本發(fā)明涉及用于治療、預防或緩解代謝疾病的包含作為活性成分的來源于Akkermansia muciniphila的胞外囊泡的藥物組合物和食品組合物。

背景技術(shù)：

代謝疾病是由于體內(nèi)代謝紊亂而發(fā)生的疾病的總稱。代謝疾病通常是由碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素、電解質(zhì)、水等的失衡而引起的。代謝疾病的實例包括肥胖癥、糖尿病、高脂血癥、動脈硬化癥、高血壓等。其中，II型糖尿病是成年型發(fā)病糖尿病，其特征是胰島素耐受性增加。當胰島素受體數(shù)量下降時，胰島素受體敏感性下降，或者產(chǎn)生激活細胞內(nèi)糖原生成的第二信使的問題，對胰島素的敏感性降低。因此，被稱為非胰島素依賴型糖尿病的II型糖尿病占糖尿病總數(shù)的85％至90％。

同時，近年來，已報導了原核細胞或真核細胞分泌胞外囊泡且分泌的囊泡實施多種功能。從細菌分泌的胞外囊泡已知包含脂多糖(LPS)和細菌來源的蛋白質(zhì)，且誘發(fā)炎性疾病。然而，抑制由病原菌來源的囊泡引起的局部炎癥反應的機制仍然是未知的。

此外，已報導了在多種分泌的物質(zhì)、排泄物或來自人類或動物的組織灌洗液中發(fā)現(xiàn)了胞外囊泡，且存在于組織中的胞外囊泡已知反映了分泌所述囊泡的所述組織的狀態(tài)，并能用于診斷疾病。

在大腸中，腸道菌群存在的數(shù)量是宿主細胞數(shù)量的大約10倍。Akkermansia muciniphila已知為生存于共生的哺乳動物(包括人類)大腸中的粘蛋白-降解革蘭氏陰性菌，并且與糖尿病和肥胖癥有關(guān)。而且，已知Akkermansia muciniphila本身惡化炎癥性腸病。近年來，本發(fā)明人已報導了Akkermansia muciniphila分泌胞外囊泡，其能預防炎癥性腸病(Kang CS et al.,Extracellular vesicles derived from Gut microbiota,especially Akkermansia muciniphila,protect the progression of dextran sulfate sodium-induced colitis；PLOS ONE 2013)。

同時，5'AMP-激活的蛋白激酶(AMPK)是在細胞內(nèi)能量平衡中起重要作用的酶，并在肝、腦、肌肉、脂肪組織、胰腺等中表達。已知在激活AMPK時，在肝中的膽固醇合成和甘油三酯合成受到抑制，在肌肉中的脂肪酸氧化和葡萄糖攝取受到刺激，以及胰腺中的胰島素分泌得到調(diào)控。而且，已知代謝疾病通過二甲雙胍激活AMPK或者通過運動等而得到改善以使胰島素耐受恢復，二甲雙胍是一種用于糖尿病的治療劑。

然而，沒有研究發(fā)現(xiàn)表明可通過Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡或者通過Akkermansia muciniphila本身緩解或治療諸如肥胖癥或糖尿病等的代謝疾病。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

[技術(shù)問題]

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)從Akkermansia muciniphila分泌的胞外囊泡抑制由高脂肪飲食引起的肥胖癥和糖尿病，并使胰島素耐受恢復，其對于由高脂肪飲食誘導的糖尿病的發(fā)病原因是重要的，所有這些均發(fā)生在AMPK被激活之時。因此，本發(fā)明是基于這樣的事實完成的。

因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種使用Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡治療或預防諸如肥胖癥、糖尿病、高脂血癥、高血壓等之類的代謝疾病的藥物組合物和食品組合物。

[技術(shù)方案]

為實現(xiàn)這樣的目的，本發(fā)明提供一種用于治療或預防代謝疾病的包含作為活性成分的Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡的藥物組合物。

此外，本發(fā)明提供一種用于預防或緩解代謝疾病的包含Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡的食品組合物。

此外，本發(fā)明提供用于預防或治療代謝疾病的方法，其包括向受試者施用Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡。

此外，本發(fā)明提供Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡用于預防或治療代謝疾病的用途。

