專(zhuān)利名稱(chēng)：魚(yú)腥草、枳椇子、刺梨、油柑子、葫瓜、佛手瓜sod提取工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物酶分離與提純工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及在魚(yú)腥草、枳犋子、刺 梨、油柑子、葫瓜、佛手瓜等植物中提取高純度超氧化物歧化酶(SOD)的技術(shù)。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(SOD)作為生物體內(nèi)一種重要的氧自由基清除劑，能夠平衡機(jī)體 的氧自由基，避免生物體內(nèi)超氧陰離子自由基濃度過(guò)高引起的不良反應(yīng)。在防輻射、糖尿 病、肺病、肝炎、心血管病、腫瘤、紅斑狼瘡、白內(nèi)障、類(lèi)風(fēng)濕、關(guān)節(jié)炎癥、變質(zhì)性炎癥、滲出性 炎癥、增生性炎癥、特異性炎以及自身免疫治療等方面具有獨(dú)特的功效。同時(shí)，超氧化物歧 化酶可以作為美容化妝品、保健食品飲品的活性成分。目前用于動(dòng)物或者植物SOD的提取工藝，大多都采用分步鹽析和有機(jī)溶劑沉淀等 傳統(tǒng)的分離純化技術(shù)。這些傳統(tǒng)的分離純化技術(shù)在工業(yè)應(yīng)用上都存在一定的局限性，如分 步鹽析和有機(jī)溶劑沉淀容易引起蛋白質(zhì)的變性和失活等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可以在魚(yú)腥草、枳犋子、刺梨、油柑子、葫瓜、佛手瓜等 植物適于工業(yè)應(yīng)用的高純度超氧化物歧化酶提出工藝，解決現(xiàn)有存在的缺陷。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案魚(yú)腥草、枳犋子、刺梨、油柑子、葫瓜、佛手瓜SOD提取工藝，包括如下步驟A)對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理，將所述的植物原料經(jīng)過(guò)循環(huán)超聲提取破碎后，經(jīng)勻漿機(jī)勻 漿后，8000 IOOOOrpm高速離心6 30min，過(guò)濾制得粗提液；B)將步驟A)所得的粗提液依次通過(guò)PEG、GST、Ni親和層析柱純化目的蛋白；C)將步驟B)所得的粗提液pH值通過(guò)100 500mM的Tris和100 500mM的PBS 緩沖液調(diào)整為7 8;D)對(duì)步驟C)所得的洗脫液依次用截留分子量為30 50kDa和截留分子量為70 150kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，制備高純度的超氧化物歧化酶；E)對(duì)超濾液進(jìn)行進(jìn)一步濃縮，制得SOD濃縮液；對(duì)SOD濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，制備 得凍干粉，備用。優(yōu)選的方案是還包括對(duì)超濾液濃縮得到的小分子物質(zhì)中的活性物質(zhì)進(jìn)一步重組 利用的步驟F)；所述活性物質(zhì)包括RNA、維生素、安基酸、短肽等。更優(yōu)的方案是還包括對(duì)植物原料經(jīng)破碎機(jī)破碎后過(guò)濾的濾渣進(jìn)行加工處理的步 驟G)，所述步驟G)為Gl)對(duì)渣加入保護(hù)液進(jìn)一步提取，等濃縮后，噴霧干燥，制備果糖或者果膠；和/或者G2)對(duì)渣加入保護(hù)液并同時(shí)添加烯醇液進(jìn)一步分離黃酮后，對(duì)分離分離液通過(guò)層 析柱層析精制，并對(duì)層析洗脫液進(jìn)一步濃縮，制得其它活性物質(zhì)；所述其它活性物質(zhì)包括RNA、維生素、安基酸、短肽等。通過(guò)本發(fā)明所述的高純度超氧化物歧化酶提出工藝，通過(guò)循環(huán)超聲提取破碎，GST 及Ni分步親和層析以及超濾幾個(gè)步驟便能從魚(yú)腥草、枳犋子、刺梨、油柑子、葫瓜、佛手瓜 等植物中分離純化到高純度超氧化物歧化酶，分離純化到的高純度超氧化物歧化酶純度可 以高達(dá)98%，酶活力可以高達(dá)5 6X 106U/g。本發(fā)明所述的提出工藝，更是可以對(duì)超濾液 濃縮得到的小分子物質(zhì)中的活性物質(zhì)進(jìn)一步重組利用；并對(duì)植物原料經(jīng)破碎機(jī)破碎后過(guò)濾 的濾渣進(jìn)行加工處理，制得果糖以及其它活性物質(zhì)，使原材料的價(jià)值得到充分的利用。