專利名稱：β-干擾素的無HSA制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及藥物組合物，更具體涉及不含人血清白蛋白作為添加的藥物賦形劑的β-干擾素的穩(wěn)定制劑。
背景技術(shù)：
干擾素是糖蛋白的一個家族，通過包括病毒、雙鏈RNA、其他多核苷酸、抗原及促分裂原在內(nèi)的許多信號的誘導(dǎo)可從細(xì)胞中分泌干擾素。干擾素具有多種生物活性，包括抗病毒、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)作用。根據(jù)許多因素，包括抗病毒活性和抗增殖活性，已經(jīng)鑒定至少三種不同類型的人源干擾素，α、β和γ。
β-干擾素(IFN-β)第一個被確認(rèn)對于治療多發(fā)性硬化癥(MS)有效，并證實能減少復(fù)發(fā)和緩解型MS病人的發(fā)作次數(shù)。IFN-β組合物在乙型和丙型肝炎感染的治療中也是有用的。
對所有以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的藥物而言，在將IFN-β用作治療劑必需克服的一個主要障礙是藥效的損失，這是由于藥物制劑的不穩(wěn)定性造成的。影響藥物制劑中多肽的活性和效能的物理不穩(wěn)定因素包括變性和可溶和不溶聚集體的形成，而化學(xué)不穩(wěn)定因素包括水解、亞胺形成、氧化、外消旋化和脫酰胺作用。已知這些變化中的一些會導(dǎo)致有興趣的蛋白質(zhì)的藥物活性的喪失或降低。其它情況下，這些變化的準(zhǔn)確作用還不知道，但由于潛在的不良副作用，所得的降解產(chǎn)物仍被認(rèn)為是藥物上所無法接受的。
藥物組合物中多肽的穩(wěn)定仍是實驗和誤差扮演主要角色的區(qū)域(Wang(1999)Int.J.Pharm.185129-188的綜述；Wang和Hanson(1988)J.Parenteral Sci.Tech.42S3-S26)。加到多肽藥物制劑中以增加其穩(wěn)定性的賦形劑包括緩沖液、糖類、表面活性劑、氨基酸、聚乙二醇和聚合物，但這些化學(xué)添加劑的穩(wěn)定效果取決于蛋白質(zhì)。
制備穩(wěn)定的IFN-β藥物制劑的一個主要障礙是IFN-β分子的穩(wěn)定性差。目前的制劑使用HSA作為IFN-β的溶解增強(qiáng)劑。然而，使用HSA有缺點。HSA是人血液產(chǎn)品，因此必需從人受試者獲得。由于采用了降低風(fēng)險的步驟，人血液產(chǎn)品如HSA的應(yīng)用有可能引入人病毒如HIV和HCV。在制劑中引入HSA還會影響正確確定IFN-β在制劑中的穩(wěn)定性的能力。這是因為HSA和IFN-β都是蛋白質(zhì)，且HSA還會影響一些指示IFN-β穩(wěn)定性的測定。
此外，IFN-β是一種當(dāng)在藥物組合物中制備時會有聚集體形成的蛋白質(zhì)，因此在這些組合物的貯存期間使處于單體生物活性狀態(tài)的這種蛋白質(zhì)的量受到損害。藥物組合物貯存期間由IFN-β等多肽形成的聚集體對那種多肽的生物學(xué)活性有不利影響，導(dǎo)致藥物組合物的治療功效的喪失。此外，聚集體形成會造成其它問題，如當(dāng)使用輸注系統(tǒng)施用IFN-β的藥物組合物時會堵塞輸液管、膜或泵。此外，注射含有蛋白質(zhì)的聚集形式的藥物組合物可能會對聚集的蛋白質(zhì)產(chǎn)生免疫原性反應(yīng)。
因此，需要其它的IFN-β藥物組合物，它含有生理上相容的穩(wěn)定劑，這種穩(wěn)定劑可提高這種蛋白質(zhì)的溶解度并穩(wěn)定蛋白質(zhì)以避免聚集體形成，由此增加其藥效。
發(fā)明概述提供了以β-干擾素(IFN-β)作為治療活性成分的組合物及其制備方法。這種組合物是穩(wěn)定的藥物組合物，它不含作為藥物賦形劑的人血清白蛋白(HSA)且基本上含有溶于低離子強(qiáng)度制劑中的單體IFN-β。所述低離子強(qiáng)度制劑是一種含有緩沖液的溶液，緩沖液的量足以使所述組合物保持在特定的pH±0.5個單位內(nèi)，其中特定的pH約為3.0-5.0，且離子強(qiáng)度不超過約60mM。非離子的滲透劑(tonicifyingagent)被加入此藥物組合物以使時組合物等滲，這里的滲透劑是碳水化合物。還提供了增加IFN-β在藥物組合物中的溶解度，以及不使用人血清白蛋白來增加這些組合物中單體IFN-β的量的方法。
附圖簡述

圖1顯示了氯化鈉溶液中IFN-β-1b的溶解度。
圖2顯示了低離子強(qiáng)度制劑中IFN-β-1b的溶解度。
圖3顯示了pH3.0對IFN-β-1b聚集狀態(tài)的影響。
圖4顯示了pH4.0對IFN-β-1b聚集狀態(tài)的影響。
圖5顯示了pH5.0對IFN-β-1b聚集狀態(tài)的影響。
圖6顯山了離子強(qiáng)度(0mM NaCl)對IFN-β-1b聚集狀態(tài)的影響。
圖7顯山了離子強(qiáng)度(50mM NaCl)對IFN-β-1b聚集狀態(tài)的影響。
圖8顯山了離子強(qiáng)度(150mM NaCl)對IFN-β-1b聚集狀態(tài)的影響。
圖9顯示了僅含5mM甘氨酸緩沖劑的pH 3.0制劑中IFN-β-1b的聚集狀態(tài)。
圖10顯示了非離子滲透劑(9％蔗糖)在圖9所示的制劑中對IFN-β-1b聚集狀態(tài)的影響。
圖11顯示了非離子滲透劑(9％海藻糖)在圖9所示的制劑中對IFN-β-1b聚集狀態(tài)的影響。
圖12顯示了在40℃貯存8周后，在含有9％海藻糖或9％蔗糖的凍干制劑中IFN-β-1b最初濃度的百分比。濃度是用UV吸收測定的。
圖13顯示了在40℃貯存8周后，在含有9％海藻糖或9％蔗糖的凍干制劑中IFN-β-1b主峰的百分比。主峰百分比是通過RP-HPLC測定的。
圖14顯示了在5℃或30℃貯存9個月后，在含有9％海藻糖的凍干制劑中IFN-β-1b最初濃度的百分比。濃度是用UV光譜測定的。
圖15顯示了在5℃或30℃貯存9個月后，在含有9％海藻糖的凍干制劑中IFN-β-1b主峰的百分比。主峰百分比是通過RP-HPLC測定的。
圖16顯示了在30℃貯存9周后，在含有9％海藻糖或9％蔗糖的液體制劑中IFN-β-1b最初濃度的百分比。濃度是用UV吸收測定的。
圖17顯示了在30℃貯存8周后，在含有9％海藻糖或9％蔗糖的液體制劑中IFN-β-1b主峰的百分比。主峰百分比是通過RP-HPLC測定的。
圖18顯示了在5℃在小瓶中貯存9個月后，在含有9％海藻糖或9％蔗糖的液體制劑中IFN-β-1b最初濃度的百分比。濃度是用UV光譜測定的。
圖19顯示了在5℃在小瓶中貯存9個月后，在含有9％海藻糖或9％蔗糖的液體制劑中IFN-β-1b主峰的百分比。主峰百分比是通過RP-HPLC測定的。
圖20顯示了在30℃貯存9周后，在含有9％海藻糖或9％蔗糖的液體制劑中IFN-β-1b最初濃度的百分比。濃度是用UV光譜測定的。
圖21顯示了在40℃貯存8周后，在含有9％海藻糖或9％蔗糖的液體制劑中IFN-β-1b最初濃度的百分比。濃度是用UV光譜測定的。
圖22顯示了在5℃貯存6個月后，在含有5％甘露醇的液體制劑中IFN-β-1b最初濃度的百分比。濃度是用UV光譜測定的。
圖23顯示了在5℃貯存9個月后，在含有5％甘露醇的液體制劑中IFN-β-1b主峰的百分比。主峰百分比是通過RP-HPLC測定的。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及含有β-干擾素(IFN-β)的穩(wěn)定的藥物組合物及其制法。這些組合物是在沒有人血清白蛋白(HSA)時制備的，因此不含這種藥物賦形劑。這種組合物在這里被稱為“無HSA”的IFN-β藥物組合物。該組合物含有基本上呈單體狀態(tài)的溶于低離子強(qiáng)度制劑的IFN-β?！暗碗x子強(qiáng)度”制劑是指一種含有緩沖液的溶液，緩沖液的量足以使所述藥物組合物保持在特定的pH±0.5個單位內(nèi)，且離子強(qiáng)度不超過約60mM?！半x子強(qiáng)度”是指用于溶液的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)定義，溶液的離子強(qiáng)度等于1/2∑cizi2，其中c是濃度，z是電荷。所述緩沖液以約1mM-約30mM的濃度存在于該低離子強(qiáng)度制劑中，優(yōu)選為約2mM-約25mM，較優(yōu)選為約2mM-約20mM，更優(yōu)選為約2mM-約10mM，最優(yōu)選為約2mM-5mM。因此，在一些實施方案中，所述低離子強(qiáng)度制劑含有濃度為約2mM-約10mM、約2mM-約7mM、約2mM-約5mM、約2mM、約3mM、約4mM或約5mM的緩沖液?？捎脕碇苽涞碗x子強(qiáng)度制劑的IFN-β可溶于其中的合適的緩沖液包括但不限于甘氨酸、天冬氨酸、琥珀酸鈉、檸檬酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、谷氨酸、組氨酸、咪唑和磷酸鹽，優(yōu)選甘氨酸、天冬氨酸和琥珀酸鈉，更加優(yōu)選甘氨酸和天冬氨酸。
優(yōu)選所述低離子強(qiáng)度制劑的離子強(qiáng)度不超過約60mM，較優(yōu)選不超過約40mM、更優(yōu)選不超過約20mM。一些實施方案中，所述制劑的離子強(qiáng)度僅僅是由緩沖液的濃度決定的，因此所述制劑不含其它對離子強(qiáng)度有影響的離子種類，如氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、銨鹽等。
低離子強(qiáng)度制劑以含有緩沖液的溶液使用，所述緩沖液的濃度約為1mM-30mM，優(yōu)選約為2mM-5mM，以制備穩(wěn)定的IFN-β藥物組合物，根據(jù)所用特定的緩沖液，該組合物的pH約為3.0-5.0，優(yōu)選約為3.0-4.5，較優(yōu)選約為3.0-4.0，更優(yōu)選約為3.5-4.0，最優(yōu)選約為4.0。因此，當(dāng)緩沖液是甘氨酸時，所述組合物的pH約為3.0-3.5，優(yōu)選約3.0。當(dāng)緩沖液是天冬氨酸時，所述組合物的pH約為3.5-4.5，優(yōu)選約4.0。當(dāng)緩沖液是琥珀酸鈉時，所述組合物的pH約為4.5-5.0，優(yōu)選約5.0。
