抗血清白蛋白的fab-效應(yīng)物部分的融合構(gòu)建體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗原結(jié)合片段(Fab)和包括該抗原結(jié)合片段(Fab)的Fab?效應(yīng)物融合蛋白或(多)肽。本發(fā)明的Fab特異性結(jié)合血清白蛋白，從而具有延長的體內(nèi)半衰期。本發(fā)明的Fab的特征在于，沒有對CH1結(jié)構(gòu)域和CκL結(jié)構(gòu)域中的鏈間二硫鍵負(fù)責(zé)的半胱氨酸殘基。本發(fā)明的Fab?效應(yīng)物融合蛋白或(多)肽可在大腸桿菌E.coli的細(xì)胞周質(zhì)中進(jìn)行高產(chǎn)量生產(chǎn)，并且具有增加的體內(nèi)半衰期。另外，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生多種Fab?效應(yīng)物融合蛋白或(多)肽的大腸桿菌E.coli菌株，和一種包括所述Fab?效應(yīng)物融合蛋白或(多)肽的藥物組合物。KCTC 12657BP20140820
【專利說明】
抗血清白蛋白的FAB-效應(yīng)物部分的融合構(gòu)建體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及抗原結(jié)合片段(Fab)以及包括該抗原結(jié)合片段(Fab)的Fab-效應(yīng)物融 合蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗原結(jié)合片段(Fab)的制備是最成功的單克隆抗體治療劑之一。例如，在很多國家 已經(jīng)批準(zhǔn)了阿昔單抗:(ReoPro:?.)、蘭尼單抗（LucentisS))和賽妥珠單抗（Certolizumab pegol)( Cimzia? )等為藥物。此外，在歐盟，可在市場上購買包括阿昔單抗（ReoPro? )、蘭 尼單抗（Lucentis? )和賽妥珠單抗（Clmzia?)的多克隆Fab制劑。
[0003] 當(dāng)外源性效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域與Fab形成Fab-效應(yīng)物融合物形式時(shí)，外源性效應(yīng)物結(jié)構(gòu) 域的綴合可賦予Fab治療效果。因此，事實(shí)上，將在臨床開發(fā)狀態(tài)下的許多抗體片段綴合至 外源性功能部分。在這樣的Fab-融合蛋白構(gòu)建體(或Fab-效應(yīng)物部分構(gòu)建體）中，抗原結(jié)合 片段可提供靶標(biāo)特異性的遞送，并且融合蛋白或（多）肽(效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域)可提供治療效果。 源自原核起源的融合結(jié)構(gòu)域可包括細(xì)胞毒素，例如deBouganin ( -種去免疫的植物毒素） (參見Entwistle et al.，（2012)Cancer Biother Radiopharm.27,582-92)、葡萄球菌腸毒 素（SE)(參見 Ilack et al.，（2003)Toxicology.l85, 161-174)或者假單胞菌 (Pseudomonas)外毒素的突變體形式（參見Choe et al.,(1994)Cancer Res.54,3460-3467;參見Kreitman et al^dggdnt.J.Cancer 57,856-864)。另外，包括來自真核生物 的多肽，諸如scFv(參見Lu et al.，（2002)J Immunolog Meth.267,213-226)或者細(xì)胞因子 (參見Holzer et al.，（1996)Cytokine.8,214-221;參見Sjogaard et al.，（1999)Int J Oncol. 15,873-882)的融合結(jié)構(gòu)域可起治療劑的作用。盡管放射性同位素通常以化學(xué)方法 綴合至Fab或(Fab'）2片段，但是細(xì)胞毒素、細(xì)胞因子或酶以基因方式與Fab或(Fab'） 2融合。 與scFv、Fv或dsFv不同，已知Fab分子可在大腸桿菌E. coli的細(xì)胞周質(zhì)中（參見Humphreys et al.，J.Immunol.Methods.209，193-202;Carter et al.，Biotechnology(N Υ)·10， 163167；Venturi et al.,J Mol Biol.315,1-8；Donzeau et al.,Methods Mol Biol.378, 14-31)或者甚至在螢光假單胞菌Pseudomonas fluorescens中（參見Retallack et al·, Prot Exp Purif.81,157-165)以可溶性形式進(jìn)行生產(chǎn)，很容易達(dá)到1~2g/L。目前，許多市 售的生物試劑，諸如rhGH、胰島素或多種類型的細(xì)胞因子，都是在大腸桿菌E.coli中生產(chǎn)的 (參見Graumann and Premstaller，（2006)Biotechnol J. 1,164-186;Chadd and Chamow, (2001 )Curr Opin Biotechnol. 12，188-194)。就這一點(diǎn)而言，治療結(jié)構(gòu)域與Fab片段和其他 治療劑的基因連接在新的生物藥劑的開發(fā)中具有很大優(yōu)勢，而且在改善目前生物藥物的功 效上也具有很大優(yōu)勢。進(jìn)一步地，F(xiàn)ab分子可與其他抗體片段，諸如scFv、Fv、dsFv或dAb融 合，以制備雙特異性或三特異性的抗體分子（參見Lu et al.，（2002)J Immunolog Meth. 267，213-226)。但是，F(xiàn)ab-效應(yīng)物融合蛋白（其中效應(yīng)物是真核生物來源的）的表達(dá)在 大腸桿菌E.coli中受到了阻礙，因?yàn)樾?yīng)物結(jié)構(gòu)域由于在大腸桿菌E.coli中的不恰當(dāng)折疊 或缺乏糖基化過程而沒有生物學(xué)功能。此外，還沒有對大腸桿菌E. coli的細(xì)胞周質(zhì)中生產(chǎn) Fab-效應(yīng)物融合蛋白的最優(yōu)化的融合形式進(jìn)行徹底的研究。分子量小于50kDa至60kDa之間 的大部分血清蛋白，諸如細(xì)胞因子和生長因子，由于腎清除率，而在體內(nèi)具有較短的半衰 期，例如從幾分鐘至幾小時(shí)。因此，延長治療性多肽或蛋白的血清半衰期是生物制藥研究中 最熱衷研究的領(lǐng)域之一（參見Kontermann，（2012)Wiley，ISBN: 978-3-527-32849-9)。為此， 已經(jīng)開發(fā)了多種方法，包括聚乙二醇化、聚唾液酸化、羥基化(HESylation)、糖基化，或與柔 性且親水性的氨基酸鏈(500~600個氨基酸)融合的重組的PEG類似物(參見Chapman ,2002; Adv Drug Deliv Rev.54.531~545;Schlapschy et al.，（2007)Prot Eng Des Sel.20， 273~283;Contermann(2011)Cur;r Op Biotechnol.22,868~876;Jevsevar et al·， (2012)Methods Mol 8丨〇1.901，233~246)。進(jìn)一步地，也已直接或間接利用了？。1?11介導(dǎo)的 再循環(huán)機(jī)制，以延長治療性蛋白的體內(nèi)半衰期。在血清蛋白中，已知人類血清白蛋白（HSA) 和免疫球蛋白（尤其是IgG)在FcRn介導(dǎo)的再循環(huán)機(jī)制中具有非常長的半衰期。在人體中，白 蛋白的血清半衰期是19天，而依賴于IgG的子類，IgG分子的血清半衰期在一周至幾乎4周之 間。因此，已經(jīng)使用這兩種分子作為融合伴侶，以延長治療性蛋白和/或（多)肽的半衰期。
[0004] 在大腸桿菌E.coli的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞周質(zhì)中制備的、經(jīng)體外折疊過程之后的重組 hGH(~19kDa)已經(jīng)在臨床上用來治療嬰兒和成人中由于缺乏生長激素而引起的疾病(參見 Blethen et al ·，（ 1997) J. Clin .Endocrinol .Metab · 82,418-420) jhGH給藥中的一個主要 不便之處是，由于半衰期短(〈30分鐘）而需進(jìn)行每日注射。為了延長hGH的血清半衰期，嘗試 了聚乙二醇的化學(xué)綴合（參見 Clark et al.，（1996)J.Biol.Chem.271,21969-21977; Pradhananga et al.,2002J Mol Endocrinol.29,1114；Cho et al.,2011；Sondergaard et al.,(2011)J Clin Endocrinol Metabol .96,681-688)，和改性的hGH與人源化的CovX-主體 IgG(CovX_Body IgG)的臂的化學(xué)綴合（參見Palanki et al.，（2013) Bioorg .Med · Chem. Lett · 23，402-406)。此外，通過人類血清白蛋白（HSA)( Albutropinli ):或 包括幾百個Pro-Ala-Ser(PAS)殘基(PAS化(PASylation))的多肽序列的基因融合，成功延 長了血清中的hGH的半衰期（參見Osborn et al.，2002Eur J Pharmacol .456,149-158; Anderson et al.,(2011)J Biol Chem.286,5234-5241；Sleep et al.,(2013)Biochimica et Biophysica Acta.1830,5526-5534；Schlapschy et al.,(2013)Protein Eng Des Sel. 26,489~501)。這一類別中得到最好研究的是VRS-317，這是一種在N-末端和C-末端與 XTEN氨基酸序列基因連接的rGH，其允許一個月的給藥方案(參見Schellenberger et al.， (2007)Nat Biotech.27,1186-1190；Cleland et al.,(2012)J Pharm Sci.101,2744-2754;Yuen et al· ,(2013)J Clin Endocrinol Metab.98,2595-2603)。另外，hGH與血管疾 ?。▍⒁奣homas J Merimee et.al.，（l973)，Diabetes，22,8l3_ 8l9WPCRETZFELDT-JAKOB 疾?。▍⒁奐ohn Powell-Jackson et &1.，1985，1^11〇61:，2,244-246)相關(guān)。此外，]^^-丫加 速移植物抗宿主病（Graft-Versus-Host-Disease)(參見Bruce R.Blazar et.al. ,2003， The Journal of Immunology, 171,1272-1277)，并且IFN-α與自身免疫性疾病相關(guān)（參見A Imagawa et al.,1995,The Journal of clinical endocrinology&metabolism,80,922-926)。另外，GSCF與自身免疫性疾病相關(guān)（參見Anke Franzke et al.，2003，Blood，102， 734-739)，與 HCV 相關(guān)的肝病相關(guān)（SMVanThielDHetal.，1995，Hepat〇-gastroenterology,42,907-912)〇
[0005] 特別當(dāng)以較低成本在微生物表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)Fab-融合蛋白時(shí)，F(xiàn)ab-融合蛋白（或 多肽)作為治療試劑具有治療長期需要大劑量藥物的慢性疾病的巨大潛力。雖然利用Fab具 有上述可能的潛在優(yōu)勢，但是在開發(fā)具有延長的體內(nèi)半衰期的蛋白或（多）肽藥物中，還沒 有嘗試應(yīng)用抗血清白蛋白（SA)的Fab抗體。在這一方面，本發(fā)明人通過構(gòu)建了新的抗血清白 蛋白（SA)的Fab-效應(yīng)物蛋白（或(多)肽)融合構(gòu)建體，并且證實(shí)功能性融合構(gòu)建體在大腸桿 菌E.coli的細(xì)胞周質(zhì)中具有很高產(chǎn)量，從而完成了本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 【技術(shù)問題】
[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種具有延長的體內(nèi)血清半衰期的新的抗原結(jié) 合片段(Fab)。
[0008] 本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是，提供一種Fab-效應(yīng)物部分的融合構(gòu)建體，該 Fab-效應(yīng)物部分的融合構(gòu)建體能在宿主細(xì)胞的細(xì)胞周質(zhì)中進(jìn)行優(yōu)化的生產(chǎn)。
[0009] 本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題是，提供一種以高產(chǎn)量、可溶形式生產(chǎn)的Fab-效應(yīng) 物構(gòu)建體的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。
[0010] 本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題是，提供一種包括上述融合構(gòu)建體的藥物組合物。
[0011] 【技術(shù)方案】
[0012]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種用于在大腸桿菌E.coli的細(xì)胞周質(zhì)中表達(dá) 的、優(yōu)化的Fab-效應(yīng)物的融合構(gòu)建體(或類型），其中所述Fab具有與重鏈恒定區(qū)1 (CH1)結(jié)合 的重鏈可變區(qū)，和與輕鏈恒定區(qū)(α)結(jié)合的輕鏈可變區(qū)。
[0013]在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，考慮到多種治療性蛋白與白蛋白或與白蛋白結(jié)合部 分(諸如小肽或結(jié)構(gòu)域抗體(dAb))的融合物，通過FcRn介導(dǎo)的再循環(huán)機(jī)制延長了治療性蛋 白的半衰期（參見Dennis et al.，（2002)Biochimica et Biophysica Acta. 1830,5526-5534；Sleep et al.,(2013)Biochimica et Biophysica Acta.1830,5526-5534；Nguyen et al.,(2006)Protein Eng Des Sel.19,291-297；Kontermann,(2011)Curr Op 13;[0丨60111101.22,868~876)，從而選擇人類抗34的?313作為抗體片段。根據(jù)之前的研究，靜脈 內(nèi)給藥之后，F(xiàn)ab片段在人類中具有16~20h的消除半衰期（參見Ujhelyi and Robert， (1995)Clin Pharmacokinet. 28,483493)，在大鼠中具有~3h的消除半衰期（參見Nguyen et al.，2006Protein Eng Des 561.19,291~297)。令人驚奇地是，本發(fā)明中的？&13(51^35) 在大鼠中的半衰期是37h，這比常規(guī)人類Fab的長約11倍，因此有理由認(rèn)為SL335在人類中可 能具有至少160~200h(6~8天)的半衰期。同時(shí)，已知兩種Vk結(jié)構(gòu)域，對RSA的結(jié)合親和力分 別為13nM和ImM的dAbr3和dAbrl6,在大鼠中分別具有ti/2值53h(dAbr3)和43h(dAbrl6)(參 見Holt et al.，（2008)Protein Eng Des 561.21，283_288)。此外，對1?厶的親和力為9211]\1 的Ab Fab4D5-H的ti/2b是26.9h(參見Nguyen et al.，2006)。因此，暗示了SL335的體內(nèi)功能 性與之前報(bào)道的dAb以及對SA具有特異性的肽的功能性相當(dāng)。值得注意地是，SL335的V H和l 與之前報(bào)道的白蛋白特異性dAb，在全序列水平上僅共享65 %~67 %的氨基酸同源性，而在 互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)水平上共享~50%的氨基酸同源性(數(shù)據(jù)未示出）。具體地，在本發(fā)明的實(shí) 施方式中，對血清白蛋白（SA)具有特異性的Fab包括:重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)具有選自

