專利名稱：普洱茶及其制劑在預(yù)防、治療鼠疫中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及普洱茶及其制劑在治療鼠疫中的應(yīng)用，屬于物質(zhì)的醫(yī)藥用途技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鼠疫(Plague)是由鼠疫耶爾森菌(YersiniaPestis)引起的人畜共患的烈性傳染病。 由于其發(fā)病急、傳播快、傳染性強(qiáng)、病死率高，被世界衛(wèi)生組織規(guī)定為國境檢疫傳染病， 是《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的甲類傳染病。2001年發(fā)生于美國的炭疽芽孢 郵件事件引起了全世界對(duì)生物武器威脅的關(guān)注。若鼠疫耶爾森菌被用于恐怖武器和大規(guī) 模破壞性戰(zhàn)爭(zhēng)的裝備中，必將成為國際恐怖分子首選的生物武器，因此已成為威脅世界 和平的因素之一。從80年代以來，鼠疫在世界范圍內(nèi)的流行呈上升趨勢(shì)，2000-2001年， 有l(wèi)l個(gè)國家報(bào)告人間鼠疫。在我國，鼠疫的流行范圍不斷擴(kuò)大，并向城市及人口密集區(qū) 逼近。因此針對(duì)鼠疫耶爾森菌的有效抑制劑的研發(fā)，已成為國際性研究熱點(diǎn)。目前，國 內(nèi)外對(duì)鼠疫的治療多采用鏈霉素輔以多種廣譜抗生素。但是由于抗生素的濫用，已經(jīng)產(chǎn) 生了多種耐藥性的鼠疫耶爾森菌，使大多數(shù)病人難以得到及時(shí)有效的治療，最終導(dǎo)致死 亡。
蛋白質(zhì)的可逆酪氨酸磷酸化作用是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的最重要基礎(chǔ)，也是最關(guān)鍵歩驟之 一。生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(Protein Tyrosine Phosphatases, PTPs)與蛋白質(zhì)酪 氨酸激酶(Protein Tyrosine Kinases, PTKs)協(xié)同作用，共同控制著蛋白質(zhì)酪氨酸的磷 酸化過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，并在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)還 與許多生理和病理現(xiàn)象密切相關(guān)，是細(xì)胞之間通信、細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖、細(xì)胞周期調(diào)控過 程中的關(guān)鍵。鼠疫耶爾森菌外膜蛋白(Yersinia outer membrane proteins, Yops)是鼠疫 耶爾森菌致病的重要因素，主要包括ll個(gè)蛋白質(zhì)，其中，鼠疫耶爾森菌外膜蛋白H (Yersinia outer membrane protein H， YopH)是唯——個(gè)具有蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶 (protein tyrosine phosphatase, PTP)活性的，它可使真核細(xì)胞的某些蛋白去磷酸化，除 破壞細(xì)胞骨架，具有抗吞噬作用外，還能抑制PI-3通路，從而抑制T淋巴細(xì)胞增殖， 是耶爾森菌逃避宿主先天免疫應(yīng)答的重要因素。因此，以鼠疫耶爾森菌外膜蛋白H (YopH)為靶標(biāo)篩選出的專一有效的抑制劑，將為鼠疫的預(yù)防及治療提供新的方法和
3說 思路。
參考文獻(xiàn)
1、 Sun, J.-P., Wu, L., Fedorov, A. A.， Almo, S. C. and Zhang, Z.-Y. "Crystal Structure of the r^/"si'm'a Protein-Ty rosine Phosphatase YopH Complexed with a Specific Small Molecule Inhibitor", / g/o/. Otg柳.，278,33392-33399函3).
2、 Liang, F., Huang, Z.， Lee, S.-Y., Liang, J.， Ivanov, M. I., Alonso, A.， Bliska, J. B., Lawrence, D. S., Mustelin, T., and Zhang， Z.-Y. "Aurintricarboxylic Acid Blocks in vitro and in vivo Activity of YopH， an Essential Virulent Factor of Yersinia pestis， the Agent of Plague", / C7^抓，278, 41734-41741 (2003).
3、 Lee, K, Gao， Y.， Yao, Z,J.， Phan， J.， Wu， L.， Liang, J., Waugh, D.， Zhang, Z,Y. and Burke, T. R. Jr. "Tripeptide Inhibitors of I^m'"/fl Protein-Tyrosine Phosphatase", g/owg. Afgrf. Otg肌丄g汰，13,2577-2581 (2003).
