本發(fā)明涉及一種基于至少一種益生菌的組合物，該組合物用于痊愈性治療超重人類的體重增加，和/或預(yù)防性治療超重或曾經(jīng)超重的人類的體重增加。

背景技術(shù)：

術(shù)語“超重”在本發(fā)明中指人類具有主要為腹部脂肪的體脂的異?；蜻^多的堆積，這對他/她的健康有風(fēng)險。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語“超重”還包括人類的肥胖狀況的特定且極端的情況。

術(shù)語“曾經(jīng)超重”在本發(fā)明中應(yīng)被理解為這個人已經(jīng)進(jìn)行了減肥，并且在3至5年的時段內(nèi)具有被認(rèn)為是正常(基于BMI或腰圍/臀圍的比率)的體重。

簡單指數(shù)允許在一組給定人群的水平上，測量超重和肥胖，詳細(xì)闡述該簡單指數(shù)卻是困難的。例如，因?yàn)閮和颓嗌倌甑纳眢w經(jīng)歷與他們的生長相關(guān)的一定數(shù)量的生理學(xué)變化，因此用于衡量兒童和青少年中的超重和肥胖指數(shù)的比例與成人中所使用的比例不同。所以，依賴于年齡，WHO(世界衛(wèi)生組織)向公眾提供了不同的、用于依賴于個體的年齡或個體樣品的平均年齡來衡量體重的方法。

作為例子，可在體重指數(shù)(BMI)的基礎(chǔ)上評價成人中的超重，與目前用于估計成人超重和肥胖的尺寸相比，這代表了對體重的簡單測量。它對應(yīng)于體重除以尺寸的平方，以kg/m²來表示。

BMI的優(yōu)點(diǎn)在于應(yīng)用于兩種性別，并且應(yīng)用于所有的成人年齡區(qū)間。因此，BMI應(yīng)被認(rèn)為是近似指示，因?yàn)樗灰欢▽?yīng)于依賴于個體的脂肪量的相同的百分比。

在本上下文中，WHO定義了在BMI的基礎(chǔ)上的以下閾值用于確定成人是否是超重或肥胖：

-正常體重狀況對應(yīng)于介于20至25之間的BMI；

-超重狀況對應(yīng)于介于25至30之間的BMI；以及

-肥胖狀況對應(yīng)于等于或大于30的BMI。

但是，應(yīng)當(dāng)注意到，BMI沒有給出相對于皮下脂肪，腹部脂肪分布的任何指示。

即使該指數(shù)具有對成人個體的所有年齡區(qū)間和兩種性別進(jìn)行一致分類的優(yōu)點(diǎn)，但優(yōu)選可與另一指標(biāo)(可例如是測量個體的腰圍)一起來補(bǔ)充解釋該指數(shù)。

因此，腰圍大于100cm的男性成人個體被認(rèn)為是超重的。該閾值在成人女性中是88cm。

通過測量腰圍(A)/臀圍(H)的比率，可將該參數(shù)推廣至所有年齡區(qū)間。

在男性個體中大于1的比率和在女性個體中大于0.85的比率被認(rèn)為是超重。

一旦人類中的超重，尤其是人類肥胖被WHO認(rèn)為是疾病，就在本發(fā)明的范圍內(nèi)應(yīng)用術(shù)語“治療”。

術(shù)語“痊愈性”在本發(fā)明中應(yīng)被理解為，目的在于降低超重人類的體重和/或降低超重人類的體重增加的作用。因此，痊愈性治療暗示了具有以下目的的作用：優(yōu)選在飲食過程中和/或在飲食之后，達(dá)到在人類中被認(rèn)為是正常的體重，即，對健康有較小的風(fēng)險，在預(yù)定值的范圍內(nèi)，例如基于BMI其包含介于20至25之間、優(yōu)選等于22。

術(shù)語“對健康有較小風(fēng)險”在本發(fā)明范圍內(nèi)應(yīng)被理解為在體重被認(rèn)為正常時，發(fā)展成代謝綜合征的風(fēng)險是可以忽略的。

具體地，痊愈性作用主要的目的在于降低個體中的腹部脂肪或至少降低腹部脂肪的堆積。

術(shù)語“預(yù)防性”在本發(fā)明中應(yīng)指具有以下目的的作用：穩(wěn)定超重或曾經(jīng)超重(即已經(jīng)減肥了)的人類的體重，并因此在飲食過程中和/或飲食之后，預(yù)防或限制超重或曾經(jīng)超重的人類的體重增加。預(yù)防性治療還暗示具有以下目的的作用：優(yōu)選在飲食過程中和/或飲食之后，維持穩(wěn)定的體重，該體重優(yōu)選在人類中被認(rèn)為是正常的體重，在基于例如BMI(作為提醒，在20～25之間)的預(yù)定值的恒定范圍內(nèi)，但按照A/H比率正常體重也可被理解為在女性個體中小于0.85，且在男性個體中小于1.00。

目前，在全球范圍內(nèi)，相對于體重不足，超重和肥胖導(dǎo)致(因?yàn)橄嚓P(guān)疾病，如II型糖尿病或心血管疾病)更多的死亡。

具體地，體重和肥胖的比例已在全球范圍內(nèi)流行(考慮到每年超過至少3百萬人的死亡在病理學(xué)上與他們的超重或肥胖相關(guān))，并且不再限于所謂的富有國家，現(xiàn)在體重和肥胖也影響低收入或中等收入的國家。

進(jìn)一步地，證明了高BMI，有時與高A/H比率一起，在一個方面是促進(jìn)代謝綜合征的因素，其在本發(fā)明的范圍內(nèi)被定義為健康的風(fēng)險因素的聯(lián)合：動脈高血壓、高甘油三酯血癥、低HDL膽固醇水平和類固醇肥胖病癥(例如腹部脂肪的堆積)和血糖增加。這些指標(biāo)實(shí)際上形成對于以下三種主要已知定義所共有的定義基礎(chǔ)：WHO的定義(公開于1998年，于1999年進(jìn)行了修訂)，2001年公開的國家膽固醇教育計劃(NCEP-ATPIII)的定義，以及2005年公開的國際糖尿病聯(lián)盟的定義。

在實(shí)踐中，以下指標(biāo)以非詳盡的方式表示了代謝綜合征：異常高的胰島素水平；II型糖尿?。桓吣懝檀佳Y(與低水平的“好”膽固醇HDL相關(guān))；高血壓；體重增加隨著時間顯著增加；尤其如果是腹部肥胖；高甘油三酯血癥；肝脂肪變性；系統(tǒng)性炎癥病癥的發(fā)展；以及，脂肪細(xì)胞肥大。

此外，以下指標(biāo)以非詳盡的方式表示了慢性疾病的風(fēng)險：肌肉-骨骼障礙，尤其是關(guān)節(jié)?。换蛘?，某些類型的癌癥。

因此，導(dǎo)致人類超重的不受控制的體重增加的問題，被證明是在全球水平上對健康具有不可忽視的影響的社會問題。

從這個角度上，WHO在它的預(yù)防體重過度增加的全球策略中，提出了關(guān)于食物和體育運(yùn)動的建議。由2004年世界衛(wèi)生大會(WHA)所采用的此策略闡述了鼓勵群眾遵循健康飲食和規(guī)律運(yùn)動所需的步驟。

