專利名稱：甲型流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甲型流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株，還涉及以此適應(yīng)株作為供體株與 流行株重配，獲得流行株的Vero細(xì)胞適應(yīng)株，以制備Vero細(xì)胞流感疫苗，屬于生物技 術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
流感(influenza )是由流感病毒引起的一種急性呼吸道感染，具有高度傳染性， 主要經(jīng)空氣飛沫傳播，因此它能在短期內(nèi)突然發(fā)生，迅速蔓延，造成不同程度的流行， 甚至世界大流行，發(fā)病率高并伴有一定的死亡率，是目前人類尚不能有效控制的世界性 傳染病。
流感病毒屬于正粘病毒科，根據(jù)病毒核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(MP)的抗原性，可 將流感病毒分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。甲型流感病毒常以流行形式出現(xiàn)，乙 型流感呈局部爆發(fā)，丙型流感主要是以散發(fā)形式出現(xiàn)。其中甲型和乙型流感病毒與人類 有密切聯(lián)系，甲型流感病毒除感染人外還可感染飛禽、豬、馬等動(dòng)物，其亞型H5或H7 易引起高致病性禽流感(HPAI)。因此人在生活中與這些動(dòng)物接觸頻繁的地方，為流感 病毒產(chǎn)生變異提供了良好的環(huán)境，變異后的病毒會(huì)導(dǎo)致流感流行，變異程度大則導(dǎo)致大 流行。
流感病毒表面抗原的變異是流感流行的主要原因，其表面抗原的變異存在兩種機(jī) 制 一種被稱為抗原漂移，包括甲型流感病毒和乙型流感病毒，主要是通過在HA和NA 基因上的點(diǎn)突變和多種氨基酸選擇性突變，逃過機(jī)體的免疫作用和以前感染病毒后獲得 的抗體對(duì)病毒的抑制作用?？乖钠瓶僧a(chǎn)生新的流行株，同時(shí)它也是流感病毒能感染 人類，并繼續(xù)進(jìn)化的武器；另一種變異被稱為抗原大變異，僅發(fā)生在甲型流感病毒上， 當(dāng)宿主細(xì)胞同時(shí)被兩種不同亞型的甲型流感病毒感染時(shí)，新生的子代病毒可獲得來自兩 個(gè)親代病毒的基因片斷，成為基因重配病毒。基因重配能產(chǎn)生甲型流感病毒抗原性突變 株，如果該突變株能在未免疫接種的易感人群中傳播就會(huì)引起流感在世界大流行。
在人群中廣泛流行的甲型流感病毒有H1N1， H2N2和H3N2三個(gè)亞型。流感病毒A型 中的16種HA和9種NA組成的亞型廣泛存在于一些野生動(dòng)物如水鳥中。如果病毒沒有經(jīng)過遺傳重配，禽流感亞型一般不對(duì)人產(chǎn)生有效的感染。但這種迅速擴(kuò)散的病毒由于 經(jīng)常性的基因再分化，從而可能使其感染人類，例如，自從1997年香港爆發(fā)禽流感以 來，H5N1型經(jīng)過遺傳修飾除了導(dǎo)致大規(guī)模的在禽類中爆發(fā)，而且產(chǎn)生了多例人感染的事 件。2003年發(fā)現(xiàn)了該病毒株的變異，出現(xiàn)了可以感染人的新變異株，可能引起新的流感 大流行，WHO預(yù)測(cè)自從1968年后一場(chǎng)新的流感大流行正在逼近。
接種流感疫苗是預(yù)防流感及其并發(fā)癥的主要手段。1941年雞胚制備的流感滅活疫苗 在美國(guó)首次獲得批準(zhǔn)，在全世界得到廣泛應(yīng)用。目前使用的流感疫苗主要是用雞胚制備 的滅活的流感三聯(lián)裂解疫苗，包括甲型流感病毒H1N1株、H3N2株和乙型流感病毒毒株。 疫苗株的組分是由WHO根據(jù)每年全球流感病毒的變化規(guī)律推薦的用于下一年度疫苗生產(chǎn) 用流感病毒流行株的表面抗原來確定的。甲型流感病毒聯(lián)合體實(shí)驗(yàn)室利用遺傳重配技術(shù) 將雞胚高產(chǎn)株與野生流行株進(jìn)行重配，得到的含有流感病毒流行株的HA和NA表面糖蛋 白的新疫苗株，具有在雞胚上高產(chǎn)的特性。但是，雞胚作為培養(yǎng)基質(zhì)生產(chǎn)流感疫苗需要 復(fù)雜的純化過程，以降低人們對(duì)雞胚蛋白產(chǎn)生的變態(tài)反應(yīng)；而且流感病毒在雞胚中傳代 后病毒的血凝素抗原易產(chǎn)生變化使疫苗效力降低；另外雞胚難于大規(guī)模生產(chǎn)以滿足流感 大流行突發(fā)性需求；尤其是2003年以來全世界范圍內(nèi)高致病性禽流感的流行，使采用 雞胚生產(chǎn)流感病毒疫苗風(fēng)險(xiǎn)性增加。研究出安全有效的疫苗已經(jīng)成為流感疫苗重要研究 方向，尤其是要在應(yīng)對(duì)流感大流行時(shí)不受雞胚來源限制，世界衛(wèi)生組織敦促世界各國(guó)研 究新的流感疫苗生產(chǎn)基質(zhì)。