在本發(fā)明的一實施方式中，所述胞外囊泡可天然或人工地從Akkermansia muciniphila分泌得到。

在本發(fā)明的另一實施方式中，所述胞外囊泡可具有的平均直徑為20-300nm，優(yōu)選50-200nm。

還在本發(fā)明的另一實施方式中，所述代謝疾病可選自肥胖癥、糖尿病、高脂血癥和高血壓。

還在本發(fā)明的另一實施方式中，所述食品可以是通過添加Akkermansia muciniphila進行發(fā)酵制備得到的發(fā)酵食品。

[有益效果]

根據(jù)本發(fā)明的包含作為活性成分的Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡的藥物組合物可治療和預防由高脂肪飲食誘導的諸如肥胖癥、糖尿病、高脂血癥、高血壓等的代謝病。

此外，根據(jù)本發(fā)明的包含Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡的發(fā)酵食品組合物可預防和緩解由高脂肪飲食誘導的諸如肥胖癥、糖尿病、高脂血癥、高血壓等的代謝病。

附圖說明

圖1舉例說明了通過電子顯微鏡觀察從Akkermansia muciniphila的培養(yǎng)基分離得到的胞外囊泡得到的結(jié)果。

圖2舉例說明了通過光散射方法測量Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡的平均直徑所得到的結(jié)果。

圖3舉例說明了通過SDS-PAGE比較和評價Akkermansia muciniphila和Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡的蛋白表達模式所得到的結(jié)果。

圖4舉例說明了表明以下的結(jié)果：在巨噬細胞經(jīng)Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡(EV)預處理時，LPS引起的促炎性細胞因子(IL-6)的分泌受到抑制。

圖5舉例說明了一種實驗方案，其用于確認在Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡(EV)被直接給藥至由高脂肪飲食誘發(fā)的肥胖和糖尿病的小鼠模型的胃部之后對代謝疾病的治療效果。

圖6舉例說明了通過觀察在Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡(Akk EV)被直接給藥至由高脂肪飲食誘發(fā)的代謝疾病小鼠模型的胃部之后體重的變化所得到的結(jié)果。

圖7舉例說明了通過測量在Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡(Akk EV)被直接給藥至由高脂肪飲食誘發(fā)的代謝疾病小鼠模型的胃部之后在禁食時血漿葡萄糖水平所得到的結(jié)果。

圖8舉例說明了通過測量在Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡(Akk EV)被直接給藥至由高脂肪飲食誘發(fā)的代謝疾病小鼠模型的胃部之后在血液中胰島素的濃度所得到的結(jié)果。

圖9舉例說明了通過測量在Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡(Akk EV)被直接給藥至由高脂肪飲食誘發(fā)的代謝疾病小鼠模型的胃部之后從所述軀體分離脾細胞然后用抗-CD3抗體和抗-CN28抗體刺激48小時所得到的上清液中IFN-γ和IL-17的濃度所得到的結(jié)果。

圖10舉例說明了通過確認在小鼠肌細胞經(jīng)高脂肪酸處理以誘發(fā)胰島素耐受之后受抑制的胰島素信號轉(zhuǎn)導是否被Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡(Akk EV)恢復而得到的結(jié)果。

圖11舉例說明了通過比較和評價在Akkermansia muciniphila(細菌)和Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡(EV)的每一種被直接給藥至小鼠的胃部之后Akkermansia muciniphila(細菌)和Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡(EV)的體內(nèi)分布模式而得到的結(jié)果。

圖12舉例說明了通過在Akkermansia muciniphila(細菌)和Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡(EV)的每一種被直接給藥至小鼠的胃部之后12小時提取血液和多種器官(例如心臟、肺、肝、腎、脾、脂肪組織和肌肉)，比較和評價Akkermansia muciniphila(細菌)和Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡(EV)的體內(nèi)分布模式所得到的結(jié)果。

圖13舉例說明了通過比較和評價在Akkermansia muciniphila(細菌)和Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡(EV)的每一種被直接給藥至小鼠的大腸之后Akkermansia muciniphila(細菌)和Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡(EV)是否透過腸道屏障然后被吸收入組織而得到的結(jié)果。

圖14舉例說明了通過確認在Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡(EV)被直接給藥至小鼠的大腸之后胞外囊泡是否被吸收入腸道毛細血管所得到的結(jié)果。

