專利名稱：針對甲型流感病毒h5n1株系的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對流感病毒，并且特別是對人類H5m甲型流感病毒具有特異性的人 類抗體。
背景技術(shù)：
甲型流感病毒是在人類中引起嚴(yán)重疾病的病原體?？蓞⒖贾晗档难?HA)和 神經(jīng)氨酸酶(NA)表面蛋白的亞型對它們進行分類。目前有抗原性彼此不同的16種已知的 HA亞型(Hl至H16)和9種NA亞型(附至N9)。人類群體中目前流行的甲型流感病毒是 Hmi或H3N2株系。當(dāng)出現(xiàn)能夠進行人類-至-人類(水平)傳播并且相對于目前流行的株系具有新 HA或NA亞型的甲型流感病毒株系時，即產(chǎn)生流感大流行。例如，人類群體目前在免疫學(xué)上 首次接觸(immimoligically naive)H5W株系，H5W株系已在禽類群體中流行了若干年。 如果H5W株系變得適應(yīng)于人類-至-人類傳播，則它可引起流感感染的大范圍爆發(fā)。目前應(yīng)對H5m爆發(fā)的方法包括預(yù)防性免疫接種或使用神經(jīng)氨酸酶抑制劑諸如奧 司他韋(達菲TM(TamifluTM))和扎那米韋(瑞樂#TM(RelenzaTM))。參考文獻1報道，具有 人類恒定域(κ輕鏈和IgGl重鏈)和鼠可變域的嵌合單克隆抗體可中和H5W病毒株系， 并因而適合用于預(yù)防和治療。參考文獻2公開了針對禽流感株系A(chǔ)/Ck/HK/Yu22/02制備的 鼠單克隆抗體，并提議可將它們?nèi)嗽椿Ｔ贖5亞型內(nèi)，根據(jù)HA序列病毒落入不同的譜系(稱為進化枝)。2004年和2005 年分別在越南和印度尼西亞分離的病毒指定為進化枝1和進化枝2(有時提及時使用羅 馬數(shù)字I和II)的參考株系。參考文獻1的抗體是針對A/Vietnam/1203/04和A/Hong Kong/213/03株系制備的，二者均在進化枝1中[3]。需要進一步的和改進的材料來預(yù)防和治療H5m甲型流感病毒感染和疾病，包括 H5N1的各個進化枝。

發(fā)明內(nèi)容
如下文更詳細(xì)地說明的，本發(fā)明人提供了可中和甲型流感病毒H5m株系的血凝 素的人類單克隆抗體。發(fā)明人還提供了具有選自由FLA5. 10、FLD21. 140、FLA3. 14和FLD20. 19組成的組 中的抗體的一個或多個CDR的抗體。優(yōu)選地，這些抗體可中和甲型流感病毒H5W株系的血凝素。發(fā)明人還提供了具有選自由FLD84、FLD93、FLD122, FLD127, FLD129, FLD132 和 FLD194組成的組中的抗體的一個或多個⑶R的抗體。優(yōu)選地，這些抗體可中和甲型流感病毒H5m株系的血凝素。發(fā)明人還提供了與選自由FLA5. 10、FLD21. 140、FLA3. 14和FLD20. 19組成的組中 的抗體結(jié)合相同表位的抗體。優(yōu)選地，這些抗體可中和甲型流感病毒H5m株系的血凝素。發(fā)明人還提供了與選自由FLD84、FLD93、FLD122, FLD127, FLD129, FLD132 和 FLD194組成的組中的抗體結(jié)合相同表位的抗體。優(yōu)選地，這些抗體可中和甲型流感病毒 H5N1株系的血凝素。發(fā)明人還提供了與選自由FLA5. 10、FLD21. 140、FLA3. 14、FLD20. 19、FLD84、FLD93、 FLD122、FLD127、FLD129、FLD132和FLD194組成的組中的抗體競爭結(jié)合H5血凝素蛋白的抗 體。優(yōu)選地，這些抗體可中和甲型流感病毒H5W株系的血凝素。