專利名稱：一種表達人工修飾合成的甲型h1n1流感病毒ha-na-m1基因的重組桿狀病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒學領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種新的含有人工修飾合成的甲型H1N1流感病毒主 要免疫原性基因HA-NA-Ml和標記基因eGFP的重組桿狀病毒株，這種重組毒株標記基因eGFP和甲型H1N1 流感病毒HA-NA-M1蛋白，并包裝成流感樣病毒顆粒。該病毒顆粒研制的疫苗可以預防人和豬甲型HINI流 感病毒的感染。
背景技術(shù)：
甲型H1N1流感(Influenza virus H1N1)是引起人和豬的呼吸道疾病的重要原發(fā)病原之一，常常與 其他病原混合感染造成更嚴重的損失。該病毒屬于正粘病毒科流感病毒屬，根據(jù)病毒核蛋白抗原性不同， 分為甲、乙和丙三個型(國際稱其為A、 B和C三個型)。甲型流感病毒(influenza virus, IV)為有囊 膜的RNA病毒,其囊膜主要由血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)以及基質(zhì)蛋白(Ml)構(gòu)成。
甲型流感病毒危害巨大，不但影響畜牧業(yè)(尤其養(yǎng)禽業(yè))健康發(fā)展，更重要的是可以引起人類的流感
大暴發(fā)，產(chǎn)生重要的公共衛(wèi)生危害。人類歷史上發(fā)生過3次流感大暴發(fā)，即1918年由H1N1亞型流感病毒
引起的西班牙流感、1957年由H2N2亞型流感病毒引起的香港流感和1968年由H3N2亞型流感病毒引起的
亞洲流感。其病原均由當時存在于禽類的甲型流感病毒直接突變或和人的流感病毒在豬體內(nèi)重組而來，如
1918年西班牙流感病毒H1N1的HA和NA基因分別具有豬流感病毒和禽流感病毒的分子特征。2009年4月
出現(xiàn)甲型H1N1流感病毒是一種新型變異流感病毒。這種新的甲型流感病毒HA、NP和NS基因來源于與1918
年人流感病毒密切相關(guān)的經(jīng)典豬流感病毒；NA和M來自于1979年引入的歐洲豬流感病毒；PB1來自人的
H3N2; PB2和PA來源于禽流感，該流感在1998年前后引入到豬體(Chang LY，et al. Novel Swine-origin
Influenza Virus A (H1N1): The First Pandemic of the 21st Century. J Formos Med Assoc, 2009;108(7):526-623 )。
目前甲型H1N1流感幾乎從美洲蔓延至世界各地，傳播途徑既可以動物傳人，也可以人傳人。截至2009 年 7 月 6 日，目前全球已有 94512 人感染，429 人死亡 (http:〃麗.who. int/csr/don/2009 07 06/en/index. html):高效疫苗和抗病毒藥物預防控制甲型H1N1 流感病毒有效措施?，F(xiàn)階段治療甲型H1N1流感病毒最有效途徑是抗病毒藥物治療，目前使用較多的是 oseltamivir(又稱Tamiflu)和zanamivir,但是目前在丹麥、日本、美國、中國香港等國家和地區(qū)發(fā)現(xiàn)抗Tamiflu 耐藥毒株(htt.p:〃www.who.int/csr/disease/swineflu/notes/hlnl antiviral —resistance 20090708/en/index.html)， 從而增加了該疾病帶來的危險，該領(lǐng)域迫切需要有效的疫苗來預防控制該甲型H1N1流感病毒。迄今為止， 還沒有商品化的疫苗問世，而傳統(tǒng)的季節(jié)性流感疫苗不能有效預防該新型流感病毒。據(jù)冊O(shè)報道常規(guī)滅活 疫苗目前正在加緊研制，還沒有問世 (http:〃www.who.int/csr/disease/swineflu/notes/ hlnl vaccine 20090713/en/index.html)，新型疫苗還未見報道。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)出具有高效、安 全的針對甲型H1N1流感的基因工程疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的就是提供編碼甲型H1N1人工修飾合成的免疫原性基因cDNA序列。 本發(fā)明的另一個目的是提供一種轉(zhuǎn)移載體pFBDPHmHNMlP10eGFP，該載體含有編碼具有甲型H1N1
3流感病毒免疫原性基因HA-NA-M1的cDNA序列和標記基因eGFP。
本發(fā)明的另一個目的就是提供一種表達人工修飾合成的甲型H1N1流感病毒HA-NA-M1的重組桿狀病 毒，它含有人工修飾合成的甲型H1N1流感病毒主要免疫原性基因HA-NA-M1以及標記基因eGFP的重組桿 狀病毒株，該毒株被命名為QP-Ac-HNMl,屬于桿狀病毒(fecw7ow'/Y/s)，于2009年7月20送交湖北省 武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCC-V200912。
申請人根據(jù)密碼子的偏愛性人工合成了一種來源于甲型H1N1流感病毒編碼的主要免疫原性蛋白HA、 NA和M1的核苷酸序列，如SEQ ID N0:1、 SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示。
更詳細的技術(shù)方案見《具體實施方式
》所述。
本發(fā)明的有益效果是
1. 本發(fā)明根據(jù)密碼子的偏愛性，人工修飾合成了甲型H1N1流感病毒HA、 NA和M1基因，提高了這些 基因在桿狀病毒中表達水平。