目前用于制備流感疫苗的哺乳動(dòng)物細(xì)胞主要是MDCK細(xì)胞和Vero細(xì)胞，雖然MDCK 細(xì)胞是培養(yǎng)和分離流感病毒的較好的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，但其存在潛在的致瘤性，使得其 應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)顧慮重重。非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)是世界衛(wèi)生組織推薦的疫苗生產(chǎn)細(xì) 胞系，現(xiàn)在采用Vero細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗已批準(zhǔn)上市的有脊髓灰質(zhì)炎疫苗、狂犬病疫苗、 乙型腦炎疫苗等。1998年開始,Kistnar等人在奧地利用Vero細(xì)胞研制純化的流感全病 毒滅活疫苗，免疫BALB/c小鼠后激發(fā)產(chǎn)生了較高的血凝抑制抗體，T細(xì)胞免疫應(yīng)答和 細(xì)胞因子的釋放水平也高。但Vero細(xì)胞并不是流感病毒的敏感培養(yǎng)基質(zhì)，產(chǎn)量較低且 多數(shù)病毒不能在Vero細(xì)胞上連續(xù)增殖，使得Vero細(xì)胞流感疫苗成本高，難于在市場(chǎng)上 使用。因此如何快速培育流感病毒Vero細(xì)胞高產(chǎn)適應(yīng)株，成為了 Vero細(xì)胞流感疫苗研 發(fā)的難題。人類細(xì)胞系PER.C6能使流感病毒在其中有效的生長(zhǎng)，是流感病毒培養(yǎng)的最 佳細(xì)胞之一，但它屬于荷蘭抗體和疫苗Crucell公司專利所有。
5反向遺傳學(xué)，是相對(duì)于經(jīng)典遺傳學(xué)而言的，是在獲得生物體基因組全部序列的基礎(chǔ) 上，通過對(duì)耙基因進(jìn)行必要的加工和修飾，如定點(diǎn)突變、基因插入/缺失、基因置換等， 再按組成順序構(gòu)建含生物體必需元件的修飾基因組，讓其裝配出具有生命活性的個(gè)體， 研究生物體基因組的結(jié)構(gòu)與功能，以及這些修飾可能對(duì)生物體的表型、性狀有何種影響 等方面的內(nèi)容。目前反向遺傳學(xué)己應(yīng)用于流感病毒跨種屬傳播機(jī)制研究，病毒毒力及其 致病性研究，疫苗研發(fā)等方向。疫苗研發(fā)的做法就是把雞胚高產(chǎn)的實(shí)驗(yàn)室毒株A/PR/8/ 34 (H1N1)和當(dāng)前流行毒株加以重配,獲得流行株的雞胚高產(chǎn)株，用以生產(chǎn)疫苗。相對(duì) 于傳統(tǒng)流感疫苗研制方法耗時(shí)繁瑣，并且要求足夠的雞胚供應(yīng)，反向遺傳學(xué)可以使疫苗 的研制周期縮短，工藝簡(jiǎn)化，因此反向遺傳學(xué)是應(yīng)對(duì)流感大流行的一個(gè)重要手段。
綜上所述，流感仍是人類尚不能有效控制的世界性傳染病，接種流感疫苗是預(yù)防流 感主要手段。目前使用雞胚作為制備流感疫苗的基質(zhì)，存在很多不足之處，如難以規(guī)模 化生產(chǎn)、工藝復(fù)雜、還有外源因子污染的可能等缺點(diǎn)。因此，使用傳代細(xì)胞如Vero細(xì) 胞制備流感疫苗成為流感疫苗發(fā)展的重要方向，而如何快速培育流感病毒Vero細(xì)胞高 產(chǎn)適應(yīng)株是Vero細(xì)胞流感疫苗和大流行流感疫苗研發(fā)的難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種甲型流感病毒Vero細(xì)胞高產(chǎn)適 應(yīng)株，該毒株在Vero細(xì)胞上傳代培養(yǎng)，血凝滴度可保持在1024以上。 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)途徑來實(shí)現(xiàn)的
一種流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株，命名為A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)，該毒株的保 藏號(hào)為CCTCCNO: V200514，保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址武漢市， 武漢大學(xué)；保藏日期2005年11月30號(hào)。
本發(fā)明目的之二是提供制備保藏號(hào)為CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero細(xì)胞適 應(yīng)株的方法。
