專利名稱：中和抗甲型流感病毒抗體及其用途的制作方法
中和抗甲型流感病毒抗體及其用途本專利申請(qǐng)要求分別于2008年7月25日和2009年5月27日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/083，838號(hào)和第61/181，582號(hào)的權(quán)益，上述專利申請(qǐng)公開的全文以引用的方式并入本文，如同在本文中記載一樣。
背景技術(shù)：
對(duì)甲型流感病毒應(yīng)答的中和抗體被認(rèn)為對(duì)給定的病毒亞型是特異性的。存在16 種通過血凝素(HA)定義的甲型流感亞型。16種HA，即H1-H16可分為兩組。組1由H1、H2、 H5、H6、H8、H9、Hll、H12、H13 和 H16 亞型組成，組 2 包括 H3、H4、H7、H10、H14 和 H15 亞型。 盡管所有的亞型都存在于鳥類中，但主要是H1、H2和H3在人類中引發(fā)疾病。H5、H7和H9亞型在人類中引起散發(fā)性嚴(yán)重感染并可能引起新的大流行病。Hl和H3病毒不斷地進(jìn)化形成新的變體，這種現(xiàn)象稱為抗原漂移。由此，對(duì)以前的病毒應(yīng)答而產(chǎn)生的抗體對(duì)于新的漂移病毒保護(hù)性很差或沒有保護(hù)性。其結(jié)果是每年必須要制備新疫苗以用于抵抗預(yù)計(jì)要出現(xiàn)的Hl 和H3病毒，這個(gè)過程很昂貴且并不總是有效。這同樣適用于H5流感疫苗的制備。事實(shí)上， 還不清楚基于越南或印度尼西亞甲型流感病毒分離體的現(xiàn)有H5疫苗是否能抵抗未來的流行性H5病毒。由于這些原因，非常期望擁有誘導(dǎo)能夠中和所有甲型流感病毒亞型及其每年的變體(2006年，由Gerhard等人進(jìn)行了綜述)的廣譜中和抗體的疫苗。此外，廣譜中和異亞型抗體也可用在預(yù)防和治療中。已經(jīng)表征了識(shí)別甲型流感病毒的抗體。M2的抗體(只在被感染細(xì)胞上表達(dá)，而不在感染性病毒上表達(dá)的一種不變的小蛋白質(zhì))已經(jīng)顯示出一些體內(nèi)保護(hù)效果，這可能是通過用NK細(xì)胞或胞毒性T細(xì)胞靶向感染的細(xì)胞并加以破壞來實(shí)現(xiàn)的。但是，HA是中和抗體的首要目標(biāo)。其包含約500個(gè)氨基酸的大胞外域，其被宿主來源的酶裂解以產(chǎn)生通過二硫鍵連接的兩個(gè)多肽。較大的N-末端片段(HAl，320至330個(gè)氨基酸)形成包含受體結(jié)合位點(diǎn)和大部分被病毒中和抗體識(shí)別的決定簇的膜遠(yuǎn)端的球狀域。較小的C-末端部分(HA2，約180 個(gè)氨基酸)形成將球狀域錨定在細(xì)胞或病毒膜的莖狀結(jié)構(gòu)。亞型之間的序列同源性程度在 HAl多肽(亞型之間34%-59%同源性)中小于HA2多肽(51%-80%的同源性)。最保守的區(qū)是裂解位點(diǎn)周圍的序列，特別是HA2N-末端的11個(gè)氨基酸，其稱為為融合肽，在所有的甲型流感病毒亞型中均是保守的。這個(gè)區(qū)的部分以表面環(huán)暴露于HA前體分子(HAO)，但是當(dāng)HAO裂解為HA1/HA2時(shí)，則變得不可接近。總之，在不同的HA亞型中，特別是在HA1-HA2 連接區(qū)和在HA2區(qū)中都存在保守區(qū)。但是，這些區(qū)對(duì)于中和抗體可能是不易接近的。目前在確認(rèn)中和一種以上甲型流感病毒亞型的抗體中只取得了有限的成功，并且其中和寬度狹窄且效力低。Okuno等人(1993)用流感病毒A/Okuda/57 (H2N2)免疫小鼠并分離了單克隆抗體(C179)，該單克隆抗體(C179)結(jié)合HA2中的保守構(gòu)象表位，并在動(dòng)物模型中體外和體內(nèi)中和組1的H2、H1和H5亞型甲型流感病毒(Okuno等人，1993 ；Smirnov等人，2000 ；Smirnov 等人，1999)。最近，Gioia等人描述了接種了傳統(tǒng)季節(jié)性流感疫苗的某些個(gè)體患者的血清中存在H5W病毒的中和抗體(Gioia等人，2008)。作者認(rèn)為中和活性可能是由于神經(jīng)氨酸酶 (Ni)的抗體?？墒菦]有分離出單克隆抗體，也沒有表征靶表位。目前尚不清楚血清抗體是否中和其它甲型流感病毒亞型。盡管經(jīng)過了數(shù)十年的研究，但是還沒有投入市場的廣譜中和或抑制甲型流感病毒感染或緩解由甲型流感病毒引發(fā)的疾病的抗體。因此，需要鑒定抵御多種甲型流感病毒亞型的新抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明部分地基于從接種了季節(jié)性流感疫苗的個(gè)體分離結(jié)合HA并中和多于一種甲型流感病毒亞型感染的自然產(chǎn)生的人單克隆抗體以及本發(fā)明的抗體所結(jié)合的新表位。因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面中，本發(fā)明包括一種中和多于一種選自組1或組2的甲型流感病毒亞型的感染的抗體或其抗原結(jié)合片段。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括中和甲型流感病毒的至少兩種不同組1亞型或至少兩種不同組2亞型感染的抗體或其抗原結(jié)合片段。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中， 本發(fā)明包括一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶幻序列，該序列與 SEQ ID NO:1-6、17-22、33-38、49-53、64-68、78-82、93-98、109-114、125-127或133-135 中的任一個(gè)有至少95%的序列同一性，其中所述抗體中和甲型流感病毒。