本申請要求于2014年7月15日提交的題為“利用人絨毛膜促性腺激素拮抗劑來預(yù)防涉及新生血管形成的眼部疾病(例如糖尿病視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變)的發(fā)展的方法”的美國臨時申請第62/024,609號的優(yōu)先權(quán)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及治療和/或預(yù)防眼部疾病的領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

已知高水平的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)與涉及視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜下新生血管形成的眼部疾病(病理性血管生長)的發(fā)展相關(guān)；VEGF刺激內(nèi)皮細胞生長和新生血管形成，并增加視網(wǎng)膜血管通透性。此外，已知VEGF的超表達與腫瘤的發(fā)展有關(guān)。

涉及病理性血管生長的眼部疾病的實例可以分類如下。這些眼部疾病中的大多數(shù)均是與VEGF相關(guān)的(即，高VEGF水平可能有助于其發(fā)展)：

(a)視網(wǎng)膜血管疾病(包括但不限于糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變)。視網(wǎng)膜血管疾病的病理生理學(xué)涉及來自現(xiàn)存的視網(wǎng)膜血管的滲漏和/或新生血管形成。

(b)視網(wǎng)膜下新生血管性疾病(包括但并不限于新生血管性年齡相關(guān)性黃斑變性、眼組織胞漿菌病、病理性近視)。視網(wǎng)膜下新生血管性疾病的病理生理學(xué)涉及新血管生長到通常無血管的外層視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜下間隙中。

(c)眼內(nèi)腫瘤(包括眼黑素瘤、眼淋巴瘤和視網(wǎng)膜母細胞瘤)。

上調(diào)眼部VEGF水平的驅(qū)動力主要歸因于視網(wǎng)膜缺血?？筕EGF抗體和人工VEGF捕獲蛋白(trapping protein)目前正用于治療與VEGF相關(guān)的眼部疾病(例如上面所列的那些)，獲得了一些有希望的結(jié)果。然而，這些試劑通常僅在疾病過程的晚期使用，且并不是對所有患者都起作用。此外，由于VEGF對維持脈絡(luò)膜血管層而言是重要的，因此長期抗VEGF治療可導(dǎo)致視網(wǎng)膜的地圖樣萎縮；在長期治療后，VEGF的“全面”消融可能會導(dǎo)致有害作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是用于治療視網(wǎng)膜疾病的方法，其通過給予有效量的人絨毛膜促性腺激素(hCG)拮抗劑、黃體生成素(LH)拮抗劑或hCG/LH受體拮抗劑，任選地與至少一種其他生物活性劑結(jié)合來治療視網(wǎng)膜疾病。這種治療通過阻斷(直接地阻斷或通過競爭性抑制而阻斷)LH/hCG受體激活或通過阻斷激素本身(即，通過針對激素的抗體)來阻斷激素誘導(dǎo)的VEGF合成。這預(yù)防VEGF誘導(dǎo)的新生血管形成或視網(wǎng)膜的血管發(fā)生(通常隨著增殖性眼部疾病的發(fā)展而發(fā)生)。

附圖說明

圖1示出了hCG的氨基酸序列，并且還示出了糖基化(N-連接或O-連接)的氨基酸；

圖2示出了使用劑量為1320和1600IU/kg的hCG的新生血管形成實驗操作中的視網(wǎng)膜前的細胞核計數(shù)；以及

圖3示出了給予了hCG的小鼠中VEG F的眼部上調(diào)。

具體實施方式

術(shù)語

為了促進對本發(fā)明原理的理解，將參考優(yōu)選的實施方案，并將使用特定語言來描述本發(fā)明。然而，應(yīng)當(dāng)理解，這并不意欲因此限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明所涉及領(lǐng)域中的技術(shù)人員通常能夠想到對于本發(fā)明的這種改變和進一步改進以及如本文所示的本發(fā)明原理的進一步應(yīng)用。

以下術(shù)語將用于描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。在缺少本文所闡述的具體定義的情況下，用于描述本發(fā)明的術(shù)語應(yīng)理解為如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的它們的通常含義。