本發(fā)明提供的保藏號(hào)為CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株，是將采 集得到的數(shù)十種野生流感病毒毒株在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)，培育25代之后得到的， 它具有H3亞型血凝素基因、N2亞型神經(jīng)氨酸酶基因和具有在Vero細(xì)胞上高產(chǎn)性狀的6 個(gè)內(nèi)部基因片段。
本發(fā)明提供的保藏號(hào)為CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株的基本特 征(a)透射電鏡觀察到所得的流感病毒直徑約為80-120nm，具有囊膜的較為典型的流
6感病毒形態(tài)；(b)基因序列分析表明在連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中，不易產(chǎn)生流感病毒基因 變異；(c)流感病毒在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)，血凝滴度可保持在1024以上；(d) HI實(shí)驗(yàn)表明病毒的HA抗原可被羊抗或其它動(dòng)物抗H3亞型流感病毒高免血清特異性識(shí) 別；(e) A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)活病毒經(jīng)自然途徑感染SPF雞后，感染雞無發(fā) 病和死亡。
本發(fā)明所述保藏號(hào)為CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株，經(jīng)過下列 方法獲得
A、 將臨床樣本中分離獲得的野毒株接種到已長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，以 簡(jiǎn)EM/F12或者M(jìn)EM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中再添加TPCK-胰酶至濃度為0. 2-1. 5ug/ml、牛 血清白蛋白至濃度為0. l-2ug/ml，以NaHCO:,調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH值為7-8;于33士2。C培養(yǎng) 48-96h后，收獲病毒液，完成第l次傳代培養(yǎng)；
B、 將上述第1代收獲的病毒液再次接種到Vero細(xì)胞上，按A步驟的方法培養(yǎng)后， 收獲病毒液；如此連續(xù)傳代至25代時(shí)，收獲病毒液，即得保藏號(hào)為CCTCC NO: V200514 的流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株。
本發(fā)明目的之三是提供流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株在制備流行株的Vero細(xì)胞適應(yīng)株 中的應(yīng)用。
本發(fā)明目的之四是提供流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株在制備流感疫苗中的應(yīng)用。 本發(fā)明目的之五是提供一種制備流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株的方法，以使用這一適
應(yīng)株制備Vero細(xì)胞流感疫苗。即以保藏號(hào)為CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero細(xì)胞
適應(yīng)株作為供體株，與流行株重配后，獲得流行株的Ver。細(xì)胞適應(yīng)株，最終使用這一
適應(yīng)株制備Vero細(xì)胞流感疫苗或Vero細(xì)胞大流行流感疫苗。
本發(fā)明提供的保藏號(hào)為CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株與流行株
用傳統(tǒng)方法重配制備流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株的方法，包括以下歩驟
1) 將保藏號(hào)為CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株與流行的亞型流感 病毒按比例進(jìn)行混合，具體比例由病毒血凝滴度和不同毒株生長(zhǎng)特性而決定；
2) 將上述混合物接種于9 10日齡SPF雞胚或者Vero細(xì)胞或者M(jìn)DCK細(xì)胞上，其 中接種SPF雞胚時(shí)，每胚接種O. l-0.3ml，于33土2。C孵育12-48h， 2-8'C過夜冷胚， 收集雞胚尿囊液即為病毒收獲液；接種Vero細(xì)胞時(shí)，每個(gè)小方瓶接種量為0. 05-0. 2ml， 置于33土2t:培養(yǎng)48-96h，收獲病毒液；接種MDCK細(xì)胞時(shí)，每個(gè)小方瓶接種量為
