeuIleSerTrpIleLysAsnLysArgLysGln2025<210>142<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<400>142GlyLeuIleGlyAlaIleLeuLysValLeuAlaThrGlyLeuProThr151015LeuIleSerTrpIleLysAsnLysArgLysGln2025<210>143<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<400>143LeuLeuIleGlyAlaIleLeuLysValLeuAlaThrGlyLeuProThr151015LeuIleSerTrpIleLysAsnLysArgLysGln2025<210>144<211>29<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<400>144LysLeuLysLeuIleGlyAlaIleLeuLysValLeuAlaThrGlyLeu151015ProThrLeuIleSerTrpIleLysAsnLysArgLysGln2025<210>145<211>29<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<400>145LysLeuLysTyrIleGlyAlaIleLeuLysValLeuAlaThrGlyLeu151015ProThrLeuIleSerTrpIleLysAsnLysArgLysGln2025<210>146<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<400>146CysLysLeuLysLeuIleGlyAlaIleLeuLysValLeuAlaThrGly151015LeuProThrLeuIleSerTrpIleLysAsnLysArgLysGln202530<210>147<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<220><221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>Xaa為Nle<400>147CysLysLeuLysXaaIleGlyAlaIleLeuLysValLeuAlaThrGly151015LeuProThrLeuIleSerTrpIleLysAsnLysArgLysGln202530<210>148<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<400>148GlyLysLeuLysLeuIleGlyAlaIleLeuLysValLeuAlaThrGly151015LeuProThrLeuIleSerTrpIleLysAsnLysArgLysGln202530<210>149<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>D型蜂毒素樣肽<400>149CysProAlaAsnLeuIleGlyAlaIleLeuLysValLeuAlaThrGly151015LeuProThrLeuIleSerTrpIleLysAsnLysArgLysGln202530<210>150<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<400>150AspGluProLeuArgAlaIleGlyAlaIleLeuLysValLeuAlaThr151015GlyLeuProThrLeuIleSerTrpIleLysAsnLysArgLysGln202530<210>151<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<400>151GlyIleGlyAlaIleLeuLysValLeuAlaThrGlyLeuProThrLeu151015IleSerTrpIleLysAsnLysArgLysGlnCys2025<210>152<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<400>152LeuIleGlyAlaIleLeuLysValLeuAlaThrGlyLeuProThrLeu151015IleSerTrpIleLysAsnLysArgLysGlnCys2025<210>153<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>Xaa為Nle<400>153XaaIleGlyAlaIleLeuLysValLeuAlaThrGlyLeuProThrLeu151015IleSerTrpIleLysAsnLysArgLysGlnCys2025<210>154<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<400>154LeuIleGlyAlaIleLeuLysValLeuAlaThrGlyLeuProThrLeu151015IleSerTrpIleLysAsnLysArgLysGlnLysLeuLysCys202530<210>155<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<400>155TyrIleGlyAlaIleLeuLysValLeuAlaThrGlyLeuProThrLeu151015IleSerTrpIleLysAsnLysArgLysGlnProLeuGlyIleAlaGly202530GlnCys<210>156<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<400>156LeuIleGlyAlaIleLeuLysValLeuAlaThrGlyLeuProThrLeu151015IleSerTrpIleLysAsnLysArgLysGlnLysLysLysLysLys202530<210>157<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<400>157TyrIleGlyAlaIleLeuLysValLeuAlaThrGlyLeuProThrLeu151015IleSerTrpIleLysAsnLysArgLysGlnGlyPheLysGlyCys202530<210>158<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<400>158CysPheLysLeuIleGlyAlaIleLeuLysValLeuAlaThrGlyLeu151015ProThrLeuIleSerTrpIleLysAsnLysArgLysGlnCys202530<210>159<211>25<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<400>159PheGlyAlaIleLeuLysValLeuAlaThrGlyLeuProThrLeuIle151015SerTrpIleLysAsnLysArgLysGln2025<210>160<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<400>160LeuIleGlyAlaIleLeuLysValLeuAlaThrGlyLeuProThrLeu151015IleSerTrpIleLysAsnLys20<210>161<211>21<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<400>161LeuIleGlyAlaValLeuLysValLeuThrThrGlyLeuProAlaLeu151015IleSerTrpIleLys20<210>162<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><223>蜂毒素樣肽<400>162LeuIleGlyAlaValLeuLysValLeuThrThrGlyLeuProAlaLeu151015IleSerTrpIleLysGlyGlu20<210>163<211>26<212>PRT<213>人工序列<220><223>逆轉(zhuǎn)(reversed)及蜂毒素樣序列<400>163GlnLysArgLysAsnLysIleTrpSerIleLeuThrProLeuGlyThr151015AlaLeuVa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