本專利申請要求于2014年7月1日提交的美國臨時專利申請62/019,717的利益，所述美國臨時專利申請的內(nèi)容全文并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及包括多層和雙層酸保護性口服劑量制劑的飲食補充劑和藥物制劑，所述多層和雙層酸保護性口服劑量制劑包含益生菌并且作為單一的統(tǒng)一或內(nèi)聚劑型單位提供。內(nèi)聚劑型的每個個別酸保護層提供了不同的益生菌有效負(fù)荷、將益生菌靶向遞送至胃腸道中的特定區(qū)域的不同釋放概況、或不同的益生菌有效負(fù)荷和將不同益生菌靶向遞送至胃腸道中的特定區(qū)域的釋放概況兩者之一。
背景技術(shù)：
：常規(guī)益生菌劑型提供了用于其中攜帶的益生菌有效負(fù)荷的單一釋放模式或速率。各種益生菌制劑和制備此類制劑的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，均勻的控制釋放益生菌制劑公開于美國專利號8,540,980；8,007,777；7,150,623；和6,627,220中。這些專利的內(nèi)容特別指出且以引用的方式并入本公開內(nèi)容內(nèi)。具體地，美國專利號8,540,980和8,007,777涉及用于制備具有控制或持續(xù)釋放的各種均勻的單一劑型單位的各種益生菌預(yù)混合粉末。使用常規(guī)益生菌劑型尋求位于胃腸道的不同區(qū)域中的不同微生物的益生菌補充的利益的人和動物必須：(1)攝取各自對于每種特定微生物和胃腸道目的區(qū)域的靶向遞送特異性的多重劑型；或(2)服用提供不同微生物的均勻釋放的無效或較不有效的單一劑型。因此，本發(fā)明人已確定在某些情況下，均勻的單一單位劑型制劑包括各種益生菌的混合物或組合可導(dǎo)致益生菌有效負(fù)荷的無效和較不有效遞送。均勻的混合或組合的異質(zhì)益生菌有效負(fù)荷劑型可導(dǎo)致無效遞送，例如其中最適合于遞送至上胃腸道的某些微生物相反整個或部分遞送至下胃腸道；同時，最適合于遞送至下胃腸道的某些其他微生物可能整個或部分遞送至上胃腸道。存在提供不同益生菌的分開制劑和釋放的劑型單位的需要。此外，存在單一內(nèi)聚分層酸保護性劑型單位的需要，以提供適合于胃腸道的不同區(qū)域，例如上胃腸道和下胃腸道的益生菌的不同釋放速率和靶向遞送。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明人已首次開發(fā)了在不同層中包含不同益生菌的內(nèi)聚酸保護性口服劑量制劑和劑型，其中每個層具有相同或不同釋放速率。本發(fā)明的分層口服劑量制劑可實現(xiàn)不同益生菌對胃腸道中的不同區(qū)域，例如上胃腸道例如口、食道、胃、十二指腸、空腸和近端回腸，以及下胃腸道例如遠端回腸、結(jié)腸和肛門的靶向遞送，以達到最大效應(yīng)。本發(fā)明的制劑可用于實現(xiàn)對胃腸道內(nèi)的不同區(qū)域的立即、持續(xù)、控制、間歇、脈沖和/或靶向益生菌遞送，因此經(jīng)過立即、間歇、脈沖和/或持續(xù)或延長時間段中的任一遞送靶向益生菌的釋放。本發(fā)明的發(fā)明人已首次實現(xiàn)分開層中的不同酸保護性益生菌預(yù)混合粉末的組合且使分開層中的不同酸保護性益生菌預(yù)混合粉末的組合變成可能，以達到在單一的統(tǒng)一或內(nèi)聚酸保護性劑型單位中不同益生菌制劑的一起遞送。本發(fā)明的發(fā)明人還已首次實現(xiàn)分開層中的不同酸保護性益生菌預(yù)混合粉末的組合且使分開層中的不同酸保護性益生菌預(yù)混合粉末的組合變成可能，以達到在單一的統(tǒng)一或內(nèi)聚酸保護性劑型單位中具有不同釋放概況的不同益生菌制劑的一起遞送。酸保護制劑的每層可含有在屬、種、亞種和菌株水平中的一種或多種上可區(qū)分的不同益生菌或益生菌混合物。每層可表征為立即釋放或者具有不同水平的脈沖、持續(xù)、延長或控制釋放中的任何一種。每層可具有不同大小，或相對于其他層中的一個或多個包含更大部分的最終劑型。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的多層或雙層益生菌酸保護劑型之間的劑型單位粘合優(yōu)選通過在劑型的每層中包括相似或相同量的一種或多種相似或相同的賦形劑得到最佳化。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，某些制劑組分跨越各種層制劑共享。本發(fā)明的劑型是酸保護性的，但每層可包括不同水平的酸保護。不同水平的酸保護可有利于對于益生菌有效負(fù)荷的靶向遞送的層釋放概況的定制。本發(fā)明的優(yōu)選實施例不包括任何腸包衣。因為腸包衣不是實現(xiàn)本發(fā)明的利益所需的，所以本文描述的劑型避免與此類腸包衣的包括相關(guān)的進一步制造復(fù)雜性和費用。然而，本發(fā)明的制劑可包括腸包衣，但腸包衣不是必需的。本發(fā)明的制劑可用于保護益生菌不受胃的苛刻酸環(huán)境影響。本發(fā)明的制劑可經(jīng)由直接壓制形成為分層片劑或囊片，或相似劑型。本發(fā)明制劑的每層可包含在壓制前松散的粉末材料或混合物。在最終壓制后，本發(fā)明的實施例有利地形成對層分離抗性的單一分層內(nèi)聚非脆性劑型單位。本發(fā)明的每個制劑層可首先分開壓制，或預(yù)壓制，并且隨后再次與一個或多個另外層一起壓制?？