本發(fā) 明所述的高純度超氧化物歧化酶提出工藝填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)天然多元抗氧化活性物的空白，為人 類(lèi)的健康及再次改良高經(jīng)濟(jì)作物具有超前創(chuàng)新重大意義，將會(huì)使食品和保健品行業(yè)得到革 命性的調(diào)整。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1魚(yú)腥草高純度SOD的提取A)取清潔的魚(yú)腥草經(jīng)過(guò)循環(huán)超聲機(jī)充分破碎，經(jīng)勻漿機(jī)勻漿約lmin，8000 IOOOOrpm高速離心6 30min，過(guò)濾制得粗提液；B)將步驟A)所得的粗提液依次通過(guò)PEG、GST、Ni親和層析柱純化目的蛋白；C)將步驟B)所得的粗提液pH值通過(guò)100 500mM的Tris和100 500mM的PBS 緩沖液調(diào)整為7 8;D)對(duì)步驟C)所得的洗脫液依次用截留分子量為30 50kDa和截留分子量為70 150kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，制備高純度的超氧化物歧化酶，測(cè)定純度及酶活力，測(cè)定結(jié)果純 度高達(dá)98. 2%，酶活力可以高達(dá)5. 3X 106U/g ；E)對(duì)超濾液進(jìn)行進(jìn)一步濃縮，制得SOD濃縮液；對(duì)SOD濃縮液進(jìn)行冷凍干燥6 8h，制備得凍干粉，備用。F)對(duì)超濾液濃縮得到的小分子物質(zhì)中的活性物質(zhì)進(jìn)一步重組利用。G2)對(duì)渣加入保護(hù)液并同時(shí)添加烯醇液進(jìn)一步分離黃酮后，對(duì)分離分離液通過(guò)層 析柱層析精制，并對(duì)層析洗脫液進(jìn)一步濃縮，制得其它活性物質(zhì)。實(shí)施例2枳犋子高純度SOD的提取A)取清潔的枳犋子經(jīng)過(guò)循環(huán)超聲機(jī)充分破碎，經(jīng)勻漿機(jī)勻漿約lmin，8000 IOOOOrpm高速離心10 30min，過(guò)濾制得粗提液；B)將步驟A)所得的粗提液依次通過(guò)PEG、GST、Ni親和層析柱純化目的蛋白；C)將步驟B)所得的粗提液pH值通過(guò)100 500mM的Tris和100 500mM的PBS 緩沖液調(diào)整為7. 2 7. 8 ；D)對(duì)步驟C)所得的洗脫液依次用截留分子量為40 50kDa和截留分子量為70 150kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，制備高純度的超氧化物歧化酶，測(cè)定純度及酶活力，測(cè)定結(jié)果純 度高達(dá)97. 8%，酶活力可以高達(dá)5. 5X 106U/g ；E)對(duì)超濾液進(jìn)行進(jìn)一步濃縮，制得SOD濃縮液；對(duì)SOD濃縮液進(jìn)行冷凍干燥6 8h，制備得凍干粉，備用。F)對(duì)超濾液濃縮得到的小分子物質(zhì)中的活性物質(zhì)進(jìn)一步重組利用。
Gl)對(duì)渣加入保護(hù)液進(jìn)一步提取，等濃縮后，噴霧干燥，制備果膠；G2)對(duì)渣加入保護(hù)液并同時(shí)添加烯醇液進(jìn)一步分離黃酮后，對(duì)分離分離液通過(guò)層析柱層析精制，并對(duì)層析洗脫液進(jìn)一步濃縮，制得其它活性物質(zhì)。實(shí)施例3刺梨高純度SOD的提取A)取清潔的刺梨經(jīng)過(guò)循環(huán)超聲機(jī)充分破碎，經(jīng)勻漿機(jī)勻漿約lmin，8000 IOOOOrpm高速離心15 30min，過(guò)濾制得粗提液；B)將步驟A)所得的粗提液依次通過(guò)PEG、GST、Ni親和層析柱純化目的蛋白；C)將步驟B)所得的粗提液pH值通過(guò)100 500mM的Tris和100 500mM的PBS 緩沖液調(diào)整為7. 5 8 ；D)對(duì)步驟C)所得的洗脫液依次用截留分子量為30 50kDa和截留分子量為70 150kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，制備高純度的超氧化物歧化酶，測(cè)定純度及酶活力，測(cè)定結(jié)果純 度高達(dá)98. 