ASTGATGVPA RFSGSRSGTD FTLTITSLQP EDFATYYCQQ YYSFLAKTFGQ GTQLEIKR)組成的組中的 氨基酸序列。而且，上述Fab的Vh結(jié)構(gòu)域與重鏈恒定區(qū)1 (CH1結(jié)構(gòu)域)相連，并且Fab的Vl結(jié)構(gòu) 域與輕鏈恒定區(qū)(Cicii吉構(gòu)域)相連。進(jìn)一步地，本發(fā)明的對血清白蛋白（SA)具有特異性的Fab 包括在 SL335 的 VH 區(qū)中的 SEQ ID N0.13(CDR1)(AYSMN)、SEQ ID N0.14(CDR2) (SISSSGRYIHYADSVKG)和SEQ ID N0.15(CDR3)(ETVMAGKALDY)的氨基酸序列，和在SL335的 Vl區(qū)中的SEQ ID N0.16(CDR1)(RASQSVGSNLA)、SEQ ID N0.17(CDR2)(GASTGAT)和SEQ ID NO. 18 (CDR3) (QQYYSFLAKT)的氨基酸序列。
[0014] 在一個實(shí)施方式中，F(xiàn)ab的(^結(jié)構(gòu)域和CKL結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸氨基酸可缺失或被 絲氨酸殘基取代。具體地，對于上述SL335, Chi結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸氨基酸是從該Chi結(jié)構(gòu)域的 N-末端起始的第233位氨基酸，而Ckl結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸是從該Ckl結(jié)構(gòu)域的N-末端起始的第 214位氨基酸，它們被絲氨酸殘基取代。為了避免混淆，將構(gòu)成Fab的Η鏈和L鏈命名如下：1) Hcys:在第233位具有半胱氨酸的Η鏈，2)Lcys:在第214位具有半胱氨酸的L鏈，3 )Hser:在第 233位具有絲氨酸的Η鏈，和4)Lser:在第214位具有絲氨酸的L鏈。
[0015] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，通過將效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域經(jīng)基因融合與Fab分子的Fd鏈 或輕鏈的N-末端或C-末端連接，來構(gòu)建Fab-效應(yīng)物融合物。因?yàn)橹亟M蛋白在大腸桿菌 E.coli的細(xì)胞周質(zhì)環(huán)境中的折疊和異源二聚化機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，并且在很大程度上是未知 的，因此不可預(yù)期哪種Fab-效應(yīng)物融合物類型對于功能性表達(dá)是最佳的。
[0016] 進(jìn)一步地，在另一實(shí)施方式中，提供了一種抗原結(jié)合片段(Fab)和效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域 (生物活性效應(yīng)物部分）的融合構(gòu)建體，其中，F(xiàn)ab的Chi結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸氨基酸和C kl結(jié)構(gòu) 域的半胱氨酸氨基酸缺失或被絲氨酸殘基取代;并且其中，所述生物活性效應(yīng)物部分是蛋 白或（多）肽;并且其中，所述Fab和所述生物活性效應(yīng)物部分通過基因融合共價(jià)連接。可使 用0~20個氨基酸的肽接頭，通過基因融合使所述Fab和所述生物活性效應(yīng)物部分共價(jià)連 接。在包括本發(fā)明的hGH的六種Fab-效應(yīng)物融合類型(或構(gòu)建體)中，結(jié)果清楚地證明HserG/ Lser在大腸桿菌E. col i中顯示出最高的表達(dá)量。也就是說，按照本實(shí)施方式，通過缺失或被 其他氨基酸殘基取代去除CH1結(jié)構(gòu)域中的Cys 233以及CLk結(jié)構(gòu)域中的Cys214,改善了 SL335-融 合效應(yīng)物構(gòu)建體在培養(yǎng)上清液中的可溶性表達(dá)。這樣解決了三個重要問題。首先，效應(yīng)物部 分(例如hGH)與Chi的C-末端的融合，對于C Lk的C-末端是優(yōu)選的。之前，Lu et al.報(bào)道了，抗 Flt-1的scFv與抗KDR的Fab的C-末端基因連接的產(chǎn)量比與CL結(jié)構(gòu)域的C-末端連接的高4倍 (參見Lu et al.，（2002)J Immunolog Meth.267,213-226)。盡管沒有包括數(shù)據(jù)，但是本發(fā) 明人使用大腸桿菌E.coli總裂解液進(jìn)行蛋白印記(western blot)分析，顯示出LcysG/Hcys 和LserG/Hcys的Fd片段幾乎完全降解，從而在大腸桿菌E.coli的上清液中沒有檢測到可溶 形式的融合蛋白。因?yàn)閂h結(jié)構(gòu)域易于在大腸桿菌E.coli中聚集(Dudgeon et al.，（2009) Protein Eng Des Sel.22,217-220)，因此可推測，在Cl的C-末端存在效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域可能阻 止Vh結(jié)構(gòu)域與Vl結(jié)構(gòu)域的相互作用以及Chi結(jié)構(gòu)域與Cl結(jié)構(gòu)域的相互作用，從而導(dǎo)致Fd片段 快速聚集并且降解。對比LserG/Hcys與LserG/Hser之間的可溶性表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)Chi結(jié)構(gòu)域中 存在Cys 233似乎加速了這一過程，這可能歸因于異常二硫鍵的形成。在去除了 CH1結(jié)構(gòu)域中的 Cys233之后，在CH1的末端存在的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域可能通過在Vh-Vl配對之前，部分阻擋了 VH結(jié)構(gòu) 域上的疏水表面而對降低Vh結(jié)構(gòu)域的聚集具有有利影響。第二，CLk存在Cys 214進(jìn)一步以附加 的方式惡化了 SL335-hGH融合蛋白的可溶性生產(chǎn)。HserG/Lcys的產(chǎn)量比HserG/Lser低可解 釋為由于L鏈傾向于形成稱為本周氏（Bence Jones)蛋白的同源二聚體（參見Kirsh et al.，（2005)J Immunol Methods.301,173-185)，其中，CLk的Cys214可對同源二聚體的穩(wěn)定性 起作用，或參與與融合蛋白中的其他半胱氨酸殘基形成異常二硫鍵。還已知，F(xiàn)ab中的(^與 Cl的C末端之間的二硫鍵是非常易變的，具有相當(dāng)程度的靈活性（參見Rothlisberger et al.,(2005)J.Mol.Biol.347,773-789；Humphreys et al.,(2007)Protein Eng Des Sel. 20,227-234)。在這一方面，本發(fā)明提供了一種不含Cys233的重鏈恒定區(qū)1(CH1)和不含 Cys214的輕鏈恒定區(qū)（CLk)的抗原結(jié)合片段(Fab)。同樣，HerGF/Lser和HserIFNb/Lser在大腸 桿菌E.coli中顯示出最高的表達(dá)量。在本發(fā)明的融合構(gòu)建體中，生物活性(多）肽(或蛋白） 與Fab的摩爾比在1:1至10:1之間，優(yōu)選在1:1至4:1之間。第三，SL335中存在的這兩個C-末 端半胱氨酸殘基，一定程度上不但抑制了表達(dá)量還限制了抗hGH的抗體接近hGH結(jié)構(gòu)域。如 果干擾了效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域與其配體之間的相互作用，則對于Fab-效應(yīng)物融合物中的效應(yīng)物結(jié) 構(gòu)域的治療功能也是重要的。本發(fā)明人證明了，利用Fahd s作為融合伴侶不僅僅對hGH是有 利的，因?yàn)閷ζ渌T如G-CSF和IFN-b的效應(yīng)物也產(chǎn)生了相同的結(jié)論。
[0017] 在本發(fā)明的另一方面中，提供了表達(dá)載體和作為宿主細(xì)胞的突變體大腸桿菌 E.Coli SUPEX5菌株(KCTC 12657BP)，來解決上述技術(shù)問題。通過對MC1061大腸桿菌E.Coli 菌株進(jìn)行隨機(jī)化學(xué)誘變建立了這一菌株，其中選擇MC1061大腸桿菌E.Coli菌株是因?yàn)樵摼?株來源于大腸桿菌E.Coli K12菌株，一種用于生產(chǎn)商用生物藥物的主要宿主菌株之一。通 過與親本MC1061菌株進(jìn)行對比，利用突變體SUPEX5大腸桿菌E.Coli菌株作為表達(dá)宿主進(jìn)一 步實(shí)現(xiàn)了對HserG/Lser生產(chǎn)的有利影響。通常，SL335-hGH融合物，以及Fabds與SUPEX5大腸 桿菌E.Coli菌株的組合對Fab-效應(yīng)物融合蛋白的可溶性表達(dá)都是有利的，這通過SL335-GCSF融合物（SL335 wt-GCSF vs.SL335Ads-GCSF)、SL335-IFN0融合物（SL335wt-IFNb vs.SL335 Ads-IFN0)、EGL4-hGH融合物（EGL4wt-hGH vs.EGL4Ads-hGH)和 1028-hGH融合物（1β 28wt-hGH vs . lf328Ads-hGH)獲得的結(jié)果得到了清楚地證明。因此，上述結(jié)果強(qiáng)有力地支持 了，至少在SUPEX5大腸桿菌E. Coli菌株中，相對于常規(guī)Fab，利用FalMds(沒有Cn^Cys233和 ακ的Cys214的Fab突變體形式)對Fab-效應(yīng)物融合蛋白的可溶性表達(dá)是有利的。分子伴侶蛋 白或二硫化物異構(gòu)酶（？1^4、31^4、31^、36〇4、36〇13、〇8匕4或〇813〇的共表達(dá)會改善 SL335wt-GCSF或甚至SL335Ads-GCSF的可溶性且功能性的表達(dá)，因?yàn)橐阎@些融合物提高可 溶性Fab片段在大腸桿菌E.coli的細(xì)胞周質(zhì)中的生產(chǎn)量(參見Schlapschy et al.，（2006) Escherichia coli.Protein Eng Des Sel.19,385-390)。本發(fā)明人相信，利用Fabds是有利， 特別是當(dāng)由于Fab-效應(yīng)物融合蛋白在宿主細(xì)胞中的高表達(dá)，而使分子伴侶和在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的 二硫化物形成的催化機(jī)制超載時(shí)。
[0018] 在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，盡管本發(fā)明中的分子大小增加了3倍，但使用培養(yǎng)瓶 生產(chǎn)的SL335Ads-hGH的濃度約為10mg/L，這一產(chǎn)量高于之前的報(bào)道。按照之前的報(bào)道，對于 rhGH在大腸桿菌E. coli的細(xì)胞周質(zhì)中的可溶性表達(dá)的研究示出，pelB-hGH的產(chǎn)量是0.64~ 2.57mg/L并且ompA-hGH的產(chǎn)量是0.32~2.29mg/L(參見Sockolosky and Szoka, (2013) Protein Exp Purif.87,129-135)，而且rhGH的產(chǎn)量很大程度上依賴于所使用的啟動子和 宿主大腸桿菌E.coli菌株（參見Soares et al.，（2003)Protein Engineering.16,1131-1138)。通過簡單的培養(yǎng)基優(yōu)化，本發(fā)明人在使用培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)上清液中通常獲得~50mg/L 的產(chǎn)量，這允許〇〇6(χ)Γ?=~10~11 (制備中的原稿)的細(xì)胞密度，通過對培養(yǎng)基組成和分批補(bǔ) 料的培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行精細(xì)調(diào)整，可進(jìn)一步改善該細(xì)胞密度，以足以用于工業(yè)規(guī)模。
[0019] 在本發(fā)明的另一方面，SL335ds-效應(yīng)物蛋白示出對HSA的親和力增加。在一個實(shí)施 方式中，與親本SL335相比，依賴于pH條件，SL335 ds-hGH對HSA(人類血清白蛋白）的應(yīng)答是提 高的，為親本SL335的5~9倍，對RSA(大鼠血清白蛋白）的應(yīng)答是降低的，為1.3~4倍?？贵w 片段和效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域的基因連接會影響抗體片段的抗原-結(jié)合親和力，并且親和力的變化 很大程度上依賴于抗體片段、效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域的性質(zhì)以及如何連接這兩個功能部分。不清楚 的是，親和力的這些差異是否是由沒有鏈間二硫鍵或存在hGH融合結(jié)構(gòu)域造成的。盡管如 此，與IFN-a2b-D0M7h-14(其對人、小鼠和大鼠的SA的親和力的降低分別為親本D0M7h-14的 7.7倍、22.3倍和 15.8倍）（參見Walker et al.，（2010)Protein Eng Des Sel.23,271-278) 相比，hGH融合物對SL335^ds與抗原的結(jié)合親和力的影響似乎是可以忽略的。因此，相對于結(jié) 構(gòu)域Ab，F(xiàn)ab在維持親和力和效應(yīng)物折疊上具有優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)镃h^PCl結(jié)構(gòu)域提供了減小抗原結(jié) 合區(qū)與結(jié)合至各配體的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域之間的位阻的空間。