研究表明，國內(nèi)盡管已經(jīng)完成對(duì)鼠疫耶爾森菌外膜蛋白Yops的克隆表達(dá)，但是缺少 鼠疫耶爾森菌外膜蛋白H (YopH)的針對(duì)性研究，對(duì)YopH抑制劑的篩選仍停留在空白 水平。國外雖然已經(jīng)從各種化合物中篩選出YopH的有效抑制劑，但都因取材困難、成 本高、副作用大，而難以推廣，只停留在機(jī)理方面的研究，尚未開發(fā)出治療鼠疫的有效 藥物。
我國對(duì)天然植物的使用已有數(shù)千年的悠久歷史，天然植物具有取材方便、成本低廉、 副作用小等特點(diǎn)，有資料顯示，天然植物聯(lián)合抗生素對(duì)鼠疫有顯著療效，因此采用鼠疫 耶爾森菌外膜蛋白H——YopH為靶標(biāo)，從傳統(tǒng)天然植物中篩選出能夠有效抑制鼠疫耶爾 森菌外膜蛋白H——YopH的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶活性的抑制劑，是最為可靠且具有前景 的方法，從而為預(yù)防國際恐怖組織的生物武器攻擊提供有效保障，具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益 和社會(huì)作用。
普洱茶是云南歷史名茶，也是我國的傳統(tǒng)飲品。傳統(tǒng)普洱茶是用云南大葉種曬青毛 茶直接蒸壓而成，在唐代已成為主要商品，明代有"士庶所用皆普茶"，少數(shù)民族有"不 可一R無茶"的說法；清，宋士雄《隨息局飲食譜》云"茶微苦微甘而涼，清心神醒 睡，除煩，涼肝膽，滌熱消痰，肅肺胃，明目解渴。普洱產(chǎn)者，味重力竣，善吐風(fēng)痰， 消肉食，凡暑穢痧氣腹痛，霍亂痢疾等癥初起，飲之輒愈"。此外，歷來就有"茶改百
4毒"，"茶為百病之藥"之說。
普洱茶根據(jù)其在生產(chǎn)過程中是否采用發(fā)酵工藝而被分為"生茶"和"熟茶"兩大類。生 茶是指在加工、生產(chǎn)過程中沒有經(jīng)過發(fā)酵處理的普洱茶，其加工生產(chǎn)過程主要為鮮葉、 攤涼、殺青、揉捻、曬干。普洱熟茶是指生產(chǎn)時(shí)采用人工渥堆發(fā)酵后的普洱茶，它的加 工生產(chǎn)過程主要為鮮葉、殺青、揉捻、曬干、渥堆發(fā)酵、攤涼、篩分、拼配、緊壓成 型、干燥、檢驗(yàn)、包裝倉儲(chǔ)。普洱茶常會(huì)因原料、生產(chǎn)工藝及發(fā)酵程度的不同，而使其 成分、口感、色澤和保健功效也各不相同。
近年來對(duì)普洱茶化學(xué)成分的藥效學(xué)研究和作用機(jī)制的報(bào)道也越來越多，都證明了普
洱茶具有顯著的保健及抗病毒作用，效果確切、安全可靠，是天然植物藥用的材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是應(yīng)用普洱茶制備預(yù)防、治療鼠疫的制劑，制成的制劑能夠高效 抑制鼠疫耶爾森菌外膜蛋白H——YopH的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶活性，最終可預(yù)防和治 療鼠疫。
本發(fā)明的發(fā)明人采用基因工程技術(shù)克隆的具有蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶活性的鼠疫耶 爾森菌外膜蛋白H——YopH的催化結(jié)構(gòu)域(AYopH)，并把它作為一個(gè)治療鼠疫的特 異靶標(biāo)，并用以酶活性變化為指標(biāo)的高通量藥物篩選技術(shù)在體外對(duì)多種普洱茶進(jìn)行研 究，從而篩選出能夠高效抑制鼠疫耶爾森菌外膜蛋白H——Y叩H的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸 酶活性的普洱茶抑制劑。最終開發(fā)出預(yù)防、治療鼠疫的普洱茶制劑。
所述普洱茶是普洱原茶，或者是用普洱原茶制成的普洱茶餅、茶磚或坨茶，或者 是用普洱原茶的提取物制得的沖劑、粉劑、浸膏、丸劑、口服液或膠囊。
所述制劑是用普洱茶直接制備成的單方制劑，或者是用普洱茶與其他藥物原料直 接制備成的復(fù)方制劑，其制備方法均是現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)方法。
所述制劑是用普洱茶的提取物制備成的單方制劑，或者是用普洱茶提取物與其他 藥物提取物制備成的復(fù)方制劑，其中，提取物是水提物，或者是醇提物。
所述水提物是用現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)提取方法獲得的，即用水煎后，經(jīng)濃縮得到的 濃縮液，或者將濃縮液再經(jīng)醇沉、噴霧干燥后得到的粉劑。
所述醇提物是用現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)提取方法獲得的，即用乙醇或者其他有機(jī)溶劑 提取后，經(jīng)濃縮得到的濃縮液或浸膏，或者再將濃縮液或浸膏進(jìn)一歩干燥得到的粉劑。