圖15舉例說明了通過確認在體外Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡(EV)被以不同的濃度(0.1、1和10μg/mL)給藥至肌細胞之后60分鐘AMPK激活而得到的結(jié)果。

圖16舉例說明了通過確認在體外Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡(EV)被以1μg的劑量給藥至肌細胞之后在不同時間點(10、20、30和60分鐘)AMPK激活而得到的結(jié)果。

圖17舉例說明了通過確認在體外二甲雙胍(一種AMPK信號抑制劑(化合物C))和大腸桿菌來源的胞外囊泡被分別給藥至肌細胞之后AMPK激活而得到的結(jié)果。

圖18舉例說明了通過比較和評價在體外胰島素、二甲雙胍和Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡(EV)被分別給藥至肌細胞之后葡萄糖攝取的程度而得到的結(jié)果。

圖19舉例說明了通過比較和評價在體外胰島素、二甲雙胍和Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡(EV)被分別給藥至肌細胞之后GLUT4轉(zhuǎn)運子(一種針對葡萄糖攝取的受體)的表達程度而得到的結(jié)果。

圖20舉例說明了通過確認在體外Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡(EV)被給藥至肌細胞之后AMPK信號抑制劑(化合物C)對葡萄糖攝取的作用所得到的結(jié)果。

具體實施方式

本發(fā)明涉及一種用于治療、預防或緩解代謝疾病的包含作為活性成分的來源于腸道細菌(尤其是Akkermansia muciniphila)的胞外囊泡的藥物/食品組合物。

本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)在Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡(EV)被給藥至由高脂肪飲食誘發(fā)的代謝疾病小鼠模型的胃部時，肥胖癥被抑制，由脂肪酸誘發(fā)的胰島素耐受被恢復，糖尿病表型被抑制，以及免疫功能得到增強。

此外，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)Akkermansia muciniphila本身和Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡的蛋白質(zhì)表達模式彼此不同。

此外，通過將Akkermansia muciniphila本身和Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡的體內(nèi)吸收模式比較得到的結(jié)果，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)胞外囊泡的體內(nèi)吸收是顯著優(yōu)異的。

此外，本發(fā)明已發(fā)現(xiàn)在Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡被給藥至肌細胞時，通過AMPK激活促進肌細胞中葡萄糖攝取受體(GLUT4)的表達，從而增加了葡萄糖攝取。

在本說明書中，“代謝疾病”是指由于體內(nèi)代謝紊亂而發(fā)生的疾病的總稱。代謝疾病通常是由碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素、電解質(zhì)、水等的失衡而引起的。代謝疾病的代表性實例包括肥胖癥、糖尿病、高脂血癥、動脈硬化癥等，所有這些疾病均由高脂肪飲食引起。

在本說明書中，“治療或預防代謝疾病”包括減輕和緩解代謝疾病，以及改善癥狀，以及還包括降低獲得代謝疾病的可能性。

在本說明書中，“Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡”可以從Akkermansia muciniphila的培養(yǎng)基或用Akkermansia muciniphila發(fā)酵的食物分離得到。只要包含胞外囊泡，并不特別限制用于從Akkermansia muciniphila的培養(yǎng)基或用Akkermansia muciniphila發(fā)酵的食物分離胞外囊泡的方法。例如，可使用以下方法從細菌培養(yǎng)基或發(fā)酵的食物分離胞外囊泡：例如離心法，超離心法，用過濾器過濾，凝膠過濾色譜法，自由流電泳，毛細管電泳，使用聚合物分離，或這些方法的組合。此外，還可包括例如用于移除雜質(zhì)的洗滌和濃縮所得到的的胞外囊泡之類的方法。

所述胞外囊泡包括天然或人工分泌的胞外囊泡。

通過所述方法分離得到的胞外囊泡可具有的平均直徑為20-300nm，優(yōu)選30-200nm。

在本發(fā)明的一實施方式中，用于治療或預防代謝疾病的所述組合物可被制備成藥物組合物。為了使用所述組合物用于治療和預防，雖然可以將根據(jù)本發(fā)明的胞外囊泡本身給藥，但是優(yōu)選的是所述藥物組合物包含所述胞外囊泡作為活性成分。