[0020] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，SL335Ads-hGH極大地延長了血清半衰期，其中，其t1/2 (靜脈內(nèi)給藥時(shí)為16.6h)與PEG5-hGH(250kDa)的ti/2類似(參見Clark et al. ,1996)。有趣 地是，SL335Ads-hGH的ti/2是 Albutropin?:( ti/2 = 2 · 96h)的5 · 6倍，并且SL335Ads-hGH與 Albutropin?之間的ti/2的差異在S . C.(皮下）給藥中進(jìn)一步擴(kuò)大，達(dá)到16倍（97.2h vs.5.93h)(參見Osborn et al. ,2002)，盡管這些對比是一種旁證，除非實(shí)驗(yàn)在相同設(shè)置下 進(jìn)行。類似地，IFN-a2b-D0M7h-14的 ti/2也近似是HSA-IFN-a2b的 1 · 5倍（參見Walker et al.，2010)。因此，似乎白蛋白-結(jié)合物的融合物提供了比具有白蛋白的融合物更長的半衰 期，而潛在的機(jī)制還有待確定。值得注意的是，在I.V.給藥中，SL335 Ads-hGH的血清t1/2與 VRS-317(ti/2 = 15h)類似（Cleland et al.，（2012)J Pharm Sci. 101,27442754)。這可能暗 不，SL335AdsHiGH (稱為$AFAtr〇:pin?)可以執(zhí)行比一周一次更長的或甚至一個月一次的給 藥方案。
[0021] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，SL335Ads_hGH的藥效學(xué)效果似乎遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于 Albiurepin?的藥效學(xué)效果，并且考慮到一周給藥一次的方案，有效性在摩爾基礎(chǔ)上是 GroMropin?的7倍。不幸的是，我們不得不在第11天中斷了兩周的藥效學(xué)研究，因?yàn)橐恍┙?jīng) 過垂體切除術(shù)的大鼠，特別是屬于僅賦形劑組的那些大鼠，提前死亡了。這似乎是因?yàn)樵? 月進(jìn)行手術(shù)之后，從日本至韓國的長距離運(yùn)輸對動物產(chǎn)生了嚴(yán)重壓力，這反映在屬于僅賦 形劑組的動物體重減少了 5%，并且產(chǎn)生比我們預(yù)期更大的標(biāo)準(zhǔn)偏差。盡管如此，SL335^s-hGH似乎仍明顯具有被開發(fā)為長效hGH的巨大潛力，因而從現(xiàn)在起，我們將它稱為 SAFAlropinS:,
[0022] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，與上述Fab融合的生物活性多肽是選自由激素、細(xì)胞 因子、酶、抗體、生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、血液因子、疫苗、結(jié)構(gòu)蛋白、配體蛋白和受體組成的組 中的任一種。
[0023] 在本發(fā)明的又一實(shí)施方式中，生物活性多肽是選自由人類生長激素、生長激素釋 放激素(GHRH)、生長激素釋放肽、干擾素、干擾素受體、集落刺激因子(CSFs)、胰高血糖素樣 肽、G蛋白偶聯(lián)受體、白細(xì)胞介素、白細(xì)胞介素受體、酶、白細(xì)胞介素結(jié)合蛋白、細(xì)胞因子結(jié)合 蛋白、巨噬細(xì)胞活化因子、巨噬細(xì)胞肽、B細(xì)胞因子、T細(xì)胞因子、蛋白A、變態(tài)反應(yīng)抑制因子、 細(xì)胞壞死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、腫瘤壞死因子、腫瘤抑制子、轉(zhuǎn)移生長因子 (metastasis growth factor)、al-抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、載脂蛋白-E、促紅細(xì) 胞生成素、高度糖基化的促紅細(xì)胞生成素、血管生成素、血紅蛋白、凝血酶、凝血酶受體激活 肽、血栓調(diào)節(jié)蛋白、因子VII、因子Vila、因子VIII、因子IX、因子XIII、纖溶酶原激活因子、纖 維蛋白結(jié)合肽、尿激酶、鏈激酶、水蛭素、蛋白C、C反應(yīng)蛋白、腎素抑制劑、膠原酶抑制劑、超 氧化物歧化酶、瘦蛋白、血小板衍生生長因子、上皮生長因子、表皮生長因子、血管抑素 (angiostatin)、血管緊張肽、骨生長因子、骨刺激蛋白、降鈣素、胰島素、心鈉素、軟骨誘導(dǎo) 因子、依降鈣素、結(jié)締組織活化因子、組織因子途徑抑制物、促卵泡激素、促黃體激素、促黃 體激素釋放激素、神經(jīng)生長因子、甲狀旁腺激素、松弛素、分泌素、生長調(diào)節(jié)素、胰島素樣生 長因子、腎上腺皮質(zhì)激素、胰高血糖素、膽囊收縮素、胰多肽、胃泌素釋放肽、促皮質(zhì)素釋放 因子、促甲狀腺激素、自體毒素（autotaxin)、乳鐵蛋白、肌肉生長抑制素、受體、受體拮抗 體、細(xì)胞表面抗原、病毒衍生的疫苗抗原、單克隆抗體、多克隆抗體和抗體片段組成的組中 的任一種。
[0024] 在本發(fā)明的另一方面中，提供了一種藥物組合物，其中，該組合物包括本發(fā)明的 Fab-效應(yīng)物部分的融合構(gòu)建體，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑，并且在體內(nèi)具有增加的持續(xù) 性?？赏ㄟ^多種方式將本發(fā)明的藥物組合物給藥至體內(nèi)，這些方式包括口服給藥、經(jīng)皮給 藥、皮下給藥、靜脈內(nèi)給藥或肌肉給藥，并且更優(yōu)選的是，本發(fā)明的藥物組合物可作為注射 型制劑給藥。進(jìn)一步地，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來配制本發(fā)明的藥物組合物，以 在給藥之后，提供活性成分的快速、持久或延遲的釋放。上述制劑可為片劑、丸劑、粉末、小 袋劑、酏劑、混懸劑、乳劑，湯劑(solution)、糖漿、氣霧劑、軟明膠膠囊和硬明膠膠囊、無菌 注射溶液、無菌包裝粉末等的形式。適當(dāng)?shù)妮d劑、賦形劑和稀釋劑的實(shí)例是乳糖、葡萄糖、蔗 糖、甘露糖醇、木糖醇、赤蘚醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯樹膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、 纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、 滑石、硬脂酸鎂和礦物油。進(jìn)一步地，上述制劑可額外包括填充劑、防凝集劑、潤滑劑，潤濕 劑、芳香劑、乳化劑、防腐劑等。
[0025]應(yīng)理解地是，應(yīng)當(dāng)根據(jù)各種相關(guān)因素來確定實(shí)際給藥的融合蛋白或多肽的量，所 述因素包括要治療的疾病，所選擇的給藥途徑，個體患者的年齡、性別和體重，以及患者癥 狀的嚴(yán)重程度；以及，活性成分的生物活性多肽的類型。因?yàn)楸景l(fā)明的融合蛋白在血液中具 有非常優(yōu)異的持續(xù)性，因此可顯著減少包括本發(fā)明的融合蛋白的肽制劑的給藥次數(shù)和頻 率。
[0026]如本文所使用的，除非上下文中另有清楚指示，否則單數(shù)形式"一(a)"、"一(an)" 和"所述(the)"也包括復(fù)數(shù)形式。進(jìn)一步地，在一定程度上說明書和/或權(quán)利要求書中使用 術(shù)語"包含/包括（including)"、"包含/包括（includes)"、"具有/有(having)"、"具有/有 (has)"、"具有/帶有/綴合(with)"、"諸如/如(such as)"或其變體，這樣的術(shù)語不是限制性 的，并且旨在表示與術(shù)語"包括(comprising)"的方式類似的含義。
[0027]在本發(fā)明中，"生物活性多肽或蛋白"是指當(dāng)給予包括人類的哺乳動物時(shí)，表現(xiàn)出 有用的生物活性的（多)肽或蛋白。
[0028]在本發(fā)明中，"Fab-效應(yīng)物部分的融合構(gòu)建體(或類型)"是其中生物活性(多)肽或 蛋白與Fab共價(jià)連接的構(gòu)建體。進(jìn)一步地，"Fab-效應(yīng)物部分的融合構(gòu)建體(或類型)"理解為 包含F(xiàn)ab-融合蛋白、Fab-融合(多)肽、融合構(gòu)建體和融合物類型。
[0029]就此，實(shí)施例中詳細(xì)描述了本發(fā)明。應(yīng)注意，實(shí)施例的描述不限制如在本公開中描 述的本發(fā)明的范圍。
[0030] 【有益效果】
[0031] 在本發(fā)明中，提供了抗血清白蛋白FalMds-相關(guān)(SAFA)技術(shù)，作為開發(fā)長效生物治 療劑的新的平臺技術(shù)。在這方面，相對于包括聚乙二醇化、Fc-融合、AlbudAb技術(shù)和白蛋白-融合物的傳統(tǒng)技術(shù)，本發(fā)明在體內(nèi)的長時(shí)間作用、維持效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域的構(gòu)形、結(jié)合親和力、 簡單生產(chǎn)及低成本程序方面具有優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0032]圖1示出了單克隆噬菌體ELISA的結(jié)果，以確定抗-SA的Fab噬菌體抗體的結(jié)合特異 性。
[0033]圖2示出了通過ELISA對人類Fab克隆的抗原-結(jié)合特異性的確定。
[0034]圖3示出了 SL335的體內(nèi)藥代動力學(xué)。
[0035]圖4是本研究所構(gòu)建的六種SL335-hGH融合物類型的圖解。
[0036]圖5示出了ELISA的結(jié)果，以確定大腸桿菌E.coli培養(yǎng)上清液中，可溶性SL335-hGH 融合物的產(chǎn)量和結(jié)合反應(yīng)性。使用TMB底物使結(jié)合信號可視化，并且使用ELI SA酶標(biāo)儀測量 450nm處的吸光度。數(shù)據(jù)表示三次實(shí)驗(yàn)的平均值土 SD。
[0037] 圖6顯示確定SL335和SL335-hGH變體的宿主E.coli-依賴的和溫度依賴的表達(dá)(20 °C，A;25°C，B;或30°C，C)的ELISA結(jié)果。
[0038] 圖7顯示確定大腸桿菌E.coli培養(yǎng)上清液中，可溶性SL335-GCSF和SL335-IFN0融 合構(gòu)建體的產(chǎn)量的ELISA結(jié)果。
[0039] 圖8顯示確定大腸桿菌E.coli培養(yǎng)上清液中，可溶性EGL4-hGH(A)和1028-hGH融合 物(B)的產(chǎn)量的ELISA結(jié)果。
[0040] 圖9是通過SDS-PAGE和蛋白印記對SL335wt-hGH和SL335ds-hGH的分析結(jié)果。
[0041 ] 圖10是通過基于芯片的毛細(xì)管電泳對HcycG/Lcys和HserG/Lser的分析結(jié)果。
[0042] 圖11是通過MALDI-T0F質(zhì)譜分析法對HcycG/Lcys和HserG/Lser的分析結(jié)果。
[0043] 圖12是使用FPLC，經(jīng)由凝膠過濾對HserG/Lser的純化。
[0044] 圖13示出了通過Nb2-ll細(xì)胞增殖測定，對SL335ds-hGH的hGH體外生物活性的測定。
[0045] 圖14示出了通過ELISA和體外Nb2-ll細(xì)胞增殖測定，對SL335ds-hGH的血清穩(wěn)定性 的測定。
[0046] 圖15是Growtrop in或SL335dsHiGH在大鼠中的藥代動力學(xué)分析。
[0047] 圖16示出了經(jīng)Grcnvtropin?或SL335Ads_hGH處理的垂體切除的大鼠中，劑量依賴性 的體重增加。N=3只大鼠/處理組，每只大鼠每天進(jìn)行一次體重測量。
[0048] 圖17示出了經(jīng)GiOwlropin、K〕或SL335Ads-hGH處理的脛骨長度的劑量依賴性的增加。 N=3-4只大鼠/處理組，每只大鼠進(jìn)行一次脛骨測量。
[0049] 圖18給出了本發(fā)明的pHEKA載體。
[0050] 圖19示出了本發(fā)明的pHEKA載體的核酸序列。
[00511圖20示出了由本發(fā)明的抗-SA的Fab克隆所利用的VH基因和VL基因的，推導(dǎo)出的氨 基酸序列。
[0052]圖21示出了由本發(fā)明的抗-SA的Fab克隆所利用的VH基因(A)和VL基因（B)的DNA序 列。
[0053]圖22示出了本發(fā)明的Fab-效應(yīng)物融合構(gòu)建體的序列信息。在接頭和效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域 下面標(biāo)有下劃線，CDR以粗體示出。
【具體實(shí)施方式】
[0054] 1、材料和分析
[0055] 1_(1)克隆和菌株
[0056] 按照標(biāo)準(zhǔn)程序（參見Sambrook et al.，（1989)分子克?。簩?shí)驗(yàn)指南，第二版 (Molecular cloning:A laboratory manula,2nd ed·)，（紐約，USA:冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)))，進(jìn)行所有的DNA克隆實(shí)驗(yàn)。由韓國大田市的 Bioneer合成用于構(gòu)建SL335-效應(yīng)物融合構(gòu)建體的測序級的寡核苷酸和密碼子優(yōu)化的基 因。除非另有說明，在94°C lmin，58°C lmin，且72°C lmin進(jìn)行25個循環(huán)，然后72°C 10min的條 件下，使用Pyrobest或Ex-Taq DNA聚合酶(Takara，tsu，日本)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。還從Takara購 買了限制性內(nèi)切酶、蝦堿性磷酸酶(SIP)和T4DNA連接酶。使用大腸桿菌E. co 1 i MCI061菌株 [araD139Del(araA-leu)7697Del(lac)X74galK16galE15(GalS)A-el4-mcrA0relAlrpsL150 (strR)spoTlmcrBlhsdR2](ATCC，馬納薩斯，USA)進(jìn)行克隆，并且使用大腸桿菌E.coli SUPEX5進(jìn)行重組蛋白表達(dá)。使用大腸桿菌E. coli TG1菌株{F' [traD36proAB+lacIqlacZ Δ M15]supE thi-1 Δ (lac-proAB) Δ (mcrB-hsdSM)5, (γκ ι?κ )} (Agilent Technologies，帕洛 阿爾托，USA)進(jìn)行重組噬菌體的制備。
[0057] l-(2)HuDVFab_8L抗體庫的生物淘選