但是，如果這一策略是基于預(yù)防體重增加的建議，則它對于超重或曾經(jīng)超重的個體和具有再次增加體重風(fēng)險的個體體重增加的痊愈性和預(yù)防性治療沒有提出任何指示。實(shí)際上，目前不受控制的體重增加的問題不再集中于具有正常體重(即具有正常的BMI和/或正常腰圍)、但可能增加體重的個體，而是特別集中于從WHO指出近14億超過20歲的人已顯示出超重的那一刻起，已經(jīng)超重的個體。在后者中，超過2億男性和近3億女性是肥胖的，并且在世界上，在10個成年人中超過1個成年人是肥胖的。

因此，非常需要一種治療方法，能夠降低或預(yù)防超重人類的超重或肥胖。優(yōu)選地，該治療方法應(yīng)當(dāng)不是非常強(qiáng)制性的，因?yàn)橐庾R到與超重和肥胖相關(guān)的主要原因是缺乏努力遵循與治療方法(有時可能是嚴(yán)格的)相關(guān)聯(lián)的特定飲食。

具體地，本發(fā)明是已知因果關(guān)系的一部分，該已知因果關(guān)系使腸道微生物區(qū)與肥胖發(fā)展相關(guān)聯(lián)(Ley et al.,2006.Nature,444:1022-1023；Nadal et al.,2008.Int J.Obes.,33(7):758-67)。

在這種情況下進(jìn)行了很多研究，并且提供了包括大量文獻(xiàn)的現(xiàn)有技術(shù)，其中文獻(xiàn)提到在超重和肥胖的范圍內(nèi)使用基于益生菌的治療方法。

具體地，已經(jīng)示出微生物區(qū)有助于使宿主維持良好的健康狀態(tài)。實(shí)際上，微生物區(qū)的平衡狀態(tài)有助于調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)和免疫平衡，從而微生物區(qū)的任何失衡都被解釋為參與了代謝綜合征的發(fā)展，尤其在發(fā)展該綜合征的遺傳易感性的個體中參與代謝綜合征的發(fā)展(Parks et al.,Cell Metab,2012)。

對微生物區(qū)——體重增加的關(guān)系的鑒定曾是大量研究的推動力，是各專利申請的主題，下面對相關(guān)度最高的專利申請進(jìn)行評述。

首先，應(yīng)當(dāng)提到國際專利申請WO2007043933，其中提出以發(fā)酵奶的形式使用干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)F19和嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)NCFB 1748，以及乳雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)Bb12的菌株，來降低食欲以及脂肪在特定組織中的堆積，從而控制人類的體重。但是，該申請中所聲稱的效果似乎主要起源于鈣和乳蛋白的共同作用，而不是上述細(xì)菌菌株的存在。此外，該效果僅靶向與小腸代謝相關(guān)的基因表達(dá)，因此不涉及參與體重增加的其它器官和組織。

其次，文獻(xiàn)US20100061967A1也提出使用細(xì)菌組合物來調(diào)整調(diào)節(jié)飽足機(jī)制的肽的表達(dá)，該調(diào)整僅發(fā)生在胃腸道中。

國際專利申請WO2009153662公開了基于雙歧桿菌(Bifidobacteriesa)和乳酸桿菌(Lactobacilli)的組合物在治療糖尿病中的應(yīng)用，該應(yīng)用僅基于這些微生物降低周圍組織的炎癥的能力，而這些微生物并不作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，因此例如不作用于飽足的中樞調(diào)節(jié)機(jī)制，其中糖尿病是與超重或肥胖誘導(dǎo)的代謝綜合征相關(guān)的指示疾病列表下的一種疾病。

此外，文獻(xiàn)US20100150890提供了以下信息：組合物中的益生菌在刺激交感神經(jīng)系統(tǒng)的功能中的應(yīng)用，以便刺激代謝，因此刺激能量消耗。但是，示出交感緊張?jiān)谀承┓逝謧€體中也是活躍的，因此它的活化在治療超重和肥胖的范圍內(nèi)不是可靠的選擇方案。

專利申請US20100111915顯示了益生菌的組合物作為在預(yù)防兒童肥胖的范圍內(nèi)的選擇方案的一般應(yīng)用。按照US20100111915記載的內(nèi)容，這一應(yīng)用基于益生菌的雙歧效果，但該文獻(xiàn)沒有給出任何具體的根據(jù)，其給出證實(shí)腸道中的雙歧桿菌的數(shù)量增加可能是預(yù)防兒童出現(xiàn)肥胖的作用的起因。

文獻(xiàn)US20050112112提出微生物的組合物從存在于胃腸道中的單糖和二糖生成不能被人類消化的糖聚合物的應(yīng)用，從而實(shí)際上降低糖在體內(nèi)的吸收。

最后，文獻(xiàn)JP10306028也給出了以下信息：使用雙歧桿菌與殼聚糖的組合，對膽固醇被身體的吸收具有抑制作用。

不幸的是，即使現(xiàn)有技術(shù)中的組合物能降低超重和肥胖，并且能降低與代謝綜合征相關(guān)的癥狀(例如，這被稱為緩解)，使用現(xiàn)有技術(shù)中的組合物也不能持續(xù)3至5年以上(例如，這被稱為痊愈)，使體重長期維持在期望的正常水平(即對應(yīng)于例如介于20至25之間的BMI)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在本發(fā)明的范圍內(nèi)，應(yīng)當(dāng)將緩解與痊愈區(qū)分開。如果一個體在體檢過程(體重、腰圍測量等)中不再檢測到超重，則該個體被稱為處于緩解狀態(tài)。但僅在特定的額外時間間隔之后，才稱為痊愈，其中特定的額外時間間隔取決于超重類型。通常，當(dāng)緩解持續(xù)3年或5年時，才被認(rèn)為痊愈了。

本發(fā)明的目標(biāo)是通過提供在開始所述的組合物來克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，該組合物的特征在于，所述益生菌是動物雙歧桿菌亞種乳酸菌(Bifidobacterium animalis ssp.Lactis)編號LMG P-28149。

按照布達(dá)佩斯條約，根據(jù)本發(fā)明的菌株于2014年1月27日保藏于BCCM(比利時微生物保藏中心，Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms)和LMG(微生物細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室，Laboratorium voor Microbiologie- )，保藏編號為LMG P-28149。

在本發(fā)明的范圍內(nèi)，上述組合物優(yōu)選包括在存活條件下的益生菌動物雙歧桿菌亞種乳酸菌(Bifidobacterium animalis ssp.Lactis)編號LMG P-28149。術(shù)語“在存活條件下”指存活細(xì)菌在上述組合物中的濃度介于10⁸CFU/g組合物和10¹³CFU/g組合物之間。

在本發(fā)明的范圍內(nèi)，觀察到該特定益生菌的菌株對飽足，以及與限制體重增加相關(guān)的腸道微生物區(qū)的恢復(fù)都具有顯著的積極作用。

明顯觀察到動物雙歧桿菌亞種乳酸菌(Bifidobacterium animalis ssp.Lactis)編號LMG P-28149的存在對腸道中的阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)重新定殖具有作用，其中阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)是因其在防止人類肥胖中的作用而聞名的一種細(xì)菌，它的水平在超重或肥胖個體中大大降低。

進(jìn)一步地，還令人驚奇地觀察到根據(jù)本發(fā)明的菌株的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，這與轉(zhuǎn)錄因子PPARγ的表達(dá)的恢復(fù)相關(guān)，該轉(zhuǎn)錄因子PPARγ參與調(diào)節(jié)白色脂肪組織的T淋巴細(xì)胞的功能。