人絨毛膜促性腺激素(hCG)和黃體生成素(LH)具有相同的受體。術(shù)語“hCG”是指天然存在或合成的“人絨毛膜促性腺激素”的任何同工型(isoform)，術(shù)語“LH”是指天然存在或合成的“黃體生成素”的任何同工型。在本專利中，當(dāng)我們提及hCG/LH拮抗劑時，我們將hCG/LH拮抗劑定義為“hCG拮抗劑”、“LH拮抗劑”、“hCG/LH拮抗劑”、“hCG受體拮抗劑”、“LH受體拮抗劑”或“hCG/LH受體拮抗劑”。這些術(shù)語可互換使用，并且意欲包括所命名的化合物的適當(dāng)有效的衍生物或片段，包括例如采用生理學(xué)上可接受的陽離子或陰離子而形成的生理學(xué)上可接受的酯或鹽。

本文所用的術(shù)語“hCG/LH拮抗劑”是指與hCG或LH激素結(jié)合或者與和其結(jié)合的受體結(jié)合而使所述激素或受體失效的部分(disabling moiety)。

術(shù)語“活性成分”是指hCG/LH拮抗劑。

如本文所用的，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”、“稀釋劑”、“添加劑”或“賦形劑”意指化學(xué)成分，活性成分單獨或與這些化學(xué)成分結(jié)合時可用于在根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的治療方法中將適當(dāng)?shù)幕衔锝o予患者或受試者。

如本文所用的，術(shù)語“生理學(xué)上可接受的”酯或鹽意指與藥物組合物的任何其它成分相容的活性成分的酯或鹽形式，其對待給予所述組合物的受試者無害。

如本文所用的，“油性”液體是包含含碳液態(tài)分子并且極性小于水的液體。

術(shù)語“DR”表示“糖尿病視網(wǎng)膜病變”。

在整個說明書中術(shù)語“患者”或“受試者”用于描述有需要的動物、通常是人，其中給予hCG/LH拮抗劑以在該患者或受試者中實現(xiàn)預(yù)期的結(jié)果。患者的年齡可以從新生兒(如早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的情況)直到成年人(如通常是糖尿病視網(wǎng)膜病變或年齡相關(guān)性黃斑變性的情況)?；颊呖梢允欠侨焉锏幕蛉焉锏?。

在整個說明書中術(shù)語“有效量”用于描述當(dāng)用在優(yōu)選實施方案的方法中時用于實現(xiàn)預(yù)期結(jié)果的本發(fā)明組合物(hCG/LH拮抗劑)的量。在本發(fā)明的許多方面中，術(shù)語有效量與患者的治療連起來使用。

如本文所用的，“藥學(xué)上可接受的添加劑”包括但不限于以下物質(zhì)中的一種或多種：表面活性劑，分散劑，惰性稀釋劑，造粒劑和崩解劑，粘合劑，潤滑劑，甜味劑，調(diào)味劑，著色劑，防腐劑，生理上可降解的組合物如明膠，水性媒介物和溶劑，油性媒介物和溶劑，懸浮劑，分散劑或潤濕劑，乳化劑，緩和劑(demulcent)，緩沖劑，鹽，增稠劑，填充劑，乳化劑，抗氧化劑，抗生素，抗真菌劑，穩(wěn)定劑，以及藥學(xué)上可接受的聚合材料或疏水材料。本發(fā)明的藥物組合物中可包含的其他“添加劑”是本領(lǐng)域已知的，并且記載于例如Genaro，ed.(1985，Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA)中。

通用方法

優(yōu)選實施方案的方法可用于治療患有任何眼部疾病的患者，所述眼部疾病包括其中hCG或LH可通過其促進血管發(fā)生或新生血管形成而起作用的視網(wǎng)膜病癥。

治療方法包括給予有效量的眼部人絨毛膜促性腺激素(hCG)拮抗劑、黃體生成素(LH)拮抗劑或hCG/LH受體拮抗劑，其任選地與至少一種其他生物活性劑結(jié)合。這種治療通過阻斷視網(wǎng)膜的LH/hCG受體激活(直接地阻斷或通過競爭性抑制而阻斷)或通過阻斷激素本身(例如通過針對激素的抗體)來阻斷激素誘導(dǎo)的VEGF合成。這預(yù)防VEGF誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜的新生血管形成或血管發(fā)生(通常隨著增殖性眼睛疾病的發(fā)展而發(fā)生)。治療的給藥途徑可以包括但不限于：局部(例如以滴眼劑的形式)、眼內(nèi)、結(jié)膜下、玻璃體內(nèi)、眼內(nèi)的任何形式、鞘內(nèi)、靜脈內(nèi)、腸胃外、腹膜內(nèi)、口服、鼻內(nèi)。優(yōu)選以滴眼劑形式的局部施用。