將本發(fā)明的IFN-β藥物組合物的pH保持在約pH3.0-pH5.0可使IFN-β在這些組合物中的溶解度超過在沒有人血清白蛋白時正常的可能值。此外，將IFN-β?lián)饺脒@里所定義的低離子強(qiáng)度制劑中可能制備含有基本上為單體IFN-β的藥物組合物。“基本上為單體”是指出現(xiàn)在該組合物中的大多數(shù)IFN-β(以重量計)為單體形式而不是聚集體形式。“聚集”是指多肽分子之間的物理相互作用，這種作用會導(dǎo)致仍溶于溶液或從溶液中沉淀出的多聚體(二聚體、三聚體等)的形成。IFN-β多肽的單體形式仍是可溶的，這里稱為“溶解”在低離子強(qiáng)度制劑或本發(fā)明的藥物組合物中。本發(fā)明的無HSA的組合物中單體形式的IFN-β的百分比(以重量計)為80％或更高。因此，本發(fā)明提供了無HSA的IFN-β藥物組合物，它含有至少約80％的單體形式而不是聚集體形式的IFN-β，優(yōu)選單體形式的IFN-β至少約85％，較優(yōu)選至少約90％，更優(yōu)選至少約91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。
在本發(fā)明的一些實施方案中，這種無HSA的IFN-β藥物組合物還含有非離子的滲透劑，其量足以使該組合物與體液等滲?？捎么祟I(lǐng)域中一般知道的一些非離子滲透調(diào)節(jié)劑使該組合物等滲。它們通常是各種類型的碳水化合物(例如可參見Voet和Voet(1990)Biochemistry(John Wiley & Sons，紐約)。醛糖類的單糖如葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖和核糖，以及酮糖類的單糖如果糖、山梨糖和木酮糖可被用作本發(fā)明的非離子滲透劑。也可使用二糖，如蔗糖、麥芽糖、海藻糖和乳糖。此外，糖醇(脂肪族的多羥基醇)如甘油、甘露醇、木糖醇和山梨醇也是本發(fā)明中有用的非離子滲透劑。最優(yōu)選的非離子滲透劑是海藻糖、蔗糖和甘露醇，或它們的組合。所加入的非離子滲透劑的量足以使所述制劑與體液等滲。當(dāng)加入無HSA的IFN-β藥物組合物時，根據(jù)所用試劑，所述非離子滲透劑的濃度約為1％-10％。因此，在一個實施方案中，所述非離子滲透劑是濃度約為8％-10％，優(yōu)選約9％(以每體積的重量計)的海藻糖或蔗糖，優(yōu)選是此濃度的海藻糖。在另一個實施方案中，所述非離子滲透劑是濃度約為4％-6％，優(yōu)選約5％(以每體積的重量計)的甘露醇。在其它實施方案中，所述非離子滲透劑是海藻糖和甘露醇，或蔗糖和甘露醇的組合物，其中海藻糖和蔗糖的濃度約為1％(以每體積的重量計)，甘露醇的濃度約為3％-5％(以每體積的重量計)，優(yōu)選約4.6％(以每體積的重量計)。
本發(fā)明的無HSA的IFN-β藥物組合物包括液態(tài)組合物及其干燥形式。出于本發(fā)明的目的，關(guān)于藥物組合物或制劑的術(shù)語“液態(tài)”是指包含術(shù)語“含水的”，并包括被冷凍的液體制劑?！案稍镄问健笔侵敢簯B(tài)藥物組合物或制劑通過冷凍干燥(即凍干，例如參見Williams和Polli(1984)J.Parenteral Sci.Technol.3848-59)、噴霧干燥(參見Masters(1991)，《噴霧干燥手冊》Spray-dryingHandbook(第5版；Longman Scientific and Technical，Essez，英國)第491-676頁；Broadhead等(1992)Drug Devel.Ind.Pharm.181169-1206；以及Mumenthaler等(1994)Pharm.Res.1112-20)或空氣干燥(Carpenter和Crowe(1988)Cryobiology25459-479；以及Roser(1991)Biopharm.447-53)而干燥。關(guān)于IFN-β的藥物組合物的術(shù)語“凍干”是指在減壓下迅速冷凍干燥許多小瓶，其中每個小瓶中都含有單位劑量的本發(fā)明的干擾素制劑。進(jìn)行上述凍干處理的凍干機(jī)是商業(yè)上可獲得的且是精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員可操作的。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述液態(tài)組合物被制成凍干組合物。
在本發(fā)明其它的實施方案中，本發(fā)明的無HSA的IFN-β藥物組合物可被制成適合肺部輸送并通過肺吸入將該制品用于受試者的形式?！胺挝搿笔侵府?dāng)受試者通過口腔吸氣時將氣溶膠或其它合適劑制的組合物從輸送裝置送到受試者的口腔中，從而將所述藥物組合物直接用于肺部?！皻馊苣z”是指固體或液體顆粒在流動的空氣或其它生理上可接受的氣流中形成的懸液。其它合適的制劑包括但不限于霧、蒸氣或噴霧制劑，只要含有蛋白質(zhì)組合物的顆粒以與下述藥物組合物的干粉形式相一致的大小范圍輸送即可。肺吸入也可通過精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的其它合適方法實現(xiàn)。這些方法包括采用合適裝置的液體滴注法或其它此類方法。肺吸入導(dǎo)致吸入的蛋白質(zhì)組合物沉積在受試者的肺泡上。一旦沉積，蛋白質(zhì)就可被被動或主動吸收，穿過肺泡上皮和毛細(xì)管上皮層進(jìn)入血流，隨后進(jìn)行全身分布。
IFN-β等多肽或蛋白質(zhì)的肺部施用要求在吸入時生物活性物質(zhì)由輸送裝置分配到受試者的口腔中。出于本發(fā)明的目的，含有IFN-β或其變體的無HSA的IFN-β藥物組合物是通過吸入氣溶膠或其它合適制劑施用的，根據(jù)所用輸送裝置，其它制劑是由藥物組合物的含水或不含水的溶液或懸液形式，或固體或干粉形式獲得的。這種輸送裝置是此領(lǐng)域熟知的，它包括但不限于噴霧器、定量吸入器和干粉吸入器，或任何其它合適的可用于分配含水或不含水的溶液或懸液或固體或干粉形式的藥物組合物的輸送裝置。當(dāng)用于本文時，適合肺部輸送的藥物組合物有以下含義?！昂摹笔侵赣盟苽?、含有水或溶于水的組合物，其中水是混合物中的主要物質(zhì)。主要物質(zhì)以大于混合物的另一組分的量存在?！胺撬摹笔侵赣贸蚧旌衔镆酝獾奈镔|(zhì)、含有水或溶于水的物質(zhì)制備的組合物，其中水不是混合物中的主要物質(zhì)?！叭芤骸笔侵竷煞N或多種物質(zhì)的均一制劑，它可以是固體、液體、氣體或它們的組合?！皯乙骸笔侵敢环N或多種不溶性物質(zhì)均勻分散在另一主要物質(zhì)中形成的混合物。
出于本發(fā)明的目的，對于適合肺部輸送的無HSA的藥物組合物，當(dāng)術(shù)語“固體”和“干粉”可互換使用。藥物組合物的“固體”或“干粉”形式是指被干燥成水分含量低于約10％(重量計)，通常低于約5％(重量計)，優(yōu)選低于約3％(重量計)的細(xì)散的粉末的組合物。組合物的這種干粉形式由含有IFN-β或其變體的顆粒構(gòu)成。優(yōu)選的粒度是平均直徑小于約10.0μm，較優(yōu)選小于約7.0μm，更優(yōu)選小于約6.0μm，再優(yōu)選在0.1-5.0μm之間，最優(yōu)選在約1.0-5.0μm之間。
因此，供肺部輸送的含有IFN-β或其變體的無HSA的液態(tài)藥物組合物可被用作輸送裝置內(nèi)的液體溶液或懸液，或者首先用此領(lǐng)域中熟知的凍干或噴霧干燥技術(shù)將其加工成干粉。如果以單劑量或多劑量，在輸送裝置、噴霧器、定量吸入器或其它合適的輸送裝置中使用液體溶液或懸液，通過肺吸入藥物有效量的組合物就以液滴形式達(dá)到受試者的肺部，該液滴與上述干粉形式有同樣的粒度范圍?！八幬镉行Я俊笔侵赣糜谥委煛㈩A(yù)防或診斷與IFN-β有關(guān)的疾病或癥狀的量。所述組合物的液體溶液或懸液可與精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的生理上適合的穩(wěn)定劑、賦形劑、粘度修飾劑、膨脹劑、表面活性劑或它們的組合一起使用，只要它們不妨礙鑒別本發(fā)明的無HSA的IFN-β組合物的特性。
在用于肺部輸送之前將所述液態(tài)藥物組合物凍干，將凍干的組合物研磨以得到細(xì)散的干粉，所述干粉是由在上述所需大小范圍內(nèi)的顆粒構(gòu)成的。如果采用噴霧干燥以得到液態(tài)藥物組合物的干粉形式，該過程是在得到基本上為無定形細(xì)散的干粉的條件下進(jìn)行的，所述干粉是由在上述所需大小范圍內(nèi)的顆粒構(gòu)成的。類似地，如果起始的藥物組合物已經(jīng)是凍干形式，可將所述組合物研磨以得到干粉形式，隨后將其制為氣溶膠或其它適合肺吸入的制劑。如果起始的藥物組合物是噴霧干燥的形式，優(yōu)選將該組合物制成干粉形式，具有作為含水或不含水的溶液或懸液或干粉形式分配的粒度的干粉形式與肺輸送一致。對于制備藥物組合物的干粉形式的方法，例如可參見WO 96/32149、WO 97/41833、WO 98/29096以及美國專利5,976,574、5,985,248和6,001,336號，本文將其引入以供參考。
將所得干粉形式的組合物放在合適的輸送裝置內(nèi)，隨后將其制成氣溶膠或其它通過肺吸入輸送給受試者的合適制劑。如果要制備藥物組合物的干粉形式并將其作為含水或不含水的溶液或懸液分配，使用了定量吸入器或其它合適的輸送設(shè)備。以氣溶膠或其它適合肺吸入的制劑施用了藥物有效量的干粉形式的組合物。置于輸送裝置內(nèi)的干粉形式的組合物的量足以通過吸入將藥物有效量的組合物輸送給受試者。因此，置于輸送裝置內(nèi)的干粉形式的量將補(bǔ)償此裝置在貯存或輸送組合物的干粉形式中可能的損失。將干粉形式置于輸送裝置內(nèi)以后，如上述大小合適的顆粒被懸浮在氣溶膠推進(jìn)劑中。然后在吸入時，加壓的不含水的懸液從輸送裝置釋放到受試者的呼吸道中。通過肺吸入，所述輸送裝置以單劑量或多劑量向受試者的肺部輸送了藥物有效量的組合物。所述氣溶膠推進(jìn)劑可用是任何常規(guī)的用于此目的的物質(zhì)，如含氯氟烴、氫氯氟烴、氫氟烴或是烴，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四-氟乙烷或它們的組合物?？稍谠撍幬锝M合物中加入表面活性劑以減少含有蛋白質(zhì)的干粉附著在用來分散氣溶膠的輸送裝置的壁上。用于此目的的合適的表面活性劑包括但不限于山梨聚糖三油酸鹽、大豆卵磷脂和油酸。適合將干粉形式的蛋白質(zhì)組合物作為不含水的懸液進(jìn)行肺部輸送的裝置是商業(yè)上可獲得的。此類裝置的例子包括Ventol in定量吸入器(Glaxo公司，Research Triangle Park，北卡羅來納州和Intal吸入器(Fisons公司，Bedfoed，馬薩諸塞州)。還可以參看美國專利第5,522,378號、5,775,320號、5,934,272號和5,960,790號描述的氣溶膠輸送設(shè)備，本文引入以供參考。