因此，根據(jù)本發(fā)明的組合物明顯能夠在超重人類中，痊愈性或預(yù)防性治療腸道微生物區(qū)障礙和與該障礙相關(guān)的炎性疾病。

因此，本發(fā)明有利地旨在于痊愈性或預(yù)防性治療與人類超重相關(guān)的代謝綜合征。

因此，根據(jù)本發(fā)明，證明了基于動物雙歧桿菌亞種乳酸菌(Bifidobacterium animalis ssp.Lactis)編號LMG P-28149的組合物對身體明顯具有以下效果，該效果優(yōu)選在飲食過程中和/或在飲食之后，伴隨在富含脂肪的飲食下體重增加降低，或伴隨體重的穩(wěn)定：改善胰島素敏感性；降低腹部和皮下脂肪量的發(fā)展；減小脂肪細(xì)胞的大??；尤其通過促炎性巨噬細(xì)胞，降低白色脂肪組織的細(xì)胞浸潤；減少炎性標(biāo)記物；限制肝脂肪變性；以及，限制或降低“壞”的膽固醇水平。

可以看出，根據(jù)本發(fā)明的至少包括益生菌動物雙歧桿菌亞種乳酸菌(Bifidobacterium animalis ssp.Lactis)編號LMG P-28149的組合物作用于與超重相關(guān)的各種因素。

在本發(fā)明的范圍內(nèi)，還證明了不僅處于或不處于存活條件下的具體動物雙歧桿菌亞種乳酸菌(Bifidobacterium animalis ssp.Lactis)編號LMG P-28149菌株，而且來源于該菌株的化合物，都具有對體重增加的預(yù)防性和痊愈性作用，并且對超重人類的代謝綜合征也有作用。

在本上下文中，根據(jù)本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步包括至少一種益生菌成分或至少兩種益生菌成分的組合，各成分都來源于動物雙歧桿菌亞種乳酸菌(Bifidobacterium animalis ssp.Lactis)編號LMG P-28149，并且選自由細(xì)胞壁的成分、細(xì)胞器的組分、核酸、細(xì)胞膜的成分和細(xì)胞代謝物所組成的組。

作為例示而不用作限制，上述細(xì)胞壁的成分選自由肽聚糖、蛋白、多糖、磷壁酸，或它們的組合所組成的組。

作為例示而不用作限制，上述代謝物選自由有機(jī)酸、無機(jī)酸、蛋白、肽、氨基酸、酶、脂質(zhì)、碳水化合物、糖脂、糖蛋白、維生素、鹽、金屬或它們的組合所組成的組。

在具體實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的組合物包括：丁酸鹽，或至少一種它的衍生物；和/或，丙酸鹽，或至少一種它的衍生物；通過動物雙歧桿菌亞種乳酸菌(Bifidobacterium animalis ssp.Lactis)編號LMG P-28149來促進(jìn)該丁酸鹽和/或丙酸鹽的誘導(dǎo)

或者，根據(jù)本發(fā)明的組合物包括至少一種額外的益生菌，所述額外的益生菌選自由以下益生菌組成的組：古生菌(Archaea)、厚壁菌(Firmicutes)、擬桿菌(Bacteroidetes)、變形菌(Proteobacteria)、放線菌(Actinobacteria)、疣微菌(Verrucomicrobia)、梭桿菌(Fusobacteria)、產(chǎn)甲烷菌(Metanobacteria)、螺旋菌(Spirochaetes)、絲狀桿菌(Fibrobacters)、脫鐵桿菌(Deferribacteres)、異常球菌(Deinococcus)、棲熱菌(Thermus)、藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)、甲烷短桿菌(Methanobrevibacterium)、乳桿菌(Lactobacillus)、消化鏈球菌(Peptostreptococcus)、瘤胃球菌(Ruminococcus)、糞球菌(Coprococcus)、薩博得林氏菌(Subdolingranulum)、多爾氏菌(Dorea)、布雷第菌(Bulleidia)、厭氧菌(Anaerofustis)、孿生球菌(Gemella)、羅氏菌(Roseburia)、凱特妮菌(Catenibacterium)、小桿菌(Dialister)、安羅倉科斯菌(Anaerotruncus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、微球菌(Micrococcus)、丙酸桿菌(Propionibacterium)、腸桿菌(Enterobacteriaceae)(非致病性)、霍氏桿菌(Faecalibacterium)、擬桿菌(Bacteroides)、普拉菌(Parabacteroides)、普氏菌(Prevotella)、真桿菌(Eubacterium)、阿克曼菌(Akkermansia)、芽胞桿菌(Bacillus)、丁酸弧菌(Butyrivibrio)和梭菌(Clostridium)，或它們的組合。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步包括至少一種真菌和/或酵母菌株，所述菌株選自由酵母(Saccharomyces)、念珠菌(Candida)、畢赤酵母(Pichia)、德巴利氏酵母(Debaryomyces)、球擬酵母(Torulopsis)、曲霉菌(Aspergillus)、根霉菌(Rhizopus)、毛霉菌(Mucor)和青霉菌(Penicillium)所組成的組。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的組合物包括用于封裝益生菌的載體，其中，上述動物雙歧桿菌亞種乳酸菌(Bifidobacterium animalis ssp.Lactis)編號LMG P-28149和可選的上述至少一種額外的益生菌被封裝在該載體中。

有利地，上述真菌和/或上述酵母也被封裝在上述載體中。

或者，上述封裝載體包括選自由藻酸鹽、殼聚糖、果膠、普魯蘭多糖、明膠、角叉菜膠、瓊脂凝膠或它們的組合所組成的組中的至少一種物質(zhì)。

優(yōu)選地，上述至少一種物質(zhì)是水膠體。

有利地，根據(jù)本發(fā)明的組合物包括選自由單糖、多糖、氨基酸、肽、蛋白、維生素、酵母提取物、鹵鹽、堿金屬或堿土金屬、抗氧化劑、甘油、乙酸鋅、氯化鋅、乳酸鋅、抗壞血酸、檸檬酸、植物油、乳脂或它們的組合所組成的組中的至少一種食物源。

在具體實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的組合物是包括至少一種益生元的共生組合物。

優(yōu)選地，所述至少一種益生元以非限制性的方式選自由低聚糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、菊粉或它的衍生物、乳果糖或它的衍生物、低聚甘露糖，或它們的組合所組成的組。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的組合物包括覆蓋上述動物雙歧桿菌亞種乳酸菌(Bifidobacterium animalis ssp.Lactis)編號LMG P-28149和可選的上述至少一種額外的益生菌的第一腸溶包衣。具體的，該第一腸溶包衣選自由乙基纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、聚合物(諸如)或它們的組合所組成的組。

或者，上述組合物進(jìn)一步包括選自由藻酸鹽、殼聚糖、果膠、普魯蘭多糖、明膠、角叉菜膠、瓊脂凝膠、纖維素、半纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素或它們的組合所組成的組中的第二外包衣。

在另一可選實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的組合物包括一種或幾種生物相容性賦形劑。

根據(jù)本發(fā)明的組合物可用于在懷孕女性或生完孩子的女性中，或在處于“擬娩”儀式或曾經(jīng)處于“擬娩”儀式的男性中，痊愈性或預(yù)防性治療過度的體重增加(即，普遍超過伴隨懷孕所發(fā)生的體重增加)。

根據(jù)本發(fā)明，上述組合物可表現(xiàn)為基于該組合物的食物，或進(jìn)一步包含(優(yōu)選處于存活條件下的)動物雙歧桿菌亞種乳酸菌(Bifidobacterium animalis ssp.Lactis)編號LMG P-28149的食物補(bǔ)充物的食物組合物。

