專利名稱：PEG-干擾素-β制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及PEG化干擾素-3制劑(PEG-IFN- 3 )。
背景技術(shù)：
干擾素是一種蛋白質(zhì)，業(yè)經(jīng)鑒定可作為有用的藥物，目前已用于例如治療多 發(fā)性硬化癥(MS)。蛋白質(zhì)可在序列上加以修飾或作其它修飾，以改變或改善例如它們的活性或穩(wěn)定 性。一種這樣的修飾是引入與聚合物如聚乙二醇(PEG)的連接鍵。例如在W099/55377和EP 0 593 868 A1中已描述了連接于聚乙二醇 (PEG-IFN-^)的干擾素。在醫(yī)藥領(lǐng)域，已采取各種方法如冷凍干燥來穩(wěn)定蛋白質(zhì)，或制成液體藥物組合物 形式。凍干材料必需在使用前重建為溶液。較容易和特別令人感興趣的是濃縮的或即用型 液體藥物組合物，因為它們應(yīng)用于患者時不需要作任何進(jìn)一步的制備。W095/31213和W02004/096263描述了干擾素的液體藥物制劑。W02005/084303描述了干擾素lb-的偶聯(lián)聚合組合物。US 6，531，122是關(guān)于含賦形劑、穩(wěn)定劑和緩沖劑的PEG化干擾素變體制劑。W02004/060299提供了包含干擾素與其受體結(jié)合拮抗劑的細(xì)胞因子偶聯(lián)聚合 物的合成方法。US20060051320 A1涉及用海藻糖作為冷凍保護(hù)劑制備的PEG化干擾素凍干制劑。W099/48535提供了能防止凍干過程中和凍干后PEG化干擾素-a偶聯(lián)物丟失和損 害的制劑。W003002152具體涉及包含干擾素多肽和磺烷基醚環(huán)糊精衍生物的穩(wěn)定組合物。以上參考文獻(xiàn)無一公開過或提議過本發(fā)明的液體制劑。發(fā)明概述本發(fā)明一方面提供一種包含PEG化干擾素(PEG-IFN-^)、賦形劑、表面活性劑 和緩沖液的液體藥物組合物，其中所述賦形劑是多元醇，所述表面活性劑是非離子表面活 性劑，所述緩沖液是乙酸鈉緩沖液。本發(fā)明另一方面提供制備液體藥物組合物的方法，所述方法包括在緩沖液中加入 計算量的賦形劑和表面活性劑，然后加入PEG-IFN-3。本發(fā)明另一方面提供在滅菌條件下密封、適合貯存待用的容器，該容器包含本發(fā) 明的液體藥物組合物。本發(fā)明另一方面提供藥物組合物的藥盒，該藥盒包含裝有本發(fā)明藥物組合物的容 器。表格和附圖的簡要說明L含0.044mg/ml PEG-干擾素-g的本發(fā)明制劑表1描述含0. 044mg/ml PEG-干擾素-0的各種本發(fā)明制劑。表2描述本發(fā)明制劑分別在40°C、25°C和2_8°C下的穩(wěn)定性試驗(SE-HPLC)，整個試驗期間pH為4. 2。表3描述本發(fā)明制劑分別在40°C、25°C和2_8°C下的穩(wěn)定性試驗(RP-HPLC)，整個 試驗期間pH為4. 2。表4描述用SE-HPLC測定本發(fā)明制劑的滴度(mcg/mL)。表5描述用SE-HPLC測定本發(fā)明制劑的滴度(mcg/mL)；過濾前后的回收百分 率％，并以圖表示(

圖1 %回收率表示為AF和TO回收百分率％ )。表6顯示分別在25°C和2_8°C貯存4_26周后本發(fā)明制劑的pH值。表7描述本發(fā)明制劑隨時間推移生物試驗的結(jié)果。II.分別含0. 055和0. 110mg/ml PEG-干擾素-|3的本發(fā)明制劑這些制劑的PEG-干擾素-0含量已分別增加至0. 055and 0. llOmg/mlPEG-干擾 素。表8描述檢測本發(fā)明制劑分別在40°C、25°C和2-8°C貯存下純度的SE-HPLC試驗， 整個期間pH為4. 2。表9描述檢測本發(fā)明制劑分別在40°C、25°C和2_8°C貯存下蛋白含量的SE-HPLC 試驗，整個期間pH為4. 2。表10描述檢測本發(fā)明制劑分別在40°C、25°C和2_8°C貯存下純度的RP-HPLC試 驗，整個期間pH為4. 2。表11顯示分別在25°C和2_8°C貯存4_13周后本發(fā)明制劑的pH值。表12顯示分別在25°C和2_8°C貯存后隨時間推移本發(fā)明制劑的生物試驗數(shù)據(jù)。表13描述關(guān)于本發(fā)明PEG-干擾素制劑氧化形式肽圖的數(shù)據(jù)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種包含PEG化干擾素-0 (PEG-IFN- ^ )、賦形劑、表面活性劑和緩沖 液的液體藥物組合物，其中所述賦形劑是多元醇，所述表面活性劑是非離子表面活性劑，所 述緩沖液是乙酸鈉緩沖液。本發(fā)明一方面涉及一種包含PEG化干擾素(PEG-IFN-^)或其變體或其活性片 段、賦形劑、表面活性劑和緩沖液的液體藥物組合物，其中所述賦形劑是多元醇，所述表面 活性劑是非離子表面活性劑，所述緩沖液是乙酸鈉緩沖液。以下章節(jié)提供了組成本發(fā)明制劑的各種化合物的定義，在整個說明書和權(quán)利要求 書中其應(yīng)用含義均相同，除非另有明確闡述的定義提供更廣泛的定義。 制劑中的PEG化干擾素_ 0是任何經(jīng)過聚乙二醇共價修飾或與其相當(dāng)?shù)男揎椀母?擾素-0。PEG化干擾素的一個例子是PEG-干擾素，其PEG化可采用已知方法進(jìn) 行，如W099/55377所述方法。具體地說，本發(fā)明的IFN-0共價結(jié)合于親水性聚乙二醇(PEG)，也稱為聚氧乙烯 (PEO)。PEG可以是兩個末端都含有羥基的線性聚合物H0CH2CH20 (CH2CH20) nCH2CH20H也可采用甲氧基-PEG-OH(m-PEG)，其一個末端為相對惰性的甲氧基，而另一末端 為易受化學(xué)修飾的羥基CH30 (CH2CH20) nCH2CH20H上式中的n可以是1到幾百。