如果將固體干粉形式的無HSA的IFN-β藥物組合物作為干粉形式輸送，優(yōu)選使用干粉吸入器或其它合適的輸送裝置。干粉形式的藥物組合物優(yōu)選用常規(guī)方法將其分散在流動的空氣或其它生理上可接受的氣流中從而制成干粉氣溶膠。市售的適合本文所述方法的干粉吸入器的例子包括Spinhaler粉末吸入器(Fisons公司，Bedfoed，馬薩諸塞州)和Ventolin吸入器(Glaxo公司，Research TrianglePark，北卡羅來納州。還可以參看WO 93/00951、WO 96/09085、WO 96/32152和美國專利第5,458,135號、5,785,049號和5,993,783號描述的干粉輸送設(shè)備，本文引入以供參考。
含有IFN-β或其生物活性變體的干粉形式的藥物組合物可以重建成水溶液，隨后以水溶液氣霧劑的形式用噴霧器、定量吸入器或其它合適的設(shè)備進(jìn)行輸送。當(dāng)用噴霧器時，保存在貯液槽內(nèi)的水溶液被轉(zhuǎn)變成水霧，每次給藥時只有一小部分離開噴霧器而輸送入受試者體內(nèi)。多余的水霧又回到噴霧器內(nèi)的貯液槽中，在那里它重新霧化成水霧。這一過程重復(fù)進(jìn)行直到貯液槽完全排空或直到霧化噴霧的給藥結(jié)束。商品供應(yīng)的這類噴霧器包括，例如，Ultravent型噴霧器(Mallinckrodt公司，St.Louis，密蘇里州)和Acorn II型噴霧器(MarquestMedical Products，Englewood，科羅拉多州)。其它的噴霧器還可以參看WO93/00951，輸送霧化的水相制劑的設(shè)備可以參看美國專利第5,544,646號；本文引入以供參考。
本發(fā)明的無HSA的IFN-β藥物組合物是“穩(wěn)定的”組合物。“穩(wěn)定的”是指在貯存期間組合物中的IFN-β多肽基本上為單體狀態(tài)，因此這種多肽的療效沒有因聚集體形成而受到影響?！百A存期間”是指液態(tài)藥物組合物或制劑一旦制成不立即用于受試者?；蛘撸谥苽浜?，它被包裝以貯存，以液體形式或以冷凍形式或以干燥形式，然后再重建成液體形式或其它適合用于受試者的形式。這種穩(wěn)定性是在沒有HSA作為穩(wěn)定劑和增溶劑時獲得的。較好地，本發(fā)明的組合物直接以其液體形式貯存，以充分利用此液體形式的貯存穩(wěn)定性、無需重建即可使用的簡便性以及以預(yù)裝填、即可使用的注射器或作為多劑量制劑(如果此配方與抑菌劑相容)補(bǔ)充制劑的能力。當(dāng)存儲在2-8℃時，本發(fā)明的穩(wěn)定的無HSA的IFN-β組合物優(yōu)選至少有約6個月、12個月、18個月，較好是至少有約20個月，更好是至少有約22個月、最好是至少有約24個月的保存期限。
此領(lǐng)域中可獲得用來檢測本發(fā)明的無HSA的IFN-β藥物組合物的穩(wěn)定性的方法，包括以下實施例中所述的方法。因此，通過測量一段時間后溶液中溶解的IFN-β的變化可以容易地確定本發(fā)明的液體藥物組合物在貯存期間IFN-β聚集體的形成?？捎迷S多適合檢測IFN-β的分析方法來量化溶液中可溶性多肽的量。這種測定包括，例如，反相(RP)-HPLC和UV吸收光譜，如以下實施例所述?？蓽y定液體制劑在貯存期出現(xiàn)的可溶和不溶的聚集體，例如，用以下實施例中提到的分析型超速離心法來分辨作為可溶性聚集體出現(xiàn)的部分可溶性多肽和以非聚集體、具有生物學(xué)活性分子形式出現(xiàn)的部分物質(zhì)。
本發(fā)明的穩(wěn)定的藥物組合物含有IFN-β及其變體。這里所用的術(shù)語“IFN-β”是指IFN-β及其變體，有時是指IFN-β樣多肽。人IFN-β變體可以指天然產(chǎn)生的(即IFN-β位點上的等位基因變體)或重組制備的蛋白質(zhì)，具有與天然成熟的人IFN-β相同、類似或基本上類似的氨基酸序列。也包括保留其活性的IFN-β片段或IFN-β的截短形式。這些具有生物活性的IFN-β片段或截短形式是使用本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)從全長IFN-β氨基酸序列中除去氨基酸殘基而得到的。IFN-β多肽可以是糖基化或非糖基化的，文獻(xiàn)報道糖基化和非糖基化的IFN-β具有相似的特異活性，因而與糖基部分無關(guān)，且不影響IFN-β的生物活性。
這里所指的IFN-β變體包括天然成熟IFN-β序列的突變蛋白，其中一個或多個對生物活性不是必需的半胱氨酸殘基已被故意刪除或被其他氨基酸替代以除去分子間交聯(lián)或形成錯誤的分子間二硫鍵的位點。這種類型的IFN-β變體包括那些用甘氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或甲硫氨酸替代天然成熟氨基酸序列的17位上半胱氨酸的IFN-β。絲氨酸和蘇氨酸是較佳的替代氨基酸，因為它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)與半胱氨酸相似，絲氨酸取代則是最佳的。在一個實施例中，就是用絲氨酸替代天然成熟氨基酸序列的17位上的半胱氨酸。17位半胱氨酸也可以采用本領(lǐng)域的已知方法刪除(參見，例如美國專利4,588,584號，本文引入供參考)，得到一個比天然成熟IFN-β短一個氨基酸的成熟IFN-β突變蛋白。另見美國專利4,530,787、4,572,798和4,588,585號。因此，本發(fā)明也包括具有一個或多個提高藥物效用的突變的IFN-β變體。
熟練的技術(shù)人員將知道通過突變編碼IFN-β的核苷酸序列可引入額外的變化，從而導(dǎo)致IFN-β氨基酸序列的改變，不改變干擾素的生物學(xué)活性。通過從編碼天然IFN-β的相應(yīng)核酸序列上引入一個或多個核苷酸取代、添加或缺失可以得到與天然成熟IFN-β氨基酸序列不同的編碼IFN-β變體的分離的核酸分子，這樣一個或多個氨基酸取代、添加或缺失引入編碼的IFN-β中。突變可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如定點誘變和PCR介導(dǎo)的誘變來引入。這種IFN-β變體也包括在本發(fā)明中。
例如，保守氨基酸取代可以在一個或多個預(yù)測的非必需氨基酸殘基上進(jìn)行。這里所說的“非必需氨”基酸殘基是指可對野生型IFN-β序列進(jìn)行改變不會改變其生物活性的殘基，而必需氨基酸殘基則是生物活性所必需的。“保守氨基酸取代”是指用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基來替代一個氨基酸殘基。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族已在本領(lǐng)域中定義。這些家族包括具有以下側(cè)鏈的氨基酸堿性側(cè)鏈(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側(cè)鏈(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)非極性側(cè)鏈(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分枝側(cè)鏈(如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。這些取代無法在保守氨基酸殘基上進(jìn)行，或者在保守基序內(nèi)無法存在氨基酸殘基。
另外，IFN-β核苷酸序列也可以通過沿著所有或部分IFN-β編碼序列隨機(jī)突變獲得，如飽和誘變，所得到的突變體通過IFN-β生物活性篩選以鑒別保留活性的突變體。誘變后，所編碼的蛋白質(zhì)可以通過重組技術(shù)進(jìn)行表達(dá)，蛋白活性則通過本發(fā)明所描述的標(biāo)準(zhǔn)分析技術(shù)測定。
具有生物學(xué)活性的IFN-β變體與天然成熟IFN-β相比，一般至少有80％，更優(yōu)先有約90％到95％或更高，最優(yōu)選有約96％到99％或更高的氨基酸序列同一性，這里天然成熟IFN-β作為比較的基礎(chǔ)。這里所說的“序列同一性”是指當(dāng)變體的氨基酸序列的指定的鄰接區(qū)段與參照分子的氨基酸序列對比和比較時，變體多肽和作為參照的多肽分子內(nèi)發(fā)現(xiàn)的相同氨基酸殘基。
為了達(dá)到兩個序列最佳排列以確定序列同一性的目的，變體的氨基酸序列的鄰接區(qū)段相對于參照分子的氨基酸序列來說可以含有額外的或刪除的氨基酸殘基。用于與參照氨基酸序列比較的鄰接區(qū)段至少有20個鄰接氨基酸殘基。通過分配間隙罰分方法來提高與變體氨基酸序列中間隙相關(guān)的序列同一性的校正值。這種序列排列方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。
因此，可以利用數(shù)學(xué)算法則來確定任何兩個序列之間的百分比同一性。一種用于序列比較的優(yōu)選的、非限制性的數(shù)學(xué)算法的例子是Myers/Millers算法(Comput.Appl.Biosci.411-7 1988)。這種算法運(yùn)用在ALIGN程序(2.0版本)中，它是GCG排列軟件包的一部分。在比較氨基酸序列時，PAM120重量殘基表、12間隙長度罰分以及4間隙罰分可以和ALIGN程序一起使用。另外一種用于序列比較的優(yōu)選的非限制性數(shù)學(xué)算法的例子是Karlin/Altschul算法(Proc.Natl.AcadSci.USA 905873-5877，1990)，后來作者對運(yùn)算法則作了改進(jìn)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877，1993)，這種算法被運(yùn)用到Altschul等的NBLAST和XBLAST程序中(J.Mol.Biol.215403-410，1990)。BLAST氨基酸序列搜索可以和XBLAST程序(分?jǐn)?shù)＝50，字長＝3)一起進(jìn)行得到與感興趣的多肽相似的氨基酸序列。為了獲得有間隙的排列以達(dá)到比較的目的，可以利用有間隙的BLAST(Altschul等1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)。另外，PSI-BLAST可用于進(jìn)行整體搜索以檢測分子之間的遠(yuǎn)緣關(guān)系。見Altschul等(1997)同上述。在運(yùn)行BLAST、有間隙的BLAST或PSI-BLAST程序時，可以使用默認(rèn)參數(shù)，見網(wǎng)站ncbi.nlm.nih.gov。也可以參見ALIGN程序(Dayhoff(1978)《蛋白質(zhì)序列與結(jié)構(gòu)圖集5增刊3》，國家生物醫(yī)藥研究基金會，華盛頓特區(qū))以及Wisconsin序列分析程序包中的程序，第8版(從Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin得到)，例如GAP程序，其程序的默認(rèn)參數(shù)已被利用。
