專(zhuān)利名稱：一種豬甲型h1n1流感病毒及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物病毒領(lǐng)域，涉及流感病毒株，具體涉及一種豬甲型Hmi病毒的新毒株及其用途。
背景技術(shù)：
流感病毒分為甲、乙、丙三型，甲型流感病毒最容易發(fā)生變異，流感大流行就是甲型流感病毒出現(xiàn)新亞型或舊亞型重現(xiàn)引起的。甲型流感病毒的表面抗原會(huì)經(jīng)常發(fā)生細(xì)小變異，這種變異被稱為“飄變” (drift)，形象地說(shuō)，“飄變”就是病毒通過(guò)細(xì)小的變化偽裝自己， 從而達(dá)到躲避人體免疫系統(tǒng)識(shí)別的目的。甲型流感病毒“飄變”的結(jié)果是每年引發(fā)流感的毒株都有可能不同，人們每年都需要重新接種流感疫苗進(jìn)行預(yù)防?！稗D(zhuǎn)變”(shift)主要是以前流行于人和動(dòng)物的流感病毒基因片段重組的結(jié)果，導(dǎo)致一種新的病毒“亞型”出現(xiàn)。因?yàn)槿梭w內(nèi)幾乎沒(méi)有抵御這種新型病毒的抗體，所以“轉(zhuǎn)變”的結(jié)果往往會(huì)導(dǎo)致流感的全球性大暴發(fā)。2009年4月，始發(fā)于北美的甲型Hmi流感，是北美豬重組株Hmi和歐亞豬流感 Hmi病毒重組而成，它包含了人、禽、豬三個(gè)來(lái)源的基因片段，并且通過(guò)了幾次重組。2009 年6月，WHO宣稱此次流感疫情為全球流感大流行。甲型流感病毒是引起人、畜、禽感染的重要人畜共患病毒病原，并可在世界范圍引起人群發(fā)生流感大流行。接種流感疫苗是避免患流感最有效的方法。由于流感病毒經(jīng)常變異，疫苗使用中的主要問(wèn)題是毒種的選擇，制造疫苗的毒株力求接近流行株。目前人群流感病毒的分離主要依靠細(xì)胞培養(yǎng)，也有用雞胚培養(yǎng)，鑒定型與亞型采用血凝抑制、免疫熒光、 RT-PCR等。2009年的1月，我國(guó)浙江地區(qū)屠宰場(chǎng)宰殺健康豬只鼻咽拭標(biāo)本分離培養(yǎng)，鑒定為豬甲型Hmi流感病毒。豬歷來(lái)被認(rèn)為是流感病毒基因發(fā)生重組的重要?jiǎng)游锼拗鳎M管人和豬Hmi流感病毒都起源于禽，但是Hmi流感病毒在豬只中的抗原性相對(duì)穩(wěn)定，人群缺乏對(duì)豬Hmi流感病毒的血清抗體。因此，對(duì)豬只Hmi流感病毒遺傳進(jìn)化信息了解保存，對(duì)掌握流感病毒宿主間重組、溯源，豐富病毒庫(kù)，完善對(duì)該病原引起感染監(jiān)測(cè)體系有重大意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株新的豬源甲型Hmi流感病毒，為豬、人甲型Hmi流感病毒全基因片段變異、重組監(jiān)測(cè)提供生物信息，利用該株豬源甲型Hmi流感病毒制備動(dòng)物免疫血清，為甲型Hmi的HA蛋白變異提供生物信息。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供上述病毒株的制備方法和疫苗研究。本發(fā)明提供了一種豬源甲型Hmi流感病毒，該病毒含有HA、NA、NP、PB1、PB2、PA、 NS、M共8個(gè)片段，8個(gè)片段的核苷酸序列分別如說(shuō)明書(shū)的核苷酸序列表所示。該病毒感染 MDCK細(xì)胞，可致細(xì)胞產(chǎn)生團(tuán)聚變圓、脫落現(xiàn)象。本發(fā)明采用屠宰場(chǎng)宰殺的健康豬只鼻咽拭標(biāo)本進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng)，單克隆熒光抗體鑒定培養(yǎng)物為甲型流感病毒。同時(shí)提取病毒核酸，采用HA、NA、PBU PB2、ΡΑ、Μ、NP、 NS的8個(gè)片段的特異引物進(jìn)行8個(gè)片段全基因RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后測(cè)序。進(jìn)入GenBank對(duì)8個(gè)片段全基因進(jìn)行搜尋比對(duì)，證實(shí)8個(gè)基因均與A/swine/Hong Kong/ NS1179/2007(H1N1)99%同源。HA蛋白327位水解位點(diǎn)處氨基酸序列為“IPSVQSR丨GL”，為非高致病力毒株特征。命名為A/SWine/Zhejiang/^6/2009(Hmi)，保藏單位名稱中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó).武漢市武昌珞珈山.