發(fā)明人還提供了可中和H5亞型進化枝2中的甲型流感病毒株系的血凝素的抗體。發(fā)明人還提供了可中和甲型流感病毒H5W株系的血凝素的抗體，其中所述抗體 具有Iambda(A)輕鏈。發(fā)明人還提供了可中和甲型流感病毒H5m株系的血凝素的I gG抗體，條件是所述 抗體不具有IgGl重鏈。發(fā)明人還提供了本發(fā)明第一抗體和本發(fā)明第二抗體的組合，其中所述第一抗體和 第二抗體結(jié)合甲型流感病毒H5m株系的血凝素上的不同表位。因此所述抗體可能能夠同 時結(jié)合單個血凝素蛋白分子。一個此類組合包含抗體FLD20. 19和FLD194。另一組合包含 (i)與FLD20. 19競爭結(jié)合H5血凝素蛋白的抗體，和(ii)與FLD194競爭結(jié)合H5血凝素蛋 白的抗體。另一組合包含(i)與FLD20. 19結(jié)合相同表位的抗體，和(ii)與FLD194結(jié)合相 同表位的抗體。這些不同抗體可以各種方式生產(chǎn)，并可用于預(yù)防和治療病毒感染和疾病。它們還 可在診斷情況中使用。人類單克隆抗體在一些實施方案中，本發(fā)明提供可中和甲型流感病毒H5W株系的血凝素的人類 單克隆抗體。和非人類抗體不同，這些人類抗體在施用于人類時將不會引起針對它們的恒 定域的免疫應(yīng)答。與嵌合抗體(諸如參考文獻1中公開的那些)不同，這些人類抗體的可 變域是100%人類的(特別是除了互補性決定區(qū)[CDR]之外，可變域的構(gòu)架區(qū)是100%人類 的)，并且因此不會在施用于人類時引起針對可變域構(gòu)架區(qū)的免疫應(yīng)答(任選地，任何抗獨 特型應(yīng)答除外)。人類抗體不包括不具有人類來源的任何序列。術(shù)語“單克隆”在最初涉及抗體使用時指由免疫細(xì)胞的單個克隆系產(chǎn)生的抗體，其 與“多克隆”抗體相反，多克隆抗體雖然全部識別相同靶蛋白，但是卻由不同B細(xì)胞產(chǎn)生， 并且將針對所述蛋白上的不同表位。如本文所用，詞語“單克隆”并不暗示任何特定的細(xì)胞 來源，而是指全部具有相同的氨基酸序列并識別相同靶蛋白中的相同表位的抗體的任何群 體。因此，單克隆抗體可使用任何合適的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)包括免疫細(xì)胞、非免疫細(xì)胞、非細(xì) 胞系統(tǒng)等產(chǎn)生。這一用法在本領(lǐng)域中是常見的，例如以下產(chǎn)品的產(chǎn)品數(shù)據(jù)表均提到這些產(chǎn) 品為單克隆抗體表達于鼠骨髓瘤NSO細(xì)胞系的CDR移植的人源化抗體Synagis ，表達于 CHO細(xì)胞系的人源化抗體赫賽汀TM(HerceptinTM)，和表達于CHO細(xì)胞系的噬菌體展示抗體 Humira 。人類單克隆抗體可通過各種方法制備。例如，產(chǎn)生目標(biāo)抗原的人類B細(xì)胞可通過例如用埃巴病毒(EBV)感染而被永生化。人類單克隆抗體還可在非人類宿主中產(chǎn)生，通 過將所述宿主自身的免疫系統(tǒng)替換為有功能的人類免疫系統(tǒng)，例如至kid小鼠或三合體 (Trimera)小鼠中。人類Ig基因座轉(zhuǎn)基因的小鼠已成功用于產(chǎn)生人類單克隆抗體(包括針 對流感病毒M2蛋白的人類抗體[4])，例如Abgenix的“異種小鼠(xeno-mouse) ” [5]。噬 菌體展示也已成功W]，并得到了 Humira 產(chǎn)品。產(chǎn)生人類單克隆抗體的優(yōu)選方法公開于 參考文獻7&8。在此方法中，使用EBV在多克隆B細(xì)胞活化物的存在下轉(zhuǎn)化靶抗原特異性的 人類B記憶淋巴細(xì)胞。