[0058] 按先前描述的方法（參見Joo et al ·，（2008) J. Immunol .Methods · 333，24-37 ;Hur et al.，（2010)Immunol Lett. 132,24-30)進(jìn)行與革E標(biāo)抗原結(jié)合的重組菌體的富集。簡單 來講，在4 °C，將綴合有人類、大鼠或小鼠的血清白蛋白（分別為HSA、RSA或MSA) (Sigma-Aldrich，圣路易斯，M0，USA)的甲苯磺?；胖?，與來自HuDVFab-8L抗體庫(AprilBio，春川 市（Chuncheon)，韓國）的10 1Q噬菌體混合4h，并且用含0 · 02 %吐溫(Tween)的磷酸緩沖鹽水 (PBST)沖洗三次。使用洗脫緩沖液(0.1M甘氨酸，pH 2)，洗脫與珠子結(jié)合的噬菌體抗體。使 用經(jīng)洗脫的噬菌體感染攜帶對應(yīng)的輕(L)(VL+CLk)鏈的新鮮的TG1細(xì)胞，并且使TG1細(xì)胞生長 在含25μg/ml氨芐青霉素、10μg/ml羧芐青霉素和10μg/ml四環(huán)素的2YT培養(yǎng)基(2XYT/ACT) 中。然后，使用Ex-12輔助噬菌體(AprilBio)使重組噬菌體擴(kuò)增，以用于隨后的淘選。在最終 淘選之后，進(jìn)行單克隆噬菌體ELISA，以鑒定出陽性克隆。將來自陽性克隆的Fd(V H+CH1)基因 亞克隆到pHg3A-3載體（AprilBio,春川市，韓國）中，并且使用在pLflT-3噬菌粒載體 (AprilBio)中的全部1.410 8人類幼稚(humanna ve) kL鏈進(jìn)行L鏈優(yōu)化。
[0059] 1-(3)_DNA 測序分析
[0060] 使用非凡質(zhì)粒小提試劑盒（Wizard Plasmid Miniprep Kit) (Promega,麥迪遜 (Medison)，WI，USA)，從產(chǎn)生抗-SA的Fab分子的大腸桿菌E.coli細(xì)胞中，分離pHflg3A-2 (AprilBio)·菌粒和pLflA-3質(zhì)粒(AprilBio)。使用與pHflg3A_2或pLT-2互補(bǔ)的兩種不同 的測序弓丨物（5'-gtgccgttctatagccatagcac_3'（SEQ ID N0:19)和5'_ ggcactggctggtttcgctaccgtg-3 '（ SEQ ID NO: 20))，分別讀出 Vh和Vl基因。由韓國大田市的 SolGent進(jìn)行DNA測序。
[0061 ] 1-(4)ρΗΕΚΑ表達(dá)載體的構(gòu)建
[0062] 使用Pyrobest DNA聚合酶和一組PCR引物#1(5'-gggagatcttgaaatgagctgttgacaattaatcatccg-3'(SEQ ID Ν0:21))^Ρ#2(5'-cctctttaatttttaataataaagttaatcgataattcc-3 '（SEQ ID NO: 22))，通過PCR擴(kuò)增，從 pTrcHis-B載體（Invitrogen,卡爾斯巴德(Carlsbad)，CA，USA)，獲得含Bgl II限制位點(diǎn)+ trc啟動子+gl0翻譯增強(qiáng)子-核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS)的DNA片段#1。使用PCR引物#3(5'_ ggaattatcgattaactttattattaaaaattaaagaggtatatattaggatccgagc tcgagttctgca-3' (SEQIDN0:23)WP#4(5，-gggcactacgtgcgaaaggcccagtctttcgact_ 3，（SEQIDN0:24))， 通過PCR擴(kuò)增，從與上述相同的模板獲得含glO翻譯增強(qiáng)子+RBS+BamH 1+多克隆位點(diǎn)(MCS) + 轉(zhuǎn)錄終止子的DNA片段#2。使用Ex-Taq DNA聚合酶和一組PCR引物#1和#4,進(jìn)行鏈接PCR，以 將這兩條DNA片段組合在一起。通過瓊脂糖凝膠電泳，分離得到的~520bp DNA片段。之后， 使用Bgl II和Dra III對連接PCR產(chǎn)物和pET28a(Invitrogen)質(zhì)粒進(jìn)行限制性酶切，并且使 用T4DNA連接酶在RT下保持2h，以使它們連接在一起。使用3ml連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化MC1061電感 受態(tài)細(xì)胞，然后在含50μg/ml卡那霉素（Sigma-Aldrich)的2YT板上選擇大腸桿菌E.coli轉(zhuǎn) 化株。為了將Fab基因亞克隆到pHEKA載體中，使用一組PCR引物#5(5'_ ggccgcagatctgttaattaaggaggaatttaaagaattcatgaaaaaactgctgttcgcgattccgct-3'(SEQ ID NO:25))和#6(5'-gggaagcttattaacaagatttgggctcaactctcttgtcc-3'（SEQ ID NO: 26))，從pHfl g3A-2噬菌粒載體，PCR擴(kuò)增Fd (VH+CH1)鏈基因；并且，使用一組PCR引物#7 (5 ' -gggggatccatgaaaaagacagctatcgcgattgcagtg-3'（SEQ ID NO :27))和#8(5'-attcctccttaattaacagatctgcggccgcactcgagattaacactctcccctgttgaagctc tttgt-3'(SEQ ID NO: 28))，從pLT-2質(zhì)粒載體，PCR擴(kuò)增L鏈基因。使用PCR引物#6和#7,通過鏈接PCR，將得 到的Fd鏈基因片段和L鏈基因片段組合在一起，并且從瓊脂糖凝膠中切出得到的大小為~ 1.4kbp的PCR產(chǎn)物。之后，使用BamH I和Hind III對PCR產(chǎn)物和pHEKA質(zhì)粒進(jìn)行限制性酶切， 使用T4DNA連接酶在RT下保持2h，以使它們連接在一起，然后經(jīng)電穿孔進(jìn)入大腸桿菌E. col i MC1061或SUPEX5的電感受態(tài)細(xì)胞中。下面的表1中，示出在制備pHEKA表達(dá)載體時(shí)所使用的 PCR引物。另外，圖18示出了 pHEKA表達(dá)載體的示意圖。
[0063] 【表1】
[0064] 制備pHEKA表達(dá)載體的PCR引物
[0065]
[0066] 1-(5)-突變體大腸桿菌E.Coli SUPEX5菌株的建立
[0067]基本按照之前的工作所描述的進(jìn)行化學(xué)誘變。簡單來講，使大腸桿菌E.coli MC1061細(xì)胞，生長在含50μg/ml氨芐青霉素的魯尼肉湯(Luria Broth，LB)培養(yǎng)基中，至OD600 為~0.3,其中大腸桿菌E.coli MC1061細(xì)胞表達(dá)與堿性磷酸酶(AP)融合的抗-人支鏈酮酸 脫氫酶復(fù)合體-E2(BCKD-E2)scFV。通過在3,000g離心10min，收集在5ml培養(yǎng)物中所含的細(xì) 胞，用冷的0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH 5.5)沖洗兩次。然后，將細(xì)胞重懸在1.9ml相同的緩沖 液中，使用50μg/ml N-甲基-N ' -硝基-N-亞硝基胍(MNNG) (Sigma-Adrich，圣路易斯，M0， USA)，在37°C處理15min、30min和45min。在MNNG處理之后，混合細(xì)胞，沖洗兩次，并且重懸在 2ml LB培養(yǎng)基中。然后，如所述進(jìn)行具有雙膜系統(tǒng)的集落挖掘測定(colony lift assay)。 簡單來講，用低蛋白結(jié)合能力的第一尼龍膜(〇.45m Nytran N尼龍印記膜）（GE Healthcare Life Science，沃瓦托薩(Wauwatosa)，WI，USA)，覆蓋含50μg/ml氨節(jié)青霉素和10μg/ml羧節(jié) 青霉素的LB瓊脂板。突變的細(xì)菌以10 6細(xì)胞/板的密度擴(kuò)散到膜上，并且在37 °C生長8h。同 時(shí)，將第二硝酸纖維素膜（Bio-Trace? NT硝酸纖維素轉(zhuǎn)移膜）（PALL，華盛頓港（Port Washington)，NY，USA)，鋪放到含50μg/ml氨芐青霉素、10μg/ml羧芐青霉素和ImM異丙基一 D-1-硫代半乳糖苷（IPTG)(Sigma-Aldrich)的新鮮的LB瓊脂板上。從LB瓊脂板上移走第一 尼龍膜，并且將第一尼龍膜放置到第二膜上，然后在37°C孵育5h。孵育之后，移去第一膜(具 有菌落），并且將第一膜放置到含50μg/ml氨芐青霉素和10μg/ml羧芐青霉素的新鮮的LB瓊 脂板上，并且儲存在4°C，用于稍后回收細(xì)菌。第二膜在含0.1%v/v Tween 20(PBS/TWeen) 的新鮮磷酸緩沖鹽水中沖洗三次，持續(xù)lOmin，然后浸沒在氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)/5-溴-4_氯-3-Π 引噪基磷酸鹽(BCIP)底物(Duchefa,哈勒姆(Haarelem)，荷蘭）中，以使大腸桿菌 E.coli菌落的AP可視化。從對應(yīng)的第一濾膜上挑選出顯示出區(qū)別性AP活性的大腸桿菌 E. col i菌落，匯集在一起，并且進(jìn)行第二輪誘變和集落挖掘測定。在第二輪集落挖掘測定之 后，選擇出試驗(yàn)性陽性的大腸桿菌E.coli菌落，并且使其生長在含50μg/ml氨芐青霉素和10 μg/ml羧芐青霉素的10ml 2YT培養(yǎng)基中，直至OD600達(dá)到0.5。將IPTG以0.1 mM的終濃度添加到 培養(yǎng)物中，并且使細(xì)胞在27 °C生長過夜。然后，通過在3，300g離心20min，收獲培養(yǎng)上清液。 為了制備細(xì)胞周質(zhì)提取物，將細(xì)胞沉淀塊重懸在細(xì)胞周質(zhì)提取緩沖液（2儲存物；200mM Tris-HCl，20mM EDTA，2M NaCl，pH 7.4)中，凍融三次，并且在4°(：、10,00(^離心2〇111丨11。通過 收獲上清液，最終獲得含可溶性抗-BCKD-AP融合物的細(xì)胞周質(zhì)提取物。用含1 %牛血清白蛋 白（BSA)(Sigma-Aldrich)的PBS制備培養(yǎng)上清液和細(xì)胞周質(zhì)提取物的系列稀釋物，并且在 96孔微量滴定板(SPL，韓國）中，50ml培養(yǎng)上清液或細(xì)胞周質(zhì)提取物樣品與100ml對硝基苯 磷酸(pNPP)底物(Roche,南舊金山，CA，USA)混合。5~10min之后，向每一孔中添加25μ1 3M NaOH以終止反應(yīng)，并且使用ELISA酶標(biāo)儀(Bio-Rad,Hercules，CA，USA)測量415nm處的吸光 度。使示出抗-BCKD-AP融合物的表達(dá)增強(qiáng)的四株突變體大腸桿菌E. col i菌株(M#5、M#7、M# 54和M#69)，在沒有抗生素的2YT培養(yǎng)基中，在37°C生長過夜。然后，將細(xì)胞以~10 3細(xì)胞/板 的密度涂布到LB瓊脂板上，并且在37°C生長過夜。將得到的菌落復(fù)制到具有或沒有50μg/ml 氨芐青霉素的LB瓊脂板上。選擇出在沒有抗生素 LB瓊脂板中生長，但在具有抗生素的LB瓊 脂板中不生長的大腸桿菌E.coli菌落，并且使其在沒有抗生素的2YT培養(yǎng)基中生長，直至 0D 6qQ達(dá)到~1.0。通過添加甘油(20 % v/v)來制備細(xì)胞儲存物，并且儲存在80 °C。為了在克隆 中使用，按照標(biāo)準(zhǔn)方案，使用突變株制備電感受態(tài)細(xì)胞，并且儲存在80°C。將突變體大腸桿 菌E.coli菌株之一M#5命名為SUPEX5(KCTC 12657BP)，并且用于表達(dá)Fab和Fab-效應(yīng)物融合 蛋白。
[0068] 1-(6)-酶-連接的免疫吸附測定(ELISA)
[0069]對于單克隆噬菌體ELISA，通過噬菌體營救，從陽性大腸桿菌E.coli克隆中獲得重 組噬菌體，并且以~1 〇8CFU/孔添加到包被有5μg/ml HSA、RSA、MSA或BSA的Maxi Sorb ELI SA 板(Nunc，羅斯基勒(Roskilde)，丹麥)上。在37°C，在pH 6或pH 7.4下保持111，使噬菌體能與 抗原結(jié)合。使用綴合HRP0的山羊抗-人kL的Ab(Sigma-Aldrich)作為第二抗體。使用TMB底物 (BD Science,圣荷西(San Jose),CA，USA)使結(jié)合信號可視化，并且使用ELISA酶標(biāo)儀01〇-1^(1，!1虹(3111^^，1^4)測量45〇11111處的吸光度。數(shù)據(jù)表示三次實(shí)驗(yàn)的平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差。對于 傳統(tǒng)ELISA，將多種抗原[人類SA、大鼠 SA、小鼠 SA、猴SA(Alpha diagnositic Inti.，圣安東 尼奧市，TX，USA)、犬SA(CUSABI0,中國湖北武漢）、兔SA(Sigma-Aldrich)、表皮生長因子受 體（EGFR) (R&D systems，明尼阿波里斯市，MN，USA)、上皮細(xì)胞粘附分子（EpCAM) (R&D systems)、IL-15受體α( IL_15Ra) (R&D systems)、IL_10(eBioscience，圣地亞哥，CA,USA)、 Q)16a(R&D systems)、c_MET(義翹神州生物技術(shù)有限公司（Sinobiological)，中國北京）]， 以5μg/ml的濃度固定至微量滴定板上，并且使Fab分子能與抗原結(jié)合，并且通過如上過程進(jìn) 行檢測。為了確定可溶性Fab或Fab-hGH融合蛋白的濃度，使用小鼠抗-人I gG的Fd的mAb (AprilBio)作為捕獲Ab，并且使用綴合HRP0的山羊抗-人kL鏈的pAb(Sigma-Aldrich)作為 檢測抗體，進(jìn)行夾心法ELISA。使用具有已知濃度的人類Fab片段（Bethyl，蒙哥馬利 (Montgomery)，TX，USA)來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用T-20、對hGH的C-末端具有特異性的山羊pAb (Santacruz Biotechnology，達(dá)拉斯(Dallas)，Tx，USA)和NYThGH、對全長hGH具有特異性的 小鼠 mAb(Prospec,東布朗士維克(East Brunswick)，NJ,USA)檢測hGH結(jié)構(gòu)域，然后，分別使 用綴合HRP0的兔抗山羊I gG的pAb (S i gma-A 1 dr i ch)或綴合HRP0的山羊抗小鼠 I gG的pAb (Sigma-Aldrich)作為第二抗體。使用山羊抗人GCSF的pAb(R&D Systems)來檢測G-CSF結(jié)構(gòu) 域，并且使用兔抗人IFN-β的pAb(PEPROTECH，洛基山（Rocky把11)，1^4)來檢測正^辟吉構(gòu) 域。
[0070] 1-( 7)-可溶性Fab和Fab-效應(yīng)物融合蛋白的制備
[0071] 可溶性Fab和Fab-hGH融合蛋白的生產(chǎn)通過使大腸桿菌E. coli SUTOX5細(xì)胞在37 °C，在10ml或1L含50μg/ml卡那霉素的2YT培養(yǎng)基中生長，直至0D_nm=0.5,然后添加0.05mM IPTG。伴隨劇烈振蕩，在20°C孵育20h之后，通過在3,300g離心20min，分離培養(yǎng)上清液和細(xì) 胞沉淀塊。如之前所述，獲得細(xì)胞周質(zhì)提取物。使培養(yǎng)上清液和/或細(xì)胞周質(zhì)提取物通過固 定有HSA(Apri IBio)的瓊脂糖(Sepharose )4B樹脂，來進(jìn)行純化。在徹底沖洗之后，使用洗脫 緩沖液(0.1M甘氨酸，10%甘油，pH 3)，洗脫結(jié)合到樹脂上的Fab分子，之后立即用Tris緩沖 液（0.5M Tris HC1，2M NaCl，pH 9.0)進(jìn)行中和。在使用AKTA FPLC(GE Healthcare,沃瓦托 薩(Wauwatosa)，WI，USA)進(jìn)行親和純化之后，還對HserG/Lser進(jìn)行凝膠過濾。簡單來講，使 用平衡緩沖液（20mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.4)對Hiprep?16/60Sephacryl? S-200HRP 再包裝柱(repacked Column)進(jìn)行平衡，并且上樣5μ1 HserG/Lser(SL335Ads_hGH融合物）。 使用平衡緩沖液在〇.35Mpa報(bào)警壓力下，以0.5μ1/π?η的運(yùn)行流速進(jìn)行洗脫。如下所述，通過 305^^^分析組分編號13、16、19和23。