所治療的示例性疾病

其中hCG或LH可起作用的血管生成性和/或新生血管性眼部疾病的實例包括：

(a)視網(wǎng)膜血管疾病(包括但不限于糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變)。

(b)視網(wǎng)膜下血管疾病(包括但并不限于年齡相關(guān)性黃斑變性、眼組織胞漿菌病、病理性近視)。

(c)眼內(nèi)腫瘤(包括眼黑素瘤、眼淋巴瘤病和視網(wǎng)膜母細胞瘤)。

這種阻斷激素誘導(dǎo)的眼部VEGF合成的方法可以用于預(yù)防眼部腫瘤的發(fā)展。到目前為止，已經(jīng)建議將hCG拮抗劑用于治療hCG相關(guān)的腫瘤。hCG相關(guān)的腫瘤是專門分泌hCG的腫瘤(例如，生殖細胞腫瘤、某些肺癌和膀胱癌)。然而，本發(fā)明的方法是使用眼部hCG/LH拮抗劑或hCG/LH受體拮抗劑通過阻斷眼部VEGF合成來阻斷任何眼部腫瘤(無論腫瘤本身是否分泌hCG)的發(fā)展。眼中VEGF水平的增加(即使它們不是由腫瘤本身產(chǎn)生的)可能有助于腫瘤生長。盡管之前已經(jīng)提出過將LH/hCG拮抗劑用于卵巢過度刺激綜合征、妊娠滋養(yǎng)細胞疾病和分泌hCG的腫瘤，但是之前從未提及過將其用于眼部疾病。

理論討論

盡管不希望受理論束縛，但是優(yōu)選實施方案的方法似乎涉及視網(wǎng)膜中LH/hCG受體活性的調(diào)節(jié)，以提供預(yù)防涉及新生血管形成/血管發(fā)生(其中VEGF可起作用)的眼部疾病發(fā)展的新方法。該方法被認為涉及靶向一種激素信號途徑，所述激素信號途徑發(fā)生在VEGF產(chǎn)生的上游，是VEGF相關(guān)的眼部疾病的一種新的治療靶點。具體地，優(yōu)選實施方案的方法似乎集中于被黃體生成素(LH)或人絨毛膜促性腺激素(hCG)激活的LH/hCG受體。

示例性的hCG/LH拮抗劑

示例性的hCG/LH拮抗劑包括小分子拮抗劑和大分子拮抗劑[分子量(MW)＞150kDa]，例如抗體拮抗劑。優(yōu)選小分子拮抗劑。小于150kDa的小分子拮抗劑適合于被配制為滴眼劑，以提供方便且安全的遞送方式。小分子拮抗劑應(yīng)足夠小以便通過滴眼劑(局部)施用實現(xiàn)有效的眼內(nèi)滲透，但還應(yīng)足夠大以獲得從玻璃體中的緩慢清除。優(yōu)選地，它們應(yīng)具有20至80kDa、更優(yōu)選30-50kDa的分子量。

可在優(yōu)選實施方案中使用的小分子hCG/LH拮抗劑的一個實例，該hCG/LH拮抗劑可包含去糖基化的hCG、突變的hCG或同時去糖基化的和突變的hCG分子。一類hCG/LH拮抗劑的實例是“去糖基化的hCG”，并且其在本文中是指相對于天然存在的hCG，碳水化合物殘基數(shù)目減少的hCG。在一個實施方案中，去糖基化的hCG包含比天然存在的hCG更少的N-連接的碳水化合物。

現(xiàn)有技術(shù)記載了將hCG去糖基化的方法。例如，可通過神經(jīng)氨酸酶處理或通過氟化氫處理來對hCG進行去糖基化。專利申請US2008/003937A1記載了去糖基化的hCG的實施方案，所述去糖基化的hCG相對于天然存在的hCG包含數(shù)目減少的N-連接的碳水化合物。在一個實施方案中，去糖基化的hCG的α和β亞基連接在一起(融合的或軛合的(yoked))，并且4個N-連接的碳水化合物位點中的3個通過位點特異性誘變而改變。如US2008/0039372中所記載的hCG/LH拮抗劑代表在本申請中所使用的拮抗劑的優(yōu)選實施方案。已經(jīng)去糖基化的hCG的α或β亞基也可被用作用于本發(fā)明目的的hCG的抑制劑。hCG的突變形式或hCG的α或β亞基代表用于本發(fā)明的其他hCG/LH拮抗劑。