商娲兀苿涌稍趩未螇褐浦幸黄饓褐?。不同的壓制或壓緊壓力可就壓制層中的每一個和/或整個制劑而言使用。此處描述的過程僅是例子，并且不構(gòu)成可用于制備本發(fā)明的過程的排他性列表。附圖說明圖1A、1B、1C和1D分別顯示了在暴露于酸后(USP2型儀器，pH2.5在37℃下，伴隨以50RPM設(shè)置的槳攪拌)，隨后為在中性溶液中的連續(xù)溶解，在零、三、六或九小時根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的雙層片劑的持續(xù)釋放評估圖像。圖2顯示了親水試劑對活的有益微生物從現(xiàn)有技術(shù)制劑控制釋放到小腸內(nèi)的作用，所述現(xiàn)有技術(shù)制劑可新近修飾且用于形成雙層劑型的一側(cè)。圖3顯示了電解質(zhì)試劑的添加對活的有益微生物從現(xiàn)有技術(shù)制劑控制釋放到小腸內(nèi)的作用，所述現(xiàn)有技術(shù)制劑可新近修飾且用于形成雙層劑型的一側(cè)。圖4顯示了pH和酶敏感試劑的添加對活的有益微生物從現(xiàn)有技術(shù)制劑控制釋放到小腸內(nèi)的作用，所述現(xiàn)有技術(shù)制劑可新近修飾且用于形成雙層劑型的一側(cè)。圖5顯示了活的有益微生物經(jīng)過延長持續(xù)時間從現(xiàn)有技術(shù)制劑控制釋放的能力，所述現(xiàn)有技術(shù)制劑可新近修飾且用于形成雙層劑型的一側(cè)。圖6顯示了對于下腸道特異性的有益微生物經(jīng)過12小時的延長持續(xù)時間從現(xiàn)有技術(shù)制劑的控制釋放，所述現(xiàn)有技術(shù)制劑可新近修飾且用于形成雙層劑型的一側(cè)。圖7顯示了用于控制本發(fā)明中的幾何可縮放性、片劑大小和形狀變化的能力，以及此類變化對活的有益微生物從現(xiàn)有技術(shù)制劑控制釋放到小腸內(nèi)的作用，所述現(xiàn)有技術(shù)制劑可新近修飾且用于形成雙層劑型的一側(cè)。圖8顯示了在壓片前使試劑干燥對活的有益微生物從現(xiàn)有技術(shù)制劑控制釋放到小腸內(nèi)的作用，所述現(xiàn)有技術(shù)制劑可新近修飾且用于形成雙層劑型的一側(cè)。圖9顯示了采用不同粘度的親水試劑的親水基質(zhì)對活的有益微生物從現(xiàn)有技術(shù)制劑控制釋放到小腸內(nèi)的作用，所述現(xiàn)有技術(shù)制劑可新近修飾且用于形成雙層劑型的一側(cè)。圖10顯示了生理學(xué)可接受的電解質(zhì)試劑對現(xiàn)有技術(shù)制劑的穩(wěn)定性的作用，所述現(xiàn)有技術(shù)制劑可新近修飾且用于形成雙層劑型的一側(cè)。具體實施方式1.制劑組分本發(fā)明的益生菌包括例如且不限于乳桿菌屬(Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、乳球菌屬(Lactococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、擬桿菌屬(Bacterioides)的成員或發(fā)現(xiàn)具有益生效應(yīng)的的其他生物，或者此類生物的一部分、片段、組分、蛋白質(zhì)或副產(chǎn)物。具體地，動物雙歧桿菌乳亞種(Bifidobacteriumanimalissubspecieslactis)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)、短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacteriuminfantis)、長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)(例如由供應(yīng)商項目代碼1217794和1244824制造，商標(biāo)名稱BI-05100B1KG、BI-05100B20KG，益生菌活菌計數(shù)≥1.0E+11CFU/g；長雙歧桿菌B1-05SD-5588)、耐久腸球菌(Enterococcusdurans)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)、干酪乳桿菌干酪亞種(Lactobacilluscaseisubspeciescasei)、干酪乳桿菌鼠李糖亞種(Lactobacilluscaseisubspeciesrhamnosus)、清酒乳桿菌(Lactobacillussakei)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)(例如由制造，益生菌活菌計數(shù)≥5.0E+10CFU/g，包括非GMO源材料包括SD-5847)、加氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)、瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)、唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)、乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcuslactissubspecieslactis)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、布拉酵母(Saccharomycesboulardii)和各種經(jīng)修飾的土壤生物的培養(yǎng)物。