在另一優(yōu)選實施方式中，PEG也可以是R(PEG-0H)m表示的分枝PEG，其中R代表中 央的核心，如季戊四醇或甘油，m代表分枝臂數(shù)。分枝臂數(shù)(m)的范圍為3-100個或幾百個。 所述羥基易受化學(xué)修飾。本發(fā)明的另一種分枝形式見例如W096/21469中所述，其中PEG有一個易受化學(xué)修 飾的末端。此種類型的PEG可表示為(CH30PEG)pRX，其中的p等于2或3，R代表中央的核 心，如賴氨酸或甘油，X代表功能基團(tuán)，如易受化學(xué)激活的羧基。本發(fā)明的另一種分枝形式稱為“懸垂體PEG”，其沿PEG骨架而非在PEG鏈末端含
有反應(yīng)活性基團(tuán)，例如羧基。也可以制備在主鏈中帶有弱的或可降解連接鍵的本發(fā)明的PEG-干擾素-0，如美 國專利申請06/026，716中所述。因此，可制備聚合物主鏈中含有易受水解的酯鍵的PEG。 根據(jù)下面的反應(yīng)方程式，水解可導(dǎo)致該聚合物切斷形成低分子量的片段-peg-co2-peg+h2o — -peg-co2h+ho-peg-環(huán)氧乙烷與環(huán)氧丙烷的共聚物在化學(xué)上與PEG密切相關(guān)，按照本發(fā)明可用于代替 PEG。已開發(fā)了 PEG化蛋白質(zhì)的各種方法。通常采用親電子活化PEG衍生物，可使PEG 結(jié)合于蛋白質(zhì)的反應(yīng)活性基團(tuán)。一種方法利用賴氨酸殘基的a-或氨基和N-末端產(chǎn) 生包括產(chǎn)品混合物的結(jié)合物。該結(jié)合物優(yōu)選包含結(jié)合于每個蛋白質(zhì)分子的1個至幾個PEG分子的分子群，其數(shù) 量為1個至該蛋白質(zhì)中氨基酸的數(shù)目。宜在干擾素中引入針對PEG化的位點，如Woghiren等.BioconjugateChem.， 4(5) =314-318,1991中所述，合成巰基選擇性PEG衍生物。在一實施方式中，將IFN特異性PEG化。可按照EP 675 201的方法在N_末端殘 基處用例如mPEG-正丙醛(proprionaldehyde)進(jìn)行特異性PEG化。特別優(yōu)選如Woghiren 等.Bioconjugate Chem. ,4(5) =314-318,1991 中描述的位點特異性單-PEG 化。本發(fā)明的一種實施方式是如W099/55377中所述含有共價結(jié)合于Cys17的單-PEG 化干擾素。其PEG部分可以是線性或分枝的甲氧基PEG、可水解或酶降解的PEG和PEG 的一種或多種多元醇和共聚物，以及PLGA(聚乳酸/乙醇酸)。根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，可使半胱氨酸的巰基與巰基反應(yīng)性PEG化制劑反 應(yīng)。也可以是含功能基團(tuán)如二硫鄰吡啶、乙烯砜、馬來酰亞胺、碘乙酰亞胺的PEG。優(yōu)選的巰 基反應(yīng)性PEG化制劑是PEG的二硫鄰吡啶(0PSS)衍生物?？刹捎脝?甲基化形式的PEG 化制劑，其中只有一個末端可用于偶聯(lián)，或采用雙功能形式的PEG化制劑，其二個末端可用 于偶聯(lián)。在一優(yōu)選的反應(yīng)實施方式中，采用IFN-0-Cys17按本申請中描述的反應(yīng)方案進(jìn)行 反應(yīng)。所述反應(yīng)是針對Cys17的特定位點反應(yīng)，因為IFN-0中的其它兩個半胱氨酸殘基(31 和141位)已形成二硫鍵而不能進(jìn)行PEG化。PEG-干擾素的有效分子大小相當(dāng)于分子 量50-110kDa(優(yōu)選約70kDa)的蛋白質(zhì)的分子大小。在此特定位點干擾素的修飾中， PEG分子優(yōu)先結(jié)合分子量大于20kDa的蛋白。在一種實施方式中，PEG分子通過一間隔臂結(jié) 合于2x20kDa蛋白的Cys17。按照以下合成方案，此間隔臂與IFN形成IFN-PEG 2kDa_0PSS。
PEG化后將溶液純化，以使PEG-干擾素與游離的間隔臂和/或PEG分離。優(yōu) 選用超濾法進(jìn)行此純化步驟。在溫度低于10°c，優(yōu)選5+/-3°C，更優(yōu)選4°C下進(jìn)行超濾。純 化步驟優(yōu)選采用0. 1M NaOH。得到的PEG-干擾素溶液含有低于0. 5EU/ml的內(nèi)毒素，更 佳為低于0. 25EU/ml內(nèi)毒素。在一種實施方式中，按以下方案將PEG引入干擾素中 在一種實施方式中，將低分子量的PEG連接于干擾素。低分子量的PEG具有以下結(jié)構(gòu)式ff-CH2CH20 (CH2CH20) nCH2CH2_X此式中的W和X是能獨立地與胺、巰基、羧基或羥基功能基團(tuán)反應(yīng)的基團(tuán)，使低分 子量的PEG結(jié)合于干擾素-0。W和X較佳為獨立地選自二硫鄰吡啶、馬來酰亞胺、乙烯 砜、碘乙酰胺、胺、硫醇、羧基、活性酯、碳酸苯丙三唑、對-硝基苯酚碳酸酯、異氰酸酯和生物素。低分子量PEG優(yōu)選分子量為100_5000Da的PEG。在一優(yōu)選實施方式中，PEG分子 量為1000-3000道爾頓，優(yōu)選1500-3000道爾頓，更優(yōu)選2000道爾頓。
含有可結(jié)合干擾素的游離末端的低分子量單功能或雙功能PEG的優(yōu)選分子量 范圍是100-200Da。優(yōu)選甲氧基PEG、分枝狀PEG、可水解或酶可降解的PEG、懸垂體PEG或 樹枝狀PEG。單功能和雙功能PEG進(jìn)一步具有以下結(jié)構(gòu)式