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括選自以下序列的重鏈⑶Rl :SEQ ID NO 1、SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :78、SEQ ID NO :93,SEQ ID NO :109、SEQ ID NO :125 和 SEQ ID NO :133 ；選自以下序列的重鏈 CDR2 :SEQ ID NO :2,SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :79、SEQ ID NO :94, SEQ ID NO :110、SEQ ID NO :1 禾口 SEQ ID NO :134 ；以及選自以下序列的重鏈 CDR3 :SEQ ID N0:3、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO :35, SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :66, SEQ ID NO :80, SEQ ID NO :95、SEQ ID NO :111, SEQ ID NO :127 禾口 SEQ ID NO : 135，其中所述抗體中和甲型流感病毒。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括抗體或其抗原結(jié)合片段，其包括選自以下序列的輕鏈CDRl =SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :52, SEQ ID NO :81、SEQ ID NO :96 禾口 SEQ ID NO :112 ；選自以下序列的輕鏈 CDR2 :SEQ ID NO 5、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :97 和 SEQ ID NO :113 ；和選自以下序列的輕鏈 CDR3 :SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :38, SEQ ID NO :53, SEQ ID NO :68,SEQ ID NO :82、SEQ ID NO :98禾口SEQ ID NO :114，其中所述抗體中和甲型流感病 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體包含含有SEQ ID N0:13的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID N0:14的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或含有SEQ ID NO :29的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO 30 的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或含有SEQ ID NO :45的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO :46的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或含有SEQ ID NO :60的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO 61的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或含有SEQ ID NO 74的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO 75的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或含有SEQ ID NO 89的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO 90的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或含有SEQ IDNO :105的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO :106的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或含有SEQ ID NO :121的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO :122的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，并且其中所述抗體中和甲型流感病毒。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種由永生B細(xì)胞克隆FB54、FB139、 FC6、FC41、FE43、FE53、FE17、FB75、FB110、FB177、FB79、FClc, FB118、FB179、FB186、FE9b、 FE25、FE54, FG20, FB 15b或FCM表達(dá)的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體中和甲型流