本發(fā)明的益生菌可包括在自然界中未發(fā)現(xiàn)的微生物或在其他方面改變以包括外來遺傳材料或化學(xué)材料包括重組DNA的益生菌。本發(fā)明的益生菌還包括通過細(xì)菌產(chǎn)生或來源于細(xì)菌或從細(xì)菌中分離的益生菌酶，以及其他益生菌副產(chǎn)物，包括例如超氧化物歧化酶(SodA)。本發(fā)明的益生菌還可任選包括非存活細(xì)胞或者其組分或片段。制劑的每層可含有在屬、種、亞種和菌株水平中的一種或多種上可區(qū)分的不同益生菌或益生菌混合物。根據(jù)本發(fā)明的制劑包括使益生菌有效負(fù)荷免于胃酸的有害作用的一種或多種組分。此類組分包括例如碳酸鈉、碳酸氫鈉和磷酸鈉。益生菌制劑的另外的組分包括親水試劑，例如溶脹劑、粘度增加劑、凝膠強度增強劑。親水試劑可選自例如：淀粉(例如玉米淀粉、米淀粉或馬鈴薯淀粉)、親水樹膠、多糖或半乳甘露聚糖(例如果膠、瓊脂、右旋糖酐、角叉菜膠、黃蓍膠、刺槐豆膠、阿拉伯樹膠、瓜爾膠、黃原膠、茄替膠、海藻酸或海藻酸鈉)、纖維素衍生物(例如甲基纖維素、羧甲基纖維素、淀粉羥乙酸鈉、羧甲基纖維素鈉或羧甲基纖維素鈣、羥乙基甲基纖維素、乙基羥乙基纖維素、乙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、乙酸鄰苯二甲酸纖維素或微晶纖維素)、硅石(例如二氧化硅，商標(biāo)名稱PRIOSILPS-200，由Glassven制造；CAS#7631-86-9)、硅酸鋁、硅酸鎂、硅酸鎂鋁、硅酸鈉或長石、氫氧化鋁、蛋白質(zhì)(例如明膠或酪蛋白)、聚合物(例如丙烯酸酯、羧基聚亞甲基、聚亞烷基二醇或聚乙烯吡咯烷酮)、親水聚合物(例如纖維素衍生物例如微晶纖維素(MCC))(例如CAS#9004-34-6；由AccentMicrocellPrivateLtd.制造的微晶纖維素MCC112；材料可源自木漿，且包括非GMO源)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)(也稱為羥丙甲纖維素)(例如由THEDOWCHEMICALCOMPANY制造的K100PREMIUM；材料可源自木漿和棉短絨；CAS#9004-65-3)、或羥丙基纖維素(HPC)、或樹膠和多糖例如瓜爾膠或麥芽糖糊精。還可使用組合材料，例如由FMCBiopolymer制造的CE-15(MCC)和瓜爾膠，其中每種組分分別源自木漿和植物源，并且包括非GMO源；(CAS#9004-34-6和CAS#9004-30-0)。還可使用疏水試劑包括蠟及其他惰性材料例如乙基纖維素或巴西棕櫚蠟。本文制劑可使用pH特異性溶脹特征或位點特異性酶降解，以定制益生菌的控制釋放。例如，可使用下述組分中的一種或多種，或調(diào)整其在制劑中的相對量：海藻酸鹽、多糖例如明膠或膠原、瓜爾膠、黃原膠、果膠(例如源自柑橘和蘋果皮、包括非GMO柑橘和蘋果皮)、異質(zhì)蛋白質(zhì)混合物、多肽、多糖(例如由Herbstreith&Fox制造的PECTIN150SLOWSET；CAS#9000-69-5)、果膠和/或海藻酸鹽和半乳甘露聚糖膠(例如瓜爾膠、黃原膠和/或刺槐豆膠)、聚乙烯衍生物(例如聚氧化乙烯(PEO)和/或聚乙二醇(PEG))、水解蛋白質(zhì)(例如明膠和/或膠原)、以及多肽(例如明膠、膠原、酪蛋白或異質(zhì)蛋白質(zhì)混合物)。另外，可包括電解質(zhì)尤其是例如無水碳酸鈉、無水碳酸鉀、無水碳酸鈉(例如，食品級無水碳酸鈉，包括CAS#497-19-8)或鈣鹽。生理學(xué)可接受的電解質(zhì)的包括可產(chǎn)生緩沖環(huán)境，所述緩沖環(huán)境允許重構(gòu)和釋放在對于細(xì)菌活力最佳的pH條件下發(fā)生。電解質(zhì)和例如親水試劑之間的相互作用不僅可允許益生菌的pH不依賴性釋放，還可穩(wěn)定劑型的內(nèi)部pH。維持穩(wěn)定的內(nèi)部pH促成益生菌的穩(wěn)定性。粘合劑可包括HPMC、MCC、瓜爾膠、果膠(作為內(nèi)聚粘合劑)等，所述粘合劑中的一些可在如上所述的制劑中發(fā)揮雙重目的。另外的任選成分包括鹽、干燥劑、崩解劑、流動試劑和管道試劑、潤滑劑和著色劑。例如，生理學(xué)可接受的鹽可在凍干期間以1.0:0.1至1.0:25益生菌與鹽的比率引入益生菌中。鹽的添加還幫助維持劑型自身內(nèi)的恒定pH，且在凍干過程期間充當(dāng)冷凍保護劑，以幫助防止細(xì)胞裂解。干燥劑可包括例如羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈣、膠體二氧化硅和/或其組合。崩解劑可包括例如可得自BlanverFarmoquimicaLTDA的作為銷售的交聯(lián)羧甲基纖維素鈉，以及可得自BASF的作為銷售的交聚維酮(不溶性聚乙烯吡咯烷酮)。流動試劑和管道試劑和潤滑劑可包括例如硬脂酸鎂和硬脂酸(例如STEARICACIDTRISTAR149)。著色劑可包括例如姜黃(例如NO.03255TURMERICCG90)。2.用于制備制劑的過程本發(fā)明的制劑可通過組合各種粉末混合物進行制備，每種混合物包含一種或多種預(yù)選擇的益生菌。這些混合物可通過單次壓制一起壓制成分層劑型?？商娲兀糜谛纬扇魏我粋€層的混合物可在與一個或多個另外的層組合之前進行預(yù)壓制。在一個實施例中，劑型是多層片劑或囊片。