70. 05-0. 2ml，置于33土2。C培養(yǎng)48-96h，收獲病毒液；
3) 將2)收獲的病毒液中加入抗A/Yunnan/1/2005Va (H3N2)的抗血清至濃度為 1%-80%，具體濃度由抗體血凝抑制效價(jià)和病毒的血凝滴度而定，接種在Vero細(xì)胞上傳 代培養(yǎng)1次；或者將2)收獲的病毒液不加抗血清直接接種在Vero細(xì)胞上傳代培養(yǎng)1 次；
4) 反復(fù)重復(fù)3)步驟，使細(xì)胞傳代，并進(jìn)行抗體篩選，選育出流行株的Vero細(xì)胞 適應(yīng)株，以便使用這一適應(yīng)株制備Vero細(xì)胞流感疫苗或Vero細(xì)胞大流行流感疫苗。
本發(fā)明提供的保藏號(hào)為CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株與流行株 用反向遺傳學(xué)技術(shù)重配制備流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株的方法，包括以下歩驟
1) 將保藏號(hào)為CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株的6個(gè)內(nèi)部基因分 別克隆于雙向轉(zhuǎn)錄載體中，分別獲得6個(gè)內(nèi)部基因的重組質(zhì)粒；
2) 將流行株的2個(gè)表面蛋白基因同樣克隆于雙向轉(zhuǎn)錄載體中，分別獲得2個(gè)表面 蛋白基因的重組質(zhì)粒；
3) 將上述1)和2)的8個(gè)質(zhì)?；旌?，共轉(zhuǎn)染在哺乳動(dòng)物細(xì)胞293T或者COS或者 MDCK上，或者轉(zhuǎn)染在MDCK與293T的混合細(xì)胞上、或者M(jìn)DCK與COS的混合細(xì)胞上，培 養(yǎng)18-24h，取細(xì)胞培養(yǎng)物上清，即獲得流行株的Vero細(xì)胞適應(yīng)株，以便使用這一適應(yīng) 株制備Vero細(xì)胞流感疫苗或Vero細(xì)胞大流行流感疫苗。
所述雙向轉(zhuǎn)錄載體為流感病毒基因雙向轉(zhuǎn)錄載體pHW2000。 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果
(1) 采用本發(fā)明提供的保藏號(hào)為CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株 后，較現(xiàn)有技術(shù)的以雞胚作為培養(yǎng)基質(zhì)生產(chǎn)流感疫苗具有以下優(yōu)點(diǎn)①可以采用微載體 發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)Vero細(xì)胞和流感病毒，生產(chǎn)工藝易于標(biāo)準(zhǔn)化；②采用標(biāo)準(zhǔn)化的Vero 細(xì)胞，不含外源生物因子污染；③不含易于引起人體過敏的雞胚蛋白；④避免了流感病 毒在雞胚培養(yǎng)后病毒的血凝素抗原易產(chǎn)生變化使疫苗效力降低；⑤在流感大流行突發(fā)性 時(shí)，不受雞胚來源的影響，能夠生產(chǎn)出足夠的滿足市場(chǎng)需求的疫苗。
(2) 目前所用的流感疫苗生產(chǎn)用毒種都是與雞胚高產(chǎn)株重配或天然的雞配適應(yīng)株， 其一般在Vero細(xì)胞上不敏感。有的廠家直接將冊(cè)0提供的流感疫苗生產(chǎn)毒種接種到Vero 細(xì)胞上，但產(chǎn)毒量低或產(chǎn)量不穩(wěn)定，制約了利用Vero細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒、制備流感疫 苗的應(yīng)用。我們將臨床樣本中分離獲得的流感病毒，接種在Vero細(xì)胞上進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，培育出保藏號(hào)為CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株，并將其作為 供體株與流行的流感病毒株重配后，獲得Vero細(xì)胞疫苗生產(chǎn)用毒株，促進(jìn)了Vero細(xì)胞 流感疫苗和Vero細(xì)胞大流行流感疫苗的開發(fā)與應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例來進(jìn)一歩描述本發(fā)明方法，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證 的目的，決不限制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例1