在本發(fā)明的意義上，術(shù)語“食物組合物”應(yīng)當(dāng)指在食品市場上普遍存在的組合物(例如零食、即食食品、飲料等)。

在本發(fā)明的意義上，術(shù)語“食物補(bǔ)充物”應(yīng)被理解為食料，它的目的是提供具有營養(yǎng)學(xué)和/或生理學(xué)效果的營養(yǎng)物或物質(zhì)的補(bǔ)充。

根據(jù)本發(fā)明，可提供上述組合物以經(jīng)由口或舌下途徑來使用和攝入，但也可經(jīng)由呼吸，優(yōu)選經(jīng)由鼻或支氣管，或進(jìn)一步經(jīng)由直腸來使用和攝入。

上述組合物也可是至少基于來自上述益生菌的成分的可注射的液體組合物，并且用于皮下注射。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的組合物可被調(diào)制為片劑、丸劑、膠囊、顆粒劑、粉末、流體、液體、乳膏或噴霧劑。

根據(jù)本發(fā)明，上述組合物可用于在懷孕女性或生完孩子的女性中，或在處于“擬娩”儀式或曾經(jīng)處于“擬娩”儀式的男性中，痊愈性或預(yù)防性治療過度的體重增加(即，普遍超過伴隨懷孕所發(fā)生的體重增加)。

在所附的權(quán)利要求書中，給出了根據(jù)本發(fā)明的治療組合物的其它實(shí)施方式和應(yīng)用。

本發(fā)明還涉及包括至少一種益生菌的組合物在超重或曾經(jīng)超重的人類中的非治療性美容應(yīng)用，該益生菌是動物雙歧桿菌亞種乳酸菌Bifidobacterium animalis ssp.Lactis編號LMG P-28149。

優(yōu)選地，用于非治療性美容應(yīng)用的上述組合物包括選自由以下益生菌所組成的組中的至少一種額外的益生菌：古生菌(Archaea)、厚壁菌(Firmicutes)、擬桿菌(Bacteroidetes)、變形菌(Proteobacteria)、放線菌(Actinobacteria)、疣微菌(Verrucomicrobia)、梭桿菌(Fusobacteria)、產(chǎn)甲烷菌(Metanobacteria)、螺旋菌(Spirochaetes)、絲狀桿菌(Fibrobacters)、脫鐵桿菌(Deferribacteres)、異常球菌(Deinococcus)、棲熱菌(Thermus)、藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)、甲烷短桿菌(Methanobrevibacterium)、乳桿菌(Lactobacillus)、消化鏈球菌(Peptostreptococcus)、瘤胃球菌(Ruminococcus)、糞球菌(Coprococcus)、薩博得林氏菌(Subdolingranulum)、多爾氏菌(Dorea)、布雷第菌(Bulleidia)、厭氧菌(Anaerofustis)、孿生球菌(Gemella)、羅氏菌(Roseburia)、凱特妮菌(Catenibacterium)、小桿菌(Dialister)、安羅倉科斯菌(Anaerotruncus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、微球菌(Micrococcus)、丙酸桿菌(Propionibacterium)、腸桿菌(Enterobacteriaceae)(非致病性)、霍氏桿菌(Faecalibacterium)、擬桿菌(Bacteroides)、普拉菌(Parabacteroides)、普氏菌(Prevotella)、真桿菌(Eubacterium)、阿克曼菌(Akkermansia)、芽胞桿菌(Bacillus)、丁酸弧菌(Butyrivibrio)和梭菌(Clostridium)，或它們的組合。

有利地，用于非治療性美容應(yīng)用的上述組合物包括選自由酵母(Saccharomyces)、念珠菌(Candida)、畢赤酵母(Pichia)、德巴利氏酵母(Debaryomyces)、球擬酵母(Torulopsis)、曲霉菌(Aspergillus)、根霉菌(Rhizopus)、毛霉菌(Mucor)和青霉菌(Penicillium)所組成的組中的真菌和/或酵母菌株。

優(yōu)選地，在用于非治療性美容應(yīng)用的上述組合物中，上述動物雙歧桿菌亞種乳酸菌(Bifidobacterium animalis ssp.Lactis)編號LMG P-28149和可選的上述至少一種額外的益生菌被封裝在封裝載體中。

有利地，在用于非治療性美容應(yīng)用的上述組合物中，上述封裝載體包括選自由藻酸鹽、殼聚糖、果膠、普魯蘭多糖、明膠、角叉菜膠、瓊脂凝膠和它們的組合所組成的組中的至少一種物質(zhì)。

有利地，用于非治療性美容應(yīng)用的上述組合物包括選自由單糖、多糖、氨基酸、肽、蛋白、維生素、酵母提取物、堿金屬或堿土金屬的鹵鹽、抗氧化劑、甘油、乙酸鋅、氯化鋅、乳酸鋅、抗壞血酸、檸檬酸、植物油、乳脂或它們的組合所組成的組中的至少一種食物源。

優(yōu)選地，用于非治療性美容應(yīng)用的上述組合物進(jìn)一步包括至少一種益生元，從而形成共生組合物。

優(yōu)選地，用于非治療性美容應(yīng)用的上述組合物包括覆蓋上述動物雙歧桿菌亞種乳酸菌(Bifidobacterium animalis ssp.Lactis)編號LMG P-28149和可選的上述至少一種額外的益生菌的第一腸溶包衣。

有利地，在用于非治療性美容應(yīng)用的上述組合物中，上述第一腸溶包衣選自由乙基纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、或它們的組合所組成的組。

優(yōu)選地，用于非治療性美容應(yīng)用的上述組合物包括選自由藻酸鹽、殼聚糖、果膠、普魯蘭多糖、明膠、角叉菜膠、瓊脂凝膠、纖維素、半纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素或它們的組合所組成的組中的第二外包衣。

有利地，用于非治療性美容應(yīng)用的上述組合物進(jìn)一步包括一種或幾種生物相容性賦形劑。

在所附的權(quán)利要求中示出了根據(jù)本發(fā)明的組合物的用于非治療性美容應(yīng)用的其它形式。

本發(fā)明還涉及益生菌動物雙歧桿菌亞種乳酸菌(Bifidobacterium animalis ssp.Lactis)編號LMG P-28149的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包括至少一種蛋白源和至少一種碳水化合物源，該培養(yǎng)基的特征在于它進(jìn)一步包括谷胱甘肽。

谷胱甘肽是三肽，參與維持細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)的氧化還原電位，以及一定數(shù)目的活性氧類的解毒和去除反應(yīng)。

令人驚奇地是，示出在本發(fā)明的范圍內(nèi)，這樣的包括谷胱甘肽的培養(yǎng)基優(yōu)化益生菌動物雙歧桿菌亞種乳酸菌(Bifidobacterium animalis ssp.Lactis)編號LMG P-28149菌株的效能，對此，觀察到對超重或曾經(jīng)超重人類中的體重增加的痊愈性或預(yù)防性作用。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基包括濃度介于20g/l培養(yǎng)基至30g/l培養(yǎng)基之間的谷胱甘肽。

有利地，根據(jù)本發(fā)明，上述培養(yǎng)基的蛋白源選自由乳清蛋白胨、酪蛋白胨、植物或細(xì)菌蛋白胨，和它們的組合所組成的組。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，上述培養(yǎng)基的碳水化合物源包括至少一種糖或多種糖的混合物，所述糖選自由乳糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、麥芽糊精、淀粉、海藻糖、麥芽三糖和它們的組合所組成的組。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，上述培養(yǎng)基進(jìn)一步包括至少一種氨基糖，例如氨基葡萄糖或氨基半乳糖。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，上述培養(yǎng)基進(jìn)一步包括至少一種酵母提取物。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，上述培養(yǎng)基進(jìn)一步包括至少一種蛋提取物。