2. 本發(fā)明所構(gòu)建的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體含有綠色熒光標記基因，提高了重組桿狀病毒的篩選效率，便 于監(jiān)控外源蛋白的表達。
3. 本發(fā)明是將合成HA、 NA和Ml基因分別置于桿狀病毒ra啟動子下串連表達，表達的蛋白在昆蟲細 胞中形成流感樣病毒顆粒(VLP)。
4. 本發(fā)明的重組桿狀病毒所表達包裝形成的流感樣病毒顆粒(VLP)可以剌激小鼠誘導產(chǎn)生免疫反應(yīng)。


序列表SEQ IDN0:1是本發(fā)明人工合成的HA基因核苷酸序列； 序列表SEQ ID N0:2是本發(fā)明人工合成的NA基因核苷酸序列； 序列表SEQ ID NO:3是本發(fā)明人工合成的Ml基因核苷酸序列； 圖1:顯示了表達綠熒光蛋白基因的桿狀病毒載體pFBD-gpA-P10eGFP物理圖譜；
圖2:顯示表達人工修飾合成的甲型H1N1流感病毒HA-NA-M1基因桿狀病毒載體 pFBDPHraHNMlPlOeGFP的物理圖譜；
圖3:是桿狀病毒載體pFBDPHmHNMlP10eGFP的酶切鑒定的電泳圖譜； 圖4:是在熒光顯微鏡下(4A)和光鏡下(4B)重組桿狀病毒感染sf9細胞結(jié)果的圖片。
具體實施例方式
實施例1:—種表達人工修飾合成的甲型H1N1流感病毒HA-NA-M1基因重組桿狀病毒QP-Ac-HNMl的 構(gòu)建。
1、 甲型HINI流感病毒主要免疫原性基因的合成。
參照甲型H1N1流感病毒A/California/04/2009(H1N1)毒株的HA、 NA和Ml基因序列，根據(jù)密碼子的 偏愛性人工合成HA、 NA和M1基因的序列，其中NA和M基因合成到一起，同時在NA基因N端加上桿狀病 毒多角 基因的啟動子(PH)，在其C端引SV40病毒的poly (A)序列'在Ml基因的N端加入啟動子HI。
2、 桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFBDPHmHNMlP10eGFP的構(gòu)建。
根據(jù)Invitrogen公司Bac-to-Bac Baculovirus Expression System (試齊U盒)中桿狀病毒載體 pFastBacDual骨架，加將雞的globin的polyA插入到Stul和Sail之間，將綠熒光蛋白基因eGFP插入到 P10下游的Ncol和Kpnl之間，獲得改造的桿狀病毒載體pFBD-gpA-P10eGFP，在該載體的基礎(chǔ)上，用Sa^I 和￡boRI分別酶切mHA基因和載體pFBD-gpA-P10eGFP，回收mHA基因和載體pFBD-gpA-PlOeGFP,用T4 DNA 連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5ct感受態(tài)細胞'涂布含有氨芐青霉素抗性平皿'37。C培養(yǎng)16小時'提取重組質(zhì)粒進行酶切鑒定后獲得載體pFBDPHmHAgpA-P10eGFP;再用Xhol和HindIII分別酶切mNA-mMl基因和 pFBDPHmHAgpA-P10eGFP,回收mNA-Mml基因和載體pFBDPHmHAgpA-PlOeGFP,然后連接，提取重組質(zhì)粒，酶 切鑒定，獲得最終桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFBDPHmHNMlPlOeGFP。 3、重組病毒桿狀病毒QP-Ac-HNM1的構(gòu)建。
(1) 重組穿梭載體(Bacmid)的構(gòu)建
取測序鑒定正確的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFBDPHmHNMlPlOeGFP和pFBD-gpA-P10eGFP 2yL與100 DHlOBac大腸桿菌感受態(tài)細胞混合，冰浴30min后，于42°C 45s水浴進行熱激，然后冰浴2rain,加入900 uLLB液體培養(yǎng)基(氯化鈉濃度為10%)， 37°C振搖培養(yǎng)4h,按10_1、 10—2、 10—3稀釋后，各取100yL涂 布于三抗高鹽LB平板(卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素，使用濃度按Invitrogen公司Bac-to-Bac Baculovirus Expression System (試劑盒)操作說明書)，37°C培養(yǎng)24-48h,通過藍白斑篩選、純化陽性菌落。
(2) 重組穿梭載體(Bacmid)的提取
無菌挑取含重組Bacmid的陽性菌落于高鹽LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至細菌對數(shù)生長期時，收集菌體用 0.3mL溶液I (50mmol/L葡萄糖，lOmraol/L EDTA, 25mmol/L Tris-CI (pH8. 0))重懸，加入0. 3mL溶液 II (0. 2raol/L NaOH, 1魁DS,現(xiàn)用現(xiàn)配)輕微混勻，室溫靜置5min，緩慢加入0. 3mL溶液III (3 mol/L的乙 酸鉀，pH5.0)混勻，冰浴5-lOmin, 14000r/min離心lOmin,上清加到0. 5mL異丙醇中，混勻冰浴5-lOmin， 室溫14000r/min離心15min， 70%乙醇洗滌沉淀，干燥后溶于40 w L TE中，可立即使用或-2(TC保存，避 免反復凍融。
(3) 重組桿狀病毒獲得