在一個優(yōu)選實施例中，劑型是用于經(jīng)口施用的雙層片劑或囊片。在另一個優(yōu)選實施例中，劑型是通過在雙面壓片機上的序貫直接壓制形成的雙層片劑。壓制可涉及冷卻的有意使用，以避免損害益生菌。與本發(fā)明一起使用的粉末混合物是干燥的。粉末混合物可包括凍干的益生菌預(yù)混物。具體地，在壓制前粉末混合物的含濕量不超過5％。根據(jù)本發(fā)明的成品劑型具有不超過0.275Aw的含水量。片劑共混物的加工在環(huán)境室溫和濕度下完成。理想地，加工室溫和濕度不超過23℃/45RH，但極低濕度可導(dǎo)致靜電問題以及干燥成分的共混和壓制中的困難。散裝培養(yǎng)濃縮物和成品散裝劑量形式的貯存維持在-10℃下或低于-10℃。當(dāng)片劑不是主動地被制造時，過程中片劑共混物貯存于4-15℃的冷藏溫度下的密封襯里中。本文描述的制劑的穩(wěn)定性可使用各種測試和方案進行評價。例如，且不限于，制劑可優(yōu)選經(jīng)過18個月的時期和/或在周圍穩(wěn)定性環(huán)境(17-20攝氏度/≤50％相對濕度)中，在例如1天后并且隨后再次在120天后就活CFU進行實時測試?？商娲兀?，且不限于，制劑可經(jīng)過18個月的時期和/或在周圍穩(wěn)定性環(huán)境(25攝氏度/60％相對濕度)中，在例如1天后并且隨后再次在120天后就活CFU進行實時測試?？紤]穩(wěn)定性不應(yīng)受影響；然而，由于多階段或兩階段壓制過程，初始壓制損失可更大。制造益生菌雙層囊片或片劑可遵循由用于制備雙層劑型的壓片機制造商提供的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置和說明書。例如，設(shè)計為通過雙重壓制過程摻入兩種獨特的配方共混物的雙面壓片機被裝配且在兩個進料斗各自中充滿共混物。隨著加工開始，操作者調(diào)整轉(zhuǎn)速、流速、壓制力和沖壓深度，以引入共混物且在囊片的第一階段(主要側(cè))中壓制它。這個側(cè)面在模具中繼續(xù)至第二階段填充和壓制(次要側(cè))，以形成單一片劑。在一個實施例中，取決于使用的壓片機和片劑模具，主要側(cè)和次要側(cè)的片劑雙層重量的相對量可從大約60％:40％變成70％:30％。在一個特定實施例中，如實例1中所示，片劑雙層重量包含在主要側(cè)壓制中的總重量的大約67％和次要側(cè)壓制中的總重量的大約33％。一旦完成，片劑就從壓片機中彈出，并且沖壓/模具站繼續(xù)其旋轉(zhuǎn)回到第一階段，以重復(fù)該過程。3.制劑除本文提供的一般制劑參數(shù)之外，在本發(fā)明的任何層、或個別側(cè)中任一或兩者(如果是雙層片劑)、或每個亞組分(如果是多層片劑)中使用的制劑與美國專利號8,540,980和8,007,777(所述美國專利號涉及和/或描述BIO-制劑)中所述的均勻的個別劑型單位制劑中的某些重疊。為此，本發(fā)明人在此處包括與某些均勻的酸保護性不同釋放的益生菌均勻劑型的制備有關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)證據(jù)和數(shù)據(jù)，他們已自此確定，可有利地基本上重新設(shè)計，重新配置且改變用途，以形成本發(fā)明的分層劑型，其中每層包含不同益生菌且任選具有不同釋放概況。參見實例4-12和圖2-10。在一個優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的雙層片劑的一個或多個個別層或“側(cè)面”可包括5-40％親水試劑、5-40％釋放改性劑和1-40％電解質(zhì)。釋放時間修飾最初通過使用脫模劑的不同輸入％和粘度來實現(xiàn)。例如，在一個實施例中，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的雙層片劑，具有約923mg的靶重量，其中第一層占約621mg并且第二層占約302mg?？紤]可制備本實施例的變化，其中第一層占約621mg(±50mg)并且第二層占約302mg(±30mg)。本發(fā)明人還已確定在每層中包括某些相同成分的某些百分比(％)重量量(w/w)促成統(tǒng)一內(nèi)聚分層劑型的成功制備，并且減少或消除最終劑型脆碎度。例如，對于主要設(shè)計為提供來自分開的分層劑型的不同益生菌的劑型，用所有成分的相同相對百分比平衡雙層片劑的主要側(cè)和次要側(cè)層，對于層是最佳的。本發(fā)明人也已確定對于制劑組分例如HPMC、果膠、MCC和益生菌粉末預(yù)混物，以相對相似量存在于每個側(cè)面上以最佳促進單位內(nèi)聚是特別重要的。劑型內(nèi)聚不僅對于產(chǎn)品貨架驗收是重要的，還對于劑型的穩(wěn)定性和功能性是重要的。這是因為分開、破壞和分裂的劑型更難以處理，并且物理上導(dǎo)致更小的劑量質(zhì)量大小和增加量的表面積，所述表面積暴露于可導(dǎo)致過早溶解以及益生菌有效負(fù)荷的無能或無效遞送的氧(穩(wěn)定性)和/或胃腸道溶解試劑。在本發(fā)明的幾種雙層片劑制劑中，HPMC、果膠、MCC和益生菌粉末預(yù)混物是成品劑型中的主要輸入組分(w/w)。在一個實施例中，本發(fā)明的雙層片劑制劑在每層中包括相同或基本上相似的相對百分比(w/w)量的一種或多種給定制劑主要輸入組分，包括但不限于HPMC、果膠、MCC和益生菌粉末預(yù)混物，以幫助制備統(tǒng)一的內(nèi)聚分層劑型。