保藏號(hào)為CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株的制備方法
1) 將臨床樣本中分離獲得的流感病毒接種到己長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，以 DMEM/F12作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中再添加TPCK-胰酶至濃度為lug/ml，牛血清白蛋白至濃 度為lug/ml，以NaHC03調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為7.5;于33±KC培養(yǎng)72h后，收獲病毒液， 完成第1次傳代培養(yǎng)；
2) 將第1次傳代培養(yǎng)收獲的病毒液再次接種到Vero細(xì)胞上，用與1)步驟相同的 方法及條件進(jìn)行培養(yǎng)后，收獲病毒液；如此在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代，傳代至25代時(shí)， 收獲病毒液即得流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株，命名為A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)，保藏 號(hào)為CCTCCNO: V200514，以此株作為供體株，與其它流行重配后獲得流行株的Vero 細(xì)胞適應(yīng)株，以用于Vero細(xì)胞流感疫苗和Vero細(xì)胞大流行流感疫苗的開發(fā)與應(yīng)用。
實(shí)施例2
流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)在無血清Vero細(xì)胞上連續(xù) 傳代培養(yǎng)保持穩(wěn)定高產(chǎn)。
1) 將實(shí)施例1所得的流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)接種 到無血清培養(yǎng)的已長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種量為每小方瓶0.2ml，維持母液成 分為SFM (Hyclone) ， TPCK-胰酶0. 5ug/ml，牛血清白蛋白L5ug/ml，用NaHCO,調(diào)整 pH值至7.2，置于33土rC培養(yǎng)72h，收獲病毒液，即完成第1代培養(yǎng)；
2) 將上述l)所得的第l代收獲的病毒液再次接種到無血清培養(yǎng)的Vero細(xì)胞上， 采用與l)相同的方法及條件進(jìn)行培養(yǎng)后，收獲病毒液；如此在Vero細(xì)胞上連續(xù)種毒傳 代，每代收獲液反復(fù)凍融三次后測(cè)其血凝滴度，血凝滴度維持在1024以上，表明毒株 A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)具有Vero細(xì)胞高產(chǎn)穩(wěn)定特性。
實(shí)施例3實(shí)施例1所得的流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)與 A/Caledonia/20/99 (H1N1)重配獲得H1N1流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株的方法
① 流感病毒重配
將Vero細(xì)胞非適應(yīng)株A/Caledonia/20/99 (H1N1)與流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株 A/Y腿an/l/2005Va (H3N2)按9 : 1體積比混合，接種9 10日齡SPF雞胚，每胚接種 0.2ml， 33土2'C孵育24h， 2'C過夜冷胚，收集雞胚尿囊液即為病毒收獲液；
② 重配后流感病毒H1N1 Vero細(xì)胞適應(yīng)株的選育
將①收獲的病毒液與抗體血凝抑制效價(jià)為1 : 640的抗A/Yunnan/l/2005Va (H3N2) 的抗血清按2 : l的體積比混合，37。C中和2小時(shí)后，接種到Vero細(xì)胞上培養(yǎng)48h，收獲病 毒液；再將收獲的病毒液同比例加入相同抗血清混合，37。C中和2小時(shí)后，接種到Vero 細(xì)胞上培養(yǎng)48h，收獲病毒液；再將收獲的病毒液不加抗血清，在Vero細(xì)胞上再連續(xù)傳 IO代，最終獲得第12代細(xì)胞種毒收獲液；
③ 血清學(xué)鑒定病毒型別
取第12代收獲的病毒液，測(cè)其血凝滴度并配置成4個(gè)血凝單位抗原，用H3N2陽(yáng)性 血清、H1N1陽(yáng)性血清、B型陽(yáng)性血清與病毒液以半加敏法進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)(H I)，血 凝滴度512，經(jīng)鑒定為H1N1流感病毒，以此株可用于Vero細(xì)胞流感疫苗的制備，或者 以此株再次作為供體株與其他流行株重配，從而獲得流行株的Vero細(xì)胞適應(yīng)株。 實(shí)施例4