所述藥物組合物包含所述經(jīng)分離的胞外囊泡作為活性成分且可包含藥學上可接受的載體。可通常在制劑中使用的藥學上可接受的載體包括生理鹽水、無菌水、林格氏溶液、緩沖鹽水、環(huán)糊精、葡萄糖溶液、麥芽糊精溶液、甘油、乙醇、脂質(zhì)體等，但是本發(fā)明不限于此。必要時，可進一步包括其它傳統(tǒng)添加劑，例如抗氧化劑、緩沖劑等。而且，可進一步添加稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘合劑、潤滑劑等以將所述組合物制備成例如水溶液劑、懸浮劑、乳劑之類的可注射制劑，丸劑，膠囊，顆粒劑或片劑。合適的藥學可接受的載體及其制備方法可優(yōu)選參閱在Remington的文獻(Remington's Pharmaceutical Science,Mack Publishing Company,Easton PA)中公開的根據(jù)一種組分的方法。雖然根據(jù)本發(fā)明的所述藥物組合物不局限于配方，但是可被制備成注射劑、吸入劑、外用皮膚藥等。

用于施用根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的方法并未特別受到限制，但是根據(jù)期望的方法，該方法可包括非經(jīng)腸給藥，例如靜脈給藥、皮下給藥、腹膜內(nèi)給藥、吸入給藥、經(jīng)皮施用或局部施用；或者口服給藥。

劑量范圍可根據(jù)患者的體重、年齡、性別和健康狀況、飲食、給藥的持續(xù)時間、給藥模式、排泄率、疾病的嚴重程度等而有所不同。每日使用的劑量是指足夠量的本發(fā)明的所述治療物質(zhì)，其被施用至需要治療的受試者，從而減輕疾病。所述治療物質(zhì)的有效劑量可根據(jù)具體的化合物、疾病的狀態(tài)和嚴重程度以及需要治療且可通常由熟練的從業(yè)者確定的受試者而有所不同。作為非限制性實例，根據(jù)本發(fā)明的所述組合物的用于人體的劑量可根據(jù)患者的年齡、體重和性別、給藥模式、健康狀況和疾病的嚴重程度而有所不同。在體重為70kg的成人患者的情況下，可通常以0.01至1000mg/天的劑量、優(yōu)選1至500mg/天的劑量施用所述組合物。在這種情況下，可在預定的時間間隔一天一次或若干次，進行分次給藥。

在本發(fā)明的實施方式中，用于預防或減輕代謝疾病的所述組合物可被制備成食品組合物。在根據(jù)本發(fā)明的所述組合物被制備成食品組合物時，所述食品組合物可包括所述胞外囊泡作為活性成分，以及還可包括通常在食品生產(chǎn)中添加的成分，例如，蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)、營養(yǎng)劑、調(diào)味劑和芳香劑。例如，當根據(jù)本發(fā)明的所述食品組合物被制備成飲料時，除了根據(jù)本發(fā)明的胞外囊泡之外還可進一步包括檸檬酸、高果糖玉米糖漿、糖、葡萄糖、醋酸、蘋果酸、果汁等。

當根據(jù)本發(fā)明的所述組合物被制備成食品組合物時，可使用經(jīng)發(fā)酵的食品本身，例如韓國泡菜。

在下文中，將描述本發(fā)明的示例性實施例，以促進理解本發(fā)明。然而，以下實施例應被認為僅是說明性的，且本發(fā)明的范圍不局限于所述實施例。

實施例1.從Akkermansia muciniphila的培養(yǎng)基分離胞外囊泡

在厭氧培養(yǎng)室中的高壓蒸汽處理的2L的腦心浸液培養(yǎng)基(BD237500)中培養(yǎng)Akkermansia muciniphila菌株(ATCC BAA-835)72小時，使得O.D值變成1.5，然后高速(10,000×g)離心培養(yǎng)基20分鐘，得到不含沉淀細菌細胞團塊的上清液。用0.45μm過濾器和0.22μm過濾器過濾所述上清液，從而得到使用所述QuixStand臺式系統(tǒng)濃縮約14倍的培養(yǎng)基。在4℃超速離心(150,000×g)所述培養(yǎng)基2小時以得到團塊，然后用無菌生理鹽水(PBS)溶解所述團塊，接著進行蛋白質(zhì)定量分析。