Y-CH2CH20 (CH2CH20) mCH2CH2-Z此式中，Y是低分子量PEG部分游離末端上的末端反應(yīng)活性基團(tuán)，能與干擾素 的結(jié)合；Z是_0CH3或是能形成雙功能偶聯(lián)物的反應(yīng)活性基團(tuán)。因此，可利用2個或多個PEG分子，通過逐步方式產(chǎn)生用于本發(fā)明組合物和用作醫(yī) 療藥物的PEG-干擾素。有益的是，PEG與IFN-0之間的二硫鍵在血循環(huán)中穩(wěn)定，而一旦進(jìn)入細(xì)胞時可被 切斷。用于本發(fā)明制劑中的PEG-干擾素具有與天然干擾素大致相同或比其更 高的干擾素活性。賦形劑可以是任何多元醇，與制劑的其它組分一起產(chǎn)生穩(wěn)定的PEG-干擾素_ 3制 劑。多元醇的例子有甘露醇(PEARLIT0L )、山梨醇(NE0S0RB )、麥芽糖醇(MALT I SORB)、 木糖醇(XYLIS0RB)和麥芽糖醇(LYCASIN)。優(yōu)選的多元醇賦形劑是甘露醇。按照本發(fā)明采用非離子表面活性劑。非離子表面活性劑包括多元醇衍生物、聚氧 乙烯酯和醚、泊洛沙姆(泊洛沙姆188)、壬基苯基醚、聚乙烯醇、丙二醇二乙酸酯、鏈烷醇酰 胺。非離子表面活性劑可優(yōu)選泊洛沙姆，特別優(yōu)選泊洛沙姆188。能維持pH于所選水平的任何緩沖液均可使用。緩沖液可以是醋酸鈉緩沖液或 PBS。特別優(yōu)選醋酸鈉緩沖液。在一個實施方案中，本發(fā)明是一種包含PEG-干擾素、賦形劑、表面活性劑和緩 沖液的液體藥物組合物，其中所述賦形劑是甘露醇，所述表面活性劑是泊洛沙姆188，所述 緩沖液是醋酸鈉緩沖液。干擾素可以是經(jīng)受本發(fā)明的PEG化的天然人干擾素或重組產(chǎn)生的干擾 素-0。還有，本發(fā)明的干擾素(IFN-0)指機體對病毒感染的應(yīng)答反應(yīng)中產(chǎn)生的糖蛋 白。有報告將干擾素單位或干擾素國際單位(U或國際單位IU)作為衡量干擾素活性 的值，定義為保護(hù)50%細(xì)胞避免病毒傷害所必需的量。已報導(dǎo)的可用于測量其生物學(xué)活性 的試驗是細(xì)胞病變作用抑制試驗(Rubinstein等 1981 ；Familletti, P. C.等，1981)。在 此抗病毒試驗中，約1單位/ml的干擾素是產(chǎn)生50%細(xì)胞病變作用所需干擾素的量?？捎?美國國立衛(wèi)生研究院提供的人-干擾素國際參比標(biāo)準(zhǔn)品(Pestka，S. 1986)檢測其單位 量。干擾素也稱為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(BRM)，因為其通過免疫調(diào)節(jié)在生物體對腫瘤 的反應(yīng)、感染的識別中起作用。人成纖維細(xì)胞干擾素(IFN-0)具有抗病毒活性，還能刺激自然殺傷細(xì)胞對抗腫 瘤細(xì)胞。它是一種由病毒和雙鏈RNA誘生的約20，OOODa的多肽。已用重組DNA技術(shù)克隆 了成纖維細(xì)胞干擾素基因的核苷酸序列(Derynk等，1980)并推導(dǎo)出該蛋白的完整氨基酸 序列。它的長度為166個氨基酸。
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一種治療多發(fā)性硬化癥(MS)的干擾素Reb i f (Merck Serono-重組人干擾 素是從哺乳動物細(xì)胞系產(chǎn)生的干擾素(IFN)-0-la。它的推薦的國際非專利藥品名稱 (INN)是“干擾素_la”。本說明書所用的“干擾素”或“IFN-日”意指包括文獻(xiàn)中如此定義的任何分子， 包括例如以上章節(jié)提及的任何類型IFN-日。適合本發(fā)明用的IFN-0可從商業(yè)上購得，如 Rebif (Merck Serono)、Avonex (Biogen Idee)，只要它含有 PEG 化的專用連接位點。 本發(fā)明也優(yōu)選采用人來源的干擾素。本說明書所用的術(shù)語干擾素包括其鹽、功能衍生 物、變體、突變蛋白、同類物和活性片段。本說明書所用的術(shù)語“干擾素(IFN-舊”，指包括成纖維細(xì)胞干擾素，特別是人 來源的，例如從生物體液分離獲得的，可用DNA重組技術(shù)獲自真核宿主細(xì)胞的干擾素，用其 鹽、功能衍生物、變體、同類物及活性片段。優(yōu)選的干擾素指干擾素_la。本說明書所用的術(shù)語"突變蛋白"，指IFN-0的同類物以及天然IFN-0的一個 或多個氨基酸殘基被不同氨基酸殘基取代或缺失或在IFN-3的天然序列中加入一個或多 個氨基酸殘基的PEG-IFN-0，但它們所產(chǎn)生的產(chǎn)物與野生型IFN-0相比活性無顯著改變。 可用已知的合成技術(shù)或定點誘變技術(shù)，或已知的任何其它合適的技術(shù)制備這些突變蛋白。 優(yōu)選的突變蛋白包括，例如Sh印ar等(1981)或Mark等(1984)所描述的那些。具體說，本 發(fā)明的突變蛋白分子中含有Cys17同時含有上述變化的任何一種變化。任何這類突變蛋白其氨基酸序列優(yōu)選充分復(fù)制了 IFN-0的序列，例如具有與 IFN-3基本相似或甚至更好的活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知干擾素的生物學(xué)功能，其生物 標(biāo)準(zhǔn)品業(yè)已建立可從美國國立衛(wèi)生院生物標(biāo)準(zhǔn)品和控制中心(http://immunoloRy. org/ links/NIBSC)購得。