實(shí)施例3所得的流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株H1N1與A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) 重配獲得H3N2流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株的方法
① 流感病毒重配
將Vero細(xì)胞非適應(yīng)株A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)與實(shí)施例3所得流感病毒Vero 細(xì)胞適應(yīng)株H1N1按1 : 1體積比混合，接種已長(zhǎng)成致密單層的MDCK細(xì)胞，每小方瓶接 種O. lml， 33土2'C培養(yǎng)72h，收獲病毒液；
② 重配后流感病毒H3N2 Vero細(xì)胞適應(yīng)株的選育
將①收獲的病毒液接種到Vero細(xì)胞上，每小方瓶接種0.05ml病毒液，33'C培養(yǎng)72小 時(shí)，收獲病毒液。再將收獲的病毒液與抗體血凝抑制效價(jià)為l : 3200的抗H1N1的抗血清 按5:1的體積比混合，37。C中和2小時(shí)后，接種到Vero細(xì)胞上培養(yǎng)72h，收獲病毒液；再 次將收獲的病毒液同比例加入相同抗血清混合，37'C中和2小時(shí)后，接種到Vero細(xì)胞上
10培養(yǎng)72h，收獲病毒液；再將收獲的病毒液不加抗血清，在Vero細(xì)胞上再連續(xù)傳5代，最 終獲得第8代細(xì)胞種毒收獲液；
③血清學(xué)鑒定病毒型別 取第8代收獲的病毒液，測(cè)其血凝滴度并配置成4個(gè)血凝單位抗原，用H3N2陽(yáng)性血 清、H1N1陽(yáng)性血清、B型陽(yáng)性血清與病毒液以半加敏法進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)(H I)，血凝 滴度512，經(jīng)鑒定為H3N2流感病毒，此株可用于Vero細(xì)胞流感疫苗的制備，或者以此 株再次作為供體株與其他流行株重配從而獲得流行株的Vero細(xì)胞適應(yīng)株。
實(shí)施例5
實(shí)施例1所得的流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)與流感病毒 H5N1重配獲得H5N1流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株的方法
① 流感病毒重配
將非流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株H5N1與流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株 A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)按1 : 1的體積比混合，接種到新鮮的Vero細(xì)胞上，接種 量為每小方瓶0. 15ml，維持母液成分為MEM， TPCK-胰酶L2ug/ml，牛血清白蛋白 1.7ug/ml ，用NaHC0:,調(diào)整pH值至7.4，置于33土2。C培養(yǎng)72h，收獲病毒液；
② 重配后流感病毒H5N1 Vero細(xì)胞適應(yīng)株的選育
將①收獲的病毒液與抗體血凝抑制效價(jià)為1: 128的抗A/Yunnan/l/2005Va (H3N2) 的抗血清，按5 : 8的體積比混勻，37t:中和2小時(shí)后，接種到Vero細(xì)胞上，33。C培養(yǎng) 96h，收獲病毒液，完成第l次傳代培養(yǎng)；再將收獲的病毒液不加抗血清，接種到Vero 細(xì)胞上34土rC培養(yǎng)96h，收獲病毒液，如此在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳4代；再將第5次傳 代培養(yǎng)收獲的病毒液，于4 8。C 10000rpm離心分離20分鐘，取上清；將所取上清按4 : 1的體積比與抗A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)的抗血清混勻，于37。C中和2小時(shí)，接種 到Vero細(xì)胞上，于33。C培養(yǎng)96h，收獲病毒液，完成第6次傳代培養(yǎng)；如此再依次按 20 : 1， 1 : 40， 1 : 80的體積比，與抗A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)的抗血清混勻，于 37。C中和2小時(shí)，接種到Vero細(xì)胞上，于33。C培養(yǎng)96h，傳代培養(yǎng)至第9代，收獲病 毒液；