在所附的權(quán)利要求書中示出了根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基的其它實(shí)施方式。

本發(fā)明還涉及通過發(fā)酵來制造益生菌動物雙歧桿菌亞種乳酸菌(Bifidobacterium animalis ssp.Lactis)編號LMG P-28149的方法，該方法包括用于在根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該益生菌的至少一個步驟。

在所附的權(quán)利要求書中示出了根據(jù)本發(fā)明的方法的其它實(shí)施方式。

以非限制性方法并且參考下面所述的實(shí)施例，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)從下面的說明中將變得明顯。

這些實(shí)施例重復(fù)了在小鼠中獲得的結(jié)果其包括從人血液中分離的免疫細(xì)胞中體外獲得的結(jié)果。

盡管在下面的實(shí)施例1至實(shí)施例4中重復(fù)測試的結(jié)果是在小鼠中獲得的，但是應(yīng)理解在人類中也能獲得類似的結(jié)果。

具體地，在本發(fā)明的范圍內(nèi)證明了上述菌株對哺乳動物，尤其是嚙齒動物中的體重增加的特定效果。

實(shí)際上，益生菌動物雙歧桿菌亞種乳酸菌(Bifidobacterium animalis ssp.Lactis)編號LMG P-28149菌株的單獨(dú)給藥或與至少一種其它益生菌的聯(lián)合給藥，在超重(包括胰島素抗性)的哺乳動物，尤其是嚙齒動物中的誘導(dǎo)了體重增加的降低以及炎性和代謝參數(shù)的改善。

具體地，在本發(fā)明的范圍內(nèi)證明了，基于根據(jù)本發(fā)明的益生菌菌株的組合物的代謝保護(hù)效果，該代謝保護(hù)效果還與脂肪組織內(nèi)的PPARγ的表達(dá)和細(xì)胞重建的恢復(fù)，以及對肝脂肪變性的防護(hù)效果的恢復(fù)相關(guān)。

基于根據(jù)本發(fā)明的菌株的組合物還能調(diào)整與脂肪酸運(yùn)輸相關(guān)的受體的表達(dá)，尤其能恢復(fù)與G蛋白(GPR41和GPR43)耦聯(lián)的參與短鏈脂肪酸(SCFA)運(yùn)輸?shù)氖荏w，其中短鏈脂肪酸(SCFA)是在由營養(yǎng)物吸收所誘導(dǎo)的飽足機(jī)制中的重要作用因子。

實(shí)際上，證明了根據(jù)本發(fā)明的菌株對脂肪細(xì)胞的大小，以及對促炎性細(xì)胞因子和趨化因子(MCP-1、IL-6、TNF-α等)的產(chǎn)生的積極作用，其中一些是導(dǎo)致胰島素抗性的直接原因。

觀察到，根據(jù)本發(fā)明的菌株還能重建哺乳動物中的血脂譜以及葡萄糖的代謝，預(yù)防發(fā)展成與代謝綜合征直接相關(guān)的疾病，如血脂異常(以及由此導(dǎo)致的II型糖尿病)和高血糖癥的風(fēng)險。

最后，證明了攝取根據(jù)本發(fā)明的益生菌菌株與阿克曼菌(Akkermansia)在腸道中的重新定殖之間的關(guān)系，其中阿克曼菌(Akkermansia)是因其在預(yù)防人類肥胖中的作用以及在超重或肥胖個體中大大降低而聞名的細(xì)菌。

附圖說明

圖1示出了小鼠中，在超重以及然后的肥胖發(fā)展過程中，Ls33對以下方面的作用：(A)體重增加(％)隨時間的變化，(B)對葡萄糖(GT)的耐受性，(C)附睪脂肪組織(EWAT)的重(量)，和(D)皮下脂肪組織(SCWAT)的重(量)。數(shù)據(jù)被表示為平均值(每組10至15只小鼠)±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。^**p<0.01；^***p<0.001。^*對應(yīng)于在相同介入性治療下，富含脂肪的飲食(HFD)與對照飲食(LFD)之間的對比(飲食效果的測量)。

圖2示出了小鼠中，在超重以及然后的肥胖發(fā)展過程中，混合物(Mix)對以下方面的作用：(A)體重增加(％)隨時間的變化，(B)食物的累積攝入(克/天/小鼠)，(C)對胰島素的耐受性(IT)，和(D)GT。數(shù)據(jù)被表示為平均值(每組5至14只小鼠)±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。^**p<0.01；^***p<0.001；^#p<0.05；^##p>0.01；^###p<0.001。^*對應(yīng)于在相同介入性治療下，HFD飲食與LFD飲食之間的對比(飲食效果的測量)。^#對應(yīng)于在相同的飲食下，Mix與磷酸鹽緩沖液(PBS)之間的對比(根據(jù)本發(fā)明的益生菌或益生菌的混合物的效果的測量)。

圖3示出了小鼠中，在超重以及然后的肥胖發(fā)展過程中，混合物(Mix)對以下方面的作用：(A)EWAT的重量(量)，(B)SCWAT的重量(量)，(C)血液中的瘦素的量(ng/ml)，(D)血液中的脂聯(lián)素的量(μg/ml)，(E)EWAT的組織學(xué)(各實(shí)驗(yàn)組的代表性切片)，和(F)EWAT中的脂肪細(xì)胞的大小分布。數(shù)據(jù)被表示為平均值(每組10至15只小鼠)±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。^**p<0.01；^***p<0.001；^#p<0.05；^##p<0.01；^###p<0.001。^*對應(yīng)于在相同介入性治療下，HFD飲食與LFD飲食之間的對比(飲食效果的測量)。^#對應(yīng)于在相同的飲食下，Mix與PBS之間的對比(根據(jù)本發(fā)明的益生菌或益生菌的混合物的效果的測量)。

圖4示出了小鼠中，在超重以及然后的肥胖發(fā)展過程中，混合物(Mix)對以下方面的作用：(A)EWAT的細(xì)胞組成(分析單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的特定基因(F4/80、CD68、CD11b、CD11c)的表達(dá)，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞(FoxP3)和趨化因子MCP-1)，(B)巨噬細(xì)胞在EWAT中的存在(對F4/80特異性的免疫熒光標(biāo)記和按照積分密度[IntDen]進(jìn)行量化)，(C)EWAT的炎癥(分析促炎性細(xì)胞因子Tnfα、IL-1a、IL-6和IL-17的基因的表達(dá))，和(D)PPAR伽馬(PPARγ)在信使RNA(左，基因表達(dá))和蛋白(中左，Western印記和量化[任意單位：A.U.])水平的表達(dá)。數(shù)據(jù)被表示為平均值(每組5至14只小鼠)±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。^**p<0.01；^***p<0.001；^##p<0.01；^###p<0.001。^*對應(yīng)于在相同介入性治療下，HFD飲食與LFD飲食之間的對比(飲食效果的測量)。^#對應(yīng)于在相同的飲食下，Mix與PBS之間的對比(益生菌或益生菌的混合物的效果的測量)。