實施例2.胞外囊泡的特性分析

為了確認通過實施例1的方法獲得的所述物質(zhì)是Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡，通過JEM 1011電子顯微鏡(可商購自Jeol Ltd.,日本)觀察蛋白質(zhì)定量分析得到的50μg/ml的樣本。結(jié)果如圖1所示，可以看出Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡是球形的。

此外，為了確認使用動態(tài)光散射(DLS)方法從Akkermansia muciniphila分離得到的胞外囊泡的大小，通過Zetasizer Nano ZS(可商購自Malvern Instruments Ltd,UK)測定50μg/ml的樣本。結(jié)果如圖2所示，可以看出Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡的平均直徑為20-300nm。

此外，為了確認從Akkermansia muciniphila分離得到的胞外囊泡的蛋白質(zhì)表達模式，通過SDS-PAGE評價10μg/ml樣本。結(jié)果如圖3所示，可以看出Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡(EV)的蛋白質(zhì)表達模式不同于Akkermansia muciniphila(細菌)的蛋白質(zhì)表達模式。

此外，為了評價從Akkermansia muciniphila分離得到的胞外囊泡的抗炎效果，在巨噬細胞經(jīng)LPS(100ng/ml)處理之前已用胞外囊泡(1μg/ml)預處理之后，通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)評價分泌的促炎性細胞因子。結(jié)果如圖4所示，可以看出在所述巨噬細胞經(jīng)Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡預處理的情況下，LPS分泌的IL-6的量下降。

實施例3.Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡在由高脂肪飲食誘發(fā)的肥胖癥和糖尿病小鼠中的治療效果

為了確認在實施例1中獲得的Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡是否抑制由高脂肪飲食誘發(fā)的肥胖癥和糖尿病，進行如下實驗。

以10μg/小鼠的劑量、每隔兩天將在實施例1中得到的所述胞外囊泡施用至喂食2個月常規(guī)飲食(RD)的正常小鼠以及由于喂食2個月高脂肪飲食(HFD)而誘發(fā)的肥胖癥和糖尿病小鼠模型中的每一只，持續(xù)3周(參見圖5)。在這種情況下，使用一組僅喂食RD的小鼠以及一組喂食RD且施用胞外囊泡的小鼠作為陰性對照。

在通過測量在每隔兩天施用胞外囊泡時的體重得到的結(jié)果中，如圖6中所示，可以看出相比于僅喂食HFD的小鼠組(HFD)，喂食HFD且施用胞外囊泡的小鼠組(HFD_Akk EV)在3周內(nèi)體重并未增加。

此外，在通過測量在完成施用胞外囊泡之后禁食6小時時的血漿葡萄糖水平得到的結(jié)果中，如圖7所示，可以看出相比于僅喂食HFD小鼠組(HFD-Akk EV)，喂食HFD且施用胞外囊泡的小鼠組(HFD+Akk EV)的血漿葡萄糖水平降低。

此外，在通過測量在完成施用胞外囊泡之后24小時從小鼠心臟采集的血液中的胰島素濃度得到的結(jié)果中，如圖8所示，可以看出相比于僅喂食HFD的小鼠組(HFD-Akk EV)，喂食HFD且施用胞外囊泡的小鼠組(HFD+Akk EV)的胰島素濃度增加較多。

結(jié)果表明，Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡有效地治療由高脂肪飲食誘發(fā)的肥胖癥和糖尿病。

實施例4.免疫功能調(diào)節(jié)作用

為了確認在實施例1中獲得的Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡是否影響免疫功能，進行如下實驗。

在以與實施例3相同的方式完成施用胞外囊泡之后24小時從小鼠采集血液和脾臟。使用100μm和40μm細胞過濾器從采集自各小鼠組的脾臟組織提取免疫細胞。提取物經(jīng)離心(400×g)五分鐘，然后以5×10⁵細胞/孔將計數(shù)的細胞接種至細胞培養(yǎng)板。此后，分別以1μg/mL和0.5μg/mL的濃度將刺激T細胞的共刺激分子(細胞因子分泌)的抗-CD3和抗-CD28添加至所述板，然后培養(yǎng)細胞48小時。