與天然存在的hCG相比，去糖基化的hCG可包含數(shù)目減少的唾液酸殘基、N-乙酰氨基葡糖殘基、N-半乳糖胺殘基、半乳糖殘基、甘露糖殘基或巖藻糖殘基。去糖基化的hCG可具有比天然存在的hCG少至少約50％至90％的碳水化合物。特別地，去糖基化的hCG可具有比天然存在的hCG少至少約55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或99+％的碳水化合物。圖1顯示了hCG的氨基酸序列，并且還顯示了糖基化(N-連接或O-連接)的氨基酸。這些氨基酸是位于hCG的α亞基的氨基酸52位和78位的天冬酰胺，以及位于hCG的β亞基的氨基酸13位和30位的天冬酰胺和氨基酸121位、127位、132位和138位的絲氨酸。根據(jù)本發(fā)明，糖基殘基可被修飾(如本文無其他描述的，通常指縮短的或去糖基化的)以提供用于本發(fā)明的hCG的抑制劑。此外，通過修飾hCG序列內(nèi)的一個或多個氨基酸殘基而獲得的突變的hCG分子也可用于本發(fā)明。作為用于本發(fā)明的拮抗劑的優(yōu)選hCG突變體包括已通過采用不能被糖基化的氨基酸置換所述氨基酸之一而消除糖基化的突變的hCG分子。一個或多個氨基酸的置換或消除提供了可用作本發(fā)明的hCG/LH拮抗劑的hCG突變體，所述一個或多個氨基酸選自位于hCG的α亞基的氨基酸52位和78位的天冬酰胺以及位于hCG的β亞基的氨基酸13位和30位的天冬酰胺和位于氨基酸121位、127位、132位和138位的絲氨酸。

可使用的大分子hCG/LH拮抗劑是針對LH、針對hCG和/或針對LH/hCG受體的抗體(單克隆或多克隆的)或抗體片段。制備這些抗體所需的方法、技術(shù)和技能是容易獲得的。LH抗體、hCG抗體和LH/hCG受體抗體是市售可得的。

示例性的藥物組合物

在優(yōu)選實施方案中待給予的藥物組合物包含有效量的、以適于給予受試者的形式的單獨的hCG/LH拮抗劑，或者所述藥物組合物可包含活性成分以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、添加劑、賦形劑和/或一種或多種其他成分，或這些的一些組合。如本文無其他描述，可配制根據(jù)優(yōu)選實施方案的藥物組合物并將其給予至需要治療的患者或受試者以遞送劑量為1ng/kg/天至100mg/kg/天的hCG/LH拮抗劑或其變體。

本文所描述的藥物組合物的制劑可通過藥理學(xué)領(lǐng)域中已知的或以后開發(fā)的任何方法而制備。通常，這些制備方法包括使活性成分與載體或一種或多種其他輔助成分結(jié)合的步驟，然后如果必要或需要，將產(chǎn)品成形或包裝成所需的單劑量或多劑量單位。

本發(fā)明的藥物組合物可作為單一單位劑量或作為多個單一單位劑量而制備、包裝或批量出售。如本文所用的，“單位劑量”是包含預(yù)定量的活性成分的藥物組合物的離散的量?；钚猿煞值牧客ǔ５扔诖o予受試者的活性成分的劑量或該劑量的適宜部分，例如該劑量的一半或三分之一。

本發(fā)明的藥物組合物中的活性成分、藥學(xué)上可接受的載體和任何其他成分的相對量將根據(jù)所治療的受試者的身份、大小和狀況并進一步根據(jù)給予所述組合物的途徑而變化。例如，所述組合物可包含小于0.1％至100％(w/w)的活性成分。本發(fā)明的藥物組合物的控釋或緩釋制劑可使用常規(guī)技術(shù)而制備。

可在優(yōu)選實施方案的方法中使用的藥物組合物可以以適合于口服、直腸、陰道、腸胃外、局部、肺、鼻內(nèi)、口腔、眼部(包括但不限于局部、眼內(nèi)、玻璃體內(nèi)、結(jié)膜下)、栓劑、氣溶膠或其他給藥途徑的制劑的形式而給予、制備、包裝和/或銷售。給藥途徑對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，并且取決于許多因素，所述因素包括待治療的疾病的類型和嚴重性，待治療的患者的類型和年齡等。