具體是將普洱茶經(jīng)下列方法制得
5普洱茶水=1 : 10 100 (W/V)，在IO(TC下煮沸30秒 3分鐘，或用沸水浸泡3
分鐘 30分鐘，再用120目篩過濾去除殘?jiān)占嵋?；重?fù)此步驟2 4次，合并
每次的提取液；將總提取液分別用200目篩和0.45pM濾器過濾，經(jīng)高溫噴霧干燥得到
普洱茶粉劑。
或者將普洱茶經(jīng)下列方法制得-
普洱茶粉水=1 : io 30 (w/v)，得到茶粉水溶液，加入等體積氯仿萃取三次，
收集保留水相，再用等體積乙酸乙酯萃取三次，收集水相，最后用等體積正丁醇進(jìn)行萃 取，保留水相。將水相中的水蒸發(fā)去除，得茶褐素粉劑。
所述制劑是臨床上能夠使用的各種不同的藥物劑型，如片劑、粉劑、丸劑、膠囊、 粒劑、液體藥劑等形式的口服制劑，或者是注射劑、栓劑、膏劑、酊劑等形式的制劑。
所述制劑也可以是人們通常使用的各種食品，如固體飲料、液體飲料，或與其它 食品原料混合加工的米制品、面制品、糕點(diǎn)、小食品等。
所述制劑還可以是人們通常使用的各種保健食品，如保健粉、保健片、保健膠囊、 保健口服液、保健沖劑等。
所述普洱茶的有效劑是通過與適當(dāng)?shù)乃幱脫交煳铮缳x形劑、粘合劑、滲透劑、
潤(rùn)滑劑等混合配制成的，其中，普洱茶有效成分的質(zhì)量含量比不低于20%。
劑量隨患者的病情、給藥途徑、患者的年齡和體重而改變。在口服給藥情況下，
劑量通常為成年人50 90mg/kg/天，優(yōu)選70 80mg/kg/天。
本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果普洱茶及其制劑在體外能抑制鼠疫耶爾森菌外膜蛋白 H——YopH的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶活性。因?yàn)樯矬w內(nèi)的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶與蛋白 質(zhì)酪氨酸激酶協(xié)同作用后，將共同控制著蛋白質(zhì)酪氨酸的磷酸化過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng) 發(fā)育，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要的作用，而鼠疫耶爾森菌外膜蛋白是鼠疫耶爾森 菌致病的重要因素，其中的鼠疫耶爾森菌外膜蛋白H是唯一一個(gè)具有蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸 酶活性的，它可使真核細(xì)胞的某些蛋白去磷酸化，除破壞細(xì)胞骨架，具有抗吞噬作用外， 還能抑制PI-3通路，從而抑制T淋巴細(xì)胞增殖，是耶爾森菌逃避宿主先天免疫應(yīng)答的 重要因素。因此，抑制鼠疫耶爾森菌外膜蛋白H——Y叩H的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶活性， 就能防治鼠疫耶爾森菌致病。因此，以鼠疫耶爾森菌外膜蛋白H——YopH為靶標(biāo)篩選出 的普洱茶有效抑制劑，將為鼠疫的預(yù)防及治療提供新的方法和思路。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明實(shí)施例所用的普洱茶是采用云南普洱天福經(jīng)貿(mào)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的普洱 茶，該普洱茶是用專利號(hào)為ZL200610010625.1，名稱為"一種用生物酶發(fā)酵普洱茶的方 法"的發(fā)明專利制得的普洱茶，如"紫妍宮廷普洱茶"、"乳香宮廷普洱茶"和"沉浮 人生普洱茶"，還有就是用上述普洱茶制備的茶粉等制劑。
其中，樣品1、 2、 3號(hào)分別是將上述"乳香宮廷普洱茶"和"沉浮人生普洱茶" 及"紫妍宮廷普洱茶"用蒸餾水配制成25mg/ml的貯液，之后按2倍梯度進(jìn)行稀釋后得 到的。
樣品4號(hào)是將上述"沉浮人生普洱茶"經(jīng)下列方法制得的
普洱茶水=1 : 50 (W/V)，在10(TC下煮沸2分鐘，再用120目篩過濾去除殘?jiān)?收集水提液；重復(fù)此歩驟2 4次，合并每次的提取液；將總提取液分別用200目篩和 0.45pM濾器過濾，經(jīng)高溫噴霧干燥得到普洱茶粉劑。
樣品5號(hào)是將上述"沉浮人生普洱茶"經(jīng)下列方法制得的-
普洱茶粉水=1 : 15 (w/v)，得到茶粉水溶液，加入等體積氯仿萃取三次，收集
保留水相，再用等體積乙酸乙酯萃取三次，收集水相，最后用等體積正丁醇進(jìn)行萃取，
保留水相；將水相中的水蒸發(fā)去除，得茶褐素粉劑。
普洱茶對(duì)鼠疫耶爾森菌外膜蛋白H——YopH的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶活性的抑制 作用的測(cè)定