在考慮氨基酸序列同一性的百分比時，有些氨基酸殘基可能因為保守氨基酸取代而位置有差異，但這并不影響蛋白質(zhì)的功能特性。在這些情況下，序列同一性百分比可能要上調(diào)以適應(yīng)保守的取代氨基酸的相似性。這種調(diào)整在本領(lǐng)域是眾所周知的。參見，如Myers和Miller(1988)Comput.Appl.Biosci.411-7。
本發(fā)明所包括的具有生物學(xué)活性的IFN-β變體還包括與(例如)聚乙二醇(PEG)或白蛋白共價結(jié)合的IFN-β多肽。這些共價雜交IFN-β分子具有某些所需的藥物特性，如在用于患者后有延長的血清半衰期。產(chǎn)生PEG-IFN加合物的方法包括化學(xué)修飾單甲氧基聚乙二醇以產(chǎn)生將與IFN-β反應(yīng)的活性化合物。制備和使用PEG連接的多肽的方法描述在，例如，Delgado等(1992)Crit.Rev.Ther.Drug.CarrierSyst.9249-304中。產(chǎn)生白蛋白融合多肽的方法包括將感興趣的多肽(如IFN-β)的編碼序列與白蛋白融合，如美國專利5,876,969所述，在此引入以供參考。
本發(fā)明的具有生物活性的IFN-β的變體應(yīng)保留IFN-β的活性，尤其是與IFN-β受體結(jié)合的能力。一些實施方案中，IFN-β變體至少保持約25％、約50％、約75％、約85％、約90％、約95％、約98％、約99％或更多的多肽的生物活性，該多肽的氨基酸序列列在圖1或2中。還包括與圖1或2所示多肽的活性相比，IFN-β變體的活性提高了。IFN-β變體的生物活性可以通過已知的任何方法測定。這種測定方法的例子見于以下文獻(xiàn)報道Fellous等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA793082-3086；Czerniecki等(1984)J.Virol.49(2)490-496；Mark等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 815662-5666；Branca等(1981)Nature 277221-223；Williams等(1979)Nature 282582-586；Herberman等(1979)Nature 277221-223；Anderson等(1982)J.Biol.Chem.257(19)11301-11304；以及這里所述的IFN-β效力測定(見實施例2)。
本發(fā)明制劑的β-干擾素可以來源于任何動物物種，包括但不局限于鳥、犬、牛、豬、馬和人。當(dāng)制劑要用于治療哺乳動物的IFN-β失調(diào)時，優(yōu)選使用來源于哺乳動物物種的干β-擾素；更優(yōu)選是來源于和接受治療這種失調(diào)的相同種類的哺乳動物。因此，當(dāng)接受治療的哺乳動物是人時，優(yōu)選對受試者施用基本上含有單體人IFN-β或其生物活性變體的無HSA的藥物組合物。
本發(fā)明所包括的IFN-β多肽和IFN-β變體多肽的非限制性例子提出于Nagata等(1980)Nature 284316-320；Goeddel等(1980)Nature 287411-416；Yelverton等(1981)Nucleic Acids Res.9731-741；Streuli等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.782848-2852；EP028033B1和EP109748B1。也見美國專利第4,518,584號；第4,569,908號；第4,588,585號；第4,738,844號；第4,753,795號；第4,769,233號；第4,793,995號；第4,914,033號；第4,959,314號；第5,545,723號；和第5,814,485號。在此引入以供參考。這些引用也為IFN-β多肽的殘基和區(qū)域可以被改變而不喪失生物活性提供指導(dǎo)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，穩(wěn)定的藥物組合物內(nèi)的IFN-β是天然成熟的IFN-β多肽。在另一個實施方案中，這些組合物中的IFN-β是成熟的IFN-β多肽，其中，用以上討論的絲氨酸代替天然成熟氨基酸序列17位上的半胱氨酸。然而，本發(fā)明包括了另外的實施方案，在這些實施方案中穩(wěn)定的藥物制劑內(nèi)的IFN-β是任何有生物活性的IFN-β多肽或變體，正如本文其他地方所述。
在本發(fā)明的一些實施方案中，IFN-β是重組產(chǎn)生的?！爸亟M產(chǎn)生的IFN-β”是指和天然成熟的IFN-β相比具有類似的生物活性，并且是用DNA重組技術(shù)制備的?？梢酝ㄟ^培養(yǎng)包含一個編碼IFN-β多肽的核苷酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞來產(chǎn)生IFN-β。宿主細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)錄核苷酸序列并產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)，它可以是原核的(如大腸桿菌)，也可以是真核的(例如酵母菌、昆蟲或哺乳動物細(xì)胞)。IFN-β的重組生產(chǎn)的例子見于Mantei等(1982)Nature 297128；Ohno等(1982)NucleicAcids Res.10967；Smith等(1983)Mol.Cell.Biol.32156以及美國專利第4,462,940號；第5,702,699號；和第5,814,485號，在此引入以供參考。又見美國專利第5,795,779號，它在中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)中利用重組技術(shù)制得IFN-β-1a；在此并入以供參考。已經(jīng)利用重組DNA(“rDNA”)技術(shù)克隆了人干擾素基因，并在大腸桿菌中表達(dá)(Nagola等，(1980)Nature 284316；Goeddel等，(1980)Nature 287411；Yelverton等(1981)Nuc.AcidRes.9731；Streuli等，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.782848)?；蛘撸凑毡绢I(lǐng)域已知的方法，用表達(dá)感興趣的IFN-β蛋白的已基因工程化的轉(zhuǎn)基因動物或植物可以產(chǎn)生IFN-β。
用rDNA技術(shù)，通過從病毒誘導(dǎo)的人細(xì)胞中提取富含poly-A的12S信使RNA，以此mRNA作為模板合成雙鏈cDNA，并將此cDNA引入合適的克隆載體k，用此載體轉(zhuǎn)化合適的微生物，收獲此微生物并從中提取β-干擾素，這樣可制得具有天然IFN-β樣特性的蛋白質(zhì)或多肽。例如可參見歐洲專利申請第28033號(公布于1981年5月6日)；32134(公布于1981年7月15日)和34307(公布于1981年8月26日)，它們描述了各種用rDNA技術(shù)生產(chǎn)β-干擾素的方法。
或者，IFN-β可以化學(xué)合成，可利用那些多肽領(lǐng)域中的技術(shù)員熟知的任何技術(shù)。例如Li等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.802216-2220，Sterward和Young(1984)Solid Phase Peptide Synthesis(Pierce Chemical公司，Rockford，依利諾斯州)，Baraney和Merrifield(1980)《肽合成的原理》(The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology)，Gross和Meinhofer編；第2卷(學(xué)術(shù)出版社，紐約，1980)，第3-254頁，討論了固相肽合成技術(shù)；Bodansky(1984)《肽合成的原理》(Principles of Peptide Synthesis)(Springer-Verlag，柏林)，Gross和Meinhofer編(1980)《肽分析、合成、生物學(xué)》第1卷(學(xué)術(shù)出版社，紐約)，討論了經(jīng)典的溶液合成。IFN-β也可以利用同時多種肽合成方法化學(xué)制備。例如，Houghten(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.825131-5135以及美國專利第4,631,211號。
可用精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的任何方法回收和純化用于制備本發(fā)明的無HSA的穩(wěn)定的IFN-β藥物組合物的重組產(chǎn)生的IFN-β。這些方法包括美國專利4,462,940和5,702,699披露的方法，在此引入以供參考。這些方法可回收在沒有用作增溶劑的SDS時趨于形成凝聚體的純化形式的IFN-β。另外，這些方法是將蛋白質(zhì)暴露于高pH值條件下，這種條件可對蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生不利影響，并導(dǎo)致組合物中含有純化期間用于溶解蛋白質(zhì)的殘留量的SDS。因此，盡管用這些方法可得到IFN-β，但優(yōu)選用改進(jìn)的方法將其回收并純化，該方法描述在題為“改進(jìn)的蛋白質(zhì)純化和回收方法”、提交于2000年10月27日、美國申請序列號第60/243,965號的待批臨時申請；題為“改進(jìn)的蛋白質(zhì)純化和回收方法”、提交于2001年4月9日、美國申請序列號第60/282,607號的待批臨時申請以及題為“蛋白質(zhì)純化和回收的方法”、現(xiàn)在提交的美國申請序列號第＿＿號的臨時申請中，在此全文引入以供參考。
在這些待批和現(xiàn)在提交的申請中披露了兩種改進(jìn)的純化和回收IPN-β的方法。第一種純化和回收方法包括用醇(如脂肪族醇)基本上沉淀純化的IFN-β，并將沉淀的IFN-β溶于鹽酸胍。然后將所得溶液稀釋進(jìn)合適的緩沖液中以使蛋白質(zhì)變性。第二種純化和回收方法省略了沉淀步驟。在這一方法中，將基本上含有純化的IFN-β的樣品與鹽酸胍混合以形成含有溶解的變性的IFN-β的溶液；然后將此溶液稀釋進(jìn)合適的緩沖液中以使蛋白質(zhì)變性。在這兩種方法中，然后將含有變性的IFN-β的溶液滲濾或透析到用于藥物目的的緩沖液中。當(dāng)用于制備本發(fā)明的無HSA的IFN-β的藥物組合物時，純化的變性IFN-β蛋白質(zhì)被滲濾或透析到如下面實施例8所述的本發(fā)明的低離子強(qiáng)度制劑中。