圖5示出了小鼠中，在超重以及然后的肥胖發(fā)展過程中，混合物(Mix)對以下方面的作用：(A)脂質(zhì)代謝中必需的因子(分析基因FABP1、APO CII和CD36的表達(dá))，(B)短鏈脂肪酸的受體(SCFA)，通過分析基因GPR41和GPR43的表達(dá))。數(shù)據(jù)被表示為平均值(每組5至14只小鼠)±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。^**p<0.01；^***p<0.001；^##p<0.01；^###p<0.001。^*對應(yīng)于在相同介入性治療下，HFD(高脂肪飲食)與LFD(低脂肪飲食)之間的對比(飲食效果的測量)。^#對應(yīng)于在相同的飲食下，Mix與PBS之間的對比(益生菌或益生菌的混合物的效果的測量)。

圖5(C)示出了在體外模擬腸道生態(tài)系統(tǒng)的模型(SHIME)中，在與益生菌混合物Mix孵育24h和48h之后，總SCFA的產(chǎn)生水平(左)，以及乙酸鹽、丁酸鹽和丙酸鹽的成比例的水平。^***與時間0相比。

圖6示出了小鼠中，在超重和肥胖發(fā)展過程中，混合物(Mix)對(A)腸道微生物區(qū)的組合物，尤其是對雙歧桿菌(Bifidobacteria)和阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)的種群的作用。(B)通過TGGE對5只小鼠(代表HFD-PBS組和HFD-Mix組)進(jìn)行分析，確定在經(jīng)Mix或未經(jīng)Mix治療的HFD小鼠中，檢測到的雙歧桿菌(Bifidobacterium)物種。標(biāo)記物M1或M2對應(yīng)于所指示菌株的混合物。^*p<0.05；^**p<0.01；^#p<0.05；^##p<0.01。^*對應(yīng)于使用相同介入性治療，HFD飲食與LFD飲食之間的對比(飲食效果的測量)。^#對應(yīng)于在相同的飲食下，Mix與PBS之間的對比(根據(jù)本發(fā)明的益生菌或益生菌的混合物的效果的測量)。

圖7示出了小鼠中，在超重以及然后的肥胖發(fā)展過程中，混合物(Mix)對以下方面的作用：(A)胰腺、肝臟和脾臟的重量(量)，(B)脂滴的堆積(脂肪變性，參見代表各實(shí)驗(yàn)組的組織切片)，和(C)炎癥或在脂質(zhì)代謝暗含的或應(yīng)答于胰島素的不同的標(biāo)記物(分析基因mcp-1、IL-6、TNFα、IL-10、IL-17、srebp-1c、APOCII Fabp1和IRS2的表達(dá))。數(shù)據(jù)被表示為平均值(每組5至14只小鼠)±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。^**p<0.01；^***p<0.001；^##p<0.01；^###p<0.001；^####p>0.0001。^*對應(yīng)于使用相同介入性治療，HFD飲食與LFD飲食之間的對比(飲食效果的測量)。^#對應(yīng)于在相同的飲食下，Mix與PBS之間的對比(根據(jù)本發(fā)明的益生菌或益生菌的混合物的效果的測量)。

圖8a和圖8b示出了根據(jù)本發(fā)明的益生菌動物雙歧桿菌亞種乳酸菌(Bifidobacterium animalis ssp.Lactis)編號LMG P-28149隨時間對體重增加的影響，這取決于該益生菌是否在根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)(圖8a)或不在根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)(圖8b)。LFD＝低脂肪飲食；HFD＝高脂肪飲食；HFD B.lactis＝當(dāng)該益生菌在谷胱甘肽(圖8a)的存在下或沒有谷胱甘肽(圖b)的情況下進(jìn)行培養(yǎng)時，與攝取根據(jù)本發(fā)明的組合物相關(guān)的高脂肪飲食。

具體實(shí)施方式

觀察了下面的程序，用于收集在下面的實(shí)施例1～4中所討論的體內(nèi)結(jié)果。

體內(nèi)程序

小鼠、細(xì)菌菌株和飲食

在實(shí)驗(yàn)開始時，對5周齡雄性小鼠C57BL/6J進(jìn)行測試。

唾液乳桿菌(Lactobacillus L.salivarius)Ls33菌株由丹尼斯克(Danisco)(Madison,WI,USA)提供。

益生菌的混合物(在下面的實(shí)施例中被稱為Mix)包括CFU(菌落形成單位)比率為1:1(總10⁹CFU)的兩種不同的菌株：鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)LMG S-28148的菌株和動物雙歧桿菌亞種乳酸菌(Bifidobacterium animalis ssp.Lactis)編號LMG P-28149的菌株。給予小鼠的飲食被分成具有低脂肪含量的第一飲食(LFD:D12450B；脂肪含10％kcal)和具有高脂肪水平的第二飲食(HFD:D12492，脂肪含60％kcal)。上述飲食由Research Diet公司提供。

動物的治療程序

每周連續(xù)持續(xù)5天，每只小鼠經(jīng)口給予：在無菌水(H₂O)中的30μL Ls33-10⁹CFU(菌落形成單位或在口服組合物中存在的菌落形成單位的數(shù)目)(Ls33-H₂O組)；無菌水(H₂O組)；或，在磷酸鹽緩沖液(PBS)中的益生菌的混合物(混合物組；5×10⁸CFU/菌株)(混合物-PBS組或PBS組)。

在治療一周之后，向經(jīng)Ls33、水、混合物或PBS治療的小鼠隨機(jī)分配LFD飲食(n＝5/組)或HFD飲食(n＝15/組)。每周記錄體重和食物攝取。

當(dāng)處死動物時，收集血液、附睪白色脂肪組織(EWAT)和皮下白色脂肪組織(SCWAT)、肝臟、脾臟、小腸和胰腺。

測試對胰島素和葡萄糖的耐受性

在分別進(jìn)行12周和14周飲食之后，進(jìn)行了葡萄糖耐受性(GTT)測試和胰島素耐受性(ITT)測試。對動物禁食6小時時段，然后接受腹膜內(nèi)(IP)給予葡萄糖(D-葡萄糖，1g/kg體重)(GTT)或胰島素(0.75UI/kg體重)(ITT)。在注射葡萄糖(GTT)或胰島素(ITT)之前，以及在注射了葡萄糖(GTT)或胰島素(ITT)之后的不同時間，使用市場上可購買到的自動血糖儀(例如 performa)對從尾巴采集的血液樣品，測量血液中的葡萄糖水平。

血液分析

使用市場上銷售的ELISA試劑盒，測量瘦素、脂聯(lián)素、MCP-1和胰島素的血漿水平。使用市場可購買到的分析試劑盒(例如由英國的Cambridge開發(fā)的Abcam試劑盒)，確定非酯化脂肪酸(NEFA)、甘油三酯、甘油、HDL膽固醇和LDL膽固醇的水平。

組織學(xué)分析和免疫組化分析

使肝臟和白色脂肪組織(EWAT)的樣品處于4％的對聚甲醛溶液中，然后包埋在石蠟中，最后進(jìn)行切片，并且放置在載玻片上，然后使用蘇木素-伊紅(H&E)進(jìn)行染色。使用成像程序Image J(NIH image,國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information))，進(jìn)行白色脂肪組織(EWAT)的形態(tài)學(xué)分析，其中每個切片至少10個視野(代表約100個脂肪細(xì)胞)。

分析基因的表達(dá)

(按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法)提取肝臟和腸的白色脂肪組織的總RNA，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(對于上述組織類別的每一種，使用1μg的量進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄)。按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，進(jìn)行定量實(shí)時PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))(RT-qPCR)。

統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)被表示為平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。使用克魯斯卡爾-沃利斯(Kruskal Wallis)檢驗(yàn)，然后使用惠曼(Mann-Whitney)U檢驗(yàn)，來進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。當(dāng)p值小于0.05時，實(shí)驗(yàn)組之間的差異被認(rèn)為在統(tǒng)計學(xué)上是顯著的