武漢大學(xué)，保藏日期2009年6月10 日，保藏號(hào)為 CCTCC NO :V201016，分類(lèi)命名流感病毒A/swine/zhe jiang/^6/2009 (HlNl)。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供的甲型Hmi流感病毒A/swine/zhejiang/^6/2009(Hmi)， 具有8個(gè)片段全基因序列和下述特征1)感染MDCK細(xì)胞引起細(xì)胞團(tuán)聚變圓、破碎；2)熒光標(biāo)記單克隆抗體觀察，顯示被感染細(xì)胞有綠色熒光；3)感染細(xì)胞培養(yǎng)上清能凝集雞紅細(xì)胞4) HA 全基因序列與 A/swine/Hong Kong/NSl 179/2007 (Hmi) 99% 同源5) NA 全基因序列與 A/swine/Hong Kong/NSl 179/2007 (Hmi) 99% 同源6) PBl 全基因序列與 A/swine/Hong Kong/NSl 179/2007 (Hmi) 99% 同源7) PB2 全基因序列與 A/swine/Hong Kong/NSl 179/2007 (Hmi) 99% 同源8) PA 全基因序列與 A/swine/Hong Kong/NSl 179/2007 (Hmi) 99% 同源9)M 全基因序列與 A/swine/Hong Kong/NSl 179/2007 (Hmi) 99% 同源10) NP 全基因序列與 A/swine/Hong Kong/NSl 179/2007 (Hmi) 99% 同源11) NS 全基因序列與 A/swine/Hong Kong/NSl 179/2007 (Hmi) 99% 同源本發(fā)明提供了上述病毒的制備方法，包括如下步驟(1)屠宰場(chǎng)宰殺健康豬只鼻咽拭標(biāo)本，經(jīng)抗生素處理置4°C冰箱，4- 后接種于 MDCK細(xì)胞，過(guò)夜；(2)觀察細(xì)胞病變效應(yīng)，病變細(xì)胞采用甲型流感病毒單克隆熒光抗體檢測(cè)，熒光顯微鏡下觀察鑒定甲型流感病毒；(3)提取病毒 RNA，RNA 反轉(zhuǎn)錄為 c-DNA ；用 ΗΑ、ΝΑ、NP、PB1、PB2、PA、NS、M 共 8 個(gè)片段的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。所述的抗生素可以是青霉素和鏈霉素。所述的細(xì)胞病變效應(yīng)是指細(xì)胞產(chǎn)生團(tuán)聚變圓、脫落現(xiàn)象。本發(fā)明的病毒株可以用于制備豬源甲型流感病毒診斷試劑。也可以用于制備豬源甲型流感病毒疫苗。具體而言，本發(fā)明通過(guò)下述方法和步驟進(jìn)行1)樣品采集屠宰場(chǎng)宰殺健康豬只鼻咽拭標(biāo)本，保存在含BSA和雙抗的MEM緩沖液，4h內(nèi)冷鏈運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。2)病原體分離培養(yǎng)標(biāo)本經(jīng)抗生素處理置4°C冰箱，4h后接種于MDCK細(xì)胞，在5% C0237°C條件下培養(yǎng)，第二天觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，病變細(xì)胞采用甲型、乙型流感病毒單克隆熒光抗體檢測(cè)，熒光顯微鏡下觀察鑒定甲型、乙型流感病毒。3) RT-PCR鑒定用Trizol法提取病毒RNA ；以血凝素基因片段設(shè)計(jì)引物， MMLV(takara)37°C作用 Ih 將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 c_DNA ；進(jìn)行 PCR，循環(huán)條件為94°C 5min ；94°C 30s，51°C 30s, 72°C 30s, 72°C 5min。擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳觀察產(chǎn)物bp數(shù)，鑒定甲型流感病毒亞型。