例如，雙層片劑的每個側(cè)面中的給定制劑組分的相對百分比(w/w)量可在另一側(cè)的約20％內(nèi)，更優(yōu)選在另一側(cè)的約15％內(nèi)，再更優(yōu)選在另一側(cè)的約10％內(nèi)，且最優(yōu)選在另一側(cè)的約5％內(nèi)，且最佳地在另一側(cè)的約1％內(nèi)。注意到雖然本發(fā)明劑型在本文中最頻繁地被稱為雙層片劑，但本發(fā)明包含多層制劑和所有可壓制的可經(jīng)口攝取的劑型類型，例如片劑和囊片。4.靶向釋放不同培養(yǎng)物群優(yōu)先居住于人胃腸道的不同區(qū)域。為了靶向釋放益生菌可攝取劑量形式的目的，居住于口腔和食道區(qū)域的微生物不是本討論的部分。小腸(十二指腸、空腸和回腸)的微生物生態(tài)學(xué)占優(yōu)勢地被例如乳桿菌屬和鏈球菌屬物種占據(jù)。結(jié)腸(升結(jié)腸、橫結(jié)腸和降結(jié)腸)包含例如由雙歧桿菌屬、擬桿菌屬和梭菌屬(Clostridium)以及腸桿菌科(Enterobacteriaceae)主導(dǎo)的一些嚴(yán)格厭氧的微生物群。人胃腸道是遠離疾病的第一道防御機制之一。在病原體有機會感染且增殖或引起疾病之前，胃中的酶和酸作用于殺死病原體。益生菌培養(yǎng)物可通過暴露于胃酸、消化酶和膽汁鹽而被殺死。培養(yǎng)物在其抵抗這些消化試劑的能力方面不同，一些是非常敏感的并且一些是更有抵抗力的。然而，一般地，活細(xì)胞的顯著損失在胃中發(fā)生。益生菌選擇歷史上已集中于能夠抵抗這些試劑的菌株，并且存在幾種有效的遞送技術(shù)以保護敏感培養(yǎng)物通過胃腸道的消化區(qū)域。益生菌產(chǎn)品的許多常規(guī)粉末和液體劑型不對培養(yǎng)物劑量提供酸保護，并且通常依賴培養(yǎng)物的天然耐酸性以存活通過胃。許多遞送技術(shù)在pH/酶依賴性爆發(fā)應(yīng)答中在小腸開始處釋放其整個有效負(fù)荷。對于適合該環(huán)境的培養(yǎng)物，這可能是足夠的，但對于對上部小腸的氧勢敏感的培養(yǎng)物，爆發(fā)或立即釋放可導(dǎo)致活力喪失。關(guān)于對上部小腸的氧勢敏感的培養(yǎng)物的更佳遞送系統(tǒng)將經(jīng)過稍后或延長持續(xù)時間提供活培養(yǎng)物的保護和釋放到下胃腸道包括結(jié)腸內(nèi)。在一個實施例中，本發(fā)明涉及不同釋放概況的制劑，以將至少兩個不同類別的益生菌優(yōu)選沉積到其預(yù)期的微生物小生境內(nèi)。例如，本發(fā)明可在小腸或上胃腸道中遞送乳桿菌屬和鏈球菌屬，并且將嚴(yán)格厭氧菌如雙歧桿菌屬進一步遞送到下部腸道內(nèi)。證實該概念的示例制劑包括每種培養(yǎng)物作為陰性對照(無保護)的立即釋放固體劑量和例如根據(jù)本發(fā)明的雙層片劑的比較。嬰兒雙歧桿菌對氧和酸暴露非常敏感。例如，嬰兒雙歧桿菌共混物可設(shè)計為具有延長釋放持續(xù)時間和優(yōu)良的酸保護，例如用于遞送至下胃腸道。此外，植物乳桿菌是氣生耐受和耐酸的；這種共混物設(shè)計用于適度酸保護和更短的釋放概況，例如用于經(jīng)由可經(jīng)口攝取的劑型遞送至上胃腸道。在本發(fā)明的一個實施例中，在主要側(cè)中具有嬰兒雙歧桿菌共混物和在次要側(cè)中具有植物乳桿菌的雙層片劑可就制造壓制損失和在溶解中隨著時間過去的差異活菌計數(shù)釋放進行評估。在另一個實施例中，在主要側(cè)中具有乳雙歧桿菌(B.lactis)共混物和在次要側(cè)中具有發(fā)酵乳桿菌的雙層片劑可就制造壓制損失和在溶解中隨著時間過去的差異活菌計數(shù)釋放進行評估。另外，注意到雙層片劑的主要層或主要側(cè)或者第一層或第一側(cè)相對于次要層的另外的質(zhì)量可影響酸存活。相應(yīng)地，上述雙層實施例可通過比較第一層或第二層中的每種益生菌進行測試，以測定哪種分層劑型提供最佳總體存活率。優(yōu)選組合可在例如第3-7小時之間釋放小腸制劑的固體劑量重量的25-70％；和例如在第6-12小時之間釋放結(jié)腸制劑的35-90％。在某些雙層片劑實施例中，例如，約30-40％的固體劑量重量在第3-7小時之間主要從主要第一側(cè)遞送至小腸制劑。隨后，固體劑量重量的剩余量在第6-12小時之間主要從次要側(cè)遞送至結(jié)腸或下部腸道。在某些其他雙層片劑實施例中，例如，約20-30％的固體劑量重量在第3-7小時之間主要從主要第一側(cè)遞送至小腸制劑。隨后，固體劑量重量的剩余量在第6-12小時之間主要從次要側(cè)遞送至結(jié)腸或下部腸道。實例實例1：內(nèi)聚乳雙歧桿菌和發(fā)酵乳桿菌雙層制劑和制備表1部分B使用Double-SidedPresswithPrecompression(標(biāo)記IV型號)雙層片劑壓片機制備使用上述制劑的雙層片劑，以通過雙重壓制過程摻入兩種獨特的制劑共混物。使用的模具或沖頭大小為大小0.312x0.750(沖頭ID：D23)。雙層片劑可使用1,000粒丸劑/分鐘的轉(zhuǎn)塔速度進行制造。上沖穿透包括8mm后部和4mm前部。第一層具有約0.531(設(shè)定點0.377)的填充深度，并且第二層具有約0.564(設(shè)定點0.394)的填充深度。關(guān)于第一層的平均沖頭壓力(磅/英寸2)為以約202的預(yù)壓制和以約738的主要壓制。關(guān)于第二層的平均沖頭壓力為以約64的預(yù)壓制和以約2188的主要壓制。