5%，酶活力可以高達(dá)5. 2X 106U/g ；E)對(duì)超濾液進(jìn)行進(jìn)一步濃縮，制得SOD濃縮液；對(duì)SOD濃縮液進(jìn)行冷凍干燥6 8h，制備得凍干粉，備用。F)對(duì)超濾液濃縮得到的小分子物質(zhì)中的活性物質(zhì)進(jìn)一步重組利用。Gl)對(duì)渣加入保護(hù)液進(jìn)一步提取，等濃縮后，噴霧干燥，制備果膠；G2)對(duì)渣加入保護(hù)液并同時(shí)添加烯醇液進(jìn)一步分離黃酮后，對(duì)分離分離液通過(guò)層 析柱層析精制，并對(duì)層析洗脫液進(jìn)一步濃縮，制得其它活性物質(zhì)。實(shí)施例4油柑子高純度SOD的提取A)取清潔的油柑子經(jīng)過(guò)循環(huán)超聲機(jī)充分破碎，經(jīng)勻漿機(jī)勻漿約lmin，8000 IOOOOrpm高速離心15 30min，過(guò)濾制得粗提液；B)將步驟A)所得的粗提液依次通過(guò)PEG、GST、Ni親和層析柱純化目的蛋白；C)將步驟B)所得的粗提液pH值通過(guò)100 500mM的Tris和100 500mM的PBS 緩沖液調(diào)整為7 8;D)對(duì)步驟C)所得的洗脫液依次用截留分子量為30 50kDa和截留分子量為70 150kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，制備高純度的超氧化物歧化酶，測(cè)定純度及酶活力，測(cè)定結(jié)果純 度高達(dá)97. 5%，酶活力可以高達(dá)5. 4X106U/g ；E)對(duì)超濾液進(jìn)行進(jìn)一步濃縮，制得SOD濃縮液；對(duì)SOD濃縮液進(jìn)行冷凍干燥6 8h，制備得凍干粉，備用。F)對(duì)超濾液濃縮得到的小分子物質(zhì)中的活性物質(zhì)進(jìn)一步重組利用。Gl)對(duì)渣加入保護(hù)液進(jìn)一步提取，等濃縮后，噴霧干燥，制備果膠；G2)對(duì)渣加入保護(hù)液并同時(shí)添加烯醇液進(jìn)一步分離黃酮后，對(duì)分離分離液通過(guò)層 析柱層析精制，并對(duì)層析洗脫液進(jìn)一步濃縮，制得其它活性物質(zhì)。實(shí)施例5葫瓜高純度SOD的提取A)取清潔的葫瓜經(jīng)過(guò)循環(huán)超聲機(jī)充分破碎，經(jīng)勻漿機(jī)勻漿約lmin，8000 IOOOOrpm高速離心15 20min，過(guò)濾制得粗提液；B)將步驟A)所得的粗提液依次通過(guò)PEG、GST、Ni親和層析柱純化目的蛋白；C)將步驟B)所得的粗提液pH值通過(guò)100 500mM的Tris和100 500mM的PBS 緩沖液調(diào)整為7 7. 5 ；
D)對(duì)步驟C)所得的洗脫液依次用截留分子量為30 50kDa和截留分子量為70 150kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，制備高純度的超氧化物歧化酶，測(cè)定純度及酶活力，測(cè)定結(jié)果純 度高達(dá)98. 6%，酶活力可以高達(dá)5. 6X 106U/g ；E)對(duì)超濾液進(jìn)行進(jìn)一步濃縮，制得SOD濃縮液；對(duì)SOD濃縮液進(jìn)行冷凍干燥6 8h，制備得凍干粉，備用。F)對(duì)超濾液濃縮得到的小分子物質(zhì)中的活性物質(zhì)進(jìn)一步重組利用。Gl)對(duì)渣加入保護(hù)液進(jìn)一步提取，等濃縮后，噴霧干燥，制備果膠；G2)對(duì)渣加入保護(hù)液并同時(shí)添加烯醇液進(jìn)一步分離黃酮后，對(duì)分離分離液通過(guò)層 析柱層析精制，并對(duì)層析洗脫液進(jìn)一步濃縮，制得其它活性物質(zhì)。實(shí)施例6佛手瓜高純度SOD的提取A)取清潔的佛手瓜經(jīng)過(guò)循環(huán)超聲機(jī)充分破碎，經(jīng)勻漿機(jī)勻漿約lmin，8000 IOOOOrpm高速離心15 20min，過(guò)濾制得粗提液；B)將步驟A)所得的粗提液依次通過(guò)GST、Ni親和層析柱純化目的蛋白；C)將步驟B)所得的粗提液pH值通過(guò)100 500mM的Tris和100 500mM的PBS 緩沖液調(diào)整為7 7. 5 ；D)對(duì)步驟C)所得的洗脫液依次用截留分子量為30 50kDa和截留分子量為70 150kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，制備高純度的超氧化物歧化酶，測(cè)定純度及酶活力，測(cè)定結(jié)果純 度高達(dá)98.4%,酶活力可以高達(dá)5. 