4) 8個(gè)片段測(cè)序引物RT-PCR及序列分析用Trizol法提取病毒RNA ；用Oligo(dT) 和隨機(jī)六核苷酸引物，MMLV(takara) 37°C作用Ih將RNA反轉(zhuǎn)錄為c_DNA ；以血凝素、神經(jīng)氨酸酶、病毒聚合酶(PB1、PB2、PA)、基質(zhì)蛋白、核蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白8個(gè)基因片段設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行 PCR，循環(huán)條件為94°C 5min ；94°C 30s，51°C 30s, 72°C 30s, 72°C 5min。擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳切割回收提純后在DNA序列自動(dòng)分析儀上測(cè)序。5)8個(gè)片段基因進(jìn)化分析用MEGA4軟件對(duì)測(cè)序的8個(gè)片段基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示1)MDCK細(xì)胞為狗腎二倍體上皮細(xì)胞，細(xì)胞呈上皮樣形態(tài)；細(xì)胞感染流感病毒后可以出現(xiàn)細(xì)胞圓縮、脫落等的細(xì)胞病變。采用Dako Cytomation公司制備的IMAGEN 甲、乙型流感(Code no k6106)單克隆熒光抗體，在熒光顯微鏡下觀察鑒定為甲型流感病毒。2)分離株病毒經(jīng)Oligo (dT)和隨機(jī)六核苷酸引物RT為cDNAJ5HA、NA、PB1、PB2、 PA、M、NP、NS的8個(gè)片段的特異測(cè)序引物PCR成功擴(kuò)增出1717bp的HA，1390bp的NA，2191bp 的 PBl，2242bp 的 PB2，2154bp 的 PA，994bp 的 M, 1485bp 的 NP 和 885bp 的 NS。3)本發(fā)明方法中采用的細(xì)胞系為本領(lǐng)域公知的MDCK細(xì)胞。4)本發(fā)明A/swine/zhe j iang/^6/2009 (HlNl)毒株是2009年1月從浙江屠宰場(chǎng)宰殺的健康豬只鼻咽拭標(biāo)本分離株，與A/swine/Hong Kong/NS1179/2007 (HlNl) 99 %基因同源。本發(fā)明豬源甲型Hmi流感的基因序列為中國(guó)豬源流感病毒庫(kù)提供了重要的生物信息； 為流感病毒變異特別是宿主間重組溯源提供可參考生物信息；補(bǔ)充了中國(guó)豬源甲型Hmi 基因數(shù)據(jù)和病毒毒種株；并可用于疫苗的研究。本發(fā)明屬微生物病毒領(lǐng)域，具體涉及一種豬源甲型Hmi流感病毒毒株及其用途。 本發(fā)明通過(guò)屠宰場(chǎng)宰殺的健康豬只鼻咽拭標(biāo)本分離培養(yǎng)和DIF、RT-PCR鑒定，以及病毒的8 個(gè)基因全序列測(cè)序比對(duì)，證實(shí)所分離的病毒為豬甲型Hmi流感病毒毒株，命名為A/swine/ zhejiang/26/2009 (HlNl)保藏編號(hào)=CCTCC NO :V201016。發(fā)明毒株得到甲型 HlNl 的 8 個(gè)基因全序列，補(bǔ)充了我國(guó)流感病毒的極有價(jià)值的遺傳信息和具有8個(gè)基因全序列測(cè)序的流感病毒毒種保存，對(duì)該病原引起宿主間流感監(jiān)測(cè)體系的完善有重要作用。本發(fā)明A/swine/ zhejiang/26/2009 (HlNl)毒株還可用于制備豬源Hmi病毒感染的快速診斷試劑和豬只疫苗研究。


圖1是培養(yǎng)液替換為不含病毒是病毒接種液后36小時(shí)的正常MDCK對(duì)照細(xì)胞。圖2是接種該流感病毒100 TCID50病毒后36小時(shí)的MDCK細(xì)胞。圖3是熒光顯微鏡觀察甲、乙型熒光標(biāo)記單克隆抗體染色的正常對(duì)照細(xì)胞。圖4為熒光顯微鏡觀察甲、乙型熒光標(biāo)記單克隆抗體染色的感染細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式采集我國(guó)浙江地區(qū)屠宰場(chǎng)宰殺健康豬只600例鼻咽拭標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)鑒定。經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)分離到能產(chǎn)生明顯細(xì)胞病變并能穩(wěn)定傳代增殖的病毒7株，鑒定為豬甲型Hmi流感病