測定IFN-0/PEG-IFN-0活性的生物學(xué)試驗已有報導(dǎo)。例如可按照Rubinstein， 1981等人所描述的進(jìn)行干擾素測定。因此，可用常規(guī)實驗檢測任何給定的突變蛋白是否具 有與IFN-0基本相似或甚至更好的活性?？捎糜诒景l(fā)明的IFN-0突變蛋白和PEG-IFN-0或其編碼核酸包括有限的一組基 本相對應(yīng)的序列，如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本說明書提供的說明和指導(dǎo)，無需過多實驗， 即可常規(guī)獲得的取代肽或多聚核苷酸。本發(fā)明突變蛋白的優(yōu)選變化是稱之為"保守性"的取代。本發(fā)明多肽或蛋白質(zhì)的 保守性氨基酸取代可包括同義組中的氨基酸取代，它們具有充分相似的理化特性，同組成 員之間的取代保留了分子的生物學(xué)功能。很清楚，在上述序列中可制作一些氨基酸插入或 缺失而不改變它們的功能，特別是，如果這些插入或缺失只涉及到少數(shù)氨基酸，如30個以 下，優(yōu)選10個以下，并且不移動或替換對于功能構(gòu)象至為關(guān)鍵的氨基酸，如半胱氨酸殘基。 這種缺失和/或插入所產(chǎn)生的蛋白和突變蛋白落入本發(fā)明的范圍。在蛋白中產(chǎn)生氨基酸取代，可用于獲得本發(fā)明所用的PEG-IFN- 0突變蛋白，其例 子包括任何已知的方法步驟，例如參見授予Mark等人的美國專利4，959，314,4, 588，585和 4，737，462，授于Koths等人的5，116，943，授于Namen等人的4，965，195，授于Chong等人的 4，879，111和授于Lee等人的5，017，691。賴氨酸取代蛋白參見美國專利4，904，584(Shaw 等)。IFN-0的特有突變蛋白已有描述，例如可參見Mark等人.，1984。本說明書所用的"功能衍生物"包括PEG-IFN-0衍生物和它們的突變蛋白及融
9合蛋白，可用本領(lǐng)域已知方法，從氨基酸殘基側(cè)鏈的功能基團(tuán)或N-或C-末端基團(tuán)加以制 備。只要它們?nèi)匀皇撬帉W(xué)上可接受的，即蛋白活性未受破壞基本上類似于IFN-0的活性， 并且不使包含它的組合物產(chǎn)生毒性，這些蛋白質(zhì)均包括在本發(fā)明中。這些衍生物，例如可包 括與羧基的脂肪族酯、羧基與氨或伯胺或仲胺反應(yīng)所產(chǎn)生的酰胺，氨基酸殘基的游離氨基 與?；?如烷?；蛱辑h(huán)芳?；?形成的N-?；苌锘蛴坞x羥基(例如絲氨?；蛱K氨 酰殘基的羥基)與?；纬傻?-?；苌?。作為PEG-IFN-0的"活性部分"，或突變蛋白和融合蛋白，本發(fā)明包括該蛋白分 子多肽鏈的任何片段或前體，它們無論是單獨的或與其連接的分子或殘基(例如糖殘基或 磷酸殘基)一起，或該蛋白分子或糖殘基本身的聚集體，只要所述部分的活性不顯著低于 相應(yīng)的IFN。術(shù)語“鹽"本說明書用于指上述蛋白質(zhì)或其同類物的羧基鹽或氨基的酸加成鹽。 羧基鹽可用本領(lǐng)域已知的方法形成，包括無機酸鹽，例如鈉鹽、鈣鹽、銨鹽、鐵鹽或鋅鹽等 等；與有機堿，例如胺類如三乙醇胺、精氨酸或賴氨酸、哌啶、普魯卡因等形成的那些鹽。酸 加成鹽包括，例如，與無機酸如鹽酸或硫酸形成的鹽；與有機酸，例如乙酸或草酸形成的鹽。 當(dāng)然，任何這些鹽必須保留本發(fā)明相關(guān)蛋白質(zhì)(IFN)的生物學(xué)活性，即能結(jié)合相應(yīng)的受體 和啟動受體信號傳遞。在還有一實施方式中，本發(fā)明組合物所含的融合蛋白包括Ig融合。這種融合可以 是直接融合，或通過一短接頭肽融合，此短肽長度可為1-3個氨基酸殘基或更長，例如長度 為13個氨基酸殘基。所述接頭可以是例如在IFN序列與免疫球蛋白序列之間引入的三肽 序列 E-F-M(Glu-Phe-Met)，或 13 個氨基酸 Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met的接頭序列。所產(chǎn)生的融合蛋白可具有如下改善的性能，例如，在體液中的駐 留時間(半壽期)延長，比活性增加，表達(dá)水平提高或有利于該融合蛋白的純化。所述組合物中的PEG-IFN-3濃度以約0. lmg/ml-0. 01mg/m為宜，優(yōu)選約0. 06mg/ ml-O. 03mg/ml，甚至更優(yōu)選約0. 044mg/ml的濃度。在另一實施方式中，所述制劑中的PEG-IFN-0濃度為0. 05-0. 150mg/ml，優(yōu)選 0.055 或 0. 110mg/mlo組合物中所用的劑量或其可應(yīng)用于個體的劑量因各種因素而異，包括藥代動力學(xué) 特性、給藥途徑、患者狀況和特征(性別、年齡、體重、健康狀況和個頭大小)、癥狀程度、同 時進(jìn)行的治療、治療的頻率和需要達(dá)到的效果。人用IFN-0/PEG-IFN-0 的標(biāo)準(zhǔn)劑量范圍是每天 80000IU/kg-200000IU/kg 或 每人每天6MIU (百萬國際單位)-12MIU，或相當(dāng)于每人22-44 y g (微克)IFN- ^。按照本 發(fā)明，本發(fā)明組合物中的PEG-IFN-3所用量為相當(dāng)于IFN-3優(yōu)選約1-50 yg，更優(yōu)選約 10-30 u g,或每人每天約10—20 u g0可通過靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下途徑給予本發(fā)明的活性成分。本發(fā)明組合物的優(yōu)選給 藥途徑是皮下和肌肉內(nèi)途徑。也可每天、隔天或不經(jīng)常給予本發(fā)明的PEG-IFN-0組合物。優(yōu)選每周一次、二次 或三次給予PEG-IFN-0組合物。優(yōu)選每二周給藥一次。優(yōu)選的給藥途徑是皮下給藥，例如一周給予三次。另一優(yōu)選的給藥途徑是肌肉內(nèi) 給予，例如可一周一次。