YopH是一種PTP，可以使磷酸化的蛋白質(zhì)去磷酸化。對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽(pNPP) 是目前最通用的PTPs活力測(cè)定的底物，它可以被PTP去磷酸化，變成對(duì)硝基苯酚，顏 色呈黃色，通過檢測(cè)405nm處光吸收值的變化來間接檢測(cè)酶活性的變化情況。
測(cè)定體系如下25mM嗎啉代丙烷磺酸(MOPS) pH 7.0， lmg/ml牛血清白蛋白 (BSA)， lmM 二硫蘇糖醇(DTT)， O.lmM乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)， 5nMAYopH， △YopH為吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院克隆表達(dá)的YopH的催化結(jié)構(gòu)域，在405nm處測(cè)定 30min內(nèi)整個(gè)反應(yīng)體系光吸收的變化值。
物質(zhì)對(duì)Y叩H的抑制能力的考察是通過測(cè)定半數(shù)抑制濃度(IC5Q)來衡量。ICso即當(dāng) 酶的總活力被抑制一半時(shí)，反應(yīng)體系中所需的抑制劑的終濃度。將抑制組分按梯度進(jìn)行 稀釋，將稀釋后的不同濃度的抑制劑加入到上述所說的反應(yīng)體系中，于37'C中準(zhǔn)確反應(yīng) 30min后，測(cè)定波長(zhǎng)405nm處的吸光值，將各個(gè)梯度的吸收值與未加抑制組分的吸光值 相除，得出的數(shù)值為抑制百分?jǐn)?shù)，當(dāng)抑制率達(dá)到50%時(shí)，所對(duì)應(yīng)的抑制劑的終濃度就是IC50 (mg/ml)。
將上述樣品的普洱茶及其制劑用蒸餾水配制成25mg/ml的貯液，按2倍梯度進(jìn)行稀釋，之后將每個(gè)濃度梯度的樣品加入到Y(jié)(5pH活性測(cè)定的反應(yīng)體系中，分別測(cè)定每個(gè)稀釋濃度對(duì)Y叩H的抑制能力，以普洱茶的濃度(mg/ml)作為ICso的單位，得出各種普洱茶的IC5o值(mg/ml)(見表l)， K^值(mg/ml)越低，表明其對(duì)蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶活性的抑制能力越強(qiáng)。
表1為云南普洱天福經(jīng)貿(mào)責(zé)任有限公司生產(chǎn)的普洱茶及其制劑對(duì)Y叩H抑制的IC50值。
表l_
樣品名稱 原液抑制率(25mg/ml) IC50
1號(hào) 98.6°/。 0. 183
2號(hào) 96.8% 0.292
3號(hào) 92. 1% 0.4365
4號(hào) 99.6% 0.0335
5號(hào) 100% 0.038
權(quán)利要求
1、普洱茶在制備預(yù)防和/或治療鼠疫藥物中的應(yīng)用。
2、 普洱茶在制備預(yù)防和/或治療鼠疫食品中的應(yīng)用。
3、 普洱茶制劑在制備預(yù)防和/或治療鼠疫藥物中的應(yīng)用。
4、 普洱茶制劑在制備預(yù)防和/或治療鼠疫的食品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供普洱茶及其制劑在預(yù)防、治療鼠疫中的應(yīng)用。具體是普洱茶及其制劑在體外能抑制鼠疫耶爾森菌外膜蛋白H——YopH的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶活性。鼠疫耶爾森菌中的外膜蛋白H是唯一一個(gè)具有蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶活性的，它可使真核細(xì)胞的某些蛋白去磷酸化，除破壞細(xì)胞骨架，具有抗吞噬作用外，還能抑制PI-3通路，從而抑制T淋巴細(xì)胞增殖，是耶爾森菌逃避宿主先天免疫應(yīng)答的重要因素。因此，抑制鼠疫耶爾森菌外膜蛋白H——YopH的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶活性，就能防治鼠疫耶爾森菌致病。因此，以鼠疫耶爾森菌外膜蛋白H——YopH為靶標(biāo)篩選出的普洱茶有效抑制劑，將為鼠疫的預(yù)防及治療提供新的方法和思路。
文檔編號(hào)A61K36/185GK101485788SQ20091009413
公開日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2009年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月26日
發(fā)明者付學(xué)奇, 軍 王, 王樂觀, 軍 盛 申請(qǐng)人:王樂觀;付學(xué)奇;盛 軍;王 軍