感病毒。在另一方面，本發(fā)明包括一種含有編碼本發(fā)明的抗體或抗體片段的多核苷酸的核酸分子。在另一方面，本發(fā)明包括一種含有本發(fā)明的核酸分子的載體或表達(dá)本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段的細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明包括含有結(jié)合本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段的表位的分離或純化的免疫原性多肽。本發(fā)明還包括一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段、本發(fā)明的核酸分子、包含本發(fā)明的核酸分子的載體、表達(dá)本發(fā)明的抗體或抗體片段的細(xì)胞或者本發(fā)明的免疫原性多肽以及藥學(xué)可接受的稀釋劑或載體(carrier)。本發(fā)明還包括一種藥物組合物，其包含第一抗體或其抗原結(jié)合片段，以及第二抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述第一抗體是本發(fā)明的抗體，而第二抗體是中和甲型流感病毒感染的抗體或其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段、本發(fā)明的核酸、包含本發(fā)明的核酸的載體、表達(dá)本發(fā)明的載體的細(xì)胞、包含結(jié)合本發(fā)明的抗體或抗體片段的表位的分離或純化的免疫原性多肽或者本發(fā)明的藥物組合物(i)在制備用于治療甲型流感病毒感染的藥物中的用途； (ii)在疫苗中的用途；或(iii)在甲型流感病毒感染的診斷中的用途也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段在通過檢查抗甲型流感病毒疫苗的抗原是否含有正確構(gòu)象中的特異表位來監(jiān)測(cè)所述疫苗的質(zhì)量中的用途也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在另一方面，本發(fā)明包括一種減少甲型流感病毒感染或降低甲型流感病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的方法，該方法包括向有需要的對(duì)象給予治療有效量的本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段。在另一方面，本發(fā)明包括一種特異性地結(jié)合本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段的表位，其用于(i)治療中；(ii)制備用于治療甲型流感病毒感染的藥物；(iii)作為疫苗；或 (iv)篩選能夠中和甲型流感病毒感染的配體。


圖IA-E示出了預(yù)防性地分別用抗體FE17或FE43處理，并在M小時(shí)后用HmiA/ PR/8/34、H6NlA/teal/HK/W312/97、H5N1A/VN/1203/04、H5N1A/IND0/5/05 或 H7N7A/ NL/219/03攻擊的小鼠的存活圖。圖IF示出了對(duì)非致死性病毒H9N2A/ck/HK/G9/97的體內(nèi)中和活性的結(jié)果。對(duì)小鼠i. P.注射FE43、FE17、對(duì)照抗體或白鼬超免疫血清，并在M小時(shí)后用105TCID50的H9N2 病毒攻擊。圖中示出了感染后的第4天肺中的病毒效價(jià)。發(fā)明詳述本發(fā)明部分地基于從接種了季節(jié)性甲型流感疫苗的個(gè)體中發(fā)現(xiàn)和分離廣譜中和不同甲型流感病毒亞型的自然產(chǎn)生的人抗體。這些抗體是期望的，因?yàn)橹灰笠环N或少數(shù)幾種抗體來中和不同的甲型流感病毒亞型。此外，由這些抗體所識(shí)別的表位可以是能夠誘導(dǎo)廣譜抗不同甲型流感病毒亞型的季節(jié)性和候選流行隔離的疫苗的一部分。因此，在一方面，本發(fā)明提供了一種中和至少兩種組1或組2亞型的甲型流感病毒的抗體及其抗原結(jié)合片段。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種中和甲型流感病毒的兩種不同組1亞型或兩種不同組2亞型的感染的抗體或其抗原結(jié)合片段。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了對(duì)不同甲型流感病毒亞型的HA具有廣譜特異性的中和抗體及其抗原結(jié)合片段。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段特異性地結(jié)合在兩種或更多種甲型流感病毒組1或組2亞型中是保守的HA的莖區(qū)的表位。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段特異性地結(jié)合在兩種或更多種的甲型流感病毒組1或組2亞型中是保守的HA的球狀頭部區(qū)的表位。人單克隆抗體、分泌本發(fā)明的抗體的永生B細(xì)胞克隆或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以及編碼本發(fā)明的抗體的核酸也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本文所用，術(shù)語“抗原結(jié)合片段”、“片段”和“抗體片段”互換地使用，指保持抗體的抗原結(jié)合活性的本發(fā)明的抗體的任何片段。示例性的抗體片段包括但不限于單鏈抗體、 Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv或scFv。如本文所用，術(shù)語“抗體”包括抗體及其抗原結(jié)合片段。如本文所用，術(shù)語“廣譜特異性”指可以結(jié)合和/或中和甲型流感病毒的兩種或更多種組1亞型或者兩種或更多種組2亞型的本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段。如本文所用，“中和抗體”指這樣的抗體，其可以中和，即預(yù)防、抑制、減少、阻礙或干擾病原體引發(fā)和/或維持宿主內(nèi)感染的能力。術(shù)語“中和抗體”和“中和…的抗體”或“中和…的多種抗體”在本文中互換地使用。如本文所述，這些抗體可以單獨(dú)使用，或作為預(yù)防劑或治療劑在合適的制劑中與作為診斷工具或制備工具的活性接種疫苗聯(lián)合使用。