③ 血清學(xué)鑒定病毒型別
取第9代收獲的病毒液，測(cè)其血凝滴度并配置成4個(gè)血凝單位抗原，用H3N2陽(yáng)性血 清、H1N1陽(yáng)性血清、B型陽(yáng)性血清與病毒液以半加敏法進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)(H I)，病毒
11血凝滴度512，經(jīng)鑒定為流感病毒H5N1，此重配毒株用于Vero細(xì)胞流感疫苗或Vero細(xì) 胞大流行流感疫苗的制備。 實(shí)施例6
實(shí)施例1所得的流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)，用反向遺 傳學(xué)技術(shù)重配獲得A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株的方法
1) 將實(shí)施例1所得的流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)的6
個(gè)內(nèi)部基因克隆于雙向轉(zhuǎn)錄載體raw20oo;
2) 將非流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)的2個(gè)表面蛋白
基因克隆于雙向表達(dá)載體raw2ooo;
3 )將流感病毒A/Yunnan/l/2005Va ( H3N2 )的6個(gè)內(nèi)部基因質(zhì)粒與 A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)的2個(gè)表面蛋白基因質(zhì)粒共8個(gè)混合，質(zhì)粒總2 n g，與 脂質(zhì)體8ul混勻后，共轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)18 24小時(shí)，于致密單層的COS細(xì)胞，培養(yǎng)24h，收獲 培養(yǎng)物上清，測(cè)其血凝滴度為64，獲得具有A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)的HA/NA的 流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株，此株用于Vero細(xì)胞流感疫苗的制備及大流行流感疫苗的制 備。
權(quán)利要求
1、一種流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株，命名為A/Yunnan/1/2005Va(H3N2)，該毒株的微生物保藏號(hào)為CCTCC NOV200514。
2、 如權(quán)利要求1所述的流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株，其特征在于它具有H3亞型血 凝素基因、N2亞型神經(jīng)氨酸酶基因和具有在Vero細(xì)胞上高產(chǎn)性狀的6個(gè)內(nèi)部基因片段。
3、 一種制備如權(quán)利要求l所述的流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株的方法，其特征在于經(jīng) 過下列步驟A、 將臨床樣本中分離獲得的野毒株接種到已長(zhǎng)成致密單層的Vero細(xì)胞上，以 DMEM/F12或者M(jìn)EM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中再添加TPCK-胰酶至濃度為0. 2-1. 5ug/ml、牛 血清白蛋白至濃度為0. l-2ug/ml，以NaHCO:,調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH值為7-8;于33±2"培養(yǎng) 48-96h后，收獲病毒液，完成第l次傳代培養(yǎng)；B、 將上述第l代收獲的病毒液再次接種到Vero細(xì)胞上，按A步驟的方法培養(yǎng)后， 收獲病毒液；如此連續(xù)傳代至25代時(shí)，收獲病毒液，即得保藏號(hào)為CCTCCNO: V200514 的流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株。
4、 如權(quán)利要求1所述流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株在制備流行株的Vero細(xì)胞適應(yīng)株 中的應(yīng)用。
5、 如權(quán)利要求1所述流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株在制備流感疫苗中的應(yīng)用。