[0072] 1_(8)通過生物膜干涉、法(biolayer interferometry)進(jìn)行親和力測量
[0073] 除 了使用AR2G(胺反應(yīng)性第二代（Amine Reactive Second-Generation))傳感器 (Costin et al.，（2013)J ν?Γ〇1·87,52-66)之外，如前所述的，使用具有Octet RED系統(tǒng) (ForteBio,門洛帕克(Menlo park)，CA，USA)的生物膜干涉法，進(jìn)行在純化的SL335與抗原 (人類SA、大鼠 SA或小鼠 SA)之間的實(shí)時(shí)結(jié)合測定。簡單來講，使預(yù)定濃度的SL335與動力學(xué) 級AR2G生物傳感器偶聯(lián)，并且通過在動力學(xué)緩沖液（1M乙醇胺，pH 8.5)中孵育，從傳感器表 面去除沒有結(jié)合的Fab片段。然后，在pH 6.0或pH 7.4的條件下，使探針能與預(yù)定濃度的人 類SA、大鼠 SA或小鼠 SA結(jié)合(人類SA在pH 6和pH 7.4下的濃度：20〇11]\1、10〇11]\1、5〇11]\1、2511]\1和 12 · 5nM;大鼠 SA在pH 6下的濃度：4mM、ImM、500nM、250nM和 125nM;大鼠 SA在pH 7 · 4下的濃 度:4mM、2mM、ImM、500nM和 125nM;小鼠 SA在pH 6和pH 7 · 4下的濃度：20mM、1 OmM、5mM、2 · 5mM 和12.5mM)，然后在pH 6或pH 7.4下，在含0.1 %BSA的PBS中解離。使用Octet QK軟件包計(jì)算 結(jié)合和解離動力學(xué)，該Octet QK軟件包適于1:1結(jié)合模型所觀察到的結(jié)合曲線，以計(jì)算結(jié)合 速率常數(shù)。使用至少三種不同濃度的人類SA、大鼠 SA或小鼠 SA，計(jì)算結(jié)合和解離速率常數(shù)。 以動力學(xué)解離速率常數(shù)除以動力學(xué)結(jié)合速率常數(shù)的方式，計(jì)算平衡解離常數(shù)。
[0074] l-(9)SL335_hGH融合構(gòu)建體的生成
[0075] 為了創(chuàng)建SL335ds，通過PCR擴(kuò)增，使用一組PCR 引物#9(5 ' -ggggaatt catgaaatatctgctgcctacggcggcggcgggcctgctgctgctggctgcacaa-3'（SEQ ID NO:29))和# 10(5 '-gggaagcttttagctgctcttcggttccacgcgtt-3 '（SEQ ID NO: 30))，從SL335的密碼子優(yōu) 化的Fd鏈基因，獲得突變體Fd(Cys233Ser233取代）（稱為Hser)。使用EcoR I/Hind III處理~ 750bp PCR產(chǎn)物，并且與pHEKA連接。還通過PCR擴(kuò)增，從SL335的密碼子優(yōu)化的L鏈基因，使用 一組PCR 弓丨物#11(5 '-gggggatccatgaaaaaaactgcgattgcgattgcggtgctggccggctttg-3 '（SEQ IDN0:31)^P#12(5'-gggctcgagttagctttcgccgcggttaaagctctttg-3'（SEQIDN0:32))， 獲得突變體L鏈(Cys 214-Ser214取代）（稱為Lser)，經(jīng)BamH I/Xho I切割并且克隆到含Hser 的pHEKA中。用于生成HcysG/Lcys構(gòu)建體的克隆程序如下：使用一組PCR引物#9和#13(5'_ agatccaggagctggtgcagaaccgcagctcttcggttccacgcgtt-3,（SEQ ID N0:33))，從SL335的密 碼子優(yōu)化的Fd，PCR擴(kuò)增具有Cys233的野生型Fd(稱為Hcys);并且，還使用一組PCR引物#14 (5 '-ggttctgcaccagctcctggatcttttccgaccattccgctgagccg-3 '（SEQ ID NO:34))和#15 (5 '-gggaagcttttagaagccgcaggagccctcca-3 '（SEQ ID NO: 35))，從密碼子優(yōu)化的hGH基因， PCR擴(kuò)增含接頭序列的hGH。使用一組PCR引物#9和#15,通過組合PCR(assembly PCR)將Hcys 和hGH基因連接在一起，經(jīng)EcoR I/Hind III切割，并且克隆到含具有SL335的Cys214野生型L 鏈的pHEKA中（稱為Leys)。為了生成LcysG/Hcys構(gòu)建體，使用一組PCR引物#11和#16(5'_ agatccaggagctggtgcagaaccgcattcgccgcggttaaagctcttt-3,（SEQ ID N0:36))，從SL335的 密碼子優(yōu)化的L鏈，PCR擴(kuò)增Leys，并且還使用一組PCR引物#14和#17(5'_ gggctcgagttagaagccgcaggagccctcca-3 '（SEQ ID N0: 37))，從密碼子優(yōu)化的hGH基因 ，PCR 擴(kuò)增含接頭序列的hGH。使用一組PCR引物#11和#17,通過組合PCR連接Leys和hGH基因，以生 成LcysG，經(jīng)BamH I/Xho I切割，并且克隆到含野生型Fd的pHEKA中。為了創(chuàng)建HserG/Lcys構(gòu) 建體，使用一組PCR引物#9和#18(5，-gggctcgagttagaagccgcaggagccctcca-3，（SEQ ID N0: 38))，從密碼子優(yōu)化的野生型Fd鏈，PCR擴(kuò)增Hser。如創(chuàng)建HeysG/Lcys構(gòu)建體那樣，進(jìn)行含接 頭序列的hGH的PCR擴(kuò)增、組合PCR和HserG的克隆。為了生成LserG/Hcys構(gòu)建體，使用一組 PCR引物#11和#19(5，_agatccaggagctggtgcagaaccgctgctcttcggttccacgcgtt_3，（SEQ ID NO: 39))，從SL335的密碼子優(yōu)化的L鏈，PCR擴(kuò)增Lser。如在創(chuàng)建LcysG/Hcys構(gòu)建體中那樣， 進(jìn)行含接頭序列的hGH的PCR擴(kuò)增、組合PCR和LserG的克隆。為了生成HerG/Lser構(gòu)建體，除 了使用含Lser的pHEKA進(jìn)行克隆之外，如創(chuàng)建HserG/Lcys構(gòu)建體那樣，進(jìn)行HserG和hGH的 PCR擴(kuò)增，以及組合PCR。除了使用含Hser的pHEKA進(jìn)行克隆之外，如創(chuàng)建LserG/Hcys構(gòu)建體 那樣，構(gòu)建LserG/Hser。下面的表2中，示出了用于制備SL335-hGH融合構(gòu)建體和SL335 Ads-hGH融合構(gòu)建體的PCR引物。
[0076] 【表2】
[0077] 用于SL335-hGH融合構(gòu)建體或SL335^ds-hGH融合構(gòu)建體的PCR引物
[0078]
[0079] 1-(10)-SL335_GCSF融合構(gòu)建體的生成
[0080] 生成HcysGF/Lcys構(gòu)建體的克隆程序如下：使用一組PCR引物#9和#20(5'_ agatccaggagctggtgcagaaccgctttcgccgcggttaaagctctttg-3'(SEQ ID NO:40))，從SL335 的密碼子優(yōu)化的Η鏈，P C R擴(kuò)增H c y s，并且還使用一組P C R引物#21(5'_ ggttctgcaccagctcctggatctgcgcctacctatcgcgcgagca-3 '（SEQ ID 腸：41))和#22(5'_ gggaagcttattaaggctgtgccagatggcgcag-3'（SEQ ID N0:42))，從密碼子優(yōu)化的G-CSF基因， PCR擴(kuò)增含接頭序列的G-CSF。使用一組PCR引物#9和#22,通過組合PCR將Hcys和G-CSF基因 連接在一起，經(jīng)EcoR I/Hind III切割，并且克隆到含SL335的L鏈的pHEKA中。為了生成 LcysGF/Hcys構(gòu)建體，使用一組PCR引物#11和#23(5'_ agatccaggagctggtgcagaaccgcattcgccgcggttaaagctcttt-3,（SEQ ID N0:43))，從SL335的 密碼子優(yōu)化的L鏈，P C R擴(kuò)增L c y s，并且使用一組P C R引物# 2 1和# 2 4 ( 5 ' -taacagatctgcggccgcactcgagattaaggctgtgccagatg gcgcag-3' (SEQ ID NO:44)) 子優(yōu)化的G-CSF基因，PCR擴(kuò)增含接頭序列的G-CSF。使用一組PCR引物#11和#25(5'-agatccaggagctggtgcagaaccgctgc tcttcggttccacgcgtt-3 '（SEQ ID NO: 45))，通過組合 PCR連接Leys和G-CSF基因，經(jīng)BamH I/Xho I切割，并且克隆到含SL335的Fd的pHEKA中。為了 創(chuàng)建HserGF/Lser構(gòu)建體，使用一組PCR引物#9和#25,從SL335的密碼子優(yōu)化的Fd，PCR擴(kuò)增 Hser。使用一組PCR引物#9和#22,通過組合PCR將Hser和G-CSF基因連接在一起，經(jīng)EcoR 1/ Hind III切割，并且克隆到含Lser的pHEKA中。為了生成LserGF/Hser構(gòu)建體，使用一組PCR 弓|物#11和#26(5-agatccaggagctggtgcagaaccgctttcgccgcggttaaagctctttg-3(SEQ ID NO:46))，從SL335的密碼子優(yōu)化的L鏈，PCR擴(kuò)增Lser，并且還使用一組PCR引物#21和#24，從 密碼子優(yōu)化的G-CSF基因，PCR擴(kuò)增含接頭序列的G-CSF。使用一組PCR引物#11和#25,通過組 合PCR連接Leys和G-CSF基因，經(jīng)BamH I/Xho I切割，并且克隆到含Hser的pHEKA中。下面的 表3中，示出了用于制備SL335-GCSH融合構(gòu)建體和SL335Ms_GCSF融合構(gòu)建體的PCR引物。 [0081]【表3】
[0082] 用于SL335-GCSH融合構(gòu)建體或SL335Ads_GCSF融合構(gòu)建體的PCR引物
[0083]
[0084] l-(ll)SL335-IFN_b融合構(gòu)建體的生成
[0085] 用于生成HcysIFNb/Lcys構(gòu)建體的克隆程序如下。使用一組引物引物#9和#27(5'_ agatccaggagctggtgcagaaccgcagctcttcggttccacgcgtt-3,（SEQ ID N0:47))，從SL335的密 碼子優(yōu)化的Η鏈，P C R擴(kuò)增H c y s，并且還使用一組P C R引物#28(5'_ ggttctgcaccagctcctggatcttcatacaacctgctgggcttcctg-3'(SEQ ID NO:48))和#29(5'_ gggaagcttttagttgcgcagatagccggtcag-3'（SEQ ID N0:49))，從密碼子優(yōu)化的IFN-bla基 因，PCR擴(kuò)增含接頭序列的IFN-b。通過一組PCR引物#9和#29，通過組合PCR，將Hey s和IFN-bla基因連接在一起，經(jīng)EcoR I/Hind III切割，并且克隆到含Leys的pHEKA中。為了創(chuàng)建 HserIFN-b/Lser 構(gòu)建體，使用一組 PCR 引物 #9 和#30(5'_ agatccaggagctggtgcagaaccgctgctcttcggttccacgcgtt-3,（SEQ ID NO:5〇))，從SL335的密 碼子優(yōu)化的Η鏈，PCR擴(kuò)增Hser。使用一組PCR引物#9和#29,通過組合PCR，將Hser和IFN-bla 基因連接在一起，經(jīng)EcoR I/Hind III切割，并且克隆到含Lser的pHEKA中。下面的表4中，示 出了用于制備SL334-IFNb融合構(gòu)建體和SL335 Ms_IFNb融合構(gòu)建體的PCR引物。
[0086]【表4】
[0087] 用于SL335-IFNb融合構(gòu)建體或SL335Ads-IFNb融合構(gòu)建體的PCR引物
[0088]
[0089] l-(12)EGL4-hGH融合構(gòu)建體和lb28-hGH融合構(gòu)建體的生成
[0090] 已經(jīng)從HuDVFab-8L抗體庫（未公開，AprilBio Co.)中，分離出了 EGL4、人類抗- EGFR的Fab和lb28、人類抗-IL-lb的Fab。為了創(chuàng)建EGL4wdPEGL4Ad s，分別使用PCR引物組#5 和#6，以及#5和#31(5'-gggaagcttattaactagatttgggctcaactctcttg-3'（SEQIDN0: 51))，從EGL4cDNA的Η鏈基因，PCR擴(kuò)增Hcys和Hser。~750bp PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoR I/Hind III處 理，并且與pHEKA連接，然后轉(zhuǎn)化MC1061感受態(tài)細(xì)胞。分別使用PCR引物組#11和#32(5'_ gggctcgagttagcattcgccgcggttaaagctcttt-3'（SEQIDN0:52))，H&#11^P#33(5'-gggctcgagttagctttcgccgcggttaaagctcttt-3 '（SEQ ID NO: 53))，從EGL4cDNA的L鏈基因， PCR擴(kuò)增Leys和Lser。它們經(jīng)BamH I/Xho I切割，并且分別克隆到含EGL4的Hcys或Hser的 pHEKA中。為了創(chuàng)建EGL4wt-hGH融合構(gòu)建體，用于生成HcysG/Lcys構(gòu)建體的克隆程序如下。使 用一組PCR 弓丨物#5^P#34(5'-agatccaggagctggtgcagaaccacaagatttgggctcaactctcttgtc-3'（SEQ ID N0:54))，從EGL4cDNA，PCR擴(kuò)增Hcys，并且使用一組PCR引物#14和#15,從密碼子 優(yōu)化的hGH基因，PCR擴(kuò)增含接頭序列的hGH。使用一組PCR引物#5和#15,通過組合PCR將Hcys 和hGH基因連接在一起，經(jīng)EcoR I/Hind III切割，并且克隆到含EGL4的Leys的pHEKA中。為 了創(chuàng)建EGL4Ads-hGH融合構(gòu)建體，使用一組PCR引物#5和#35(5'-agatccaggagctggtgcagaaccactagatttggg ctcaactctcttgtc-3'（SEQ ID N0:55))，從 EGL4cDNA的H鏈，PCR擴(kuò)增Hser，并且還使用一組PCR引物，從密碼子優(yōu)化的HGH基因，PCR擴(kuò)增 含接頭序列的hGH。使用一組PCR引物#5和#15,通過組合PCR將Hser和hGH基因連接在一起， 經(jīng)EcoR I/Hind III切割，并且克隆到含EGL4ms的Lser的pHEKA中。除了使用lb28cDNA作為 PCR模板之外，如EGL4-hGH融合物那樣，使用相同的PCR引物，創(chuàng)建lb28wt、lb28Ads、lb28 wt-hGH和lb28^ds-hGH。下面的表5中，示出了用于制備EGL4-hGH融合構(gòu)建體和lb28-hGH融合構(gòu) 建體的PCR引物。