為了確認在完成培養(yǎng)之后在各組中促炎性細胞因子的分泌差異，將從所述細胞培養(yǎng)板收集的各組的上清液離心(400×g)5分鐘，以除去存在上清液中的細胞，然后僅再次收集上清液。在通過ELISA確認收集的上清液中IFN-γ和IL-17的濃度得到的結(jié)果中，如圖9所示，可以看出雖然在僅喂食HFD的小鼠組(HFD-Akk EV)中IFN-γ和IL-17的濃度升高，但是在施用Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡的喂食HFD的小鼠組(HFD+AkkEV)中IFN-γ和IL-17的濃度降低。

諸如IFN-γ和IL-17之類的促炎性細胞因子的減少表明：由于肥胖癥和糖尿病與炎癥有關(guān)，因此其可能通過提高免疫功能治療肥胖癥和糖尿病。

實施例5.胰島素耐受對信號轉(zhuǎn)導抑制的影響

為了確認在實施例1中獲得的Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡是否使胰島素耐受恢復，進行如下實驗。

為了實施體外胰島素耐受，用1mM脂肪酸(棕櫚酸鈉，SIGMA)和4％牛血清白蛋白(BSA)處理小鼠-來源的肌細胞(C2C12,ATCCCRL-1772)的培養(yǎng)基48小時。此后，以1μg/ml的濃度將Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡添加至所述經(jīng)處理的培養(yǎng)基，培養(yǎng)6小時，然后用2nM胰島素處理，以確認細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導。

在通過蛋白免疫印跡法確認在未經(jīng)胰島素處理的組和經(jīng)胰島素處理的組之間用作為細胞內(nèi)胰島素信號轉(zhuǎn)導的重要指示物的磷酸化-胰島素受體底物-1(p-IRS-1)的量的差別得到的結(jié)果中，如圖10所示，可以看出在胞外囊泡處理的組中觀察到p-IRS-1，表明由胰島素耐受抑制的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導被恢復。

所示結(jié)果表明Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡可以起到恢復肌細胞中由高脂肪酸誘發(fā)的胰島素耐受，也就是恢復由胰島素抑制的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導。

實施例6.細菌和細菌-來源的胞外囊泡的體內(nèi)吸收、分布和排泄模式

為了比較和評價Akkermansia muciniphila和Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡是否通過消化道被全身吸收，進行如下實驗。

首先，PBS用作為對照組。用熒光標記的Akkermansia muciniphila和Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡的每一種被以50μg的劑量施用至小鼠消化道，然后經(jīng)過0分鐘、5分鐘、3小時、6小時和12小時之后采用熒光和和生物發(fā)光成像系統(tǒng)(體內(nèi)成像系統(tǒng)(IVIS))測定熒光。結(jié)果如圖11所示，可以看出所述細菌并未被全身吸收，而細菌-來源的胞外囊泡在施用后剛5分鐘被全身吸收，通過泌尿器官排泄(這是在施用后3小時從膀胱中的強熒光觀察到的)，并且甚至在施用后12小時仍存在軀體中。

此外，為了確認在Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡被全身吸收之后胞外囊泡透入各種器官的模式，在熒光標記的胞外囊泡已被以50μg的劑量施用至小鼠消化道之后12小時提取血液、心臟、肺、肝、腎、脾、脂肪組織和肌肉樣本。在通過IVIS觀察提取的組織樣本中的熒光得到的結(jié)果中，如圖12所示，可以看出在所述胞外囊泡已被施用至消化道之后12小時胞外囊泡分布于所有的血液和器官樣本中。但是未觀察到細菌本身的熒光。

此外，為了確認Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡是否透過腸道屏障，Akkermansia muciniphila細菌和Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡的每一種被以10μg的劑量施用至小鼠大腸10分鐘。在通過通過免疫組織化學(IHC)檢查所述經(jīng)分離的大腸得到的結(jié)果中，如圖13所示，可以看出所述細菌并未透過腸道屏障，而所述胞外囊泡透過腸道屏障以被吸收入所述組織。

此外，為了確認Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡是否透過腸道屏障以被吸收入腸道毛細血管，以10μg的劑量施用熒光標記的胞外囊泡至小鼠大腸。在通過實時成像方法觀察腸道毛細血管得到的結(jié)果中，如圖14中所示，可以看出所述胞外囊泡被吸收入血管以遷移入血管。