6、 一種制備流行株的Vero細(xì)胞適應(yīng)株的方法，其特征在于經(jīng)過以下步驟1) 將保藏號(hào)為CCTCC NO: V200514的流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株與流行的亞型流感 病毒按比例進(jìn)行混合，具體比例由病毒血凝滴度和不同毒株生長(zhǎng)特性而決定；2) 將上述混合物接種于9 10閂齡SPF雞胚或者Vero細(xì)胞或者M(jìn)DCK細(xì)胞上，其 中接種SPF雞胚時(shí)，每胚接種O. 1-0. 3ml，于33士2。C孵育12-48h， 2-8。C過夜冷胚， 收集雞胚尿囊液即為病毒收獲液；接種Vero細(xì)胞時(shí)，每個(gè)小方瓶接種量為0. 05-0. 2ml， 置于33土2'C培養(yǎng)48-96h，收獲病毒液；接種MDCK細(xì)胞時(shí)，每個(gè)小方瓶接種量為 0. 05-0. 2ml，置于33士2。C培養(yǎng)48-96h，收獲病毒液；3) 將2)收獲的病毒液中加入抗A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)的抗血清至濃度為 1%-80%，具體濃度由抗體血凝抑制效價(jià)和病毒的血凝滴度而定，接種在Vero細(xì)胞上傳 代培養(yǎng)1次；或者將2)收獲的病毒液不加抗血清直接接種在Vero細(xì)胞上傳代培養(yǎng)1 次；4)反復(fù)重復(fù)3)步驟，使細(xì)胞傳代，并進(jìn)行抗體篩選，選育出流行株的Vero細(xì)胞 適應(yīng)株，以便使用這一適應(yīng)株制備Vero細(xì)胞流感疫苗或Vero細(xì)胞大流行流感疫苗。
7、 一種制備流行株的Vero細(xì)胞適應(yīng)株的方法，其特征在于經(jīng)過以下歩驟1) 將保藏號(hào)為CCTCC N0: V200514的流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株的6個(gè)內(nèi)部基因分 別克隆于雙向轉(zhuǎn)錄載體中，分別獲得6個(gè)內(nèi)部基因的重組質(zhì)粒；2) 將流行株的2個(gè)表面蛋白基因同樣克隆于雙向轉(zhuǎn)錄載體中，分別獲得2個(gè)表面 蛋白基因的重組質(zhì)粒；3) 將上述l)和2)的8個(gè)質(zhì)?；旌?，共轉(zhuǎn)染在哺乳動(dòng)物細(xì)胞293T或者COS或者 MDCK上，或者轉(zhuǎn)染在MDCK與293T的混合細(xì)胞上、或者M(jìn)DCK與COS的混合細(xì)胞上，培 養(yǎng)18-24h，取細(xì)胞培養(yǎng)物上清，即獲得流行株的Vero細(xì)胞適應(yīng)株，以便使用這一適應(yīng) 株制備Vero細(xì)胞流感疫苗或Vero細(xì)胞大流行流感疫苗。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備流行株的Vero細(xì)胞適應(yīng)株的方法，其特征在于所述 雙向轉(zhuǎn)錄載體為流感病毒基因雙向轉(zhuǎn)錄載體pHW2000。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甲型流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株及其應(yīng)用，所述甲型流感病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)株命名為A/Yunnan/1/2005Va(H3N2)，該毒株的保藏號(hào)為CCTCC NOV200514。該毒株含有H3亞型血凝素基因、N2亞型神經(jīng)氨酸酶基因和具有在Vero細(xì)胞上高產(chǎn)性狀流感病毒的6個(gè)內(nèi)部基因。將該毒株在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)，血凝滴度可保持在1024以上。該毒株可作為供體株與流行株遺傳重配，或采用反向遺傳學(xué)技術(shù)，將其6個(gè)內(nèi)部基因與流行株2個(gè)表面蛋白基因進(jìn)行基因重配，獲得流行株的Vero細(xì)胞適應(yīng)株，最終使用這一適應(yīng)株制備Vero細(xì)胞流感疫苗或Vero細(xì)胞大流行流感疫苗。
文檔編號(hào)A61K39/145GK101560503SQ20091009422
公開日2009年10月21日 申請(qǐng)日期2009年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月13日
發(fā)明者健 周, 姜述德, 孫明波, 廖國(guó)陽(yáng), 張英偉, 李衛(wèi)東, 范東瀛 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所