本發(fā)明所包括的組合物少則可含有大約0.01mg/ml的IFN-β，多則可含有大約20.0mg/ml的IFN-β(重量/體積)。在各種實施方案中，IFN-β的濃度是大約0.01mg/ml至20.0mg/ml，大約0.015mg/ml至12.5mg/ml，大約0.025mg/ml至10.0mg/ml，大約0.05mg/ml至8.0mg/ml，大約0.075mg/ml至6.0mg/ml，大約0.1mg/ml至4.0mg/ml，大約0.125mg/ml至2.0mg/ml，大約0.175mg/ml至1.0mg/ml，大約0.2mg/ml至0.5mg/ml，大約0.225mg/ml至0.3mg/ml，和大約0.25mg/ml。
在一些實施方案中，本發(fā)明的制劑包含藥學(xué)上可接受的載體?！八帉W(xué)上可接受的載體”是指本領(lǐng)域中通常使用的，能夠方便貯存、給藥、和/或發(fā)揮治療成份的治療效應(yīng)的載體。載體也會減少IFN-β的任何不良副作用。一種合適的載體應(yīng)該是穩(wěn)定的，即不會和制劑中其他的成份起反應(yīng)。在治療所用的劑量和濃度時，它不會在接受治療者中產(chǎn)生出明顯的局部或全身性副反應(yīng)。這樣的載體在本領(lǐng)域中普遍為人們所知。本發(fā)明合適的載體是那些經(jīng)常使用的很穩(wěn)定的大分子，例如明膠、膠原、多糖、單糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、固定油、油酸乙酯、脂質(zhì)體、葡萄糖、乳糖、甘露糖、右旋糖、右旋糖酐、纖維素、山梨醇、聚乙二醇(PEG)等。緩釋載體，例如透明質(zhì)酸也是合適的。特別見Prisell等(1992)Int.J.Pharmaceu.8551-56和美國專利第5,166,311號。
藥物組合物可附加的包含一種增溶劑或溶解度它們有助于蛋白質(zhì)的溶解度超過使用本文披露的低離子強(qiáng)度配方得到的提高的溶解度。含有胍鹽基團(tuán)的化合物，最優(yōu)選的是精氨酸，對于IFN-β來說是合適的溶解度增強(qiáng)劑。這樣的溶解度增強(qiáng)劑的例子包括精氨酸以及能保持提高IFN-β溶解度能力的精氨酸類似物。這樣的類似物，包括但不限于含有精氨酸的二肽和三肽。其他合適的增溶劑見于美國專利第4,816,440號；第4,894,330號；第5,004,605號；第5,183,46號；第5,643,566號；以及Wang等(1980)J.Parenteral Drug Assoc.34452-462，在此引入以供參考。
除以上披露的試劑以外，可加入其它穩(wěn)定劑如乙二胺四乙酸(EDTA)或其鹽之一(如二鈉EDTA)以進(jìn)一步提高液態(tài)藥物組合物的穩(wěn)定性。已知EDTA用作金屬離子的清除劑以催化許多氧化反應(yīng)，從而提供額外的穩(wěn)定劑。其它合適的穩(wěn)定劑包括非離子表面活性劑，包括聚氧乙烯、山梨醇酯如聚山梨酸酯80(Tween 80)和聚山梨酸酯20(Tween 20)；聚氧丙烯-聚氧乙烯酯如Pluronic F68和Plwonic F127；聚氧乙烯醇如Brij 35；二甲聚硅氧烷(Simethicone)；聚乙二醇如PEG400；溶血磷酯酰膽堿；和聚氧乙烯-p-t-辛基苯酚如Triton x-100。描述了經(jīng)典的使用表面活性劑使藥物具有穩(wěn)定性的方法，例如見于Levine等(1991)J.Parenteral Sci.Technol.45(3)160-165。在此引入以供參考。
本發(fā)明的藥物有效量的穩(wěn)定的液態(tài)無HSA的IFN-β制劑，或重建的穩(wěn)定的本發(fā)明的無HSA的IFN-β凍干藥物制劑被用于受試者?！八幬镉行Я俊笔侵冈谥委煛㈩A(yù)防或診斷疾病或癥狀中有效的量。典型的給藥途徑包括但不局限于口服給藥、鼻腔給藥、肺部給藥、腸道外給藥，包括經(jīng)皮膚、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)注射或滴注。在一個實施方案中，給藥方式是注射，優(yōu)選皮下注射。本發(fā)明的組合物的可注射形態(tài)包括但不局限于溶液、懸浮液、乳狀液。典型的IFN-β治療有效量約含0.01μg/kg-5mg/kg，優(yōu)選約0.05μg/kg-1000μg/kg，更優(yōu)選約0.1μg/kg-500μg/kg，最優(yōu)選約0.5μg/kg-30μg/kg組合物。
在一種實施方案中，含有單體IFN-β的穩(wěn)定無HAS的藥物組合物配制成一個單位劑量，是可注射或滴注的形式如溶液、懸浮液或乳狀液。而且，它可以凍結(jié)貯存或制備成干燥形式，如凍干粉末，它可以在給藥前通過任何各種方法重建成液體溶液、懸浮液、或乳劑包括口服或經(jīng)腸道外給藥。穩(wěn)定的藥物組合物可以通過膜過濾滅菌，可以存儲在單位劑量或多劑量的容器中，如密封的小瓶或安瓿中。本領(lǐng)域普遍知道的配制藥物組合物的另外的方法可以用來進(jìn)一步提高本文所披露的藥物組合物的貯存穩(wěn)定性，只要它們不負(fù)面地影響所披露的穩(wěn)定劑的有益作用。關(guān)于藥學(xué)上可接受的載體、穩(wěn)定劑等的配方和選擇的詳盡的討論見于Remington’sPharmaceutical Sciences(1990)(第18版，Mack出版公司，Eaton，賓夕法尼亞州)，在此引入以供參考。
包含有效量的β-含有干擾素(IFN-β)或其變體，如稱為hIFN-βserl7的人IFN-β(hIFN-β)的突變蛋白的本發(fā)明的藥物組合物在診斷、預(yù)防和治療(局部或全身)臨床適應(yīng)癥中是有用的，這些適應(yīng)癥響應(yīng)這些多肽的治療。例如，這些臨床適應(yīng)癥包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)、腦和/或脊髓的障礙或疾病，包括阿爾茨海默病、帕金森病、盧伊體癡呆、多發(fā)性硬化、癲癇、小腦性共濟(jì)失調(diào)、進(jìn)行性核上性麻痹、肌萎縮側(cè)索硬化、情感障礙、焦慮癥、強(qiáng)迫癥、人格障礙、注意缺陷障礙、注意缺陷多動障礙、圖雷特綜合征、泰-薩病、尼曼-皮克病和精神分裂癥；腦血管病如腦或脊髓中風(fēng)造成的神經(jīng)損傷，包括腦膜炎和HIV在內(nèi)的CNS感染造成的神經(jīng)損傷，腦和脊髓腫瘤造成的神經(jīng)損傷，或由普利朊病造成的神經(jīng)損傷；自身免疫病，包括獲得性免疫缺陷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、克羅恩氏病、舍格倫綜合征、肌萎縮側(cè)索硬化和狼瘡；以及癌癥，包括乳腺、前列腺、膀胱、腎臟和結(jié)腸癌。據(jù)醫(yī)師認(rèn)為，對人或動物施用IFN-β或其突變蛋白可通過口、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)輸送，或通過肺輸送。
本發(fā)明提供了在沒有人血清白蛋白時增加β-干擾素(IFN-β)或其生物活性變體在藥物組合物中的溶解度的方法。所述方法包括用這里所述的低離子強(qiáng)度制劑制備組合物，以使組合物保持在約pH3.0-5.0，并在所述組合物中摻入IFN-β或其生物活性變體。在一個實施方案中，所述低離子強(qiáng)度的制劑含有甘氨酸、天冬氨酸或檸檬酸鈉作為緩沖液，其濃度約為1mM-30mM，優(yōu)選約2mM-5mM。所述組合物還可以含有非離子滲透劑，滲透劑的量足以使該組合物與這里所述的體液等滲。在一個實施方案中，所述非離子滲透劑選自海藻糖、蔗糖、甘露醇以及它們的任何混合物。此外，通過將該組合物的pH保持在約pH3.0和pH5.0，優(yōu)選pH4.0，可使大部分IFN-β維持在單體狀態(tài)。因此，本發(fā)明還提供了制備穩(wěn)定的無HSA的基本上含單體IFN-β的藥物組合物。
以下實施例是為了說明而不是為了限制。
實施例本發(fā)明是為了更好的理解IFN-β-1b的溶解度和穩(wěn)定性特性。無HSA的IFN-β-1b制劑的優(yōu)選特征是，pH范圍約在pH3.0-pH5.0以及非常低的離子強(qiáng)度條件。在此pH范圍內(nèi)使用非常低的離子強(qiáng)度條件得到了較高含量的單體IFN-β-1b和較低含量的聚集的IFN-β-1b。若不在制劑中使用HAS以前無法得到這些為IFN-β-1b溶解度和穩(wěn)定性提供的條件。還提供了單體IFN-β-1b含量最高的制劑。
這些實驗中所用的IFN-β-1b是在大腸桿菌中產(chǎn)生的，所用大腸桿菌與美國專利4,462,940和/或4,816,400的前幾個純化步驟所述的大腸桿菌是一樣的。這就是說，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌被用來產(chǎn)生IFN-β；濃縮宿主細(xì)胞，并破碎其細(xì)胞壁以得到IFN-β-1b粗物質(zhì)。
這樣獲得的IFN-β-1b粗物質(zhì)含有50mM乙酸鈉、1mM EDTA、0.1％十二烷基磺酸鈉(SDS)，pH為5.5。為得到用于下述溶解度和穩(wěn)定性測量的起始材料，使所述粗物質(zhì)通過用1.5mM pH＞11的氫氧化鈉平衡的G-25柱(Pharmacia)，以從所述IFN-β-1b粗物質(zhì)中除去SDS。從G-25柱收集后，迅速攪拌加入pH3的體積等于或約等于1/10收集物體積的1M甘氨酸以將收集物的pH調(diào)至約pH3。將材料貯存于4℃或冷凍隨后用于溶解度和穩(wěn)定性的測量。
實施例1—測定IFN-β-1b的溶解度進(jìn)行最初的實驗以了解在不同pH、緩沖液類型和離子強(qiáng)度條件下IFN-β-1b的溶解度。用表1所列的緩沖液透析IFN-β-1b溶液(約0.8mg/ml IFN-β-1b溶于100mM甘氨酸，pH3.0)。結(jié)果顯示在圖1中。這些結(jié)果顯示，IFN-β-1b的溶解度取決于pH和離子強(qiáng)度。pH3.0時，IFN-β-1b在所有濃度(至200mM)的氯化鈉中保持可溶解。對于pH4.0的制劑，IFN-β-1b在濃度為150mM的氯化鈉中變得不太溶解。對于pH5.0的制劑，當(dāng)制劑中僅含有100mM氯化鈉時IFN-β-1b就變得不太溶解?？傊?，這些數(shù)據(jù)說明，IFN-β-1b在pH3.0的制劑中最可溶解，在pH4.0的制劑中不太溶解，在pH5.0時難溶解。這些數(shù)據(jù)還說明，增加制劑的離子強(qiáng)度(通過增加氯化鈉濃度)也會降低IFN-β-1b的溶解度。