優(yōu)選皮下注射一周三次給予本發(fā)明的PEG-IFN-0組合物，相當(dāng)于22-44 iig或 6MIU-12MIU 的 IFN-3。皮下給予PEG-IFN-0組合物的劑量為每隔一天25-30iig或8MIU-9. 6MIU。還可 一周一次肌肉內(nèi)給予相當(dāng)于30 ii g或6MIU IFN- 0的PEG-IFN- ^組合物。術(shù)語“穩(wěn)定性”指本發(fā)明干擾素制劑的物理、化學(xué)和構(gòu)象穩(wěn)定性(包括生物效應(yīng)的 維持)。導(dǎo)致蛋白制劑不穩(wěn)定的原因有蛋白分子的化學(xué)降解或聚集形成較高等級的聚合物、 去糖基化、糖基化修飾、氧化或其它任何結(jié)構(gòu)修飾，它們導(dǎo)致本發(fā)明干擾素多肽的至少一種 生物學(xué)活性降低?！胺€(wěn)定的"組合物、溶液或制劑是其中蛋白質(zhì)的降解、修飾、聚集程度、生物學(xué)活 性的喪失等是可接受地得到控制，并且不隨時間的推移而增加至不可接受的程度。優(yōu)選在 12-24月內(nèi)保留標(biāo)記干擾素活性的至少或約60%，更優(yōu)選至少或約70%，最優(yōu)選至少或約 80%。當(dāng)在2-8°C貯存時，優(yōu)選的本發(fā)明PEG-IFN-0組合物的半壽期較佳約為至少6個月、 12個月、18個月，更佳為至少20個月，還要更佳為至少約22個有，最佳為至少約24個月。監(jiān)測本發(fā)明的液體PEG-IFN-0藥物組合物穩(wěn)定性的方法在本技術(shù)領(lǐng)域可以獲 得，包括本說明書描述的那些方法。因此，通過檢測溶液中可溶性PEG-IFN-0隨時間的變 化，不難測定本發(fā)明的液體藥物組合物在貯存期間PEG-IFN-0聚集物的形成狀況。采用適 合于檢測顆粒性PEG-IFN-0的各種分析試驗法可測定溶液中可溶性多肽的含量。這類試 驗包括，例如以下實施例中描述的反相(RP) -HPLC和UV吸收分光光度法實現(xiàn)對貯存期間液體組合物中可溶性和不溶性聚集物的檢測，例如，可采用以下 實施例中闡述的分析型超離心法，以區(qū)分可溶性聚集物形式存在的可溶性多肽部分與不聚 集的生物活性分子形式存在的部分。術(shù)語“緩沖液”或“生理上可接受的緩沖液”指制劑中所含的對醫(yī)用或獸用安全、 能有效維持或控制該制劑pH在制劑所需pH范圍內(nèi)的化合物溶液?？刂苝H在溫和酸性pH 的可接受的緩沖液包括但不限于諸如磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、精氨酸、TRIS和組氨酸緩 沖液?！癟RIS”指2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇及其藥學(xué)上可接受的鹽。優(yōu)選的緩沖液 是含鹽水或可接受的鹽的乙酸鹽緩沖液。賦形劑優(yōu)選以約30mg/ml-50mg/ml的濃度存在，更優(yōu)選約40mg/ml-50mg/ml的濃 度，甚至還要優(yōu)選約45mg/ml的濃度。表面活性劑的濃度以約0. lmg/ml-lmg/ml為宜，優(yōu)選濃度約0. 4mg/ml-0. 7mg/ml, 甚至更優(yōu)選濃度約0. 5mg/ml。術(shù)語“表面活性劑”指能降低液體表面張力或降低二種液體或液體與固體之間界 面張力的可溶性化合物，表面張力是作用于液體表面，傾向于使表面面積降至最小的力。表 面活性劑有時用于藥物制劑，包括遞送低分子量藥物和多肽，以改善藥物的吸收或向靶組 織的遞送。熟知的表面活性劑包括聚山梨酯(polysorbates)(山梨醇脂肪酯的聚氧乙烯衍 生物Tween )和泊洛沙姆，如德國BASF的普奴尼克Pluronic 或Lutrol 。按照本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，發(fā)現(xiàn)配制PEG-IFN-0采用的表面活性劑選自 Pluronic F77、Pluronic F8、Pluronic F88 和 Pluronic F68，特別優(yōu)選 Pluronic F68 (BASF, Pluronic <g)F68也稱為泊洛沙姆188)時，獲得的穩(wěn)定制劑最大程度減少了因 吸附于小瓶和/或遞送裝置(如針管、泵、插管等)表面所造成的活性成分丟失。也發(fā)現(xiàn)用選自 Pluronic F77、Pluronic F87、Pluronic F88 和 Pluronic F68，特別 優(yōu)選Pluronic； F68(BASF，Pluronic F68也稱為泊洛沙姆188)的表面活性劑配制 PEG-IFN-0時，獲得的穩(wěn)定組合物更能抵制氧化和蛋白聚集體的形成。Pluronic; :表面活性劑是環(huán)氧乙烷(E0)與環(huán)氧丙烷(P0)的嵌段共聚物。環(huán)氧丙 烷嵌段(P0)夾心在二個環(huán)氧乙烷(E0)嵌段中。 在Pluronic ; F77中，聚氧乙烯(親水)百分比為70%，疏水(聚氧丙烯)的分 子量約2，306Da。在Pluronic F87中，聚氧乙烯(親水)百分比為70%，疏水(聚氧丙烯)的分 子量約2，644Da。在Pluronic F88中，聚氧乙烯(親水)百分比為80%，疏水(聚氧丙烯)的分 子量約2，644Da。