利用脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染法(按Invitrogen公司Bac-to-Bac Baculovirus Expression System (試劑盒) 操作說明書操作)，將篩選、純化后的重組穿梭載體(Bacmid)轉(zhuǎn)染到sf9昆蟲細胞(購自武漢大學中國 典型物保藏中心)中，于28'C培養(yǎng)，待出現(xiàn)細胞病變和發(fā)綠色熒光后，收集細胞培養(yǎng)上清即可獲得重組桿 狀病毒。
實施例2:重組桿狀病毒QP-Ac-HNMl鑒定、VLP疫苗制備和免疫原性實驗。 1、重組桿狀病毒QP-Ac-HNM1鑒定。
將sf9細胞接種6孔細胞培養(yǎng)板，待細胞長成80-90%單層時，用1個M0I重組桿狀病毒QP-Ac-HNM1接 種，同時設(shè)對照桿狀病毒，逐日觀察。感染72小時后90X以上的sf9細胞發(fā)亮綠熒光。
取400nl培養(yǎng)上清和細胞懸液，用胰蛋白酶在56'C下處理4個小時，用等體積的酚/氯仿抽提二次，取 上清加入1/10體積的3M醋酸納和2倍體積的無水乙醇沉淀，離心棄上清，用500^170%乙醇洗沉淀一次, 自然干燥后加入50^1滅菌的去離子水重懸作為PCR模板。PCR鑒定所用的上游引物為 5,——ttttcccgggatccaccatgaaggccatc—3,, 下 游 引 物 為 -
5， —ttttctcgaggattccgggtcactgtgag—3， <■
PCR擴增條件如下-
LA T叫酶 0.5^1
10xLA buffer 5.0nl
模板
特異性上游引物 i.opi
特異性下游引物 i.ow
dNTP 2，
5ddH2035.5^1
反應(yīng)條件
94 。C3 miii
94 °C30 s -
56 。C30 s
72'C3.0 min
72 。ClOmin
4°C00
PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明能夠擴增出一條2597bp特異的目的帶，大小與預 期一致，表明外源基因己經(jīng)成功的插入到重組桿狀病毒中。
2、 重組桿狀病毒QP-Ac-HNMl VLP疫苗制備。
參考Pushko P等人的方法(Influenza virus-like particles comprised of the HA, NA, and Ml proteins of H9N2 influenza virus induce protective immune response in BALB/c mice. Vaccine 2005,23:5751-5759)提取甲型H1N1流感病毒樣顆粒(VLP)。在剛長成單層的sf9細胞上，以3-5pfu/cell 的感染復數(shù)接種重組桿狀病毒QP-Ac-HNMl， 72小時后通過熒光顯微鏡檢測90%以上細胞發(fā)綠色熒光后 收集病變細胞并超聲波裂解，總體積為300ml。在4'C條件下8000g離心30min，然后用蔗糖濃縮到原體積 的1/10，上清中即含有表達的VLP顆粒。將上清27，000rpm/min，超速離心3小時，沉淀重懸于2ml的PBS 中，并用1ml的注射器反復吹打，然后病毒懸液用20-60%蔗糖密度梯度進行27，00rpm/min超速離心16 小時，最上層的蛋白帶即為流感病毒樣顆粒VLP。獲得的VLP用pH7.2的PBS重懸稀釋，27，000rpm/min， 超速離心3小時，沉淀重懸于2ml的PBS中，測定所獲得的VLP蛋白濃度，配成lmg/ml濃度，然后用等 體積的氟氏完全佐劑進行乳化制備成VLP疫苗，存儲于4'C備用。
3、 重組桿狀病毒QP-Ac-HNMl VLP疫苗免疫原性初步實驗。
10只雌性6-8周齡的Blab/C小鼠分為兩組，每組5只。第一組5只小鼠作為陰性對照，兩后腿肌肉 各注射PBS加氟氏完全佐劑乳化的對照疫苗10(^1。第二組5只小鼠兩后腿肌肉各注射VLP疫苗10(^1，共 含有2jigVLP蛋白。首免28天后用相同劑量加強免疫一次。分別于0天、14天、28天、42天采血，檢測 其血凝抑制抗體。血凝抑制抗體是用8個血凝單位的H1N2豬流感病毒進行檢測(注H1N2豬流感病毒 的HA基因與甲型H1N1流感病毒的HA基因同源性達到95X)。結(jié)果如下表所示初步表明VLP疫苗可 以誘導小鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
表l重組桿狀病毒QP-Ac-HNMl VLP疫苗免疫原性
. . MI抗體效價組別o天14天 28天42天
VLP疫苗組1016 58910
陰性對照組1010 1010
盡管本發(fā)明的內(nèi)容是結(jié)合本實施例進行說明，但是不能認為是對本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍由 所附權(quán)利要求書限定。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在所附權(quán)利要求書限定的范圍內(nèi)對本發(fā)明進行各種改動或 修飾，這些改動或修飾形式同樣落在本發(fā)明范圍內(nèi)。序列表
<110〉 <120> <130〉 〈141〉 〈160〉 <170>
華中農(nóng)業(yè)大學
一種表達人工修飾合成的甲型H1N1流感病毒HA-NA-Ml基因的重組桿狀病毒
2009-07-14 6
Patentln version 3. 1
<210> <211〉 <212〉 <213〉 〈220> <221> <222> <223> <220〉 <221〉 <222〉 <223> <400> 3tg aag Met Lys 1
get gac Ala Asp
gtg gac Val Asp
ctg etc Leu Leu 50
gCC CC3
Ala Pro 65
aac cc3 Asn Pro
gtg gaa Val Glu
1
1701 DNA
甲型流感病毒 (l)..(讓)
(Influenza A virus)
CDS (l)..