本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段中和多于一種組1亞型(H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、 H12、H13和H16以及它們的變體)的甲型流感病毒亞型，或多于一種組2亞型(H3、H4、H7、 H10、H14和H15以及它們的變體)的甲型流感病毒亞型。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體中和多于一種組1和組2亞型的甲型流感病毒亞型。本發(fā)明的抗體和抗體片段能夠中和甲型流感病毒亞型的各種組合。在一實(shí)施方案中，抗體可以中和甲型流感病毒Hl和H2亞型、或Hl和H5亞型、或Hl和H9亞型、或H2和 H5亞型、或H2和H9亞型、或H5和H9亞型，或H3和H7亞型、或HI、H2、H5亞型，或HI、H2 和H9亞型、或Hl、H5和H9亞型、或H2、H5和H9亞型或Hl、H2、H5和H9亞型。在一實(shí)施方案中，除了中和甲型流感病毒H6亞型外，本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合片段中和一種或多種的上述組合。本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合片段具有高中和效力。中和50%甲型流感病毒所需的本發(fā)明的抗體濃度可以例如為約50 μ g/ml或更低。在一實(shí)施方案中，中和50%甲型流感病毒所需的本發(fā)明的抗體濃度為約 50、45、40、35、30、25、20、17· 5、15、12· 5、11、10、9、8、7、6、5、 4. 5、4、3. 5、3、2. 5、2、1. 5或約1 μ g/ml或更低。在另一實(shí)施方案中，中和50%甲型流感病毒所需的本發(fā)明的抗體濃度為約 0. 9,0. 8,0. 75,0. 7,0. 65,0. 6,0. 55,0. 5,0. 45,0. 4,0. 35、 0. 3、0· 25、0· 2、0· 15、0· 1、0· 075、0· 05、0· 04、0· 03、0. 02,0. 0U0. 008,0. 006,0. 004,0. 003、 0. 002或約0. 001 μ g/ml或更低。這意味著僅需低濃度的抗體來中和50%的甲型流感病毒。 可使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)中和測(cè)定來測(cè)量特異性和效力。本發(fā)明的抗體
本發(fā)明提供了一種對(duì)HA具有特定廣譜特異性且其中和多于一種組1的甲型流感病毒亞型或者多于一種組2的甲型流感病毒亞型的抗體。本發(fā)明的抗體結(jié)合在兩種或更多種甲型流感病毒組1亞型中或者在兩種或更多種甲型流感病毒組2亞型中是保守的HA的區(qū)中的表位。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種結(jié)合在兩種或更多種組1或組2甲型流感病毒亞型中是保守的HA的莖區(qū)中的表位的抗體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種結(jié)合在兩種或更多種的組1或組2甲型流感病毒亞型中是保守的HA的球狀頭部區(qū)中的表位的抗體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種抗體如分離的抗體或純化的抗體，其特異性地結(jié)合HA的莖區(qū)或球狀頭部區(qū)中的保守表位，并干擾病毒的復(fù)制和擴(kuò)散。本發(fā)明還提供了一種抗體如分離的抗體或純化的抗體，其特異性地結(jié)合HA的莖區(qū)或球狀頭部區(qū)中的保守表位，并抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞。不受任何理論的約束，在示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段結(jié)合甲型流感病毒的莖區(qū)中的保守表位，并通過干擾融合步驟來抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞。蛋白的表位或抗原決定簇對(duì)應(yīng)于由抗體的結(jié)合位點(diǎn)(或互補(bǔ)位)特異性識(shí)別的分子的那些部分。因此，表位是需要互補(bǔ)的互補(bǔ)位來進(jìn)行操作性識(shí)別的相關(guān)實(shí)體。在蛋白的不同變體中保守的表位指相同的互補(bǔ)位可以通過接觸這些分子的相同部分來特異性地識(shí)別這些不同變體。本發(fā)明的抗體可以是單克隆的如人單克隆抗體或重組抗體。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的抗體片段，特別是保留了抗體的抗原結(jié)合活性的片段。盡管在某些地方，包括權(quán)利要求書的說明書明確指出了抗原結(jié)合片段、抗體片段、抗體的變體和/或衍生物，但是應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語“抗體”或“本發(fā)明的抗體”包括所有的抗體類別，即抗原結(jié)合片段、抗體片段、抗體的變體和衍生物。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和抗體片段中和甲型流感病毒的至少兩種不同組1亞型或者至少兩種不同組2亞型。示例性甲型流感病毒亞型包括但不限于H5m(A/ Vietnam/1203/04)、HlNl (A/New Caledonia/20/99)、HlNl (A/Salomon Island/3/2006)、 H3N2 (A/ffyoming/3/03)和 H9N2 (A/chicken/Hong Kong/G9/97)。在另一實(shí)施方案中，抗體對(duì)2、3、4、5、6、7或更多的組1甲型流感病毒亞型或組2甲型流感病毒亞型是特異性的。在示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種對(duì)甲型流感病毒亞型Hl和H5(例如Hmi 和H5m)是特異性的抗體或其抗體片段。在另一實(shí)施方案中，抗體或其抗體片段對(duì)甲型流感病毒亞型Hl和H9(例如Hmi和H9N》是特異性的。在另一實(shí)施方案中，抗體或其抗體片段對(duì)甲型流感病毒亞型H1、H5和H9(例如HlNl、H5m和H9N》是特異性的。在本申請(qǐng)的前面部分提供了其它的示例性甲型流感病毒的亞型。本發(fā)明的示例性抗體的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列的SEQ ID編號(hào)列于表1。表1.示例性甲型流感病毒中和抗體的VH和VL多肽SEQ ID NO