在本發(fā)明的具體實施方案中，發(fā)明人制備了本文稱作FLA5. 10、FLD21. 140、 FLA3. 14和FLD20. 19的人類單克隆抗體。在本發(fā)明的進一步具體的實施方案中，發(fā)明人制 備了本文稱作 FLD84、FLD93、FLD122, FLD127, FLD129, FLD132 和 FLD194 的人類單克隆抗 體。這些抗體是使用參考文獻7&8的技術(shù)制備的?？贵wFLA5. 10特異性識別進化枝1中的H5W病毒。表位作圖研究顯示它識別HA 蛋白。它的重鏈可變域的氨基酸序列是SEQ ID NO :13(由SEQID NO 14編碼)，并且它的輕 鏈(κ)可變域是SEQ ID NO :15(由SEQ ID而16編碼)。因此它的⑶R具有以下序列CDRHlΗ2Η3LlL2L3SEQ ID NO 171819202122抗體FLD21. 140特異性識別進化枝1中的H5W病毒。它識別HA蛋白。它的重鏈 可變域的氨基酸序列是SEQ ID NO :5 (由SEQ ID NO 6編碼)，并且它的輕鏈(λ )可變域 是SEQ ID NO :7 (由SEQ ID NO 8編碼)。因此它的⑶R具有以下序列CDRHlΗ2Η3LlL2L3SEQ ID NO 232425262728抗體FLA3. 14識別進化枝1和進化枝2中的H5W病毒。表位作圖研究顯示它識 別HA蛋白。它的重鏈可變域的氨基酸序列是SEQ ID Ν0:9(由SEQ ID Ν0:10編碼)，并且 它的輕鏈(κ )可變域是SEQ ID NO :11(由SEQ IDN0:12編碼)。因此它的⑶R具有以下 序列CDRHlΗ2Η3LlL2L3SEQ ID NO 293031323334抗體FLD20. 19識別進化枝1和進化枝2中的H5W病毒。它識別HA蛋白。它的 重鏈可變域的氨基酸序列是SEQ ID NO :1 (由SEQ ID NO 2編碼)，并且它的輕鏈(κ)可 變域是SEQ ID NO :3 (由SEQ ID NO 4編碼)。因此它的⑶R具有以下序列
權(quán)利要求
1.一種人類單克隆抗體，其可中和甲型流感病毒H5m株系。
2.如權(quán)利要求1所述的抗體，其結(jié)合甲型流感病毒H5m株系的病毒體中存在的血凝素。
3.如權(quán)利要求2所述的抗體，其具有包含SEQID NO 13的重鏈和包含SEQ ID NO 15 的輕鏈。
4.如權(quán)利要求2所述的抗體，其具有包含SEQID NO 5的重鏈和包含SEQ ID NO 7的 輕鏈。
5.如權(quán)利要求2所述的抗體，其具有包含SEQID NO :9的重鏈和包含SEQ ID NO 11 的輕鏈。
6.如權(quán)利要求2所述的抗體，其具有包含SEQID NO 1的重鏈和包含SEQ ID NO 3的 輕鏈。
7.如權(quán)利要求2所述的抗體，其具有包含SEQID NO :42的重鏈和包含SEQ ID NO 44 的輕鏈。
8.如權(quán)利要求2所述的抗體，其具有包含SEQID NO :52的重鏈和包含SEQ ID NO 54 的輕鏈。
9.如權(quán)利要求2所述的抗體，其具有包含SEQID NO :62的重鏈和包含SEQ ID NO 64 的輕鏈。
10.如權(quán)利要求2所述的抗體，其具有包含SEQID NO :72的重鏈和包含SEQ ID NO 74 的輕鏈。
11.如權(quán)利要求2所述的抗體，其具有包含SEQID NO :82的重鏈和包含SEQ ID NO 84 的輕鏈。
12.如權(quán)利要求2所述的抗體，其具有包含SEQID NO :92的重鏈和包含SEQ ID NO 94 的輕鏈。
13.如權(quán)利要求2所述的抗體，其具有包含SEQID NO :102的重鏈和包含SEQ ID NO 104的輕鏈。