優(yōu)選用作滴眼劑的局部施用制劑。所述制劑可例如以滴眼劑的形式，所述滴眼劑包括例如活性成分于水性或油性液態(tài)載體中的0.1-1.0％(W/W)溶液或懸浮液。所述滴劑可還包含緩沖劑、鹽或一種或多種本文所述的其他成分。

根據(jù)本發(fā)明的方法，其他可能的制劑，例如納米粒、脂質(zhì)體、重新包封的紅細胞和基于免疫的系統(tǒng)也可用于給予例如肽、其片段或衍生物和/或編碼它們的核酸。

適合于口服給藥的本發(fā)明的藥物組合物的制劑可以以離散的固體劑量單位的形式而制備、包裝或銷售，所述形式包括但不限于片劑、硬膠囊劑或軟膠囊劑、扁囊劑、糖錠或錠劑，其分別含有預(yù)定量的活性成分。適合于口服給藥的其他制劑包括但不限于粉狀或顆粒狀制劑、水性或油性懸浮液、水性或油性溶液或者乳液。

適合于口服給藥的本發(fā)明的藥物組合物的液體制劑可以以液體形式或以干燥品(在使用前用水或另一種合適的載體復(fù)原)的形式而制備、包裝和銷售。

可將所述化合物以每天數(shù)次的頻率給予受試者，或者可以以更低的頻率給予，例如每天一次、每周一次、每兩周一次、每月一次，或者甚至更低的頻率，例如每幾個月一次或甚至每年一次或更少。劑量的頻率對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，并且取決于許多因素，例如但不限于，待治療的視網(wǎng)膜疾病的類型和嚴重性、給藥途徑、受試者年齡。

適合給予人類的藥物組合物的修改方案以使該組合物適合給予多種動物是眾所周知的，且普通的獸醫(yī)藥理學(xué)家可僅通過常規(guī)實驗(如果需要的話)設(shè)計并實施這種修改方案。預(yù)期給予本發(fā)明的藥物組合物的受試者包括但不限于人和其他靈長類動物、哺乳動物，所述哺乳動物包括商業(yè)上相關(guān)的哺乳動物，例如牛、豬、馬、羊、貓和狗。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認識到，如上所描述的與治療眼部病癥或改善疾病狀態(tài)和/或病癥或其癥狀的具體方法相關(guān)的本發(fā)明的各種實施方案在上下文中可涉及治療或解決本文未具體提及的癥候?qū)W，或可涉及癥候?qū)W的不同情況。

實施例的討論

以下的實施例1表明在氧誘導(dǎo)性視網(wǎng)膜病變(OIR)的小鼠模型中hCG對視網(wǎng)膜新生血管形成的作用，即給予hCG在氧誘導(dǎo)性視網(wǎng)膜病變的小鼠模型中促進異常的視網(wǎng)膜新生血管形成。OIR小鼠模型已經(jīng)成為研究增殖性視網(wǎng)膜病變(例如糖尿病視網(wǎng)膜病變和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變)的許多研究的基石。來自該實驗的數(shù)據(jù)支持這一觀點：LH/hCG信號可影響視網(wǎng)膜新生血管形成。在以下的實施例1中，使用了hCG，因為其具有比LH(20分鐘)更長的半衰期(＞24小時)，因此其用于涉及LH/hCG受體激活的實驗中是更為實用的。將hCG用作LH替代物在涉及LH的臨床和臨床前研究中是常見的。

實施例1：參見圖2

進行以下實驗以證明劑量為1320和1600IU/kg的hCG在氧誘導(dǎo)性視網(wǎng)膜病變的小鼠模型中顯著增加視網(wǎng)膜新生血管形成。因此，hCG/LH拮抗劑可有助于治療涉及新生血管形成的眼部疾病。

目的

這項研究的目的是在氧誘導(dǎo)性視網(wǎng)膜病變(OIR)的小鼠模型中評估腹膜內(nèi)遞送的人絨毛膜促性腺激素(hCG)對視網(wǎng)膜新生血管形成的作用。

方法

使用三(3)窩小鼠，每窩五(5)只，每個治療組一窩小鼠。將出生后7天的動物(P7)通過在75％氧氣氣氛下暴露5天(從P7至P12)來誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變。然后將動物保持在常氧中。通過每天一次腹膜內(nèi)(ip)給予1320或1600IU/kg的hCG以及媒介物對照來處理動物，連續(xù)進行10天(從P5到P14)。在P17時，取出兩個眼球并進行組織學(xué)處理。