權(quán)利要求
1.一種中和甲型流感病毒的至少兩種不同組1亞型或至少兩種不同組2亞型感染的人抗體或其抗原結(jié)合片段。
2.如權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述甲型流感病毒亞型選自H1、H2、H3、H4、H5、H6、 H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 和 H16。
3.如權(quán)利要求1或2所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中中和50%甲型流感病毒所需的抗體濃度是50 μ g/ml或更低。
4.如權(quán)利要求1或2所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中中和50%甲型流感病毒所需的抗體濃度是10 μ g/ml或更低。
5.如權(quán)利要求1、2、3或4所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述組1亞型是H1、H2、 H5 或 H9。
6.如權(quán)利要求1、2、3或4所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述組2亞型是H3或H7。
7.如權(quán)利要求1、2、3或4所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或抗體片段中和三種、四種、五種或更多種甲型流感病毒亞型的感染。
8.如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體中和以下甲型流感病毒亞型的感染(i)Hl和H2 ； (ii)Hl和H5 ； (iii)Hl和H9 ； (iv)H2和H5 ； (v)H2 禾口 H9 ； (vi)H5 禾口 H9 ； (vii)H3 禾口 H7 ； (viii)Hl、H2 禾口 H5 ； (ix)Hl、H2 禾口 H9 ； (χ)Η1、Η5 禾口 H9 ； 或(xi)Hl、H2、H5 禾口 H9。
9.一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)序列，所述互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)序列與 SEQ ID NO :1-6、17-22、33-38、49-53、64-68、78-82、93-98、109-114、 125-127或133-135中的任一個(gè)具有至少95%的序列同一性，其中所述抗體中和甲型流感病毒。
10.一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含選自以下序列的重鏈⑶Rl =SEQ ID NO=USEQ ID NO 17,SEQ ID NO 33、SEQ ID NO 49、SEQ ID NO 64、SEQ ID NO 78、SEQ ID NO 93、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO :125 禾口 SEQ ID NO :133 ；選自以下序列的重鏈 CDR2 :SEQ ID NO :2、 SEQ ID NO18,SEQ ID NO 34、SEQ ID NO50,SEQ ID NO :65、SEQ ID NO79,SEQ ID NO: 94、SEQ ID N0:110、SEQ ID NO 126 ^P SEQ ID NO :134 ；以及選自以下序列的重鏈 CDR3 : SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO 80, SEQ ID NO 95, SEQ ID NO =IlUSEQ ID NO :127 禾口 SEQ ID NO 135，其中所述抗體中禾口甲型流感病毒。
11.一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含選自以下序列的輕鏈⑶Rl :SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :81、SEQ ID NO :96 和 SEQ ID NO 112 ；選自以下序列的輕鏈 CDR2 :SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :37, SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO :97 禾口 SEQ ID NO :113 ；以及選自以下序列的輕鏈 CDR3 :SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :38,SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :68, SEQ ID NO :82, SEQ ID NO :98 禾口 SEQ ID NO :114，其中所述抗體中和甲型流感病毒。