最終KP(千克力)為約10.7KP(平均值)。此類雙層片劑的脆碎度為約0.25％，其中脆碎度指示破壞的丸劑或?qū)拥姆蛛x。脆碎度是關(guān)于片劑耐久力的USP標(biāo)準(zhǔn)測試：稱重十(10)個片劑，隨后插入標(biāo)準(zhǔn)尺寸以及轉(zhuǎn)速和時間的轉(zhuǎn)筒內(nèi)，隨后再次稱重。損失記錄為百分比。<1％的損失對于大多數(shù)補充劑是良好的，但對于益生菌例外。因此，成品劑型重量(w/w)為約870mg，具有約923mg的靶重量，其中第一層占約621mg，并且第二層占約302mg。實例2：不同培養(yǎng)物壓片雙層制劑的酸保護評估活益生菌培養(yǎng)物的存活在USP2型溶解儀器中評估在pH2.5下在37℃下暴露30分鐘的禁食狀態(tài)測試參數(shù)，伴隨以50RPM設(shè)置的槳攪拌。每個數(shù)據(jù)點是在900mL溶解培養(yǎng)基中個別重復(fù)的三個個別劑量測試的平均值。測試的劑型是根據(jù)實例1制備的那些。益生菌計數(shù)在暴露結(jié)束時通過下述對殘留囊片材料完成：輕輕地將水合的囊片提出腔室且通過輕輕溶解加工其用于板計數(shù)測定，并且在鐵胃(stomacher)攪拌器中勻漿化，隨后為標(biāo)準(zhǔn)板計數(shù)測定，以計數(shù)活菌落形成單位。為了評價處于無保護狀態(tài)的益生菌的存活，凍干的粉狀培養(yǎng)物(用于制造囊片)就酸暴露前的活菌計數(shù)進行測定，并且使1g這種材料在溶解培養(yǎng)基中在儀器中水合且接受相同暴露。在暴露后，從培養(yǎng)基中抽取樣品且如上所述加工用于活菌計數(shù)。乳雙歧桿菌和發(fā)酵乳桿菌的差異計數(shù)通過培養(yǎng)物的不同菌落外觀成為可能，且報告為就稀釋因子調(diào)整后的總的回收活細(xì)胞。存活通過將酸后回收的CFU除以引入的CFU進行測定，并且表示為百分比。這還表示為通過將囊片存活百分比除以無保護粉末存活百分比的關(guān)于個別培養(yǎng)物的“保護因子”。表2在37℃50RPM下30分鐘pH2.5發(fā)酵乳桿菌是酸敏感培養(yǎng)物，但它靶向用于遞送至上胃腸道，使得它可照慣例視為適合于立即釋放制劑或者不需要延長或控制釋放概況的制劑。本文數(shù)據(jù)顯示當(dāng)發(fā)酵乳桿菌在酸中直接測試時，發(fā)酵乳桿菌活力中的嚴(yán)重喪失，以及當(dāng)在本發(fā)明的酸保護劑型例如實例1中所述的那些中制備時，這些損失的顯著避免或減少。這些結(jié)果突出顯示在胃通過期間關(guān)于酸保護的關(guān)鍵需要，即使被施用的培養(yǎng)物靶向用于遞送至上胃腸道，并且因此不預(yù)期需要不受胃酸影響的保護。這一系列測試證實關(guān)于通過雙層片劑提供的益生菌培養(yǎng)物的兩個趨異屬各自的活有效負(fù)荷的優(yōu)良保護。令人驚訝的是，根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌培養(yǎng)物不存在的制劑被證明對于酸是非常敏感的。事實上，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明制劑提供了對于發(fā)酵乳桿菌培養(yǎng)物超過1800X的令人驚訝的制劑保護因子。此處，即使雙歧桿菌屬培養(yǎng)物乳雙歧桿菌最終比發(fā)酵乳桿菌培養(yǎng)物耐酸性高幾個數(shù)量級，但兩種培養(yǎng)物均獲益于通過雙層片劑劑型提供的酸保護。本文數(shù)據(jù)證實使用本文公開的酸保護制劑對于所有培養(yǎng)物的重要優(yōu)點，與摻入制劑內(nèi)的培養(yǎng)物對酸更敏感還是更不敏感無關(guān)，并且與靶向遞送部位是上胃腸道還是下胃腸道無關(guān)。此外，本實例顯示本發(fā)明的酸保護制劑允許含有例如敏感或耐酸培養(yǎng)物的截然不同的制劑在單一內(nèi)聚劑型中組合，所述單一內(nèi)聚劑型提供了對于劑型益生菌有效負(fù)荷轉(zhuǎn)運通過胃的共享的相似酸保護。相應(yīng)地，本實例顯示本發(fā)明的酸保護的分層劑型可有助于適當(dāng)益生菌包括酸敏感益生菌對位于胃腸道的不同區(qū)域中的靶部位的沉積。實例3：持續(xù)釋放評估為了證實來自根據(jù)實例1制備的這些劑型的活益生菌通過模擬腸通道的持續(xù)釋放，相同USP2型儀器和測試參數(shù)用于如上文實例2中注明的初始酸暴露(即USP2型溶解儀器，用于在pH2.5下在37℃下的30分鐘暴露的禁食狀態(tài)測試參數(shù)，伴隨以50RPM設(shè)置的槳攪拌)。隨后，在30分鐘時，室的pH調(diào)整至中性pH7.0-7.5，并且允許劑量保持在室中另外的溶解暴露至3、6或9小時的總時間。根據(jù)實例1制備的劑型的圖像在此處對于零時間、3小時時間、6小時時間和9小時時間分別如圖1A、1B、1C和1D提供。在測試期結(jié)束時，殘留劑型輕輕地從室中取出且如上加工以測定在完整囊片中剩余的活菌計數(shù)。獲取溶解培養(yǎng)基的樣品且測定在培養(yǎng)基中釋放的益生菌活菌計數(shù)。調(diào)整計數(shù)以反映引入溶解室內(nèi)且從溶解室中回收的總CFU。再次，對于每個數(shù)據(jù)點測試三個重復(fù)且在報告中求平均值。下文數(shù)據(jù)顯示隨著雙層片劑溶解逐步增加的細(xì)胞計數(shù)回收。