在Pluronic ; F68中，聚氧乙烯(親水)百分比為80%，疏水(聚氧丙烯)的分 子量約1，967Da。本發(fā)明組合物中也可采用性質(zhì)與普奴尼克(Pluronic)系列類似的其它聚合物。 優(yōu)選的表面活性劑是Pluronic F68和具有類似性質(zhì)的表面活性劑。Pluronic，特別是Pluronic ; F68，優(yōu)選以在整個貯存期間(例如12-24個月)足 以維持PEG-IFN-0穩(wěn)定性的濃度存在，也以足以防止蛋白質(zhì)因吸附于表面(如小瓶、安瓶 或插管、針管表面)而損失的濃度存在。液體制劑中Pluronic <g),特別是Pluronic F68的優(yōu)選濃度是或約0. Olmg/ ml-10mg/ml，更優(yōu)選是或約0. 05mg/ml-5mg/ml，還要特別優(yōu)先是或約0. lmg/ml-2mg/ml，最 優(yōu)選是或約lmg/ml。在另一優(yōu)選實施方式中，采用甲硫氨酸，具體是L_甲硫氨酸。具體的使用濃度 為 0. lmg/ml-0. 5mg/ml,優(yōu)選的濃度約為 0. lmg/ml-0. 3mg/ml,更優(yōu)選約 0. 25mg/ml 或約 0. 12mg/ml。甲硫氨酸的加入被發(fā)現(xiàn)有利于制劑的進(jìn)一步穩(wěn)定并減少蛋白質(zhì)氧化。本發(fā)明制劑中所含或包含的各種化合物可如上文所述進(jìn)行改變，仍可實現(xiàn)甲硫氨 酸的正面作用。在一實施方式中，該制劑包含或含有O.O55mg/mlPEG-IFN-0 UOmM乙酸鈉 緩沖液(pH 3. 5-4. 5、優(yōu)選pH4. 2)、45mg/ml甘露醇和0. 5mg/ml泊洛沙姆188，或者可包含 0. 110mg/ml PEG-IFN-旦。本發(fā)明的組合物含有足夠量的緩沖劑以維持所述組合物的pH在特定pH的士0. 5 單位。該特定PH是約3. 0-5.0，優(yōu)選所述pH是約3.5-4.5，甚至更優(yōu)選所述pH是約 4. 2 士 0. 2。本發(fā)明組合物中的緩沖液濃度約5mM-500mM，優(yōu)選濃度約10mM。
所述組合物以水溶液為宜。本發(fā)明包括液體組合物。優(yōu)選的溶劑是注射用水。調(diào)節(jié)PEG-IFN- 0組合物的pH至約pH3-5，優(yōu)選至約3. 5-4. 5，更優(yōu)選至約 4. 2+/-0. 2，可顯示能提供穩(wěn)定的制劑。本發(fā)明的組合物達(dá)到對PEG-IFN-0降解過程有正面影響，而這一降解過程在液 體組合物中是起負(fù)面影響的?？煞謩e在例如40°C和25°C用SE-HPLC檢測這種影響。本發(fā) 明的組合物觀察到PEG-IFN-0含量(SE-HPLC)無明顯減少，特別是40°C二周和25°C六周 PEG-IFN-^含量無減少。本發(fā)明組合物顯示了良好的穩(wěn)定特征，特別是實現(xiàn)了貯存期蛋白 質(zhì)聚集減少。玻璃小瓶(優(yōu)選3ml)或玻璃針管(優(yōu)選1ml)中制備的包含0. 044mg/ mlPEG-IFN-3、pH約4. 2的10mM乙酸鈉緩沖液、45mg/ml甘露醇和0. 5mg/ml泊洛沙姆188 的組合物，特別可達(dá)到正面效果。用SE-HPLC、RP_HPLC測定純度，用SE-HPLC測定蛋白含量和生物學(xué)活性檢測，顯示 本發(fā)明組合物良好的穩(wěn)定性。另一方面，本發(fā)明涉及制備上述液體藥物組合物的方法，其中所述方法包括在緩 沖液中加入計算量的賦形劑和表面活性劑，然后加入PEG-IFN-3。還有另一方面，本發(fā)明涉及在無菌條件下密封的適合貯藏待用的容器，該容器包 含本發(fā)明的液體藥物組合物。任何適合醫(yī)用的容器均可采用。所述容器優(yōu)選預(yù)充填的針管、自動注射器用的小 瓶或藥筒?？捎靡驯徽J(rèn)可的裝置給予本發(fā)明的制劑。包含這些單個小瓶系統(tǒng)的例子包括遞送 溶液的自動注射器或注射筆裝置，如Rebiject 。本申請要求保護(hù)的產(chǎn)品包括包裝材料。包裝材料除管理機構(gòu)要求提供的信息外， 還提供該產(chǎn)品使用的條件。本發(fā)明的包裝材料向患者提供使用說明書，如果需要，也提供制 備二個小瓶干/濕產(chǎn)品最后溶液和在24小時內(nèi)或更長時間內(nèi)使用該最后溶液的說明。對 于單個小瓶溶液產(chǎn)品，標(biāo)簽上指明該溶液可在24小時或更長時間內(nèi)使用。本申請要求保護(hù) 的產(chǎn)品是人用的藥物產(chǎn)品。向患者提供的組合物是澄清溶液。按照本發(fā)明，PEG-IFN-0可通過各種遞送方法給予患者，包括SC或IM注射、透皮、 經(jīng)肺、經(jīng)粘膜、植入、滲透泵、注射藥筒、微型泵、口服或本領(lǐng)域熟知的、技術(shù)人員認(rèn)可的其它 方式。另一方面，本發(fā)明涉及藥物組合物的藥盒，該藥盒包含充裝了本發(fā)明藥物組合物 的容器。所述容器優(yōu)選作為遞送裝置的針管。本說明書引用的所有參考文獻(xiàn)，包括雜志文章或摘要，公開或未公開的美國或外 國專利申請，批準(zhǔn)的美國或外國專利或其它參考文獻(xiàn)，它們的內(nèi)容通過引用整體納入本說 明書，包括所引用參考文獻(xiàn)中提供的所有數(shù)據(jù)、表格、附圖和正文。此外，本說明書引用的參 考文獻(xiàn)中所引用的參考文獻(xiàn)，其全部內(nèi)容也整體納入本說明書作為參考。以下通過實施例闡述本發(fā)明，這些實施例并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。實施例