12.如權(quán)利要求10或11所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含含有以下氨基酸序列的重鏈:CDRH1 為 SEQ ID NO :1、CDRH2 為 SEQ ID NO 2 和 CDRH3 為 SEQ ID NO 3 ；或者 CDRHl 為 SEQ ID NO :17、CDRH2 為 SEQ ID NO 18 和 CDRH3 為 SEQ ID NO 19 ；或者 CDRHl 為 SEQ IDNO 33, CDRH2 為 SEQ ID NO 34 和 CDRH3 為 SEQ ID NO 35 ；或者 CDRHl 為 SEQ ID NO :49、 CDRH2 為 SEQ ID NO 50 和 CDRH3 為 SEQ ID NO 51 ；或者 CDRHl 為 SEQ ID NO :64、CDRH2 為 SEQ ID NO 65 和 CDRH3 為 SEQ ID NO 66 ；或者 CDRHl 為 SEQ ID NO :78、CDRH2 為 SEQ ID NO 79 和 CDRH3 為 SEQ ID NO 80 ；或者 CDRHl 為 SEQ ID NO :93、CDRH2 為 SEQ ID NO 94 和 CDRH3 為 SEQ ID NO 95 ；或者 CDRHl 為 SEQ ID NO :109、CDRH2 為 SEQ ID NO :110 和 CDRH3 為 SEQ ID NO :111 ；或者 CDRHl 為 SEQ ID NO :125、CDRH2 為 SEQ ID NO 126 禾口 CDRH3 為 SEQ ID NO 127 ；或者 CDRHl 為 SEQ ID NO :133、CDRH2 為 SEQ ID NO :134 和 CDRH3 為 SEQ ID NO :135。
13.如權(quán)利要求10、11或12所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含含有以下氨基酸序列的輕鏈CDRLl 為 SEQ ID NO :4、CDRL2 為 SEQ ID NO 5 和 CDRL3 為 SEQ ID NO 6 ；或者 CDRLl 為 SEQ ID NO :20、CDRL2 為 SEQ ID NO 21 和 CDRL3 為 SEQ ID NO 22 ；或者 CDRLl 為 SEQ ID NO :36、CDRL2 為 SEQ ID NO 37 和 CDRL3 為 SEQ ID NO 38 ；或者 CDRLl 為 SEQ ID NO 52, CDRL2 為 SEQ ID NO 5 和 CDRL3 為 SEQ ID NO 53 ；或者 CDRLl 為 SEQ ID NO :36、 CDRL2 為 SEQ ID NO 67 和 CDRL3 為 SEQ ID NO 68 ；或者 CDRLl 為 SEQ ID NO :81、CDRL2 為 SEQ ID NO 21 和 CDRL3 為 SEQ ID NO 82 ；或者 CDRLl 為 SEQ ID NO :96、CDRL2 為 SEQ ID NO 97 和 CDRL3 為 SEQ ID NO 98 ；或者 CDRLl 為 SEQ ID NO :112、CDRL2 為 SEQ ID NO :113 和 CDRL3 為 SEQ ID NO :114。
14.如權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含與SEQID NO13、29、45、60、74、89、105、121、131或139中任一個(gè)的氨基酸序列具有至少80%的序列同一性的重鏈可變區(qū)。
15.如權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含與SEQID NO14、30、46、61、75、90、106或122中任一個(gè)的氨基酸序列具有至少80%的序列同一性的輕鏈可變區(qū)。
16.一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體包含含有SEQ ID N0:13的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO 14的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或者含有SEQ ID NO 四的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和含有SEQID NO :30的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或者含有 SEQ ID NO :45的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO :46的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或者含有SEQ ID NO 60的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO 61的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或者含有SEQ ID NO 74的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO 75的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或者含有SEQID NO 89的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和含有 SEQ ID NO :90的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或者含有SEQ ID NO :105的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO 106的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或者含有SEQ ID NO :121的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO :122的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；其中所述抗體中和甲型流感病毒。