在底部處的總回收部分顯示回收的益生菌逐步下降，但重要的是，細(xì)胞回收發(fā)生，并且存在通過至少約9小時暴露。表3在37℃50RPM下30分鐘pH2.5，隨后為培養(yǎng)基的中和以及連續(xù)溶解溶解前CFU/殘留劑型證實隨著劑型侵蝕到培養(yǎng)基內(nèi)活菌計數(shù)中的進行性減少。培養(yǎng)基樣品通過測試的9小時在計數(shù)中進行性增加。重要的是，活細(xì)胞回收持續(xù)通過9小時，其中總回收從在30分鐘時間點的初始劑量的66％下降到分別在3、6和9小時時的26％、24％和14％。注意到顯著活躍細(xì)胞計數(shù)在溶解自始至終都回收到。下述實例提供了提議用于用作本發(fā)明的劑型的亞組分的層制劑。單獨獲取的這些制劑在總質(zhì)量中視為太小而無法與許多常規(guī)分層壓片機一起工作。注意到增加總質(zhì)量重量的一種方法是例如包括填料例如MCC或麥芽糖糊精。然而，注意到雖然MCC或麥芽糖糊精的包括對于片劑壓制可能是重要的，但這些組分一般不幫助片劑內(nèi)聚。此外，包括大量MCC或麥芽糖糊精可影響片劑釋放速率，即增加釋放速率。本發(fā)明的劑型的制備可包含下述層制劑中的一種或多種連同如本文描述的其他層制劑一起，以形成本發(fā)明的分層內(nèi)聚酸保護制劑，以提供不同益生菌層且提供具有不同釋放概況的不同益生菌層。實例4如表4中所示制備多層劑型的一種亞組分或雙層片劑劑型的側(cè)面，稱重大約382mg，且含有親水試劑和益生菌預(yù)混物。組A1是對照。在本實例中，益生菌預(yù)混物包含有益微生物例如凍干粉末的乳酸菌預(yù)混物和淀粉。采用的親水試劑是微晶纖維素(MCC)、麥芽糖糊精、羥丙基甲基纖維素(HPMC)或聚氧化乙烯(PEO)。親水試劑的添加延遲來自劑型的益生菌釋放。硬脂酸被包括作為流動試劑，并且二氧化硅用作流動試劑和干燥劑。如圖2中所示，本實例的結(jié)果反映通過使用包含親水試劑和凍干益生菌的基質(zhì)授予的，來自雙層劑型的分開側(cè)面的控制釋放水平。這種控制釋放通過在暴露于胃介質(zhì)后遞送的比對照高得多水平的活乳酸菌菌落形成單位(CFU)顯示。較少溶脹的親水試劑例如MCC和麥芽糖糊精的使用與足夠但更低的控制水平相關(guān)。優(yōu)良的控制水平在聚氧化乙烯和HPMC基質(zhì)兩者中得到證實。因此，親水試劑并不限于特定類型的親水試劑，只要實現(xiàn)足夠的基質(zhì)粘度。表4實例5可如表5中所示制備作為片劑的雙層劑型的一個側(cè)面，大約382mg，含有親水試劑、電解質(zhì)試劑和益生菌預(yù)混物。組B1是對照。制劑采用HPMC作為親水試劑。所使用的電解質(zhì)試劑包括NaHCO3、Na2CO3或NaH2PO4中的任何一種。在這種情況下，益生菌由凍干粉末的乳酸菌預(yù)混物和淀粉組成。電解質(zhì)試劑NaHCO3、Na2CO3或NaH2PO4中的任何一種的添加建立在遞送系統(tǒng)的劑型內(nèi)的內(nèi)部pH。硬脂酸被包括作為流動試劑，并且二氧化硅用作流動試劑和干燥劑。如圖3中所示的，本實例證實雙層劑型的分開側(cè)面的內(nèi)部pH通過電解質(zhì)試劑的存在加以改變，從而影響遞送的活CFU的量。特定內(nèi)部pH的這種建立與給定重構(gòu)凍干BC的不同活力水平相關(guān)。特別地，制劑B2含有Na2CO3，并且電解質(zhì)試劑提供了在遞送系統(tǒng)的劑型內(nèi)的內(nèi)部pH且?guī)椭貥?gòu)活乳酸菌。表5劑量配方(mg)B1(對照)B2B3B4乳酸菌預(yù)混物150150150150HPMC00100100100MCC200000Na2CO3010000NaHCO3001000NaH2PO4000100硬脂酸16161616二氧化硅16161616總重量382382382382實例6可如表6中所示制備作為片劑的雙層劑型的一個側(cè)面，大約382mg，含有親水試劑、釋放改性劑和益生菌預(yù)混物。組C1是對照。所采用的親水試劑是HPMC。所采用的釋放改性劑是果膠或明膠。凍干粉末的乳酸菌預(yù)混物和淀粉構(gòu)成BC。硬脂酸被包括作為流動試劑，并且二氧化硅用作流動試劑和干燥劑。如圖4中所示，本實例示出當(dāng)釋放改性劑加入親水可溶脹基質(zhì)中時，增加的控制水平是可能的。果膠或明膠作為釋放改性劑的存在與pH依賴性降解程度和基質(zhì)粘度中的總體增加相關(guān)，所述基質(zhì)粘度中的總體增加延遲益生菌的釋放。這在暴露于胃pH介質(zhì)后遞送的活CFU中的增加中反映。表6劑量配方(mg)C1(對照)C2C3乳酸菌預(yù)混物150150150HPMC0100100MCC20000果膠01000明膠00100硬脂酸161616二氧化硅161616總重量382382382實例7如表7中所示制備作為片劑的雙層劑型的一個側(cè)面，大約534mg，含有親水試劑、電解質(zhì)試劑、釋放改性劑、惰性填料和益生菌預(yù)混物。所采用的親水試劑是HPMC。所使用的電解質(zhì)試劑是NaHCO3。所采用的釋放改性劑是果膠，并且所采用的惰性填料是MCC。在本實例中采用的益生菌預(yù)混物由凍干粉末的乳酸菌預(yù)混物和淀粉組成。惰性填料的添加與增加的粉末流動性相關(guān)，所述增加的粉末流動性在制造過程期間通常是有利的。硬脂酸被包括作為流動試劑，并且二氧化硅用作流動試劑和干燥劑。姜黃被包括作為著色劑。