1
gec Ala
3CC
Thr
3CC
Thr 35 g朋 Glu
ctg Leu
gag Glu
acc Thr
(1701)
3tC
lie
etc
Leu
20
gtg
Val
gsc Asp
C8C
His
tgt Cys
cct Pro 100
ctg Leu 5
tgc Cys
ctg Leu
aag Lys
ctg Leu
gag
Glu
85
age
Ser
gtg gtc Val Val
3tC ggt lie Gly
gag肪g Glu Lys
cat His
ggt
Gly
70
tec
Ser
sac
Asn
55
肪a
Lys
etc Leu
ctg Leu
tac Tyr
aac
Asn
40
ggc
Gly
etc Leu
est
His
25
gtc
Val
Lys
tec gac Ser Asp
tec Ser
Asn
tac
Tyr
10
gec
Ala
acEi Thr
ctg Leu
tgt 38C ate
Cys Asn lie
3CC
Thr
ggc Gly 105
gec Ala 90
8CC
Thr
acc ttc Thr Phe
33C
Asn
gtc Val
tgc Cys
get
Ala
75
age
Ser
88C
Asn
8CC
Thr
Lys 60 ggc Gly
tec Ser
get acc Ala Thr
tgt tac Cys Tyr
tec Ser
His 45 etc Leu
tgg Trp
tgg Trp
cca Pro
3CC
Thr 30 tct Ser
cgc Arg
att lie
tec Ser
ggt Gly 110
gec
Ala
15
gsc
Asp
gtg Val
Asn
act Thr
助c Asn
ggc gtc Gly Val
ctg Leu
tac
Tyr
95
gac
Asp
ggt
Gly
80
ate
lie
ttc Phe
48
96
144
192
240
288
336
ate gat tac gag gag ctg cgc gag cag ctg age tec gtg tec tec ttc
384
7lie Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gin Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
115 120 125
gaa cgc ttt gaa ate ttc cct aag act age tec tgg cca aac cac gac 432
Glu Arg Phe Glu lie Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp
130 135 140
tct aac aag ggt gtg ace get gcc tgc cct cac get ggt gca卿age 480
Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser
145 150 155 160
ttc tac aag aac ctg ate tgg ctg gtg aaa aag ggt aac tct tac cca 528
Phe Tyr Lys Asn Leu lie Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro
165 170 175
aag etc age aag tec tac att aac gac aaa ggc aaa gaa gtc etc gtg 576
Lys Leu Ser Lys Ser Tyr lie Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val
180 185 190
ctg tgg ggc att cac cac cca tct acc agt gcc gac cag caa age etc 624 Leu Trp Gly lie His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gin Gin Ser Leu
195 200 205
tac cag aac gca gac acc tac gtc ttc gtg ggc tec tec cgc tac age 672 Tyr Gin Asn Ala Asp Thr Tyr Val Phe Val Gly Ser Ser Arg Tyr Ser
210 215 220
aag卿ttc aag cct gag ate gcc ate cgc cct aag gtg agg gac cag 720 Lys Lys Phe Lys Pro Glu lie Ala lie Arg Pro Lys Val Arg Asp Gin 225 230 235 240
gag ggc cgc atg aac tac tac tgg aca ctg gtg gag cct ggc gac aag 768 Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys
245 250 255
ate acc ttc gag gcc 8cc ggc aac ctg gtg gtc cct aga tac gcc ttc 816 lie Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe
260 265 270
get atg gag aga aac get ggt tct ggt ate ate ate tec gac acc cca 864 Ala Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser Gly lie lie lie Ser Asp Thr Pro
275 280 285
gtc cac gac tgc aac aca act tgt cag aca cct aag ggt gcc ate aac 912 Val His A印Cys Asn Thr Thr Cys Gin Thr Pro Lys Gly Ala lie Asn
290 295 300
acc age etc cca ttc cag aac ate cac cct ate acc ate ggc aag tgc 960 Thr Ser Leu Pro Phe Gin Asn lie His Pro lie Thr lie Gly Lys Cys 305 310 315 320
cca aag tac gtg犯g age aca aag ctg cgc ctg gcc aca ggc ctg cgc 1008 Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg
325 330 335
aac ate cct tec ate cag tec卿ggc ctg ttc ggc gcc ate gcc ggt 1056 Asn lie Pro Ser lie Gin Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala lie Ala Gly 340 345 350ttc ate gag ggc ggc tgg aca ggc atg gtg gac ggt tgg tac ggt tac 1104 Phe lie Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr
355 360 365
cac cat cag aac gag cag ggc tec ggt tac get gcc gac ctg aag age 1152 His His Gin Asn Glu Gin Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser
370 375 380
acc cag aac gcc ate gac gag ate acc aac aag gtg aac tec gtg ate 1200 Thr Gin Asn Ala lie Asp Glu lie Thr Asn Lys Val Asn Ser Val lie 385 390 395 400
gag aag atg aac acc cag ttc acc get gtg ggt aag gag ttc aac cac 1248 Glu Lys Met Asn Thr Gin Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His