觀察了下面的程序，用于收集在實(shí)施例5和6中所討論的體外結(jié)果。

體外程序

人類微生物生態(tài)系統(tǒng)的模擬裝置–SHIME模型

按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的程序，將模擬人胃腸道的SHIME反應(yīng)器設(shè)置在適當(dāng)位置。

將Mix添加到反應(yīng)器中，并且在厭氧氣氛下，在37℃孵育t＝0、t＝24h和t＝48h的時間點(diǎn)，測量短鏈脂肪酸產(chǎn)物(SCFA)。

評價動物雙歧桿菌亞種乳酸菌(Bifidobacterium animalis ssp.Lactis)編號LMG P-28149菌株對人類血細(xì)胞的抗炎性效果

將從四位健康供體獲得的新鮮人類血液以1:1的比率稀釋在PBS-Ca(GIBCO)中，沉積在聚蔗糖(Ficoll)(GIBCO)層上，并且在20℃在400G下離心30分鐘。

在離心后，從血液中分離出外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，使用PBS-Ca懸浮在50ml的終體積中，然后在20℃在750G下離心10分鐘進(jìn)行沖洗，重復(fù)三次。然后，將PBMC重懸在補(bǔ)充有10％(v/v)滅活的小牛血清(在56℃孵育30分鐘的血清)、1％(w/v)L-谷氨酰胺(GIBCO)和慶大霉素(30μg/ml)(GIBCO)的RPMI培養(yǎng)基(GIBCO)中。對PBMC進(jìn)行計數(shù)，將它們的數(shù)目調(diào)節(jié)為2×10⁶細(xì)胞/ml。將制備物分配(1ml)在24孔培養(yǎng)板中。

實(shí)施例1：Ls33與混合物

本實(shí)施例示出了Ls33對小鼠的超重和肥胖發(fā)展的影響。

圖1示出了對于在Ls33或水和具有低脂肪水平(LFD)或高脂肪水平(HFD)的食物飲食中治療15周，以下指示：

(A)體重增加隨時間的變化，表示為相對于在d＝0天測量的體重的百分比；

(B)在飲食12周之后進(jìn)行的葡萄糖耐受性測試(GTT)。在6小時禁食時段之后、在圖上指示的時間t(分鐘)時、在腹膜內(nèi)注射(IP)葡萄糖之后(對應(yīng)于時間t＝0)，測量小鼠的葡萄糖水平(mg/dl)。

(C)在15周飲食(在處死過程中稱重)之后，附睪脂肪組織(EWAT)的重量(量)(g)；

(D)在15周飲食(在處死過程中稱重)之后，皮下脂肪組織(SCWAT)的重量(量)(g)。

如該圖所顯示的結(jié)果，盡管在其它病理學(xué)模型中(即腸炎)證明了菌株Ls33具有體外抗炎性活性，但菌株Ls33沒有示出對各指示A至D的任何(陽性或陰性)效果。

相反地，給予混合物Mix示出顯著的保護(hù)效果。這些結(jié)果示于圖2中。

該圖示出在使用益生菌混合物(Mix)或PBS治療，并且食用低脂肪水平(LFD)或高脂肪水平(HFD)的飲食17周之后的對應(yīng)結(jié)果：

(A)體重增加隨時間的變化(表示為相對于在d＝0天測量的體重的百分比)；

(B)每只小鼠每天的累積食物攝入(g/天/小鼠)；

(C)在起始飲食后14周進(jìn)行胰島素耐受性測試(ITT)：在腹膜內(nèi)注射(IP)胰島素之后測量血液中的葡萄糖水平。結(jié)果示出標(biāo)準(zhǔn)化水平(相對于注射前測量的葡萄糖水平的％)±SEM，和在注射胰島素之后的各標(biāo)準(zhǔn)化葡萄糖水平的曲線下面積(AUC)的值的平均值±SEM；

(D)在飲食12周之后進(jìn)行的葡萄糖耐受性測試(GTT)。測量IP注射葡萄糖之后的小鼠中的葡萄糖水平(mg/dl)，并且計算AUC值。

與HFD-PBS組中獲得的體重增加(113.51％±4.89％的增加)相比，在HFD-Mix小鼠組中觀察到顯著性較小的體重增加(80.97％±4.96％的增加)(參見圖2A)。

如圖2B所示，經(jīng)益生菌混合物Mix治療的HFD組的小鼠具有降低的累積食物攝入(食物攝入，F(xiàn)I)。有趣的是，對于體重增加和FI指數(shù)所觀察到的有益效果在起始治療之后(從第四周)快速顯現(xiàn)出來。

如下面表1中較少的葡萄糖和胰島素水平所示，給予Mix混合物改善了HFD組的葡萄糖的內(nèi)穩(wěn)態(tài)：

表1

該表的數(shù)據(jù)表示為平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)(對應(yīng)于每組5至14只小鼠)。^*p<0.05；^***p<0.001；^#p<0.05；^##p<0.01；^###p<0.001。^*對應(yīng)于在相同介入性治療下，HFD飲食與LFD飲食之間的對比(飲食效果的測量)。^#對應(yīng)于在相同的飲食下，Mix與PBS之間的對比(益生菌或益生菌的混合物的效果的測量)。

此外，如表1所示，如果Mix的效果維持局限于NEFA、甘油和甘油三酯的水平，則當(dāng)它與總膽固醇水平的減少和HDL膽固醇減少相關(guān)時，證明了Mix具有降膽固醇作用。

進(jìn)一步地，如通過胰島素耐受性測試的結(jié)果所證明的(參見圖2C)，與對照組相比，HOMA-IR指數(shù)((禁食胰島素/禁食葡萄糖水平)/22.5的水平)在HDF-Mix組的小鼠中顯著降低(32.04±5.86比81.57±19.63；p<0.01)，這表明胰島素敏感性得到改善。

另外，經(jīng)Mix治療的小鼠對葡萄糖注射的耐受性更低(參見圖2D)。

實(shí)施例2：Mix對白色脂肪組織的炎癥的作用

圖3示出了Mix對以下方面的效果：

(A)EWAT的重量(量)(g)；

(B)SCWAT的重量(量)(g)；

(C)如在提前禁食6小時的小鼠的血清中通過ELISA法(酶聯(lián)免疫檢驗(yàn)法)測量的，血液中的瘦素的量(ng/ml)；

(D)如在提前禁食6小時的小鼠的血清中通過ELISA法測量的，血液中的脂聯(lián)素的量(μg/ml)；

(E)附睪白色脂肪組織的組織學(xué)(呈現(xiàn)了代表各實(shí)驗(yàn)組的經(jīng)蘇木精和伊紅染色的切片)。比例尺為100μm。黑色箭頭指示細(xì)胞浸潤的存在；和

(F)EWAT中的脂肪細(xì)胞的大小分布。結(jié)果以每一大小等級的脂肪細(xì)胞的％表示(0～20μm，20～40等)。同時，圖7示出Mix對以下方面的作用：

(A)胰腺、肝臟和脾臟的重量(量)(g)；

(B)肝臟(呈現(xiàn)了代表各實(shí)驗(yàn)組的經(jīng)H&E染色的切片)中的脂滴的堆積(即脂肪變性)。比例尺為100μm；和

(C)肝臟中，編碼促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子，以及參與脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝的受體的基因的表達(dá)。