以下實施例將描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。1. PEG-IFN- P偶聯(lián)物的制各以下流程說明了 PEG-IFN-3的制備實例PEG-IFN合成和鈍化的流稈 PEG 2k OPSS = (2-吡啶基二硫醇)2-PEG-2KPEG (20K) 2 = HS_ 半胱酰胺-賴氨酸-(PEG-20K) 2PEG-IFN合成和鈍化的流稈 2.制劑用PEG-IFN-0 la 配制 PEG-IFN-0 組合物。通過 0. 22um 膜(Durapore)過濾溶液， 過濾到最終的容器(1ml小瓶或針管)中。受試組合物含0. 044mg/ml PEG-IFN- 3 la、10mM 乙酸鈉緩沖液(pH4. 2)、45mg/ml 甘露醇和0. 5mg/ml泊洛沙姆188?；蛘?，含0. 055或0. 110mg/ml PEG-IFN- ^ la和可加入 甲硫氨酸。將受試組合物的樣品分別貯存在40°C、25°C和2_8°C并進(jìn)行測試，用SE-HPLC或 RP-HPLC檢測純度，用SE-HPLC檢測蛋白含量，用依據(jù)IFN-0誘導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)作用的抗病毒試 驗檢測生物學(xué)活性，并測PH隨時間的變化，以及用肽圖/UPLC分析測肽的氧化形式。3.穩(wěn)定性試驗和其它實驗3. 1.純度和 SE-HPLC 測定用SE-HPLC在Shodex柱(Aqueous SE公司，編號KW-803)上評估純度；用水10倍 稀釋PBS 10x(Gibco BRL公司，編號70013-016)制備PBS lx，以1. OmL/分等滲方式進(jìn)行洗 脫；用紫外光UV于214nm進(jìn)行檢測。注射IFN-PEG制劑樣品，采用以下注射體積200mcL (對于44和55mcg/mL樣品)； 100mcL (對于 110mcg/mL 樣品)。該試驗用對照參比標(biāo)準(zhǔn)品PS200-01 (單點試驗)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量測定。3. 2. RP-HPLC 測定純度用RP-HPLC 在 35°C恒溫下，在 C4 柱(Symmetry 300C4，5m size4. 6x250mm, Waters 公司)上進(jìn)行純度檢測。波長設(shè)置為214nm，用以下條件以lmL/分流速進(jìn)行洗脫
移動相A= 0. 1% TFA/ 水；B = 0. 1 % TFA/ 乙腈梯度30%—70% B,40 分鐘 注射IFN-PEG制劑樣品，采用以下注射體積160mcL (對于44mcg/mL樣品)； 200mcL (對于 55mcg/mL 樣品)；lOOmcL (對于 110mcg/mL 樣品)。3. 3.生物學(xué)活性(體外試驗)用現(xiàn)有檢測IFN-0的方法測定生物學(xué)活性，這是一個抗病毒試驗，基于IFN-3可 誘導(dǎo)細(xì)胞(WISH細(xì)胞，人羊膜組織細(xì)胞)保護(hù)抵御病毒(水泡性口膜炎病毒)的細(xì)胞致病 作用。3. 4.pH 測定用校準(zhǔn)的pH計(Mettler-Toledo公司，713型)按照標(biāo)準(zhǔn)操作方案進(jìn)行pH檢測。3. 5.用肽圖/UPLC分析氧化形式定量測定被氧化的甲硫氨酸殘基(Met 1, Met 117, Met 36)的方法可預(yù)見 IFN-PEG樣品的蛋白水解消化情況，采用內(nèi)蛋白酶Lys-C消化然后作梯度UPLC分析；蛋白 水解前對制劑樣品作預(yù)處理去除基質(zhì)組分的干擾。在AcquityUPLC分析柱(BEH C18 1, 7um 2. 1x50mm cod. 1860002350，Waters 公 司)上分離蛋白水解混合液；用0. TFA/水(A1)和0. TFA/乙腈(B1)作梯度洗脫?？刹捎靡韵聝x器設(shè)置和分析參數(shù) 表1PEG-IFN-3 制劑組合物(mg/mL) 0大體積組合物中也殘留有PBS緩沖液(由于5倍稀釋PEG-IFN藥品)。表2SE-HPLC測定的純度％ 表3RP-HPLC測定的純度％表4 SE-HPLC測定的滴度(mcg/ml)
表6pH測定 表7生物檢定(MIU/mL) 表8SE-HPLC測定的純度(％ ) 表10RP-HPLC測定的純度(％ ) 表13肽圖/UPLC顯示的氧化形式(％ ) 參考文獻(xiàn)1. Derynk R.等，Nature 1980 ；285, 542-547 2. Familletti，P. C.，Rubinstein，S.和 Pestka，S ； 1981 “干擾素的方便快速細(xì)胞 病變效應(yīng)抑制試驗”，Methods in Enzymology，78 卷(S. Pestka，主編)，Academic Press, New York,387-394o3. Mark D. F 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ,81 (18) 5662-5666 (1984)。4. Pestka, S. (1986) “干擾素的標(biāo)準(zhǔn)品和通用縮寫”，Methods inEnzymology (S. Pestka,主編)，Academic Press, New York 119,14-23。5. Rubinstein, S.，F(xiàn)amilletti, P. C 和 Pestka, S ；“干擾素的簡便試驗”，J. Virol 1981 ；37，755-758。6. Sh印ard H. M 等，Nature 1981 ;294，563-565。7.Woghiren 等，Bioconjugate Chem. , 4 (5) :314_318，1993。