405 410 415
ctg gaa aag cgc ate gag aac etc aac aag aag gtt gac gac ggt ttc 1296 Leu Glu Lys Arg lie Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe 420 425 430
ctg gac ate tgg acc tac aac gcc gag ctg ctg gtg ctg ctg gaa aac 1344 Leu Asp lie Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn
435 440 445
gag cgc acc ctg gac tac cac gat tec aac gtg aag aac ctg tac gag 1392 Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu
450 455 柳
aag gta cgc age cag ctg aag aac aac gcc aag gaa ate ggc aac ggc 1440 Lys Val Arg Ser Gin Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu lie Gly Asn Gly 465 470 475 480
tgc ttc gag ttt tac cac aag tgc gac aac acc tgc atg gag age gtc 1488 Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val
485 490 495
aag aac ggc acc tac gac tac cca aag tac tec gag gaa gcc aag etc 1536 Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu
500 505 510
aac cgc gag gaa ate gac ggc gtg aag ctg gag tec aca cgc ate tac 1584 Asn Arg Glu Glu lie Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg lie Tyr
515 520 525
cag att ctg gcc ate tat tec act gtg gcc age tec ctg gtg ctg gtg 1632 Gin lie Leu Ala lie Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val
530 535 540
gtc tec ctg ggc gcc ate age ttc tgg atg tgc tct aac ggc tec etc 1680 Val Ser Leu Gly Ala lie Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu 545 550 555 560
cag tgt cgc ate tgc ate taa 1701 Gin Cys Arg lie Cys lie 565
〈210〉 2<211> 566 〈212> PRT
<213〉 甲型流感病毒(Influenza A virus) 〈400〉 2
Met Lys Ala lie Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn
15 10 15
Ala Asp Thr Leu Cys lie Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val
50 55 60
Ala Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn lie Ala Gly Trp lie Leu Gly 65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr lie
85 90 95
Val Glu Thr Pro Ser Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe
100 105 110
lie Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gin Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
115 120 125
Glu Arg Phe Glu lie Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp
130 135 140
Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser 145 150 155 160
Phe Tyr Lys Asn Leu lie Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro
165 170 175
Lys Leu Ser Lys Ser Tyr lie Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val
180 185 190
Leu Trp Gly lie His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gin Gin Ser Leu
195 200 205
Tyr Gin Asn Ala Asp Thr Tyr Val Phe Val Gly Ser Ser Arg Tyr Ser
210 215 220
Lys Lys Phe Lys Pro Glu lie Ala lie Arg Pro Lys Val Arg Asp Gin 225 230 235 240
Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys
245 250 255
lie Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe
260 265 270
Ala Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser Gly lie lie lie Ser Asp Thr Pro
275 280 285
Val His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gin Thr Pro Lys Gly Ala lie Asn
290 295 300
Thr Ser Leu Pro Phe Gin Asn lie His Pro lie Thr lie Gly Lys Cys 305 310 315 320
Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu ArgAsn
Phe
His
Thr 385 Glu
Leu
Leu
Glu
Lys 465 Cys
Lys
Asn
Gin
Val 545 Gin
lie
lie
His 370 Gin
Lys
Glu
Asp
Arg 450 Val
Phe
Asn
Arg
lie 530 Ser
Cys
Pro
Glu 355 Gin
Asn
Met
Lys
lie 435 Thr
Arg
Glu
Gly
Glu 515 Leu
Leu
Arg
Ser 340 Gly
Asn
Ala
Asn
Arg 420 Trp
Leu
Ser
Phe
Thr 500 Glu
Ala
Gly
lie
325 lie
Gly
Glu
lie
Thr 405 lie
Thr
Asp
Gin
Tyr 485 Tyr
lie
lie
Ala
Cys 565
Gin
T卬
Gin
Asp 390 Gin
Glu
Tyr
Tyr
Leu 470 His
Asp
Asp
Tyr
lie 550 lie
Ser
Thr
Gly 375 Glu
Phe
Asn
Asn
His 455 Lys
Lys
Tyr
Gly
Ser 535 Ser
Arg
Gly 360 Ser
lie
Thr
Leu
Ala 440 Asp
Asn
Cys
Pro
Val 520 Thr
Phe
Gly 345 Met
Gly
Thr