通過對視網(wǎng)膜前的細胞核(即在來自雙眼的組織切片中來自延伸至內(nèi)界膜的玻璃體側(cè)的新血管的細胞核)進行計數(shù)來評估視網(wǎng)膜的新生血管形成。

結(jié)果：參見圖2

與媒介物處理的一窩小鼠相比，通過hCG處理(不考慮劑量)并沒有改變動物行為和體重。來自媒介物組的兩只小鼠被發(fā)現(xiàn)在P6和P7時死亡。這些死亡是由于母親放棄了幼崽。以1320和1600IU/kg的劑量每天經(jīng)腹膜內(nèi)給予hCG激素分別顯著地增加了63％(p＝0.004)和51％(p＝0.0085)視網(wǎng)膜前的細胞核計數(shù)。

在這些實驗條件下，多次腹膜內(nèi)給予人絨毛膜促性腺激素(hCG)可被小鼠良好耐受。劑量為1320和1600IU/kg的hCG顯著地增加了OIR小鼠模型中視網(wǎng)膜新生血管形成。

實施例2：

HCG可通過作為眼部VEGF調(diào)節(jié)物起作用來促進眼部血管發(fā)生。VEGF參與了糖尿病視網(wǎng)膜病變、黃斑變性和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變。因此，hCG/LH拮抗劑可有助于這些疾病。參見圖3。

在子宮血管系統(tǒng)中，促血管生成素hCG是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和兩種VEGF受體(VEGFR-1，VEGFR-2)的重要調(diào)節(jié)物。發(fā)明人提議hCG也作為眼部VEGF調(diào)節(jié)物起作用。早期ROP的標志，未成熟的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的消退是由高氧誘導(dǎo)的VEGF抑制而引起的。晚期ROP的異常新生血管形成特征是由視網(wǎng)膜的過多的VEGF的上調(diào)以過度補償早期氧誘導(dǎo)的VEGF抑制而引起的。進行以下實驗。

相對數(shù)量的圖(將每組中的一個對照設(shè)定為校準)

腹膜內(nèi)給予PBS(對照媒介物)與腹膜內(nèi)給予hCG(試驗化合物)之后小鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜VEGFA表達的比較

P＝出生后天數(shù)(即，P7＝出生后第7天)；

(SDS v1.4，ddCT研究，Applied Biosystems 7500快速實時PCR系統(tǒng))。

將1320IU/kg腹膜內(nèi)人絨毛膜促性腺激素(hCG)或磷酸鹽緩沖鹽水經(jīng)腹膜內(nèi)給予C57BL/6野生型小鼠。

(a)第1組：對P7新生小鼠注射hCG或PBS，一天后進行視網(wǎng)膜處理。在一個窩里出生的4只小鼠中，1只是最弱小的幼崽。由于最弱小的幼崽通常眼部發(fā)育落后，因而不被用作對照。因此，組1中有一只對照(PBS)和兩只試驗小鼠(hCG)。兩只試驗小鼠中的每一只均顯示出視網(wǎng)膜VEGFa表達增加，盡管兩只試驗小鼠中一只的增加達到顯著性(p＜0.05)。將兩只試驗小鼠的結(jié)果進行平均，與對照相比，未成熟的HCG處理的視網(wǎng)膜中視網(wǎng)膜VEGFa表達增加70％。

(b)第2組：P25年輕成年小鼠接受hCG或PBS注射，第二天進行視網(wǎng)膜處理。在該組中有兩只對照和兩只試驗小鼠。雖然兩只試驗小鼠之一的視網(wǎng)膜VEGFa表達有無顯著意義的20％的下降，但是另一只試驗小鼠的VEGFa表達與各對照相比顯示出70％的顯著性(p＜0.05)增加。

(c)第3組：P29/P30年輕成年小鼠，接受2劑量的hCG或PBS，每天一個劑量，連續(xù)兩天，在第二劑量后的第二天進行視網(wǎng)膜處理。在該組中有一只對照(PBS)和一只試驗小鼠(hCG)。與對照相比，試驗小鼠的VEGFa表達有400％的顯著性(p＜0.05)增加。

以上實驗的結(jié)果示于附圖3中。它們?yōu)橐韵绿峁┝俗C據(jù)：在所測試的小鼠中，hCG顯示出對VEGF的顯著上調(diào)。

當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)理解，前面是對本發(fā)明優(yōu)選實施方案的描述，在不背離如所附權(quán)利要求書中所闡述的本發(fā)明的范圍和精神的情況下，可以進行各種變更和改變。