14.一種抗體，其具有選自由 FLA5. 10、FLD21. 140、FLA3. 14、FLD20. 19、FLD84、FLD93、 FLD122, FLD127, FLD129, FLD132 和 FLD194 組成的組中的抗體的一個或多個 CDR(SEQ ID NO :17-40、45-50、55-60、65-70、75-80、85-90、95-100、105-110)。
15.一種抗體，其與選自由 FLA5. 10、FLD21. 140、FLA3. 14、FLD20. 19、FLD84、FLD93、 FLD122、FLD127、FLD129、FLD132和FLD194組成的組中的抗體結(jié)合相同的表位。
16.一種抗體，其可與選自由 FLA5. 10、FLD21. 140、FLA3. 14、FLD20. 19、FLD84、FLD93、 FLD122, FLD127, FLD129, FLD132和FLD194組成的組中的抗體競爭結(jié)合H5血凝素蛋白。
17.一種抗體，其可中和H5亞型進化枝2中的甲型流感病毒株系。
18.一種抗體，其可中和甲型流感病毒H5W株系，其中所述抗體具有λ輕鏈。
19.一種IgG抗體，其可中和甲型流感病毒H5W株系，條件是所述抗體不具有IgGl重鏈。
20.如權(quán)利要求14至19的任一項所述的抗體，其是人類抗體。
21.如前述權(quán)利要求的任一項所述的抗體，其中所述抗體可以100μg/ml或更低例如 1 μ g/ml或更低的濃度中和IOOTCID5q的H5W甲型流感病毒。
22.如權(quán)利要求21所述的抗體，其中所述抗體可以10(^8/1111或更低例如148/1111或 更低的濃度中和IOOTCID5q的進化枝1中的H5W甲型流感病毒株系和進化枝2中的H5W 甲型流感病毒株系二者。
23.如權(quán)利要求21或權(quán)利要求22所述的抗體，其中所述抗體可以lOOng/ml或更低的 濃度進行中和。
24.一種核酸，其編碼前述權(quán)利要求的任一項所述的抗體的重鏈和/或輕鏈。
25.根據(jù)權(quán)利要求1至23的任一項所述的第一抗體和根據(jù)權(quán)利要求1至23的任一項 所述的第二抗體的組合，其中所述第一抗體和第二抗體結(jié)合甲型流感病毒H5m株系的血 凝素上的不同表位。
26.一種治療患者的方法，所述方法包括向需要其的患者施用權(quán)利要求1至23的任一 項所述的抗體或權(quán)利要求25所述的組合。
27.第一抗體和第二抗體，其同時分開施用或順序施用，其中所述第一抗體是根據(jù)權(quán)利 要求1至23的任一項所述的抗體，且所述第二抗體是根據(jù)權(quán)利要求1至23的任一項所述 的抗體，且其中所述第一抗體和第二抗體不同。
28.如權(quán)利要求27所述的第一抗體和第二抗體，它們共同可中和H5W甲型流感病毒的 進化枝1株系和進化枝2株系。
29.如權(quán)利要求28所述的第一抗體和第二抗體，其結(jié)合相同H5血凝素上的不同表位。
全文摘要
本發(fā)明人提供了可中和甲型流感病毒H5N1株系的人類抗體。發(fā)明人還提供了可中和H5亞型進化枝2中的甲型流感病毒株系的抗體，可中和甲型流感病毒H5N1株系并具有λ輕鏈的抗體，和是可中和甲型流感病毒H5N1株系的IgG抗體(但不具有IgG1重鏈)的抗體。
文檔編號C07K16/00GK102046654SQ200880013049
公開日2011年5月4日 申請日期2008年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月13日
發(fā)明者A·蘭扎韋基亞 申請人:胡馬斯有限公司