實施例7.在肌細胞中Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡對AMPK激活的影響

由于AMPK已知是在維持能量穩(wěn)態(tài)中起重要作用的蛋白質(zhì)，為了評價Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡通過AMPK激活對肌細胞中葡萄糖代謝的影響，進行如下實驗。

首先，為了基于濃度評價AMPK激活，其中在該種濃度下在體外進行采用Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡的處理，用0、0.1、1和10μg/ml濃度的胞外囊泡處理肌細胞1小時。在通過蛋白免疫印跡法測定用作為AMPK信號轉(zhuǎn)導中的重要指示物的磷酸化-5'AMP-活化蛋白激酶(pAMPK)和磷酸化-乙酰輔酶A羧化酶(pACC)的表達水平的差別得到的結(jié)果中，如圖15所示，根據(jù)處理的胞外囊泡的濃度，pAMPK和pACC的表達增加，因此，可以看出AMPK被激活，具體取決于胞外囊泡的濃度。

此外，為了評價針對體外采用Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡的處理隨時間推移的AMPK激活，用胞外囊泡以10μg/ml的濃度處理肌細胞0、10、20、30和60分鐘。在通過蛋白免疫印跡法測定在AMPK信號轉(zhuǎn)導中用作為重要指示物的pAMPK和pACC的表達模式得到的結(jié)果中，如圖16所示，可以看出所述pAMPK和pACC表達的增加起始于采用胞外囊泡處理之后10分鐘，并持續(xù)60分鐘。

同時，為了進一步比較并非來源于Akkermansia muciniphila而是來源于細菌的胞外囊泡對AMPK激活的影響，用大腸桿菌來源的胞外囊泡以10μg/ml的濃度處理肌細胞。在通過蛋白免疫印跡法測定在AMPK信號轉(zhuǎn)導中用作為重要指示物的pAMPK和pACC的表達水平得到的結(jié)果中，如圖17所示，可以看出pAMPK和pACC的表達水平顯著下降，證明了AMPK信號轉(zhuǎn)導受到抑制。另一方面，二甲雙胍(用于糖尿病的治療劑)增加所述AMPK信號轉(zhuǎn)導，化合物C(AMPK信號轉(zhuǎn)導抑制劑)減少AMPK信號轉(zhuǎn)導。

實施例8.Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡在肌細胞中對葡萄糖攝取的影響

為了評價Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡在肌細胞中對葡萄糖攝取的影響，用10μg/ml的Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡體外處理肌細胞1小時，并采用放射性同位素(2-[¹⁴C]脫氧葡萄糖)評價葡萄糖攝取。結(jié)果如圖18所示，可以看出，相比于陰性對照(未處理(NT))，Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡(EV)增加了在肌細胞中葡萄糖的攝取，其在一定程度上類似于在用胰島素(10nm)或二甲雙胍(50mM)處理肌細胞時葡萄糖攝取的增加。

此外，為了評價Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡對肌細胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT4轉(zhuǎn)運子)的表達的影響，使用10μg/ml的Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡體外處理肌細胞1小時，然后通過鄰苯二胺(OPD)法測定細胞膜中GLUT4表達的程度。結(jié)果如圖19所示，可以看出相比于陰性對照(未處理(NT))，通過Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡(EV)增加了所述GLUT4表達，這在一定程度上類似于在用胰島素(10nm)或二甲雙胍(50mM)處理肌細胞時GLUT4表達的增加。

此外，為了評價通過Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡增加的葡萄糖攝取是否被AMPK信號轉(zhuǎn)導所抑制，用化合物C(AMPK信號轉(zhuǎn)導抑制劑)預處理肌細胞，然后用10μg/ml的胞外囊泡處理1小時，接著使用放射性同位素(2-[¹⁴C]脫氧葡萄糖)評價所述葡萄糖攝取。結(jié)果如圖20所示，可以看出通過Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡增加的葡萄糖攝取被化合物C降低。這意味著通過Akkermansia muciniphila-來源的胞外囊泡的肌細胞中胰島素耐受的改善與AMPK信號轉(zhuǎn)導過程密切相關(guān)。

盡管在上文中已根據(jù)本發(fā)明的示例性實施方式描述了本發(fā)明，但是本領域技術(shù)人員應理解的是，在不背離所附權(quán)利要求書中描述的本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可進行各種修飾和變化。