[0091]【表5】
[0092] 用于制備EGL4-hGH融合構(gòu)建體和lb28-hGH融合構(gòu)建體的PCR引物
[0093]
[0094] 1 - (13) SDS-PAGE和蛋白印記分析
[0095] 對于SDS-PAGE分析，將純化的SL335wt-hGH蛋白和SL335 Ads-hGH蛋白重懸在有或者 沒有NuPAGE'R樣品還原劑（Invi trogen)的NuPAGE? LDS樣品緩沖液（Invi trogen)中，并 且以7yg/孔的濃度加載到凝膠上。使用考馬斯藍(lán)染色(Bio-Rad)，使蛋白條帶可視化。對于 蛋白印記分析，如上將500ng親和純化的SL335 wt-hGH和SL335Ads-hGH加載到每孔中，并且轉(zhuǎn) 移到硝酸纖維素膜上。使用在含0.01%T Ween(Sigma-Aldrich)的I?S中的3%脫脂奶(Bio-Rad)對膜進(jìn)行封閉，然后通過與綴合AP(B ethyl)的山羊抗人κL鏈的pAb孵育，來檢測蛋白。 將氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽(BCIP)底物(Duchefa)添加到膜 上，以使結(jié)合信號可視化。 _6] 1-(14)基于芯片的毛細(xì)管電泳
[0097] 使用Agilent 2100生物分析儀系統(tǒng)（Agilent Technologies,圣克拉拉（Santa Clara)，CA，USA)，進(jìn)行基于芯片的毛細(xì)管電泳。按照制造商的方案制備蛋白樣品，并且在 Protein 80試劑盒上進(jìn)行分析，其中Protein 80試劑盒被推薦用于分析5~80kDa的蛋白。 簡單來講，在分別用于還原或非還原電泳的有或沒有DTT的情況下，將樣品與樣品緩沖液混 合。使樣品在95°C變性，并且加載到已填充了包含熒光染料和凝膠溶液的適當(dāng)試劑的芯片 上。然后，將芯片插入系統(tǒng)中，并且在系統(tǒng)上使用Expert 2100軟件運(yùn)行。標(biāo)繪結(jié)果，以反映 針對蛋白大小的熒光強(qiáng)度單位。
[0098] 1-(15)MALDI_T0F 質(zhì)譜分析法
[0099] 在 Autoflex III Smartbeam 裝置（（Bruker Daltonics，比勒利卡（Billerica)， ΜΑ，USA)上，進(jìn)行MALDI -T0F質(zhì)譜分析法。將樣品與相同體積的MALDI基質(zhì)（1 Omg/mLa-氰基-4 -羥基肉桂酸）混合，并且點(diǎn)在MALDI靶標(biāo)板上。使用肽和蛋白MALDI-MS校準(zhǔn)試劑盒 (Peptide and Protein MALDI-MS Calibration Kit,Sigma-Aldrich)，進(jìn)行外部校準(zhǔn)。在 正離子模式下，分別為SL3 35wt-hGH融合物和SL335Ads-hGH融合物獲取m/z范圍為 15000160000 和 1000070000 的質(zhì)譜。
[0100] 1-(16)體外hGH生物活性的測定
[0101] 使Nb2-ll大鼠淋巴瘤細(xì)胞(Sigma-Aldrich)在37°C，潮濕的5%C02培養(yǎng)箱中，生長 在添加有5%馬血清（3丨8111&-41(14(^)和1%青霉素鏈霉素（11^丨讓(^611)的完全01^1中 (Tanakaet al ·，1980)。將細(xì)胞用DMEM沖洗兩次，在1，000g離心5min，并且以8 X 104細(xì)胞/ml 重懸在含5% (v/v)馬血清的DMEM中。將50yg等份的細(xì)胞懸浮液添加到96孔板的每一孔中， 并且孵育過夜。然后，使用在含5 %馬血清的50ml DMEM中的、濃度逐漸增加的（0~20nM) Growtropin? (未改性的rhGH;Dong_A Pharmaceuticals，首爾，韓國）或SL335 Ads_hGH，在 3 7 。(:處理細(xì)胞48h。孵育之后，將10μ1 CCK-8(Dojindo,益城町(Mashiki-machi)，日本)添加到 每一孔中，并且孵育4h。在酶標(biāo)儀(Bio-Rad)上，記錄波長450nm處的吸光度。
[0102] 1-(17)SL335 A ds-hGH的血清穩(wěn)定性
[0103] 將SL335w4PSL335Ads-hGH( 10μg/ml終濃度）重懸在含0.03 %疊氮化鈉的胎牛血清 (FBS) (Thermo Scientific，沃爾瑟姆(Waltham)，MA,USA)中，并且在37°C解育16天。每天米 集少量等份樣品（50ml)，并且在使用之前儲存在-20°C。通過ELISA確定對HSA的結(jié)合反應(yīng) 性，并且如上所述，使用Nb2-ll細(xì)胞(Sigma-Aldrich)測量hGH體外生物活性。
[0104] 1-(18)體內(nèi)藥代動力學(xué)測定
[0105] 在有資質(zhì)的CR0公司（ChemOn，水原市（Suwon)，韓國）中，進(jìn)行了PK研究。以嚙齒動 物顆粒飼料的標(biāo)準(zhǔn)飲食和任意飲水條件下飼養(yǎng)動物，并將動物飼養(yǎng)在恒濕和恒溫的、具有 受控照明（12h照明，然后是12h黑暗）的房間中。簡單來講，以lmg/kg的量，分別將SL335和 Neg Fab(不相關(guān)的人類Fab)靜脈內(nèi)（IV)或皮下（SC)注射到Sprague Dawley大鼠體內(nèi)，每組 三只，并且在幾個時(shí)間點(diǎn)（對于I.V.為5min、15min、30min、lh、2h、4h、8h、24h、48h、96h和 14411 ;而對于5.(：.為5111丨11、15111丨11、3〇111丨11、111、211、411、811、2411、4811和9611)獲得血清樣品。分別 使用小鼠抗人IgG Fd的mAb和綴合HRP0的山羊抗人kL鏈的pAb作為捕獲抗體和檢測抗體，通 過夾心法ELISA，測量血清樣品中的SL335和Neg Fab的濃度。在測定中還包括已知濃度的人 類Fab片段，以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用WinNonlin軟件使（SL335和Neg Fab)血清濃度相對于時(shí) 間的曲線擬合為非房室模型，并且使用Sigma Plot軟件進(jìn)行繪制。類似地，分別將 Growlropin?和SL335Ads-hGH靜脈內(nèi)或皮下注射到大鼠的體內(nèi)，每組三至四只。對于I. V.給 藥，Growiropin?·和SL335Ads-hGH的劑量是0 · 3mg/kg，而對于S · C ·給藥，Growtropin?'和 SL335Ads-hGH 的劑量是 0.6mg/kg。在幾個時(shí)間點(diǎn)（對于 Grovvlropin龍為 5min、15min、30min、 111、211、311、411、611和811，而對于51^335^(^-116!1為5111丨11、3〇111丨11、111、211、411、811、2411、4811、9611和 144h)，獲得血清樣品。使用hGH ELISA檢測試劑盒(Genway，圣地亞哥（San Diego)，CA，USA) 測量血清樣品中的Growtropin?的量，并且使用如上所述的夾心法ELISA測量SL335A ds-hGH 的量。使用Phoenix? WinNonlin軟件(6.2版），使血清濃度相對于時(shí)間的曲線擬合為單房室 模型。
[0106] 1-(19)體內(nèi)藥效學(xué)測定
[0107] 如前所述，在ChemOn，使用S. C.給藥，在垂體切除的大鼠中分析GiOwtropin?每日 給藥量和SL335Ads-hGH-周一次給藥量在促進(jìn)體重增加中的能力（參見Clark et al.， (1996)J. Biol. Chem. 271,21969-21977)。簡單來講，購買垂體切除的 Sprague Dawley 幼小 大鼠（Harlan，東京，日本），并且在手術(shù)之后的第一個15天中增重超過7g的所有動物從研究 中排除。將動物隨機(jī)分成5個處理組(僅賦形劑，每日注射0.3mg/kg.Gf〇_wtr〇piti?_，和一周注 射一次0 · 6mg/kg、1 · 2mg/kg或2 · 4mg/kg SL335Ads_hGH)。在起始給藥方案之后，每天記錄體 重。使用骨卡尺，仔細(xì)測量脛骨的生長。使用方差分析，然后進(jìn)行鄧尼特多重比較檢驗(yàn) (DunnettsMultiple Comparison Test)來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，而且認(rèn)為p值小于0.05是具有 顯著性的。
[0108] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0109] 2-(1)抗-SA的Fab克隆的分離
[0110]在pH 6或pH 7.4的條件下，針對綴合有人類SA、大鼠 SA或小鼠 SA的磁珠，選擇 HuDVFab-8L抗體庫。在三輪生物淘選之后，進(jìn)行單克隆噬菌體ELISA，以鑒定出對抗原具有 特異性的噬菌體抗體克隆。通過ELISA鑒定出超過60個陽性克隆(數(shù)據(jù)未示出），并且對V H和 Vl基因進(jìn)行DNA測序分析，鑒定出8個離散的噬菌體抗體，分別稱為SA138、SA139、SA140、 3八141、31^18、31^301、31^310和31^335。通過在？!16或？!17.4的條件下，進(jìn)行單克隆噬菌體 ELISA，確認(rèn)這些克隆與人類SA、大鼠 SA、小鼠 SA或牛SA的結(jié)合反應(yīng)性（圖1 A&圖1B)。不管pH 條件如何，三個噬菌體抗體克隆SA138、SA139和SA141都僅對人類SA有反應(yīng)性。SA140僅在pH 7.4下識別人類SA，但它在pH 6下結(jié)合反應(yīng)性消失。另一方面，SL18、SL310和SL335在兩種pH 條件下都與人類SA、大鼠 SA和小鼠 SA結(jié)合，但具有稍微不同的強(qiáng)度。SL301在兩種pH下與人 類SA和大鼠 SA具有顯著反應(yīng)性，而僅在pH 7.4下與小鼠 SA的反應(yīng)性弱。八個Fab克隆全部對 牛SA沒有反應(yīng)性。因?yàn)閷碜灾辽賰煞N不同物種的SA具有交叉反應(yīng)性，而對SL18、SL301、 SL310和SL335進(jìn)行了進(jìn)一步表征。將四個噬菌體抗體克隆的Fd鏈和L鏈基因亞克隆到pHEKA 載體中，用于在大腸桿菌E.coli中進(jìn)行細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)，并且由培養(yǎng)上清液或細(xì)胞周質(zhì)提取 物制備可溶性Fab片段。在進(jìn)行親和純化之后進(jìn)行ELISA，以對比這些片段在pH 6(圖2A)和 pH7.4 (圖2B)的條件下，對人類SA、大鼠 SA或小鼠 SA的結(jié)合反應(yīng)性。將濃度為5μg/ml的HSA、 RSA、MSA或BSA固定在微量滴定板的每一個孔中，并且允許四種純化的Fab分子（SL18、 SL301、SL310和SL335)在pH 6(圖2A)和pH7.4(圖2B)下與抗原結(jié)合。使用綴合有HRP0的山羊 抗人KL鏈的pAb作為第二抗體。使用TMB底物使結(jié)合信號可視化，并且使用ELISA酶標(biāo)儀 (Bio-Rad)測量450nm處的吸光度。數(shù)據(jù)表示三次實(shí)驗(yàn)的平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差。在與人類SA結(jié)合 中，結(jié)合信號的順序在pH 6和pH 7.4下都是SL335>SL310>SL301>SL18。在大鼠 SA結(jié)合中，順 序在pH 6下是SL335>SL310>SL301>SL18,而在pH 7.4下是SL335 = SL310>SL301 = SL18。在 小鼠 SA結(jié)合中，順序在pH 6下是SL18>SL335>SL310,而在pH 7.4下是SL335>SL310>SL18。從 圖2看出，SL301在pH 6下不與小鼠 SA結(jié)合，而且在pH 7.4下結(jié)合非常弱。發(fā)現(xiàn)不管pH條件如 何，在四種Fab克隆中，都是SL335與人類SA和大鼠 SA結(jié)合最好。SL335與人類SA的結(jié)合強(qiáng)度 在pH 6下是其在pH 7.4下的兩倍(50%結(jié)合信號為20ng/ml vs.40ng/ml)，是相同pH條件下 與大鼠 SA結(jié)合強(qiáng)度的20倍(50%結(jié)合信號為20ng/ml vs.400ng/ml)，并且在pH 7.4下是與 大鼠 SA結(jié)合強(qiáng)度的4倍(50 %結(jié)合信號為40ng/ml vs. 160ng/ml)。
[0111] 2-(2)SL335的交叉反應(yīng)性和結(jié)合親和力
[0112] 因?yàn)镾L335是四種抗人類SA的Fab克隆中最好的結(jié)合物，因此通過ELISA進(jìn)一步分 析了它的交叉反應(yīng)性。如圖2所示，再現(xiàn)了與人類SA、大鼠 SA和小鼠 SA的結(jié)合反應(yīng)性。還發(fā) 現(xiàn)，SL335高度識別食蟹猴SA，但與犬SA的結(jié)合較弱。另外，SL335不識別兔SA，以及其它包括 EGFR、EpCAM、IL-15Ra、IL-lb、CD16a或c-MET的不相關(guān)的抗原。經(jīng)由生物膜干涉法，通過使不 同濃度的抗原通過涂敷有SL335的生物傳感器(參見下面的表6)，進(jìn)一步測量了SL335在pH 6或pH 7.4下對人類SA、大鼠 SA和小鼠 SA的結(jié)合親和力。結(jié)果與圖2中的ELISA數(shù)據(jù)的相關(guān)性 很好，其中SL335對HSA的解離常數(shù)在pH 6下是9nM且在pH 7.4下是13nM，對RSA的解離常數(shù) 在口!16和?!17.4下分別是12211]\1和6511]\1。31^35對134的結(jié)合親和力在?!16下約是1〇111]\1且在 pH 7.4下約是1.6mM，但是這些數(shù)據(jù)由于缺少可靠性而沒有示于表6中。
[0113] 【表6】
[0114] 通過生物膜干涉結(jié)合測定對SL335和HserG/Lser的結(jié)合親和力的確定 「01151
[0116] 使用Octet QK軟件包，計(jì)算結(jié)合動力學(xué)和解離動力學(xué)。
[0117] 2_(3)SL335的體內(nèi)藥代動力學(xué)
[0118] 在所有的血漿蛋白中，HSA在FcRn介導(dǎo)的再循環(huán)機(jī)制中具有格外長的半衰期，并且 通常用作延長治療蛋白的半衰期的融合伴侶。此外，與血清白蛋白相關(guān)的抗體片段已知具 有延長的血清半衰期。因此，進(jìn)行了藥代動力學(xué)分析，以證實(shí)SL335是否也具有長的血清半 衰期。使用了具有未知結(jié)合特異性的人類Fab作為陰性對照（Neg Fab)。分別將lmg/kg的 SL335和Neg Fab靜脈內(nèi)或皮下注射到大鼠體內(nèi)，每組三只，并且在幾個時(shí)間點(diǎn)(對于I.V.為 5min、15min、30min、lh、2h、4h、8h、24h、48h、96h和 144h，并且對于S.C.為5min、15min、 30min、lh、2h、4h、8h、24h、48h和96h)收集血清樣品。分別使用小鼠抗人IgG Fd的mAb和綴合 HRPO的山羊抗人kL鏈的pAb作為捕獲抗體和檢測抗體，通過夾心法ELI SA，測量血清樣品中 的SL335和Neg Fab的濃度。在測定中還使用已知濃度的人類Fab片段，以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。使 用WinNonlin軟件使血清濃度對時(shí)間的曲線擬合為單房室模型（SL335和Neg Fab)，并且使 用Sigma Plot軟件使其擬合為雙房室模型。在靜脈內(nèi)給藥中，SL335的末期半衰期（t1/2)是 37h，并且其曲線下面積(AUCo·^?)是187h mg/ml，這表示與Neg Fab(分別為3.8h mg/ml和7h mg/ml)相比，t1/2的增加為其10倍，而AUCh的增加為其26倍（圖3AKSL335的皮下注射產(chǎn)生 了類似的測量結(jié)果，包括與Neg Fab相比，t1/2的增加是其9倍（120h vs.l3h)，而AUCh的增 加是其44倍(87vs. 2h mg/ml)(圖3B)。這些結(jié)果清楚地示出SL335具有延長的血清半衰期， 并且暗示了 SL335在大鼠中不會干擾RSA與FcRn之間的相互作用。