權(quán)利要求
一種液體藥物組合物，包含PEG化干擾素-β(PEG-IFN-β)或其突變蛋白或活性片段、賦形劑、表面活性劑和緩沖液，其中所述賦形劑是多元醇，所述表面活性劑是非離子表面活性劑，所述緩沖液是乙酸鈉緩沖液。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，包含PEG-IFN-0、賦形劑、表面活性劑和緩沖液，其中 所述賦形劑是甘露醇，所述表面活性劑是泊洛沙姆188，所述緩沖液是乙酸鈉緩沖液
3.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述PEG-IFN-0的濃度約為O.Olmg/ ml-0. lmg/ml0
4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述PEG-IFN-0的濃度約為0. 044mg/ml、 0.055mg/ml 或 0. 110mg/mlo
5.如以上權(quán)利要求任何一項所述的組合物，其中所述PEG-IFN-0包含線性或分枝性 PEG，優(yōu)選分枝性PEG。
6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述PEG的分子量為至少20kDa，優(yōu)選至少40kDa， 更優(yōu)選40kDa。
7.如權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述PEG-IFN-0含有間隔臂。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述間隔臂的分子量為100-5000道爾頓，優(yōu)選 1500-2500道爾頓，更優(yōu)選2000道爾頓。
9.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述賦形劑的濃度為約30mg/ml-50mg/ml。
10.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述賦形劑的濃度為約40mg/ml-50mg/ml。
11.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述賦形劑的濃度為約45mg/ml。
12.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述表面活性劑的濃度為約0.lmg/m-lmg/ml。
13.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述表面活性劑的濃度為約0.4mg/ ml-0. 7mg/ml。
14.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述表面活性劑的濃度為約0.5mg/ml。
15.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述緩沖液的量足以維持所述組合物的pH 在特定PH的士 0. 5單位，所述特定的pH是約3. 0-5. 0。
16.如權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述pH是約3.5-4. 5。
17.如權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述pH是約4.2士0. 2。
18.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述緩沖液的濃度為約5mM-500mM。
19.如權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述緩沖液的濃度為約10mM。
20.如以上權(quán)利要求任何一項所述的組合物，其中所述組合物是一種水溶液。
21.如以上權(quán)利要求任何一項所述的組合物，其中所述組合物還包含甲硫氨酸。
22.如權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述甲硫氨酸的濃度為0.10-0. 50mg/ml，優(yōu)選 0. 20-0. 40mg/ml，更優(yōu)選 0. 12 或 0. 25mg/ml。
23.一種制備權(quán)利要求1-22中任何一項所述液體藥物組合物的方法，其特征在于，所 述方法包括在所述緩沖液中加入計算量的賦形劑和表面活性劑，然后加入PEG-IFN-3。
24.一種適合于貯存待用的在無菌條件下密封的容器，包含權(quán)利要求1-22中任何一項 所述的液體藥物制劑。
25.如權(quán)利要求24所述的容器，其中所述容器是預(yù)裝填的針管或自動注射器用的小2瓶。
26. —種藥物組合物的藥盒，該藥盒包含充裝了權(quán)利要求1-22中任何一項所述藥物組 合物的容器。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種液體藥物組合物，該組合物包含PEG化干擾素-β(PEG-IFN-β)、賦形劑、表面活性劑和緩沖液，其中所述賦形劑是多元醇，所述表面活性劑是非離子表面活性劑，所述緩沖液是乙酸鈉緩沖液。
文檔編號A61K47/48GK101878043SQ200880118584
公開日2010年11月3日 申請日期2008年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月20日
發(fā)明者A·德爾里奧, J·里查德 申請人:默克雪蘭諾有限公司