盡管上述實驗可確定有利于IFN-β-1b溶解度的條件，但無法確定任何給定條件下溶解度的范圍。進(jìn)行了隨后的實驗以確定IFN-β-1b的溶解度范圍。為使IFN-β-1b的溶解度最大，使用了低離子強(qiáng)度制劑(即5mM沒有氯化鈉等鹽類的緩沖液)。透析后，濃縮IFN-β-1b以確定給定制劑中的溶解度范圍。這些實驗的結(jié)果顯示在圖2中。pH3.0和4.0的制劑最可溶解，其溶解度至少為16mg/ml。pH5.0時制劑的溶解度約為8mg/ml。pH5.0以上制劑的溶解度僅約0.2mg/ml。這些結(jié)果再次說明pH有力地影響IFN-β-1b的溶解度。pH3.0和pH4.0時低離子強(qiáng)度制劑較之pH5.0時更加可溶解。pH5.0以上，IFN-β-1b在低離子強(qiáng)度制劑中基本上不溶解。
表1測定IFN-β-1b溶解度的制劑的pH、緩沖液類型和氯化鈉濃度緩沖液pH 氯化鈉濃度(mM)5mM甘氨酸 pH3 0mM5mM甘氨酸 pH3 50mM5mM甘氨酸 pH3 100mM5mM甘氨酸 pH3 150mM5mM檸檬酸鹽 pH4 0mM5mM檸檬酸鹽 pH4 50mM5mM檸檬酸鹽 pH4 100mM5mM檸檬酸鹽 pH4 150mM5mM乙酸鹽 pH4 0mM5mM乙酸鹽 pH4 50mM5mM乙酸 pH4 100mM5mM乙酸鹽 pH4 150mM5mM甲酸鹽 pH4 0mM5mM甲酸鹽 pH4 50mM5mM甲酸鹽 pH4 100mM5mM甲酸鹽 pH4 150mM5mM乙酸鹽 pH5 0mM5mM乙酸鹽 pH5 50mM5mM乙酸鹽 pH5 100mM5mM乙酸鹽 pH5 150mM5mM組氨酸 pH5 0mM5mM組氨酸 pH5 50mM5mM組氨酸 pH5 100mM5mM組氨酸 pH5 150mM5mM琥珀酸鈉 pH5 0mM5mM琥珀酸鈉 pH5 50mM5mM琥珀酸鈉 pH5 100mM5mM琥珀酸鈉 pH5 150mM實施例2—分析型超速離心實驗盡管溶解度實驗可確定溶液中有多少IFN-β-1b，但需要其它技術(shù)以確定蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài)。重要的是確定蛋白質(zhì)在給定的制劑中是是呈單體以及確定有多少蛋白質(zhì)(如果有的話)以較高次序形式(如二聚體、三聚體等)存在。分析型超速離心是闡明蛋白質(zhì)聚集狀態(tài)的最有效的技術(shù)之一(參見Liu和Shire(1999)J.Pharm.Sci.881237-1241)。進(jìn)行了三次實驗用分析型超速離心表征幾種IFN-β-1b制劑的單體含量。這些分析型超速離心實驗分別是用不同的IFN-β-1b制劑進(jìn)行的。這樣，每個實驗都有常規(guī)配方(5mM甘氨酸，pH3.0)。然而，每個常規(guī)配方在單體百分比上都有輕微差別(圖3-89.8％；圖6-94.2％；圖9-86.3％)。用于制備這些IFN-β-1b制劑的回收和純化過程產(chǎn)生了一些IFN-β-1b分子的聚集體，天然狀態(tài)中它們主要是共價的。因此，對每個實驗而言，5mM甘氨酸、pH3.0的配方在每個實驗開始時作為制劑中聚集體量的基線。
第一個實驗測定了pH對IFN-β-1b聚集狀態(tài)的影響。分析了pH3.0(僅含5mM甘氨酸以緩沖此溶液)、pH4.0(僅含5mM天冬氨酸以緩沖此溶液)和pH5.0(僅含5mM琥珀酸鈉以緩沖此溶液)的制劑。結(jié)果顯示在圖3，4和5中。這些圖中的主峰相應(yīng)于約20kDa的分子量，這與IFN-β-1b的分子量(19.878kDa)非常接近。因此主峰是IFN-β-1b單體。較大的種類(二聚體、三聚體等)與較高的沉降系數(shù)相符合。這些結(jié)果顯示，盡管pH3.0和pH4.0時IFN-β-1b主要為單體(約90％)，但在pH5.0時分子開始聚集成較高次序的種類且只有約75％為單體。這些結(jié)果說明，IFN-β-1b的聚集狀態(tài)對pH的變化敏感，IFN-β-1b單體偏愛低pH條件，如pH3.0和pH4.0。
第二個實驗研究了離子強(qiáng)度對IFN-β-1b聚集狀態(tài)的影響。在pH3.0(用5mM甘氨酸緩沖)的制劑中，通過加入0.50mM和150mM氯化鈉來增加制劑中的離子強(qiáng)度。結(jié)果顯示在圖6、7和8中。對未添加氯化鈉的制劑(圖6)，單體形式的IFN-β-1b約占總IFN-β-1b的94％(即94％主峰)。當(dāng)制劑中加入50mM氯化鈉時，單體含量降至約76％(圖7)，制劑中加入150mM氯化鈉時，單體含量降至10％以下(圖8)。這些結(jié)果說明，IFN-β-1b的聚集狀態(tài)很容易受離子強(qiáng)度的影響，且IFN-β-1b單體偏愛低離子強(qiáng)度的條件。
可注射的藥物制劑的一個所需特征是與體液等滲?？捎秒x子性物質(zhì)(如氯化鈉)和非離子物質(zhì)(如蔗糖和海藻糖)使所述制劑與體液等滲。上述分析型超速離心實驗測定的制劑既不是等滲的(僅含5mM緩沖液)也不含有作為離子滲透劑的氯化鈉。第三個實驗測定了非離子滲透劑對IFN-β-1b聚集狀態(tài)的影響。在這個實驗中制備了三種pH3.0的制劑(用5mM甘氨酸緩沖)。一種僅含甘氨酸緩沖劑，第二種用9％蔗糖滲透，第三種用9％海藻糖滲透。分析型超速離心結(jié)果顯示在圖9、10和11中。具含有緩沖劑的制劑的單體含量(圖9)約為86％。當(dāng)加入作為滲透劑的蔗糖(圖10)或海藻糖(圖11)時，單體含量約為89％。這些結(jié)果說明，非離子滲透劑如蔗糖和海藻糖不會促進(jìn)IFN-β-1b分子的聚集。
實施例3—升高的溫度條件下無HSA的IFN-β-1b的凍干制劑的穩(wěn)定性將含有9％海藻糖(pH3.0和pH4.0)或9％蔗糖(pH4.0)的pH3.0(5mM甘氨酸作為緩沖液)和pH4.0(5mM天冬氨酸作為緩沖液)的無HSA的IFN-β-1b制劑凍干。然后將凍干的制劑貯存在40℃并在8周內(nèi)測定其穩(wěn)定性。蔗糖和海藻糖是典型的用于凍干制劑的穩(wěn)定劑。以9％的水平使用這些制劑，這樣重建的制劑將與體液等滲。為使制劑的離子強(qiáng)度最小化，從而使聚集的IFN-β-1b量最少，將緩沖液的量保持在最低水平。因此，所有緩沖液的濃度都為5mM。
蛋白質(zhì)藥物制品的典型儲藏條件通常為5℃。然而，升高的溫度條件通常用于制劑研究以增加特定制劑的降解速度，這樣就可在較短時間內(nèi)收集到相對穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。這一實驗中，采用40℃試圖迫使無HSA制劑中的IFN-β-1b降解。濃度測量和反相PHLC(RP-HPLC)分析的結(jié)果顯示在圖12和13中。這些結(jié)果顯示，即使在升高的溫度下，這些IFN-β-1b制劑在8周的研究期間仍未顯示出可檢測的變化。
實施例4—實時儲藏條件下含海藻糖的無HSA的IFN-β-1b的凍干制劑的穩(wěn)定性盡管蛋白質(zhì)藥物的典型儲藏條件是5℃，需要使產(chǎn)品具有室溫穩(wěn)定性(25℃-30℃)。在這一實驗中，將含有9％海藻糖的制劑(5mM甘氨酸，pH3，或5mM天冬氨酸，pH4)凍干。使用濃度為9％的海藻糖，這樣重建的制劑將與體液等滲。將制劑儲藏在5℃和30℃，并在9個月內(nèi)測定其穩(wěn)定性。濃度測量和反相HPLC(RP-HPLC)分析的結(jié)果顯示在圖14和15中。這些結(jié)果顯示，即便在30℃下，這些IFN-β-1b制劑在9個月的研究期間仍未顯示出可測檢的變化。
實施例5—升高的溫度條件下無HSA的IFN-β-1b的液體制劑的穩(wěn)定性還在液體狀態(tài)檢測了pH3.0和pH4.0時無HSA的IFN-β-1b制劑的穩(wěn)定性。所述制劑組合物與實施例3中列出的相同(9％海藻糖(pH3.0和pH4.0)或9％蔗糖(pH4.0))。再者，為使制劑的離子強(qiáng)度最小化，從而使聚集的IFN-β-1b量最少，將緩沖液的量保持在最低水平(5mM)。將液體制劑儲藏在30℃并在9周內(nèi)測定其穩(wěn)定性。液體蛋白質(zhì)制劑的典型儲藏條件是5℃。因此，30℃儲藏代表用來加快IFN-β-1b降解速度的升高的溫度條件。圖16(濃度測量)和圖17(反相HPLC分析)中顯示的結(jié)果表明9周研究期間制劑沒有可檢測的變化。這些結(jié)果說明，這些條件下，這些制劑中IFN-β-1b在研究期間是穩(wěn)定的。
實施例6—實時儲藏條件下無HSA的IFN-β-1b的液體制劑的穩(wěn)定性在這一實驗中，在5℃的實時儲藏條件下檢測了含9％海藻糖(5mM甘氨酸，pH3，或5mM天冬氨酸，pH4)或9％蔗糖(5mM甘氨酸，pH3，或5mM天冬氨酸，pH4)的液體制劑。將制劑裝入小瓶并在9個月內(nèi)測量其穩(wěn)定性。濃度測量和反相HPLC(RP-HPLC)分析的結(jié)果分別顯示在圖18和19中。這些結(jié)果顯示，這些制劑中的IFN-β-1b在9個月的研究中是穩(wěn)定的。
實施例7—與蔗糖相比，海藻糖是優(yōu)選的IFN-β-1b制劑的非離子滲透劑在這一實驗中，制備了含9％海藻糖(5mM甘氨酸，pH3，或5mM天冬氨酸，pH4)和9％蔗糖(5mM甘氨酸，pH3，或5mM天冬氨酸，pH4)的制劑，并將其作為液體裝進(jìn)小瓶子，并將裝有同一制劑的小瓶凍干。在升高的溫度條件下測量其穩(wěn)定性，通常預(yù)測所給蛋白質(zhì)制劑穩(wěn)定性的排列次序。將液體制劑在30℃儲藏9周，凍干制劑在40℃儲藏8周。濃度測量的結(jié)果顯示在圖20(液體)和圖21(凍干的)中。這些結(jié)果說明，pH3時含有蔗糖的制劑在濃度上明顯增加。這種濃度的顯著提高是由于蔗糖在低pH下水解形成還原糖造成的。導(dǎo)致制劑的非酶促褐變(即美拉德反應(yīng))。海藻糖更耐水解，因此與蔗糖相比，在這些制劑中是優(yōu)選的(參見O’Brien(1996)Science 61679-682)。
實施例8用鹽酸胍沉淀除去SDS和IFN-β-1b的制劑將純化的IFN-β-1b(1L 1.91mg/ml溶于液0.4％SDS、50mM乙酸鹽緩沖液，pH5.5)貯存在5℃。在貯存期間，有一些SDS沉淀。將250ml該物質(zhì)(477.5mg)與229g鹽酸胍(6M，總體積400ml)混合，并在室溫下用磁力攪拌棒攪拌15分鐘。然后用SartobranP Capsule(孔徑0.45μm)過濾6M鹽酸胍/蛋白質(zhì)溶液以除去沉淀的SDS。在280nm處用UV測得的蛋白質(zhì)濃度為1.02mg/ml。蛋白質(zhì)產(chǎn)量為406mg或85％。