17.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是FC41、 FE43、FB110 或FE17。
18.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是單克隆抗體、純化的抗體、分離的抗體、單鏈抗體、Fab、Fab，、F (ab' )2、Fv或scFv。
19.一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其結(jié)合與如前述的權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體相同的表位，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段中和甲型流感病毒。
20.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其用于治療甲型流感病毒感染。
21.一種由永生 B 細(xì)胞克隆 FB54、FB139、FC6、FC41、FE43、FE53、FE17、FB75、FB110、 FB177、FB79、FClc, FB118、FB179、FB186、FE9b、FE25、FE54、FG20、FB 15b 或 FC54 表達(dá)的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體中和甲型流感病毒。
22.一種包含編碼如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的多核苷酸的核酸分子。
23.如權(quán)利要求22所述的核酸分子，其中所述多核苷酸序列與SEQID NO :7-12,15, 16、23-28、31、32、39-44、47、48、54-59、62、63、69-73、76、77、83-88、91、92、99-104、107、 108、115-120、123、124、128-130、132、136-138 或 140 中任一個(gè)的核酸序列至少 75%相同。
24.一種載體，其包含如權(quán)利要求22或23所述的核酸分子。
25.一種細(xì)胞，其表達(dá)如權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段或者包含如權(quán)利要求M所述的載體。
26.一種分離或純化的免疫原性多肽，其包含結(jié)合如權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的表位。
27.一種藥物組合物，其包含如權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段、如權(quán)利要求22或23所述的核酸、如權(quán)利要求M所述的載體、如權(quán)利要求25所述的細(xì)胞或如權(quán)利要求26所述的免疫原性多肽以及藥學(xué)可接受的稀釋劑或載體。
28.一種藥物組合物，其包含第一抗體或其抗原結(jié)合片段以及第二抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述第一抗體是如權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的抗體，并且所述第二抗體中和甲型流感病毒感染。
29.如權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段、如權(quán)利要求22或23 所述的核酸、如權(quán)利要求M所述的載體、如權(quán)利要求25所述的細(xì)胞、如權(quán)利要求沈所述的免疫原性多肽或者如權(quán)利要求27或觀所述的藥物組合物(i)在制備用于治療甲型流感病毒感染的藥物中的用途；(ii)在疫苗中的用途；或(iii)在甲型流感病毒感染的診斷中的用途。
30.如權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段在通過檢查抗甲型流感病毒疫苗的抗原是否含有正確構(gòu)象中的特異性的表位來監(jiān)測(cè)所述疫苗的質(zhì)量中的用途。
31.一種減少甲型流感病毒感染或降低甲型流感病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述方法包括向有需要的對(duì)象給予治療有效量的如權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。
32.—種特異性結(jié)合如權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的表位，其用于(i)治療中；(ii)制備用于治療甲型流感病毒感染的藥物；(iii)作為疫苗；或 (iv)篩選能夠中和甲型流感病毒感染的配體。
全文摘要
本發(fā)明涉及結(jié)合血凝素并中和甲型流感病毒的至少兩種不同組1亞型或至少兩種不同組2亞型感染的抗體及其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明還涉及編碼這樣的抗體及抗體片段的核酸、產(chǎn)生這樣的抗體及抗體片段的永生B細(xì)胞和培養(yǎng)的單漿細(xì)胞以及結(jié)合這樣的抗體及抗體片段表位。此外，本發(fā)明還涉及所述抗體、抗體片段和表位在篩選方法中以及在甲型流感病毒感染的診斷、治療和預(yù)防中的用途。
文檔編號(hào)C07K16/12GK102216327SQ200980132988
公開日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2009年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月25日
發(fā)明者A·蘭扎韋基亞 申請(qǐng)人:生物醫(yī)學(xué)研究所