Ala
Asn 425 Glu
Ser
Asn
Asp
Lys 505 Lys
Val
Trp
330 Leu
Val
Tyr
Asn
Val 410 Lys
Leu
Asn
Ala
Asn 490 Tyr
Leu
Ala
Met
Phe
Asp
Ala
Lys 395 Gly
Lys
Leu
Val
Lys 475 Thr
Ser
Glu
Ser
Cys 555
335
Gly Ala lie Ala Gly 350
Gly Trp Tyr Gly Tyr 365
Ala Asp Leu Lys Ser 380
Val Asn
Lys Glu Val Asp
Ser Val lie 400
Phe Asn His
415 Asp Gly Phe 430
Leu Glu Asn
Val Leu 445
Lys Asn Leu Tyr Glu 460
Glu lie
Cys Met Glu Glu
Gly Asn Gly ■
Glu Ser Val
495 Ala Lys Leu 510
Arg lie Tyr
Ser Thr 525
Ser Leu Val Leu Val 540
Ser Asn Gly Ser Leu 560
〈210> 3
<211> 畫
〈212〉 DNA
<213〉 甲型流感病毒(Influenza A virus) <220>
<221〉 gene
〈222〉 (1)..(1410) <223> <220>
<221> CDS
<222> (l)..(l楊)
<223>
< 3
11atg aac cca aac cag aag ate ate acc att ggc tec gtg tgc atg ace 48 Met Asn Pro Asn Gin Lys lie lie Thr lie Gly Ser Val Cys Met Thr 15 10 15
att ggc atg gcc aac ctg ate etc cag ate ggc aac ate ate tec ate 96 lie Gly Met Ala Asn Leu lie Leu Gin lie Gly Asn lie lie Ser lie
20 25 30
tgg ate age cac tec ate cag etc ggc aac cag aac cag ate gag acc 144 Trp lie Ser His Ser lie Gin Leu Gly Asn Gin Asn Gin lie Glu Thr
35 40 45
tgc aac cag age gtc ate act tac gag aac aac acc tgg gtg aac cag 192 Gys Asn Gin Ser Val lie Thr Tyr Glu Asn Asn Thr Trp Val Asn Gin
50 55 60
acc tac gtg aac ate age aac acc aac ttc get gcc ggc cag tec gtg 240 Thr Tyr Val Asn lie Ser Asn Thr Asn Phe Ala Ala Gly Gin Ser Val 65 70 75 80
gtc tec gtg aaa ctg gcc ggc aac tec tct etc tgc cct gtg age ggc 288 Val Ser Val Lys Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Val Ser Gly
85 90 95
tgg get ate tac agt aaa gac aac agt gtg cgc ate ggt tec aag ggc 336 Trp Ala lie Tyr Ser Lys Asp Asn Ser Val Arg lie Gly Ser Lys Gly
100 105 110
gat gtg ttc gtc ate cgc gag cca ttc ate tec tgc tec cct ctg gag 384 Asp Val Phe Val lie Arg Glu Pro Phe lie Ser Cys Ser Pro Leu Glu
115 120 125
tgc cgc acc ttc ttc ctg act cag ggc gcc ctg etc aac gac aag cat 432 Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Gin Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His
130 135 140
tec aac ggc acc ate aaa gac cgc age cca tac cgc acc ctg atg age 480 Ser Asn Gly Thr lie Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser 145 150 155 160
tgt cct ate ggt gag gtg cct tct cca tac aac tct cgc ttc gag tec 528 Cys Pro lie Gly Glu Val Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser
165 170 175
gtc get tgg tec gcc age get tgc cac gac ggc ate aac tgg ctg aca 576 Val Ala Trp Ser Ala Ser Ala Cys His Asp Gly lie Asn Trp Leu Thr
180 185 190
ate ggc ate tct ggc cca gac aac ggc gcc gtg get gtg ctg aag tac 624 lie Gly lie Ser Gly Pro Asp Asn Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr
195 200 205
aac ggc ate att acc gac acc ate卿age tgg cgc aac aac ate ctg 672 Asn Gly lie lie Thr Asp Thr lie Lys Ser Trp Arg Asn Asn lie Leu
210 215 220
cgc aca cag gag tct gaa tgt gcc tgt gtg aac ggt tct tgc ttc act 720 Arg Thr Gin Glu Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr 225 230 235 240gtg atg acc gac ggc cca age aac ggc cag gcc tec tac aag att ttc 768 Val Met Thr Asp Gly Pro Ser Asn Gly Gin Ala Ser Tyr Lys lie Phe
245 250 255
cgc ate gag aag ggc aag ate gtc aag tec gtc gag atg aac gcc cct 816 Arg lie Glu Lys Gly Lys lie Val Lys Ser Val Glu Met Asn Ala Pro
260 265 270
aac tac cac tat gag gaa tgc tec tgt tac cct gac tct age gag ate 864 Asn Tyr His Tyr Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ser Ser Glu lie
275 280 285
acc tgt gtg tgc cgc gac asc tgg cac ggc tec aac cgc cct tgg gtg 912 Thr Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val
290 295 300
tct ttc aac cag aac ctg gag tac cag ate ggc tac ate tgt age ggc 960 Ser Phe Asn Gin Asn Leu Glu Tyr Gin lie Gly Tyr lie Cys Ser Gly 305 310 315 320
ate ttc ggc gac aac cca cgc cct aac gac aag aca ggc age tgc ggt 1008 lie Phe Gly Asp Asn Pro Arg Pro Asn Asp Lys Thr Gly Ser Cys Gly