用裝有兩層PelliconXL Biomax0.1cm210kD聚砜膜(Millipore公司)的MilliporeLabscaleTFF滲濾系統(tǒng)(Millipore公司)濃縮400ml經(jīng)鹽酸胍處理的物質(zhì)。濃縮后的體積為37ml，蛋白質(zhì)濃度為10.3mg/ml，產(chǎn)量為381mg或93％。
用移液管，在10ml(103mg)濃縮的鹽酸胍/蛋白質(zhì)溶液中逐滴加入590ml的5mM甘氨酸溶液(pH3.2)。用磁力攪拌棒迅速攪拌此溶液；將蛋白質(zhì)溶液直接加到旋渦中。這種稀釋60倍的6M鹽酸胍/蛋白質(zhì)溶液產(chǎn)生了0.1M鹽酸胍/蛋白質(zhì)溶液，其濃度為0.17mg/ml。將此600ml轉(zhuǎn)移到裝有兩層PelliconII 10kD，0.1cm2聚砜膜的500ml刻度滲濾裝置。將此溶液先濃縮成約400mL，蛋白質(zhì)濃度為0.23mg/ml，然后用9倍體積(3.6L)的5mM甘氨酸(pH3.2)滲濾。在280nm處用UV測得的最終滲濾液(402ml)的最終蛋白質(zhì)濃度為0.23mg/ml，即滲濾步驟的產(chǎn)量為92.46mg或90％，純化步驟可溶蛋白質(zhì)的總產(chǎn)量為72％。
實施例9—含有甘露醇作為滲透劑的無HSA的IFN-β-1b液體制劑的穩(wěn)定性在這一實驗中，在5℃的實時儲藏條件下檢測含有5mM天冬氨酸、5％甘露醇的液體制劑。用單批的無HAS的IFN-β-1b制備了三種單獨(dú)的制品(稱為制品A、制品B和制品C)，將其裝入小瓶中。將小瓶貯存在5℃，并在6個月內(nèi)測量制劑的穩(wěn)定性。濃度測量和反相HPLC(RP-HPLC)分析的結(jié)果分別顯示在圖22和23中。這些結(jié)果顯示，這些IFN-β-1b制劑在6個月的研究期間仍未顯示出可檢測的變化。
說明書中提到的所有出版物和專利申請是表示適合此發(fā)明的本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員的水平。本文納入的所有出版物和專利申請在相同程度上作為參考，似乎各出版物或?qū)＠暾埗际蔷唧w地和單獨(dú)地納入作為參考。說明書中列出副標(biāo)題只是為了更容易地評述文件，并不打算以任何方式對文獻(xiàn)的內(nèi)容進(jìn)行限定。
盡管上述發(fā)明已經(jīng)以說明和實施例方式在某些細(xì)節(jié)上作了描述以便達(dá)到清楚理解本發(fā)明的目的，但顯然在實際操作過程中可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)作某些改變和調(diào)整。
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定的無HSA的藥物組合物，所述組合物基本上含有溶于低離子強(qiáng)度制劑的單體β-干擾素(IFN-β)或其生物活性變體，其特征在于，所述低離子強(qiáng)度制劑是含有緩沖液的溶液，所述緩沖液的量足以使所述組合物保持在特定pH±0.5個單位內(nèi)，其中特定pH約為3.0-5.0，所述制劑的離子強(qiáng)度不超過約60mM。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述緩沖液以約的1mM-30mM的濃度存在。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述緩沖液以約1mM-10mM的濃度存在。
4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，所述緩沖液以約2mM-7mM的濃度存在。
5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于，所述緩沖液以約2mM-5mM的濃度存在。
6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述緩沖液以約5mM的濃度存在。
7.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述特定pH約為3.0，且其中所述緩沖液是甘氨酸。
8.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述特定pH為約4.0，且其中所述緩沖液是天冬氨酸。
9.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述特定pH約為5.0，且其中所述緩沖液是琥珀酸鈉。
10.如權(quán)利要求6所述的組合物，其特征在于，所述特定pH約為3.0，且其中所述緩沖液是甘氨酸。
11.如權(quán)利要求6所述的組合物，其特征在于，所述特定pH約為4.0，且其中所述緩沖液是天冬氨酸。
12.如權(quán)利要求6所述的組合物，其特征在于，所述特定pH約為5.0，且其中所述緩沖液是琥珀酸鈉。
13.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物為液體或干燥形式，其中所述干燥形式選自凍干形式、空氣干燥形式和噴霧干燥形式。
14.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物為含水或不含水的溶液、含水或不含水的懸液、或適合通過肺吸入輸送到受試者的干粉形式。
15.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，它還含有足以使所述組合物等滲的非離子滲透劑的量，其中所述非離子滲透劑是海藻糖。
16.如權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，所述海藻糖的濃度以每體積的重量計為9％。
17.如權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，所述組合物為液體或干燥形式，其中所述干燥形式選自凍干形式、空氣干燥形式和噴霧干燥形式。
18.如權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，所述組合物為含水或不含水的溶液、含水或不含水的懸液、或適合通過肺吸入輸送到受試者的干粉形式。
19.如權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于，它還含有足以使所述組合物等滲的非離子滲透劑的量，其中所述非離子滲透劑是海藻糖。
20.如權(quán)利要求19所述的組合物，其特征在于，所述海藻糖的濃度以每體積的重量計為9％。
21.如權(quán)利要求19所述的組合物，其特征在于，所述組合物為液體或干燥形式，其中所述干燥形式選自凍干形式、空氣干燥形式和噴霧干燥形式。
22.如權(quán)利要求19所述的組合物，其特征在于，所述組合物為含水或不含水的溶液、含水或不含水的懸液、或適合通過肺吸入輸送到受試者的干粉形式。
23.如權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，它還含有足以使所述組合物等滲的非離子滲透劑的量，其中所述非離子滲透劑是海藻糖。
24.如權(quán)利要求23所述的組合物，其特征在于，所述海藻糖的濃度以每體積的重量計約為9％。
25.如權(quán)利要求23所述的組合物，其特征在于，所述組合物為液體或干燥形式，其中所述干燥形式選自凍干形式、空氣干燥形式和噴霧干燥形式。
26.如權(quán)利要求23所述的組合物，其特征在于，所述組合物為含水或不含水的溶液、含水或不含水的懸液、或適合通過肺吸入輸送到受試者的干粉形式。
27.如權(quán)利要求12所述的組合物，其特征在于，它還含有足以使所述組合物等滲的非離子滲透劑的量，其中所述非離子滲透劑是海藻糖。
28.如權(quán)利要求27所述的組合物，其特征在于，所述海藻糖的濃度以每體積的重量計約為9％。
29.如權(quán)利要求27所述的組合物，其特征在于，所述組合物為液體或干燥形式，其中所述干燥形式選自凍干形式、空氣干燥形式和噴霧干燥形式。
30.如權(quán)利要求27所述的組合物，其特征在于，所述組合物為含水或不含水的溶液、含水或不含水的懸液、或適合通過肺吸入輸送到受試者的干粉形式。
31.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述IFN-β是具有天然成熟的IFN-β的氨基酸序列的多肽或其生物活性變體。
32.如權(quán)利要求31所述的組合物，其特征在于，所述IFN-β是重組產(chǎn)生的。
33.如權(quán)利要求32所述的組合物，其特征在于，所述IFN-β是糖基化或非糖基化的。
34.如權(quán)利要求33所述的組合物，其特征在于，所述IFN-β是非糖基化的人IFN-β(hIFN-β)或其生物活性變體。
35.如權(quán)利要求34所述的組合物，其特征在于，所述突變蛋白是hIFN-βserl7。
36.一種穩(wěn)定的無HSA的藥物組合物，所述組合物基本上含有溶于低離子強(qiáng)度制劑的單體β-干擾素(IFN-β)或其生物活性變體，其特征在于，所述低離子強(qiáng)度制劑是含有選自甘氨酸、天冬氨酸或琥珀酸鈉的緩沖液的溶液，緩沖液濃度為約1mM-10mM，所述組合物的pH約為3.0-5.0，且其中所述制劑的離子強(qiáng)度不超過約60mM。
37.如權(quán)利要求36所述的組合物，其特征在于，所述IFN-β是重組人IFN-β(rhIFN-β)或其生物活性變體。
38.如權(quán)利要求37所述的組合物，其特征在于，所述rhIFN-β或其生物活性變體是非糖基化的。
39.如權(quán)利要求38所述的組合物，其特征在于，所述突變蛋白是hIFN-βser17。
40.如權(quán)利要求36所述的組合物，其特征在于，所述rhIFN-β以的0.01mg/ml-20.0mg/ml的濃度存在。
41.如權(quán)利要求36所述的組合物，其特征在于，所述緩沖液是甘氨酸，所述甘氨酸以約5mM的濃度存在，且其中所述組合物的pH約為3.0。
42.如權(quán)利要求41所述的組合物，其特征在于，它還含有以每體積重量計的9％海藻糖。
43.如權(quán)利要求36所述的組合物，其特征在于，所述緩沖液是天冬氨酸，所述天冬氨酸以約5mM的濃度存在，且其中所述組合物的pH約為4.0。
44.如權(quán)利要求43所述的組合物，其特征在于，它還含有以每體積重量計約9％海藻糖。
45.如權(quán)利要求36所述的組合物，其特征在于，所述緩沖液是琥珀酸鈉，所述琥珀酸鈉以約5mM的濃度存在，且其中所述組合物的pH約為5.0。