如圖5中所示，本實例的結(jié)果證實活益生菌細(xì)菌經(jīng)過延長持續(xù)時間的控制釋放的能力。親水基質(zhì)的控制釋放也顯示類似地執(zhí)行，與對胃介質(zhì)的暴露持續(xù)時間無關(guān)。E1和E2是分別顯示基于1小時或2小時暴露時間在控制釋放中的差異的相同制劑。表7劑量配方(mg)E1E2乳酸菌預(yù)混物150150HPMC5050NaHCO35050MCC200200果膠5050硬脂酸1616二氧化硅1616姜黃22總重量534534實例8如表8中所示制備作為片劑的雙層劑型的一個側(cè)面，大約532mg，含有親水試劑、電解質(zhì)試劑、釋放改性劑、惰性填料和益生菌預(yù)混物。所采用的親水試劑是HPMC或PEO。所使用的電解質(zhì)試劑是NaHCO3。所采用的釋放改性劑是果膠，并且所采用的惰性填料是MCC。在本實例中采用的益生菌由凍干粉末的雙歧桿菌屬預(yù)混物和淀粉組成。硬脂酸被包括作為流動試劑，并且二氧化硅用作流動試劑和干燥劑。姜黃被包括作為著色劑。如圖6中所示，本實例的結(jié)果證實益生菌經(jīng)過延長持續(xù)時間的控制釋放的能力。親水基質(zhì)的控制釋放也顯示在八小時后以對于BC(在這種情況下，由雙歧桿菌屬組成)遞送有利的概況釋放。此類例子可用于將雙歧桿菌屬遞送至下部腸和超過下部腸。表8劑量配方(mg)F2F3雙歧桿菌預(yù)混物150150HPMC1500PEO0150果膠100100NaHCO3100100硬脂酸1616二氧化硅1616總重量532532實例9如表9中所示制備作為片劑的雙層劑型的單個側(cè)面，分別為大約684mg和342mg，含有親水試劑、電解質(zhì)試劑、釋放改性劑、惰性填料和益生菌預(yù)混物。所采用的親水試劑是HPMC。所采用的電解質(zhì)試劑是NaHCO3。所采用的釋放改性劑是果膠。在本實例中采用的益生菌預(yù)混物由凍干粉末的乳酸菌預(yù)混物和淀粉組成。硬脂酸被包括作為流動試劑，并且二氧化硅用作流動試劑和干燥劑。如圖7中所示，本實例的結(jié)果證實親水試劑、電解質(zhì)試劑和釋放改性劑的組合能夠控制幾何可縮放性、片劑形狀、大小和體積，同時控制在其親水基質(zhì)中和整體片劑的劑型中來自遞送系統(tǒng)的益生菌釋放。當(dāng)需要不同制劑體積，特別是改變片劑形狀和大小時，改變劑型的這種靈活性尤其可用于制造中。表9劑量配方(mg)H1H2乳酸菌預(yù)混物75150果膠50100HPMC50100NaHCO350100瓜爾膠100200硬脂酸816二氧化硅816姜黃12總重量342684實例10如表10中所示制備作為片劑的雙層劑型的一個側(cè)面，大約684mg，含有親水試劑、電解質(zhì)試劑、釋放改性劑、惰性填料和益生菌預(yù)混物。所采用的親水試劑是HPMC。所使用的電解質(zhì)試劑是NaHCO3。所采用的釋放改性劑是果膠，并且所采用的惰性填料是MCC。在本實例中采用的益生菌由凍干粉末的乳酸菌預(yù)混物和淀粉組成。硬脂酸被包括作為流動試劑，并且二氧化硅用作流動試劑和干燥劑。姜黃被包括作為著色劑。如圖8中所示，本實例的結(jié)果證實使壓片前的預(yù)混物(I2)相對于非干燥的預(yù)混物(I1)的賦形劑的相同制劑干燥的應(yīng)用。當(dāng)與非干燥的預(yù)混物I1相比較，干燥的有益效應(yīng)通過在干燥的預(yù)混物I2中遞送的活乳酸菌或益生菌CFU中的增加得到證明。表10劑量配方(mg)I1I2乳酸菌預(yù)混物150150HPMC100100果膠100100NAH(CO3)2100100MCC200200硬脂酸88二氧化硅88姜黃22總重量684684實例11如表11中所示制備作為片劑的雙層劑型的一個側(cè)面，大約532mg，含有親水試劑、電解質(zhì)試劑、釋放改性劑、惰性填料和益生菌預(yù)混物。所采用的親水試劑是粘度4000mPa(H1)或15000mPa(H2)的HPMC。所采用的電解質(zhì)試劑是NaHCO3。所采用的釋放改性劑是果膠，并且所采用的惰性填料是MCC。在本實例中采用的益生菌預(yù)混物由凍干粉末的雙歧桿菌屬預(yù)混物和淀粉組成。硬脂酸被包括作為流動試劑，并且二氧化硅用作流動試劑和干燥劑。姜黃被包括作為著色劑。如圖9中所示，本實例的結(jié)果證實通過采用不同粘度的親水試劑，活益生菌的差異控制釋放的能力。表11實例12如表12中所示制備作為片劑的雙層劑型的一個側(cè)面，大約343mg，含有親水試劑、電解質(zhì)試劑、釋放改性劑、惰性填料和益生菌預(yù)混物。所采用的親水試劑是HPMC。所采用的電解質(zhì)試劑是NaHCO3。所采用的釋放改性劑是果膠，并且所采用的惰性填料是MCC。在本實例中采用的益生菌預(yù)混物由凍干粉末的乳酸預(yù)混物和淀粉組成。硬脂酸被包括作為流動試劑，并且二氧化硅用作流動試劑和干燥劑。姜黃被包括作為著色劑。如圖10中所示，本實例的結(jié)果證實通過相對恒定量的活乳酸菌CFU證明的，當(dāng)貯存于周圍環(huán)境(25攝氏度，60％相對濕度)中時，關(guān)于隨著時間過去穩(wěn)定性增加的能力。表12劑量配方(mg)K1乳酸菌預(yù)混物75HPMC50果膠50NaHCO350MCC100硬脂酸8二氧化硅8姜黃2總重量343上文討論是描述性、舉例說明性和示例性的，并且不視為限制通過任何所附權(quán)利要求限定的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3