325 330 335
cca gtg tec tct aac ggt gcc aac ggc gtg aag ggc ttc tec ttc aag 1056 Pro Val Ser Ser Asn Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys
340 345 350
tac ggc aac ggt gtg tgg ate ggt cgc act aag age ate agt tct cgc 1104 Tyr Gly Asn Gly Val Trp lie Gly Arg Thr Lys Ser lie Ser Ser Arg
355 360 365
aac ggt ttc gag atg att tgg gac cct aac ggc tgg act ggc acc gac 1152 Asn Gly Phe Glu Met lie Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp
370 375 380
aac aac ttc tec ate aag cag gac ate gtg ggc ate aac gag tgg tec 1200 Asn Asn Phe Ser lie Lys Gin Asp lie Val Gly lie Asn Glu Trp Ser 385 390 395 400
ggc tac age ggc age ttc gtg cag cac cca gag ctg aca ggc ctg gac 1248 Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gin His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp
405 410 415
tgt ate cgc cct tgc ttc tgg gtg gaa ctg ate cgc ggt cgc cct aag 1296 Cys lie Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu lie Arg Gly Arg Pro Lys
420 425 430
gag aac aca ate tgg act age ggc age age ate tec ttc tgt ggt gtg 1344 Glu Asn Thr lie Trp Thr Ser Gly Ser Ser lie Ser Phe Cys Gly Val
435 440 445
aac agt gac act gtg ggt tgg tct tgg cca gac ggt get gag ctg cca 1392 Asn Ser Asp Thr Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro
450 455 460
ttc acc ate gac aag taa 1410 Phe Thr lie Asp Lys 465
13〈210> 4
〈211>柳
<212〉 PRT
〈213〉甲型流感病毒
〈400> 4
Met Asn Pro Asn Gin 1 5 lie Gly Met Ala Asn 20
Trp lie Ser His Ser 35
Cys Asn Gin Ser Val 50
Thr Tyr Val Asn lie 65
Val Ser Val Lys Leu 85
Trp Ala lie Tyr Ser 100
Asp Val Phe Val lie 115
Cys Arg Thr Phe Phe 130
Ser Asn Gly Thr lie 145
Cys Pro lie Gly Glu 165
Val Ala Trp Ser Ala 180
lie Gly lie Ser Gly 195
Asn Gly lie lie Thr 210
Arg Thr Gin Glu Ser 225
Val Met Thr Asp Gly 245
Arg lie Glu Lys Gly 260
Asn Tyr His Tyr Glu 275
Thr Cys Val Cys Arg 290
Ser Phe Asn Gin Asn
(Influenza A virus)
Lys
Leu
lie
lie
Ser
70
Ala
Lys
Arg
Leu
Lys 150 Val
Ser
Pro
Asp
Glu 230 Pro
Lys
Glu
Asp
Leu
lie
lie
Gin
Thr
55
Asn
Gly
Asp
Glu
Thr 135 Asp
Pro
Ala
Asp
Thr 215 Cys
Ser
lie
Cys
Asn 295 Glu
lie
Leu
Leu
40
Tyr
Thr
Asn
Asn
Pro 120 Gin
Arg
Ser
Cys
Asn 200 lie
Ala
Asn
Val
Ser 280 Trp
Tyr
Thr
Gin
25
Gly
Glu
Asn
Ser
Ser 105 Phe
Gly
Ser
Pro
His 185 Gly
Lys
Cys
Gly
Lys 265 Cys
His
Gin
lie
10
lie
Asn
Asn
Phe
Ser
90
Val
lie
Ala
Pro
Tyr 170 Asp
Ala
Ser
Val
Gin 250 Ser
Tyr
Gly
lie
Gly
Gly
Gin
Asn
Ala
75
Leu
Arg
Ser
Leu
Tyr 155 Asn
Gly
Val
Trp
Asn 235 Ala
Val
Pro
Ser
Gly
Ser
Asn
Asn
Thr
60
Ala
Cys
lie
Cys
Leu 140 Arg
Ser
lie
Ala
Arg 220 Gly
Ser
Glu
Asp
Asn 300 Tyr
Val
lie
Gin
45
Trp
Gly
Pro
Gly
Ser 125 Asn
Thr
Arg
Asn
Val 205 Asn
Ser
Tyr
Met
Ser 285 Arg
lie
Cys
lie
30
lie
Val
Gin
Val
Ser 110 Pro
Asp
Leu
Phe
Trp 190 Leu
Asn
Cys
Lys
Asn 270 Ser
Pro
Cys
Met
15
Ser
Glu
Asn
Ser
Ser
95
Lys
Leu
Lys
Met
Glu 175 Leu
Lys
lie
Phe
lie 255 Ala
Glu
Trp
Ser
Thr
lie
Thr
Gin
Val
80
Gly
Gly
Glu
His
Ser 160 Ser
Thr
Tyr
Leu
Thr 240 Phe
Pro
lie
Val
Gly305 310 315 320
lie Phe Gly Asp Asn Pro Arg Pro Asn Asp Lys Thr Gly Ser Cys Gly
325 330 335
Pro Val Ser Ser Asn Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys
340 345 350
Tyr Gly Asn Gly Val Trp lie Gly Arg Thr Lys Ser lie Ser Ser Arg
355 360 365
Asn Gly Phe Glu Met lie Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp
370 375 380
Asn Asn Phe Ser lie Lys Gin Asp lie Val Gly lie Asn Glu Trp Ser 385 390 395 400
Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gin His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp
405 410 415
Cys lie Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu lie Arg Gly Arg Pro Lys
420 425 430
Glu Asn Thr lie Trp Thr Ser Gly Ser Ser lie Ser Phe Cys Gly Val
435 440 445
Asn Ser Asp Thr Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro
450 455 460
Phe Thr lie Asp Lys 465
〈210> 5 <211〉 759 〈212> DNA
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus) 〈220>
<221> gene 〈222〉 (1)..(759) 〈223> 〈220〉
〈221〉 CDS <222> (1)..(759) <223〉 〈400〉 5
atg age etc ctg acc gag gtg gag acc tac gtg ctg tct ate ate cct 48 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser lie lie Pro 15 10 15
tec ggc cct etc aag gcc gag ate gcc cag cgc ctg gag age gtg ttc 96 Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu lie Ala Gin Arg Leu Glu Ser Val Phe
20 25 30
gcc ggc aag aac aca gac ctg gag get etc atg gag tgg ctg aag aca 144 Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Ala Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr
35 40 45
cgc cca ate ctg tec cct ctg act aag ggc att ctg ggc ttc gtg ttc 192Arg Pro lie Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly lie Leu Gly Phe Val Phe
50 55 60
acc etc acc gtg cct age gag cgc ggt etc cag cgt cgc cgc ttc gtc 240 Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gin Arg Arg Arg Phe Val 65 70 75 80
cag aac gcc ctg aac ggt aac ggc gac cct aac aac atg gac cgc gca 288 Gin Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Arg Ala
85 90 95
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100 105 110
卿gag gtg tec ctg age tac tea act ggt gcc ctg gcc age tgc atg 鵬 Lys Glu Val Ser Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met
115 120 125
ggc etc ate tac aac cgc atg ggc aca gtg acc aca gaa get gcg ttc 432 Gly Leu lie Tyr Asn Arg Met Gly Thr Val Thr Thr Glu Ala Ala Phe
130 135 140
ggt ctg gtg tgc gcc act tgt gaa cag att get gac tec cag cac cgc 480 Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gin lie Ala Asp Ser Gin His Arg 145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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245 250
<210> 6
〈211〉 252
<212> PRT
<213>甲型流感病毒
<400> 6
(Influenza A virus)
16AlaArgThr65GinValLysGlyGly 145 SerAsnAlaThrSer 225 GinSerGlyGlyPro50LeuAsnLysGluLeu 130 LeuHisArgGlyArg 210 SerLysLeuProLys35lieThrAlaLeuVal 115 lieValArgMetSer 195 GinAlaArgLeuLeu20AsnLeuValLeuTyr 100 SerTyrCysGinVal 180 SerMetGlyMetThr 5LysThrSerProAsn85LysLeuAsnAlaMet 165 LeuGluValLeuGly 245GluAlaAspProSer70GlyLysSerArgThr 150 AlaAlaGinHisLys 230 ValValGluLeuLeu55GluAsnLeuTyrMet 135 CysThrSerAlaAla 215 AspGinGlulieGlu40ThrArgGlyLysSer 120 GlyGluThrThrAla 200 MetAspMetThrAla25AlaLysGlyAspArg 105 ThrThrGinThrThr 185 GluArgLeuGinTyr10GinLeuGlyLeuPro90GluGlyVallieAsn 170 AlaAlaThrLeuArg 250ValArgMetlieGin75AsnlieAlaThrAla 155 ProLysMetlieGlu 235 PheLeuLeuGluLeu60ArgAsnThrLeuThr 140 AspLeuAlaGluGly 220 AsnLysSerGluTrp45GlyArgMetPheAla 125 GluSerlieMetVal 205 ThrLeulieSer30LeuPheArgAspHis 110 SerAlaGinArgGlu 190 AlaHisGinlie15ValLysValPheArg95GlyCysAlaHisHis 175 GinAsnProAlaProPheThrPheVal80AlaAlaMetPheArg 160 GluMetGinSerTyr 2401權(quán)利要求
1、一種重組的甲型H1N1流感病毒基因工程毒株，其特征在于，它含有人工修飾合成的甲型H1N1流感病毒主要免疫原性基因HA-NA-M1以及標記基因eGFP，所述的重組甲型H1N1流感病毒基因工程毒株(Baculovirus)，QP-Ac-HNM1；保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC-V200912。
2、 人工合成修飾的甲型H1N1流感病毒編碼的免疫原性蛋白HA、 NA及M1， 它們是序列表SEQ ID N0:1， SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列。
3、 權(quán)利要求1所述的基因工程毒株在制備甲型H1N1流感病毒基因工程疫苗 中的應(yīng)用。
4、 權(quán)利要求2所述的免疫原性蛋白HA、 NA及Ml在制備甲型H1N1流感病毒 基因工程疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及病毒學領(lǐng)域。具體涉及一種人工修飾合成的含有甲型H1N1流感病毒主要免疫原性基因HA-NA-M1的重組桿狀病毒，該毒株QP-Ac-HNM1屬于桿狀病毒(Baculovirus)，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCC-V200912。該重組病毒可以同時表達甲型H1N1流感病毒HA、NA和M1蛋白，形成病毒樣顆粒。該病毒樣顆?？梢杂脕硌兄瞥梢呙?，預防人和豬感染甲型H1N1流感病毒。
文檔編號C12N7/01GK101624580SQ20091006321
公開日2010年1月13日 申請日期2009年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月21日
發(fā)明者李祥敏, 金梅林, 平 錢, 陳煥春 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學