[0119] 2-(4)SL335-hGH 融合物的產(chǎn)生
[0120] 通過將重組的hGH(27~191aa)經(jīng)由短的肽接頭，基因融合至Fd或L鏈的N-末端或 C-末端，而使用SL335來創(chuàng)建兩種SL335-hGH融合物和四種額外的SL335-hGH融合物。將重組 的hGH cDNA(27~191aa)經(jīng)由短的肽接頭，融合至經(jīng)典Fab形式的SL335wj^H鏈或L鏈的C-末 端，從而產(chǎn)生兩種融合類型（HcysG/Lcys和LcysG/Hcys)的構(gòu)建體。除了使用無效形式 (SL335通)的SL335或ds Fab形式(SL335ms)(其中Ch^C-末端的Cys233和/或CLk的C-末端的 Cys214被替換成Ser)之外，與上面一樣，構(gòu)建了四種額外的融合類型(HserG/Lcys、LserG/ Hcys、HserG/Lser和LserG/Hser)。對于融合蛋白的細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)，將ompA (MKKTAIAIAVLAGFATVAQA(SEQ ID No:56))前導(dǎo)序列置于L鏈或L-hGH融合物的上游，并且將 pelB前導(dǎo)序列(MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA(SEQ IN No:57))置于Η鏈或H-hGH融合物的上游。 在這些預(yù)備實(shí)驗(yàn)中，hGH與Fd鏈或L鏈的N-末端的基因連接，導(dǎo)致可溶性融合蛋白的低表達(dá) 或不表達(dá)。hGH與Fd的C-末端的融合也示出低表達(dá)量，并且似乎中斷了hGH結(jié)構(gòu)域的折疊，這 很可能是由于SL335-hGH融合物中的異常二硫鍵合導(dǎo)致的（數(shù)據(jù)未示出）。之前報(bào)道了通過 突變C H1和CLk中的C-末端Cys殘基(分別為Cys233和Cys214)而去除Fab的鏈間二硫鍵，不影響 細(xì)胞周質(zhì)生產(chǎn)水平、提取和純化的穩(wěn)定性、血清穩(wěn)定性或血清半衰期（參見Kabat et al.， (1991(Sequences of Proteins of Immunological Interest；Humphreys et al.,(1997) J. Immunol.Methods.209,193202；Humphreys et al.,(2007)Protein Eng Des Sel.20, 227234)。通過將 Chi 的 Cys233 和 CLk 的 Cys214 都替換成絲氨酸（Cys233Ser233 和 Cys214Ser214 取 代），我們測試了 SL335中的這些Cys殘基是否調(diào)節(jié)SL335-hGH融合物的可溶性表達(dá)和適當(dāng)?shù)?折疊。圖4例示了六種SL335-hGH融合構(gòu)建體。除了 SL335w4PSL335Ads之外，還通過將Chi的 Cys233或Cu的Cys214取代成Ser，以分別說明每一個半胱氨酸殘基(Cys 233或Cys214)的效果，而 創(chuàng)建了被稱為SL335通的又一種SL335變體。兩種SL335 wt融合衍生物是HcysG/Lcys (與 LCys214 配對的 HCys233_hGH 融合物）和LcysG/Hcys (與HCys233配對的 LCys214_hGH 融合物），兩 種SL335通融合衍生物是HserG/Lcys (與LCys214配對的HSer233-hGH融合物）和LserG/Hcys (與HCys233配對的LSer214-hGH融合物）。最后，兩種SL335^ds融合衍生物是HserG/Lser (與 LSer214 配對的 HSer233-hGH 融合物)和 LserG/Hser (與 HSer233 配對的 LSer214-hGH 融合物）。在 大腸桿菌E. coli SUPEX5宿主細(xì)胞中表達(dá)這六種SL335-hGH融合構(gòu)建體，并且通過ELISA分 析這六種SL335-hGH融合蛋白在培養(yǎng)上清液中的產(chǎn)量和HSA-結(jié)合反應(yīng)性。在存在IPTG的相 同條件下，使表達(dá)SL335-hGH融合蛋白的大腸桿菌E.coli克隆生長，并且通過簡單的離心收 獲培養(yǎng)上清液。使用小鼠抗人Fd的mAb作為捕獲Ab并且使用綴合HRP0的山羊抗人kL鏈的pAb 作為檢測抗體，通過夾心法ELISA，測量可溶性SL335-hGH融合物的濃度（圖5A)。沒有檢測到 來自LcysG/Hcys或LserG/Hcys的可溶性Fab形式。盡管沒有示出數(shù)據(jù)，但是使用大腸桿菌 E.coli細(xì)胞裂解液進(jìn)行的蛋白印記顯示出，F(xiàn)d的Cys233對重鏈降解和不分泌Fd片段負(fù)責(zé)，這 很可能是由于蛋白聚集導(dǎo)致的。HcysG/Lcys的產(chǎn)量是0.5μg/ml，并且HserG/Lcys和LserG/ Hser的產(chǎn)量分別為約1.8μg/ml和1.4μg/ml(圖5A)。有趣地是，HserG/Lser的產(chǎn)量是約4yg/ ml，為HcysG/Lcys產(chǎn)量的8倍。細(xì)胞周質(zhì)提取物示出相同的表達(dá)模式，但是總產(chǎn)量僅為在培 養(yǎng)上清液中存在的產(chǎn)量的~30% (數(shù)據(jù)未示出）。在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，證實(shí)了在HcysG/Lcys和 HserG/Lser之間產(chǎn)量的差異不依賴于大腸桿菌E.coli克隆的克隆變異或生長速率。使用包 被有5μg/ml HSA的微量滴定板，與含SL335-hGH融合物的培養(yǎng)上清液的系列稀釋液孵育，來 對比SL335-hGH融合物與HSA的結(jié)合反應(yīng)性。然后，使用綴合HRP0的山羊抗-人的kL鏈的pAb， 檢測與HSA結(jié)合的SL335-hGH融合物。如預(yù)期的那樣，使用抗-人kL的pAb檢測與HSA結(jié)合的 HserG/Lser產(chǎn)生的結(jié)合信號是HcysG/Lcys的8倍，并且是HserG/Lcys和LserG/Hser的結(jié)合 信號的約4倍（圖5B)。當(dāng)使用T-20、對hGH的C-末端具有特異性的山羊pAb來檢測SL335-hGH 融合物時(shí)，也觀察到了類似的結(jié)合信號模式（圖5C)。但是，在使用對全長hGH具有特異性的 小鼠 mAb NYThGH檢測時(shí)，HserG/Lser產(chǎn)生的結(jié)合信號是HserG/Lcys和LserG/Hser的30倍， 并且是HcysG/Lcys的結(jié)合信號的60倍（圖5D)，這暗示SL335中存在的鏈間二硫鍵干擾了 NYThGH與HcysG/Lcys的hGH結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。因?yàn)镠cysG/Lcys和HserG/Lser分別表示利用 SL335w4PSL335Ads來創(chuàng)建SL335-hGH融合物，因此在下文中，將它們分別稱為SL335 wt-hGH融 合物和SL335Ms_hGH融合物（圖5)。
[0121] 為了確定可溶性SL335Ads-hGH融合物的高產(chǎn)量依賴于SL335中的鏈間二硫鍵的去 除、宿主大腸桿菌E.coli菌株還是誘導(dǎo)溫度，而在20°C (圖6A)、25°C (圖6B)或30°C (圖6C)， 在親本MC1061以及突變體SUTOX5細(xì)胞中表達(dá)了 SL335wt、SL335Ads、SL335wt-hGH融合物和 SL335Ads-hGH融合物，并且通過ELISA測量了在培養(yǎng)上清液中的Fab分子的量。在MC1061菌株 中表達(dá)的SL335 wj^產(chǎn)量在20°C是lμg/ml，這是25°C和30°C下產(chǎn)量的約3倍。這意味著，當(dāng)使 用MC1061作為宿主菌株時(shí)，低于25°C誘導(dǎo)SL335 wt是特別有利的。使用SUPEX5菌株也獲得了 類似的結(jié)果。在SL335^ds的情況中，不管宿主大腸桿菌E.coli菌株和誘導(dǎo)溫度如何，在20°C 下的產(chǎn)量都約為1.3μg/ml。這些結(jié)果示出，不管大腸桿菌E.coli宿主菌株如何，F(xiàn)ab中有或 沒有鏈間二硫鍵都不顯著影響20°C下的可溶性Fab生產(chǎn)的產(chǎn)量。不管宿主大腸桿菌E.coli 菌株和誘導(dǎo)溫度如何，SL335wt-hGH融合物的產(chǎn)量都約為0.3~0.5μg/ml。另一方面，在 MC1061菌株中表達(dá)的SL335^ds-hGH融合物的產(chǎn)量在20°C和25°C下都為1.8μg/ml，在30°C下 為1.5μg/ml，這示出了較小的溫度依賴性，然而，在SUPEX5菌株中表達(dá)的SL335 Ads-hGH融合 物的產(chǎn)量在20°C和25°C下都為4.0μg/ml，在30°C下為3.5μg/ml。這些結(jié)果意味著，利用 SL335^ds形式和大腸桿菌E.coli SUPEX5菌株所獲得的SL335-hGH融合蛋白產(chǎn)量是以 SL335wt形式和大腸桿菌E.coli MC1061菌株的組合所獲得的產(chǎn)量的12倍。
[0122] 2-( 5) SL335-GCSF、SL335-IFNb、EGL4-hGH 和 lb28-hGH 融合構(gòu)建體的生成
[0123] 為了證明FalMds形式和SUPEX5菌株對改善Fab-效應(yīng)物融合蛋白的可溶性表達(dá)的有 利效果，而生成了多種Fab-效應(yīng)物融合構(gòu)建體。首先，以與生成SL335 wt-hGH和SL335Ads-hGH 融合物相同的方式，創(chuàng)建了兩種SL335-GCSF融合物變體(被稱為SL335wt-GCSF的HcysGCSF/ Leys，被稱為SL335^ds-GCSF的HserGF/Lser)和兩種SL335-IFNb融合物變體（被稱為 SL335wt-IFNb的HcysIFNb/Lcys，被稱為SL335^ds-IFNb的HserIFNb/Lser)，以確定效應(yīng)物結(jié) 構(gòu)域的影響。將誘導(dǎo)溫度設(shè)置為最優(yōu)化的20°C，并且通過ELISA對比這些融合蛋白在大腸桿 菌E.coli培養(yǎng)上清液中的表達(dá)量。SL335 wt-GCSF在MC1061和SUPEX5中的產(chǎn)量分別為0.3mg/ ml和0 · 6mg/ml，并且SL335Ms-GCSF在MC1061和SUPEX5中的產(chǎn)量分別為0 · 6mg/ml和 1 · 5mg/ml (圖7A)。另外，SL335wt-IFNb在MC1061 和SUPEX5中的產(chǎn)量都約為0 · 16mg/ml，并且SL335Ads-IFNb在MC1061和SUPEX5中的產(chǎn)量分別為0 · 2mg/ml和0 · 5mg/ml (圖7B)。因此，SL335Ads-GCSF 融合物和SUPEX5菌株的組合的SL335-GCSF融合物產(chǎn)量是SL335wt-GCSF融合物和MC1061的組 合的5倍，并且SL335 Ads-IFNb融合物和SUPEX5菌株的組合產(chǎn)生的SL335-IFNb融合物形式的 量是SL335wt-IFNb融合物和MC1061菌株的組合的約3倍。其次，我們還使用EGL4(人抗-EFGR 的Fab)和lb28(人抗-IL-lb的Fab)創(chuàng)建了兩種Fab-hGH融合構(gòu)建體，以確定Fab的影響。以與 生成SL335 wt-hGH和SL335^ds-hGH融合物相同的方式，兩種EGL4-hGH融合構(gòu)建體是HcysG/ Leys類型的EGL4wt-hGH融合物和HserG/Lser類型的EGL^ds-hGH融合物。同樣，lb284-hGH融 合構(gòu)建體是HcysG/Lcys類型的lb28 wt-hGH融合物和HserG/Lser類型的lb28Ads-hGH融合物。 EGL4wt-hGH融合物在MC1061和SUPEX5菌株中的產(chǎn)量是8090ng/ml，并且EGL4^ds-hGH融合物 在MC1061菌株中的產(chǎn)量是140ng/ml，而在SUPEX5菌株中的產(chǎn)量是220ng/ml (圖8A)，這指示 EGL^ds-hGH融合物和SUPEX5宿主細(xì)胞的組合在培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生的EGL4-hGH融合蛋白的 量是EGL4wt-hGH融合物和MC1061宿主細(xì)胞的組合的2.4倍。在lb28-hGH融合構(gòu)建體的情況 中，lb284 wt-hGH融合物的產(chǎn)量在MC1061菌株中是50ng/ml，并且在SUPEX5菌株中的產(chǎn)量是 100ng/ml，lb28^ds-hGH融合物在MC1061菌株中的產(chǎn)量是900ng/ml，并且在SUPEX5菌株中的 產(chǎn)量是4mg/ml (圖8B)，這指示lb28Ads-hGH融合物和SUPEX5宿主細(xì)胞的組合在培養(yǎng)上清液中 產(chǎn)生的lb28-hGH融合物形式的量是lb28 wt-hGH融合物和MC1061宿主細(xì)胞的組合的800倍。
[0124] 2-( 6) SL335wt-hGH 和 SL335Ads-hGH 的分子特征
[0125] 進(jìn)一步描述了 SL335wt-hGH和SL335^ds-hGH融合物在分子水平上的特征。在培養(yǎng)上 清液中的融合蛋白穿過包被有HSA的樹脂進(jìn)行親和純化，并且通過在還原和非還原條件下 的SDS-PAGE和蛋白印記進(jìn)行分析。使用HSA-固定的瓊脂糖珠子，從培養(yǎng)上清液中親和純化 HcysG/Lcys (泳道1)和HserG/Lser (泳道2)，并且使用4-12%Bis_Tris凝膠，在還原或非還 原條件下進(jìn)行SDS-PAGE。使用考馬斯藍(lán)染色（圖9A)使蛋白條帶可視化。將各SDS-PAGE的蛋 白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，并且使用綴合AP的山羊抗-人kL的Ab，檢測Leys和Lser(圖9B)。 使用NBT/BCIP底物，使結(jié)合信號可視化。在SDS-PAGE分析中，在還原條件下，SL335 wt-hGH和 SL335Ads-hGH都產(chǎn)生了分別對應(yīng)于Fd-hGH融合物和L鏈的，大小為46kDa和23kDa的兩條主要 蛋白條帶。正如所預(yù)期的那樣，在非還原條件下，由于沒有鏈間二硫鍵，SL335 Ads-hGH產(chǎn)生了 兩條相同的蛋白條帶。在SL335wt-hGH的情況下，可看到對應(yīng)于SL335 wt-hGH的正確異二聚體 形式的主要的70kD蛋白條帶。然而，還發(fā)現(xiàn)了很多不同大小的SL335wt-hGH衍生物，包括 24kDa~45kDa的四條明顯的未知蛋白條帶，和大小對應(yīng)于lOOkDa和135kDa的少數(shù)幾個弱蛋 白條帶。從所有樣品中，都可以看到大小為15kDa和12.5kDa的蛋白。然后，使用抗人Fd的 mAb、抗-kL鏈的pAb和抗-hGH的pAb T-20,進(jìn)行蛋白印記分析。在非還原條件和還原條件下 (數(shù)據(jù)未示出），使用抗-人Fd的mAb進(jìn)行的印記，僅檢測到大小為46kDa的HcysG和HserG。另 一方面，在非還原條件下（圖9B)，通過抗-kL鏈的pAb全部檢測到SL335 wt-hGH樣品中的24kDa ~45kDa的四條蛋白條帶，以及比70kDa大的那些蛋白條帶。這一結(jié)果指示，L鏈的Cys214至少 經(jīng)由形成異常二硫鍵，而對多種多聚體L鏈的形成負(fù)責(zé)。在非還原條件下（圖9C)，使用T-20 抗-hGH的pAb進(jìn)行印記，正確識別出SL335 wt-hGH的70kDa異二聚體形式，和SL335Ads-hGH的 ~45kDa的單體HerG。通過這些抗體的任意一種都沒有檢測到大小為15kDa和12.5kDa的蛋 白，這暗示它們是來自融合物的降解產(chǎn)物，或者是來自大腸桿菌E.coli宿主蛋白的污染物。