與對照組HFD相比，HFD-Mix組的EWAT和SCWAT的脂肪量明顯降低(參見圖3A和圖3B)。

另外，在HFD-Mix組的個體中，還觀察到胰腺、肝臟和脾臟的重量(量)的明顯降低(參見圖7A)。

進(jìn)一步地，盡管受控的HFD組小鼠發(fā)展成肝脂肪變性，但給予益生菌混合物Mix可以限制組織中的脂滴的存在(參見圖7B)。

與白色脂肪組織質(zhì)量的減少一致，證明血液瘦素水平顯著低于HFD-Mix組中的血液瘦素水平(參見圖3C)，同時脂聯(lián)素水平趨于較高(參見圖3D)。

附睪脂肪組織的組織學(xué)示出，在HFD-Mix組的小鼠中具有較高密度的小脂肪細(xì)胞(參見圖3E和圖3F)。

應(yīng)注意，如果在對照組的小鼠中，圍繞脂肪細(xì)胞的細(xì)胞(由圖3E中的箭頭所示)明顯浸潤到脂肪組織中，則在接受了益生菌Mix的組的小鼠中采集的組織樣品標(biāo)記的這種浸潤較少。

在肥胖發(fā)展過程中，巨噬細(xì)胞被招募到白色脂肪組織中，同時調(diào)節(jié)T細(xì)胞FoxP3⁺CD4⁺離開這些組織。

圖4示出了在超重小鼠中，Mix對脂肪組織的炎癥的作用。

如圖4A所示，與對照組LFD相比，幾種單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記物(F4/80、Cd68、Cd11b和Cd11c)的表達(dá)水平在HFD組小鼠中升高，同時與標(biāo)記物Foxp3相關(guān)的水平降低。

給予益生菌混合物Mix顯著降低了由HFD飲食誘導(dǎo)的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)，并且使標(biāo)記物Foxp3的表達(dá)水平升高。

Mix混合物，即根據(jù)本發(fā)明的益生菌菌株對巨噬細(xì)胞被招募到脂肪組織中的影響得到了圖4B所示的結(jié)果的支持。

如Il6、Tnfα、Il-1α和Il-17的特異性信使RNA的表達(dá)水平降低(參見圖4C)所證明的，根據(jù)巨噬細(xì)胞的招募降低，同時抗炎性Treg淋巴細(xì)胞積累增加，本實(shí)施例示出經(jīng)Mix混合物治療的小鼠中，附睪脂肪組織具有比對照組織低的炎性水平。

進(jìn)一步地，示出了基于Mix混合物的治療限制了HFD飲食誘導(dǎo)的PPARγ(在信使RNA水平和蛋白水平上)的降低(參見圖4D)。

實(shí)施例3：Mix對小腸的脂質(zhì)代謝和短鏈脂肪酸(SCFA)的產(chǎn)生的作用

本實(shí)施例中示出，負(fù)責(zé)短鏈脂肪酸(Short-Chain Fatty Acid,SCFA)運(yùn)輸?shù)幕?GPR41和GPR43)的表達(dá)水平在進(jìn)行HFD飲食的小鼠的小腸中降低，這表明在HFD組中，當(dāng)后者較少被檢出時，SCFA能夠在較小程度上起積極作用，同時基因(GPR41和GPR43)在HFD飲食下在經(jīng)Mix混合物治療的動物中顯著增加(參見圖5B)

反過來，給予Mix具有限制在脂肪食物飲食誘導(dǎo)的脂質(zhì)代謝中必需的基因增加的效果(參見圖5A)。

實(shí)施例4：Mix對微生物區(qū)和阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)的集落水平的作用

通過定量PCR(qPCR)對來自小鼠盲腸內(nèi)容物的微生物區(qū)的特定細(xì)菌進(jìn)行分析，其中小鼠在給予或沒有給予Mix的同時食用HFD飲食，在另一方面小鼠在給予或沒有給予Mix的同時食用LFD飲食。

圖6中示出的結(jié)果示出了HFD-Mix小鼠的微生物區(qū)的組成的變化，特別是在食用HFD飲食且經(jīng)根據(jù)本發(fā)明的益生菌菌株或益生菌混合物治療的小鼠中阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)集落的恢復(fù)。

實(shí)施例5：Mix對SFCA的產(chǎn)生的作用；SHIME模型的使用

在本實(shí)施例中，使用了體外模擬腸道的動態(tài)模型，旨于再現(xiàn)人類腸道的微生物生態(tài)系統(tǒng)。

如該模擬的結(jié)果所示(參見圖5C)，使用益生菌動物雙歧桿菌亞種乳酸菌(Bifidobacterium animalis ssp.Lactis)編號LMG P-28149菌株能在接種后48h時段內(nèi)增加SFCA的產(chǎn)生，促進(jìn)腸道中丁酸鹽和丙酸鹽的產(chǎn)生，其中丁酸鹽和丙酸鹽在人類中促進(jìn)由營養(yǎng)物攝取所誘導(dǎo)的飽足的兩種代謝物。在表2中重復(fù)了，在根據(jù)本發(fā)明的Mix混合物孵育之前(T0)和之后(T24h和T48h)，與SHIME反應(yīng)器相關(guān)聯(lián)的升結(jié)腸中產(chǎn)生的丁酸鹽和丙酸鹽水平。這些數(shù)據(jù)表示為mmol/L±SED。

表2

證明在動物雙歧桿菌亞種乳酸菌(Bifidobacterium animalis ssp.Lactis)編號LMG P-28149菌株的培養(yǎng)基中的谷胱甘肽的重要性

圖8a和圖8b示出了根據(jù)本發(fā)明的益生菌動物雙歧桿菌亞種乳酸菌(Bifidobacterium animalis ssp.Lactis)編號LMG P-28149隨時間對體重增加的影響，這取決于上述益生菌是否培養(yǎng)在(圖8a)或沒有培養(yǎng)在(圖8b)根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基中。

如通過對比圖8a和圖8b所看到的，更具體地如通過HFD B.lactis曲線所看到的，當(dāng)富含脂肪的食物飲食與攝入根據(jù)本發(fā)明的組合物相關(guān)聯(lián)時，其中通過在含谷胱甘肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)來獲得益生菌動物雙歧桿菌亞種乳酸菌(Bifidobacterium animalis ssp.Lactis)編號LMG P-28149，觀察到體重增加隨時間顯著降低(圖8a)；而當(dāng)給予根據(jù)本發(fā)明的組合物，其中根據(jù)本發(fā)明的組合物包括在不含谷胱甘肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得的益生菌，則不是這種情況(圖8b)。

很容易理解，本發(fā)明并不收到上述實(shí)施方式的限制，可以在不偏離所附權(quán)利要求的范圍的情況下，對其進(jìn)行很多改變。

縮寫詞列表

SCFA：短鏈脂肪酸

EWAT：附睪白色脂肪組織

GT(T)：葡萄糖耐受性(測試)

HDL：高密度脂質(zhì)

H&E：蘇木精和伊紅

HFD：富含脂肪的飲食

BMI：體重指數(shù)

(HOMA)-IR：用于估計胰島素抗性的(穩(wěn)態(tài)模型)

IT(T)：胰島素耐受性(測試)

(V)LDL：(極)低密度脂質(zhì)

LFD：低脂肪飲食

NEFA：非酯化脂肪酸

PBS：磷酸鹽緩沖液

PBMC：外周血單個核細(xì)胞

SCWAT：皮下白色脂肪組織

SEM：平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差

SHIME：人腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)的模擬裝置

WAT：白色脂肪組織

PCT/RO/134表