8X 106U/g ；E)對(duì)超濾液進(jìn)行進(jìn)一步濃縮，制得SOD濃縮液；對(duì)SOD濃縮液進(jìn)行冷凍干燥6 8h，制備得凍干粉，備用。F)對(duì)超濾液濃縮得到的小分子物質(zhì)中的活性物質(zhì)進(jìn)一步重組利用。Gl)對(duì)渣加入保護(hù)液進(jìn)一步提取，等濃縮后，噴霧干燥，制備果膠；G2)對(duì)渣加入保護(hù)液并同時(shí)添加烯醇液進(jìn)一步分離黃酮后，對(duì)分離分離液通過(guò)層析柱層析精制，并對(duì)層析洗脫液進(jìn)一步濃縮，制得其它活性物質(zhì)。
權(quán)利要求
魚(yú)腥草、枳椇子、刺梨、油柑子、葫瓜、佛手瓜SOD提取工藝，包括如下步驟A)對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理，將所述的植物原料經(jīng)過(guò)循環(huán)超聲提取破碎后，經(jīng)勻漿機(jī)勻漿后，8000～10000rpm高速離心6～30min，過(guò)濾制得粗提液；B)將步驟A)所得的粗提液依次通過(guò)PEG、GST、Ni親和層析柱純化目的蛋白；C)將步驟B)所得的粗提液pH值通過(guò)100～500mM的TRIS和100～500mM的PBS緩沖液調(diào)整為7～8；D)對(duì)步驟C)所得的洗脫液依次用截留分子量為30～50kDa和截留分子量為70～150kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，制備高純度的超氧化物歧化酶；E)對(duì)超濾液進(jìn)行進(jìn)一步濃縮，制得SOD濃縮液；對(duì)SOD濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，制備得凍干粉，備用。
2.如權(quán)利要求1所述的魚(yú)腥草、枳犋子、刺梨、油柑子、葫瓜、佛手瓜SOD提取工藝，其特 征是還包括對(duì)超濾液濃縮得到的小分子物質(zhì)中的活性物質(zhì)進(jìn)一步重組利用的步驟F)。
3.如權(quán)利要求1所述的魚(yú)腥草、枳犋子、刺梨、油柑子、葫瓜、佛手瓜SOD提取工藝，其特 征是還包括對(duì)植物原料經(jīng)破碎機(jī)破碎后過(guò)濾的濾渣進(jìn)行加工處理的步驟G)，所述步驟G) 為Gl)對(duì)渣加入保護(hù)液進(jìn)一步提取，等濃縮后，噴霧干燥，制備果糖或果膠；和/或者G2)對(duì)渣加入保護(hù)液并同時(shí)添加烯醇液進(jìn)一步分離黃酮后，對(duì)分離分離液通過(guò)層析柱 層析精制，并對(duì)層析洗脫液進(jìn)一步濃縮，制得活性物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了魚(yú)腥草、枳椇子、刺梨、油柑子、葫瓜、佛手瓜SOD提取工藝，包括步驟A)對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理，經(jīng)勻漿機(jī)勻漿后，8000～10000rpm高速離心，過(guò)濾制得粗提液；B)所得的粗提液依次通過(guò)PEG、GST、Ni親和層析柱純化目的蛋白；C)將步驟B)所得的粗提液pH值通調(diào)整為7～8；D)對(duì)步驟C)所得的洗脫液用超濾膜進(jìn)行超濾，制備高純度的超氧化物歧化酶；E)對(duì)超濾液進(jìn)行進(jìn)一步濃縮，制得SOD濃縮液；對(duì)SOD濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，制備得凍干粉，備用。本發(fā)明所述的提出工藝分離純化到的高純度超氧化物歧化酶純度可以高達(dá)98％，酶活力可以高達(dá)5～6×106U/g，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N9/08GK101812432SQ20101015179
公開(kāi)日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2010年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月21日
發(fā)明者張衛(wèi)國(guó) 申請(qǐng)人:張衛(wèi)國(guó)