1)病原體分離培養(yǎng)咽拭標(biāo)本處理培養(yǎng)參照WHO推薦的方法，標(biāo)本青霉素、鏈霉素處理(終濃度均為100ug/ml)大于4h，1500g 4°C離心lOmin，取上清接種于MDCK細(xì)胞，在 5%C02 37°C條件下培養(yǎng)，24h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，病變細(xì)胞經(jīng)DIF 染色，熒光顯微鏡觀察鑒定為甲型流感病毒。2)甲型Hmi流感病毒全基因測(cè)序分別采用8個(gè)基因片段的測(cè)序引物，對(duì)8個(gè)基因片段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。細(xì)胞培養(yǎng)液用hvitrogen公司TRIzol LS Reagent試劑抽提病毒核酸，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega) 逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄條件為 42°C lh, 95°C 5min。保真 PCR(Ex Taq, TaKafci)，PCR 條件為94°C， 45s，50°C，45s，72°C，60s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，72°C延伸7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海市基康生物技術(shù)有限公司測(cè)序。結(jié)果顯示，單克隆直接免疫熒光觀察，為甲型流感病毒；對(duì)本發(fā)明病毒的HA基因全序列測(cè)序并采用MEGA4. O分析軟件進(jìn)行同源性分析，證實(shí)所分離株A/swine/HongKong/ NS1179/2007 (HlNl)氨基酸序列有99 %同源豬甲型Hmi流感病毒。而感染本發(fā)明病毒的 MDCK細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)團(tuán)縮、脫落的細(xì)胞病變。
權(quán)利要求
1.一種豬源甲型Hmi流感病毒，其特征在于，該病毒含有HA、NA、NP、PB1、PB2、PA、NS、M 共8個(gè)片段，8個(gè)片段的核苷酸序列依次如SEQ ID NO 1_8所示，該該病毒的保藏號(hào)為CCTCC NO :V201016。
2.如權(quán)利要求1所述的病毒，其特征在于，該病毒感染MDCK細(xì)胞，細(xì)胞產(chǎn)生團(tuán)聚變圓、 脫落現(xiàn)象。
3.權(quán)利要求1所述的病毒的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)取健康豬只鼻咽拭標(biāo)本，經(jīng)抗生素處理置4°C冰箱，4-5h后接種于MDCK細(xì)胞，過(guò)夜；(2)觀察細(xì)胞病變效應(yīng)，病變細(xì)胞采用甲型流感病毒單克隆熒光抗體檢測(cè)，熒光顯微鏡下觀察鑒定甲型流感病毒；(3)提取病毒RNA，RNA 反轉(zhuǎn)錄為 c-DNA ；用 ΗΑ、ΝΑ、NP、PB1、PB2、PA、NS、M 共 8 個(gè)片段的弓I物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的抗生素是青霉素和鏈霉素。
5.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的細(xì)胞病變效應(yīng)是指細(xì)胞產(chǎn)生團(tuán)聚變圓、脫落現(xiàn)象。
6.權(quán)利要求1所述的病毒的應(yīng)用，其特征在于，該病毒株應(yīng)用于制備甲型流感病毒診斷試劑。
7.權(quán)利要求1所述的病毒的應(yīng)用，其特征在于，該病毒株應(yīng)用于制備豬只甲型流感病毒疫苗。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物病毒領(lǐng)域，提供了豬源甲型H1N1流感病毒。該病毒含有HA、NA、NP、PB1、PB2、PA、NS、M共8個(gè)片段，其核苷酸序列依次分別如說(shuō)明書(shū)的核苷酸序列表中序列1-8所示。本發(fā)明通過(guò)健康豬只鼻咽拭標(biāo)本分離培養(yǎng)和DIF、RT-PCR鑒定，以及病毒的8個(gè)基因全序列測(cè)序比對(duì)，獲得并證實(shí)所分離的病毒為豬甲型H1N1流感病毒毒株，命名為A/swine/zhejiang/26/2009(H1N1)，保藏號(hào)CCTCC NOV201016。本發(fā)明的毒株補(bǔ)充了我國(guó)豬只甲型流感病毒的極有價(jià)值的遺傳信息，對(duì)該病原引起感染監(jiān)測(cè)體系的完善有重要作用，還可用于制備甲型H1N1病毒感染的快速診斷試劑。
文檔編號(hào)G01N33/569GK102154219SQ20101021640
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日
發(fā)明者姜慶五, 居麗雯, 蔣露芳 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)