46.如權(quán)利要求45所述的組合物，其特征在于，它還含有以每體積重量計的9％海藻糖。
47.如權(quán)利要求36所述的組合物，其特征在于，所述組合物為液體或干燥形式，其中所述干燥形式選自凍干形式、空氣干燥形式和噴霧干燥形式。
48.如權(quán)利要求36所述的組合物，其特征在于，所述組合物為含水或不含水的溶液、含水或不含水的懸液、或適合通過肺吸入輸送到受試者的干粉形式。
49.如權(quán)利要求41所述的組合物，其特征在于，所述組合物為液體或干燥形式，其中所述干燥形式選自凍干形式、空氣干燥形式和噴霧干燥形式。
50.如權(quán)利要求41所述的組合物，其特征在于，所述組合物為含水或不含水的溶液、含水或不含水的懸液、或適合通過肺吸入輸送到受試者的干粉形式。
51.如權(quán)利要求43所述的組合物，其特征在于，所述組合物為液體或干燥形式，其中所述干燥形式選自凍干形式、空氣干燥形式和噴霧干燥形式。
52.如權(quán)利要求43所述的組合物，其特征在于，所述組合物為含水或不含水的溶液、含水或不含水的懸液、或適合通過肺吸入輸送到受試者的干粉形式。
53.如權(quán)利要求45所述的組合物，其特征在于，所述組合物為液體或干燥形式，其中所述干燥形式選自凍干形式、空氣干燥形式和噴霧干燥形式。
54.如權(quán)利要求45所述的組合物，其特征在于，所述組合物為含水或不含水的溶液、含水或不含水的懸液、或適合通過肺吸入輸送到受試者的干粉形式。
55.如權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于，所述組合物為液體或干燥形式，其中所述干燥形式選自凍干形式、空氣干燥形式和噴霧干燥形式。
56.如權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于，所述組合物為含水或不含水的溶液、含水或不含水的懸液、或適合通過肺吸入輸送到受試者的干粉形式。
57.如權(quán)利要求44所述的組合物，其特征在于，所述組合物為液體或干燥形式，其中所述干燥形式選自凍干形式、空氣干燥形式和噴霧干燥形式。
58.如權(quán)利要求44所述的組合物，其特征在于，所述組合物為含水或不含水的溶液、含水或不含水的懸液、或適合通過肺吸入輸送到受試者的干粉形式。
59.如權(quán)利要求46所述的組合物，其特征在于，所述組合物為液體或干燥形式，其中所述干燥形式選自凍干形式、空氣干燥形式和噴霧干燥形式。
60.如權(quán)利要求46所述的組合物，其特征在于，所述組合物為含水或不含水的溶液、含水或不含水的懸液、或適合通過肺吸入輸送到受試者的干粉形式。
61.一種穩(wěn)定的無HSA的藥物組合物，所述組合物基本上含有溶于低離子強(qiáng)度制劑的單體β-干擾素(IFN-β)或其生物活性變體，其特征在于，所述低離子強(qiáng)度的制劑是含有甘氨酸作為緩沖液的溶液，其特征在于，所述緩沖液以約2mM-5mM的濃度存在，所述組合物的pH約為3.0-4.0，且其中所述制劑的離子強(qiáng)度不超過40mM。
62.如權(quán)利要求61所述的組合物，其特征在于，所述rhIFN-β或其生物活性變體是非糖基化的。
63.如權(quán)利要求62所述的組合物，其特征在于，所述突變蛋白是hIFN-βser17。
64.如權(quán)利要求63所述的組合物，其特征在于，所述緩沖液以約5mM的濃度存在，所述pH約為3.0，且所述離子強(qiáng)度不超過約20mM。
65.如權(quán)利要求61所述的組合物，其特征在于，所述組合物為液體或干燥形式，其中所述干燥形式選自凍干形式、空氣干燥形式和噴霧干燥形式。
66.如權(quán)利要求61所述的組合物，其特征在于，所述組合物為含水或不含水的溶液、含水或不含水的懸液、或適合通過肺吸入輸送到受試者的干粉形式。
67.如權(quán)利要求61所述的組合物，其特征在于，它還含有以每體積重量計約9％海藻糖。
68.一種穩(wěn)定的無HSA的藥物組合物，所述組合物基本上含有溶于低離子強(qiáng)度制劑的單體β-干擾素(IFN-β)或其生物活性變體，其特征在于，所述低離子強(qiáng)度的制劑是含有天冬氨酸作為緩沖液的溶液，其特征在于，所述緩沖液以約2mM-5mM的濃度存在，所述組合物的pH約為3.5-4.5，且其中所述制劑的離子強(qiáng)度不超過約40mM。
69.如權(quán)利要求68所述的組合物，其特征在于，所述rhIFN-β或其生物活性變體是非糖基化的。
70.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，所述突變蛋白是hIFN-βserl7。
71.如權(quán)利要求68所述的組合物，其特征在于，所述緩沖液以約5mM的濃度存在，所述pH約為4.0，且所述離子強(qiáng)度不超過約20mM。
72.如權(quán)利要求68所述的組合物，其特征在于，所述組合物為液體或干燥形式，其中所述干燥形式選自凍干形式、空氣干燥形式和噴霧干燥形式。
73.如權(quán)利要求68所述的組合物，其特征在于，所述組合物為含水或不含水的溶液、含水或不含水的懸液、或適合通過肺吸入輸送到受試者的干粉形式。
74.如權(quán)利要求68所述的組合物，其特征在于，它還含有以每體積重量計約9％海藻糖。
75.一種穩(wěn)定的無HSA的藥物組合物，所述組合物基本上含有溶于低離子強(qiáng)度制劑的單體β-干擾素(IFN-β)或其生物活性變體，其特征在于，所述低離子強(qiáng)度的制劑是含有琥珀酸鈉作為緩沖液的溶液，其特征在于，所述緩沖液以約2mM-5mM的濃度存在，所述組合物的pH約為4.5-5.0，且其中所述制劑的離子強(qiáng)度不超過約40mM。
76.如權(quán)利要求75所述的組合物，其特征在于，所述rhIFN-β或其生物活性變體是非糖基化的。
77.如權(quán)利要求76所述的組合物，其特征在于，所述突變蛋白是hIFN-βser17。
78.如權(quán)利要求75所述的組合物，其特征在于，所述緩沖液以約5mM的濃度存在，所述pH約為5.0，且所述離子強(qiáng)度不超過約20mM。
79.如權(quán)利要求75所述的組合物，其特征在于，所述組合物為液體或干燥形式，其中所述干燥形式選自凍干形式、空氣干燥形式和噴霧干燥形式。
80.如權(quán)利要求75所述的組合物，其特征在于，所述組合物為含水或不含水的溶液、含水或不含水的懸液、或適合通過肺吸入輸送到受試者的干粉形式。
81.如權(quán)利要求75所述的組合物，其特征在于，它還含有以每體積重量計約9％海藻糖。
82.一種在沒有人血清白蛋白時增加β-干擾素(IFN-β)或其生物活性變體在藥物組合物中的溶解度的方法，所述方法包括用低離子強(qiáng)度制劑制備所述組合物，其特征在于。其中所述低離子強(qiáng)度制劑是含有緩沖液的溶液，緩沖液的量足以使所述組合物保持在特定pH±0.5個單位內(nèi)，其中特定pH約為3.0-5.0，所述制劑的離子強(qiáng)度不超過約60mM，并將所述IFN-β或其生物活性變體加到所述組合物中。
83.如權(quán)利要求82所述的方法，其特征在于，所述緩沖液以約1mM-30mM的濃度存在。
84.如權(quán)利要求83所述的方法，其特征在于，所述緩沖液以約2mM-5mM的濃度存在。
85.如權(quán)利要求84所述的方法，其特征在于，所述特定pH約為3.0，且其中所述緩沖液是甘氨酸。
86.如權(quán)利要求84所述的方法，其特征在于，所述特定pH約為4.0，且其中所述緩沖液是天冬氨酸。
87.如權(quán)利要求84所述的方法，其特征在于，所述特定pH約為5.0，且其中所述緩沖液是琥珀酸鈉。
88.如權(quán)利要求82所述的組合物，其特征在于，它還含有足以使所述組合物等滲的非離子滲透劑的量，其中所述非離子滲透劑是海藻糖。
89.如權(quán)利要求82所述的組合物，其特征在于，還包含制備所述組合物的干燥形式的步驟，其中所述干燥形式選自凍干形式、空氣干燥形式和噴霧干燥形式。
90.如權(quán)利要求82所述的組合物，其特征在于，所述組合物為含水或不含水的溶液、含水或不含水的懸液、或適合通過肺吸入輸送到受試者的干粉形式。
91.一種用權(quán)利要求82所述方法制得的藥物組合物。
92.一種制備基本上含單體β-干擾素(IFN-β)的無HSA的藥物組合物的方法，所述方法包括用低離子強(qiáng)度制劑制備所述組合物，其特征在于，所述低離子強(qiáng)度制劑是含有緩沖液的溶液，緩沖液的量足以使所述組合物保持在特定pH±0.5個單位內(nèi)，其中特定pH約為3.0-5.0，所述制劑的離子強(qiáng)度不超過約60mM，并將所述IFN-β或其生物活性變體加到所述組合物中。
93.如權(quán)利要求92所述的方法，其特征在于，所述緩沖液以約1mM-30mM的濃度存在。
94.如權(quán)利要求93所述的方法，其特征在于，所述緩沖液以約2mM-5mM的濃度存在。
95.如權(quán)利要求94所述的方法，其特征在于，所述特定pH約為3.0，且其中所述緩沖液是甘氨酸。
96.如權(quán)利要求94所述的方法，其特征在于，所述特定pH約為4.0，且其中所述緩沖液是天冬氨酸。
97.如權(quán)利要求94所述的方法，其特征在于，所述特定pH約為5.0，且其中所述緩沖液是琥珀酸鈉。
98.如權(quán)利要求92所述的組合物，其特征在于，它還含有足以使所述組合物等滲的非離子滲透劑的量，其中所述非離子滲透劑是海藻糖。
99.如權(quán)利要求92所述的組合物，其特征在于，還包含制備所述組合物的干燥形式的步驟，其中所述干燥形式選自凍干形式、空氣干燥形式和噴霧干燥形式。
100.如權(quán)利要求92所述的組合物，其特征在于，所述組合物為含水或不含水的溶液、含水或不含水的懸液、或適合通過肺吸入輸送到受試者的干粉形式。
101.一種用權(quán)利要求92所述方法制得的藥物組合物。
102.一種用于診斷、預(yù)防或治療對β-擾素(IFN-β)治療有響應(yīng)的疾病的制劑，其特征在于，所述制劑含有如權(quán)利要求1、36、61、68或75所述的藥物組合物。
全文摘要
提供了基本上含有單體β－干擾素(IFN－β)的穩(wěn)定的藥物組合物及其制備方法。提供了含有IFN－β的組合物，其中IFN－β溶于使所述組合物保持在pH約5的低離子強(qiáng)度制劑中，制備這些組合物的方法以及增加IFN－β在藥物組合物中的溶解度的方法。
文檔編號A61P25/28GK1511053SQ01823122
公開日2004年7月7日 申請日期2001年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月9日
發(fā)明者B·A·雪莉, B A 雪莉, M·喬伊, 賬, M·特勒斯, 伎, S·巴布卡 申請人:希龍公司