[0126] 基于芯片的毛細(xì)管電泳證實(shí)了SDS-PAGE分析。使用用于還原或非還原電泳的、有 或沒有DTT的樣品緩沖液，來制備HcysG/Lcys(圖10A)和HserG/Lser(圖10B)，并且按照制造 商的方案，使用蛋白80(Protein 80)試劑盒，經(jīng)Agilent 2100生物分析儀系統(tǒng)，進(jìn)行基于芯 片的毛細(xì)管電泳。繪制結(jié)果以反映針對蛋白大小的熒光強(qiáng)度單位。在非還原條件下， SL335wt-hGH產(chǎn)生了大小在27 . lkDa~52.4kDa范圍內(nèi)的SL335wt-hGH衍生物，而這些衍生物 中有很多在有DTT的還原條件下消失了（圖10A)。除了在分子量上有較小變化之外， SL335Ms_hGH在非還原條件和還原條件下，幾乎產(chǎn)生了相同的蛋白質(zhì)峰（圖10B)。
[0127] 使用MALDI-T0F質(zhì)譜分析法，進(jìn)一步分析了 SL335wt-hGH和SL335^ds-hGH。在 Autoflex III Smartbeam裝置（Bruker Daltonics,比勒利卡（Billerica)，MA,USA)上，進(jìn) 行了MALDI-T0F質(zhì)譜分析法。將親和純化的HcysG/Lcys(圖11A)和HserG/Lser(圖11B)與 MALDI基質(zhì)混合，并且獲取正離子模式的、在10000~150000Da的m/z范圍中的譜圖。獲取 SL335Ads-hGH的、在10000~70000的m/z范圍中的質(zhì)譜。獲得SL335wt-hGH的、在15000~ 160000的m/z范圍中的質(zhì)譜，因?yàn)槿鐖D8A所示，SL335 wt-hGH樣品示出了大于70kDa的蛋白條 帶。鑒定出 Lcys、HcysG 和 SL335wt-hGH 的分子質(zhì)量分別為 23,226Da、46226Da 和 69,837Da(圖 11八）。比正確的51^335#-116!1大的三個離散蛋白的大小為92,824〇3、117,455〇3和139,347〇3。 在SL335 Ads-hGH的情況中，鑒定出Lser和HserG的分子質(zhì)量分別為23,334Da和46,667Da(圖 11B)。與Lser相比，HserG的低峰可能表示了較大分子的較低電離效率，或者樣品中存在比 Ls er低的Hs erG的摩爾比率。
[0128] 通過使用FPLC，通過SephacrylS-200HR柱，進(jìn)一步純化經(jīng)親和純化的SL335 Ads_ hGH。在使用Sephacryl? S-200HR預(yù)填充柱和AKTA FPLC(GE Healthcare,沃瓦托薩 (Wauwatosa)，WI，USA)進(jìn)行了親和純化之后，進(jìn)行HserG/Lser的凝膠過濾。使用平衡緩沖液 (含150mM NaCl的20mM HETOS pH 7.4)對柱子進(jìn)行平衡，并且加載經(jīng)親和純化的此6"/ Lser。使用平衡緩沖液，以0.5ml/min的運(yùn)行流速進(jìn)行洗脫。箭頭指示選定用于SDS-PAGE分 析的組分（圖12A)。在還原條件下，通過4-12%Bi S-Tris凝膠，分析了從兩個不同峰取得的 組分#13、#16、#19和#23(圖12B)。使用考馬斯藍(lán)染色，使蛋白條帶可視化。對應(yīng)于約66kDa和 25kDa的兩個峰由來自#12~#27的組分可視化（圖9A)。然后，在還原條件下，通過SDS-PAGE 分析了四種組分(組分#13、#16、#19和#23)，以確定組分中的蛋白內(nèi)容物（圖9B)。結(jié)果示出 了，來自66kDa峰的組分(組分#13、#16和#19)含有異二聚體SL335^ds-hGH，而來自25kDa峰的 組分(組分#23)主要含有單體Lser。
[0129] 2_(7)SL335 A ds-hGH的體外功能表征
[0130] 為了確定去除hGH的融合物和SL335wt中的鏈間二硫鍵是否影響HSA或RSA的結(jié)合親 和力，在pH 6和pH 7.4條件下，使用31^335^5-1^!1進(jìn)行了生物膜干涉測定(參見下面的表6)。 SL335Ads-hGH與HSA的解離常數(shù)在pH 6下是1·7ηΜ且在pH 7.4下是1·5ηΜ，顯示出SL335Ads-hGH與HSA的親和力分別是SL335的5倍和8.7倍。SL335 Ads-hGH與RSA的解離常數(shù)在pH 6下為 499nM且在pH 7.4下是83.6nM，顯示出SL335^ds-hGH與RSA的親和力的減小相對于SL335分別 是4.2倍和1.3倍。
[0131] 還使用Nb2-ll大鼠淋巴瘤細(xì)胞，測量了 SL335ds-hGH的體外hGH活性，其中Nb2-ll大 鼠淋巴瘤細(xì)胞經(jīng)hGH處理，以濃度依賴的方式進(jìn)行增殖。將Nb2-11大鼠淋巴瘤細(xì)胞以8 X 104 細(xì)胞/ml的濃度重懸在含5 % (v/v)馬血清的DMEM中，并且將50μ1等份的細(xì)胞懸浮液添加到 96孔板的每一孔中，然后孵育過夜。然后，使用在含5% (v/v)馬血清的DMEM中的、濃度漸增 的GrowiropinK或HserG/Lser，在37 °C對細(xì)胞處理48h。在孵育之后，將10ylCCK-8溶液添加 到每一孔中，并且將細(xì)胞孵育4h。在酶標(biāo)儀上，記錄450nm波長處的吸光度。數(shù)據(jù)表示三次實(shí) 驗(yàn)的平均值SD。在沒有HSA時(shí)，SL335 Ads-hGH能夠刺激Nb2-11的生長，具有50pM(3.5ng/ml)的 明顯的EC5Q(圖13A)。該值與rhGH標(biāo)準(zhǔn)（7.5pM)Growtropin?的有效性相比減小的倍數(shù)為6.7 倍。在有10mM HSA時(shí)，Grovvtropin?·和SL335Ads-hGH各自的效能很大程度上沒有受到影響， 雖然與Grovvtropin?相比，SL335△ds-hGH的效能表現(xiàn)出約5倍的降低（圖13B)。用作陰性對照 的SL335沒有示出任何增殖效果。這些結(jié)果清楚地證明，SL335 Ads-hGH具有hGH功能性生物活 性。
[0132] 然后，將SL335Ads-hGH在37°C孵育16天，以確定血清穩(wěn)定性。使用FBS(而不是人血 清)來重懸樣品，因?yàn)镾L335 Ads-hGH和SL335與人血清中的HSA的結(jié)合能力會使后續(xù)實(shí)驗(yàn)復(fù)雜 化。一天收集一次樣品，并且通過ELISA(圖14A)和Nb2-ll細(xì)胞增殖測定（圖14B)，分別測量 HSA-結(jié)合反應(yīng)性和體外生物活性。仍使用SL335作為對照。與SL335類似，甚至在37 °C孵育16 天之后，SL335Ads-hGH與HSA的結(jié)合反應(yīng)性以及Nb2-11增殖活性也沒有發(fā)生變化，這證明盡 管沒有鏈間二硫鍵，SL335 Ms_hGH也與SL335-樣穩(wěn)定。
[0133] 2-(8)大鼠中的藥代動力學(xué)和藥效學(xué)研究
[0134] 因?yàn)镾L335Ads-hGH示出是長效hGH的有希望的候選物，因此進(jìn)行了體內(nèi)功效研究。 首先，在單次靜脈內(nèi)或皮下注射之后，通過測量每一類似物作為時(shí)間函數(shù)的血清水平，對比 了 Growtropin?和SL335Ads_hGH在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)。向每組大鼠（一組四只），皮下注 射（圖15A)單次劑量0 · 6mg/kg的Growtropin或SAFAtropin，或靜脈內(nèi)注射（圖15B)單次劑量 0 · 3mg/kg的Growtropin或SAFAtropin。取決于蛋白，在延伸至144h的期間，間隔采集血清樣 品。如上所述，通過ELI SA，以所示次數(shù)分析Growtropin?或S AFAtropinK的血清樣品。藥代 動力學(xué)參數(shù)示于表7中。
[0135] 【表7】
[0136]大鼠體內(nèi)，Growtropin或SAFAtropin的單次靜脈內(nèi)或皮下注射給藥的藥代動力學(xué) 參數(shù)
[0137]
[0138] 示出的值是平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差。縮寫如下：Cmax:最高濃度；t1/2:末期半衰期； AUC〇^:推測至無窮大的濃度-時(shí)間曲線下面積;Cl/f:明顯的總血漿清除率。
[0139] 不論給藥途徑如何，SL335Ads_hGH都示出t1/2的大幅延長。在靜脈內(nèi)給藥中， SL335Ads_hGH的ti/2的增加是Growtropin的83倍（16.6h vs.0.2h)，在皮下給藥中，其增加是 68倍（97.2h vs.l.4h)。
[0140] 不管給藥途徑如何，與Growlropin?相比，SL335^ds-hGH的AUC〇-=〇的增加是 Growteopin?的1 〇倍，清除率(Cl/f)的減慢是Growtropin?的超過1 〇倍。對于每一組大鼠（一 組四只），通過皮下注射單一劑量的〇.6mg/kg Growtropin或SAFAtropin，或靜脈注射單一 劑量的〇.3mg/kg Growtropin或SAFAtropin給藥。取決于蛋白，在延伸至144h的使間隔中， 采集血清樣品。如上所述，通過ELISA，以所示次數(shù)分析Growtropin?或SAFAlropin?的血清 樣品。有趣地是，取決于給藥途徑，SL335 Ads-hGH的Uax值的降低分別是Growtropin'1?的6倍和 3倍。
[0141 ] 接下來，在每日S. C.給藥Growlropin?或賦形劑緩沖液對照（僅賦形劑），或一周 S. C.給藥一次SL335ds-hGH之后，對比10天中垂體切除的大鼠的生長率。垂體切除的大鼠經(jīng) 僅賦形劑處理或每日經(jīng)〇.3mg/kg Growtropin?處理，或在第〇天和第7天使用劑量漸增的 SAFAtropin?處理。實(shí)線指示體重的平均百分比變化。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。經(jīng)賦形劑處理 的大鼠示出約5 %的失重。然而，接受每天注射Growtropin? (〇. 3mg/kg)的大鼠示出5 %的體 重增加，也就是相對僅賦形劑組產(chǎn)生總共10%的體重增加。一周注射一次SL335Ms_hGH產(chǎn)生 劑量依賴性的體重增加，其中，2.4mg/kg的劑量產(chǎn)生15%的體重增加，而0.6mg/kg的劑量產(chǎn) 生3.5%的體重增加。等摩爾的31^335^ 5-1^!1(1.211^/1^)劑量方案得到5%的體重增加，這與 每日注射Growiropin?獲得的體重增加相當(dāng)。
[0142] 圖17示出了一周給藥一次0.6mg/kg SL335Ads-hGH實(shí)現(xiàn)了與每日給藥 Growtropin?等量的，脛骨長度的增加。實(shí)心棒指示測量的脛骨長度的平均值。誤差棒表示 標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0143] 【工業(yè)實(shí)用性】
[0144] 因?yàn)榭芍苽浔景l(fā)明的融合構(gòu)建體，以包括多種類型的效應(yīng)物部分(包括人類生長 激素、干擾素、促紅細(xì)胞生成素、集落刺激因子或其衍生物，以及抗體衍生物等），因此能使 用本發(fā)明來開發(fā)生物活性蛋白或多肽治療劑。
[0145] 本文中所引用的所有專利、公開申請或參考文件的教導(dǎo)都通過引用整體并入本文 中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種針對血清白蛋白（SA)的抗原結(jié)合片段(Fab)，其中，所述Fab包括： (a) 重鏈可變區(qū)（Vh結(jié)構(gòu)域），具有選自由SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6組成的組中的氨基酸序列；和 (b) 輕鏈可變區(qū)（Vl結(jié)構(gòu)域），具有選自由SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 12組成的組中的氨基酸序列， 其中，所述Fab特異性結(jié)合血清白蛋白。2. -種結(jié)合血清白蛋白（SA)的抗原結(jié)合片段(Fab )，其中，所述Fab包括： (a) 決定Vh結(jié)構(gòu)域的CDR的SEQ ID N0.13(CDR1)、SEQ ID N0.14(CDR2)和SEQ ID N0.15 (CDRl 5)的氨基酸序列；和 (b) 決定Vl結(jié)構(gòu)域的CDR的SEQ ID N0.16(CDR1)、SEQ ID N0.17(CDR2)和SEQ ID N0.18 (⑶R3)的氨基酸序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的Fab，其中，所述Vh結(jié)構(gòu)域與重鏈恒定區(qū)1(CH1結(jié)構(gòu)域)相連，并 且所述Vl結(jié)構(gòu)域與輕鏈恒定區(qū)(Ca結(jié)構(gòu)域)相連。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的Fab，其中，所述Vh結(jié)構(gòu)域具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列，并且 所述Vl結(jié)構(gòu)域具有SEQ ID NO. 12的氨基酸序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的Fab，其中，所述Ch1結(jié)構(gòu)域和所述Ca結(jié)構(gòu)域的半胱 氨酸氨基酸缺失，或者被除了半胱氨酸之外的其它任意氨基酸殘基取代，所述其它任意氨 基酸殘基包括絲氨酸。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的Fab，其中，Chi結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸氨基酸是從所述(^結(jié)構(gòu)域的 N-末端起始的第233位氨基酸，并且Ca結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸是從所述Ca結(jié)構(gòu)域的N-末端起始 的第214位氨基酸。7. -種抗原結(jié)合片段(Fab)和生物活性效應(yīng)物部分的融合構(gòu)建體，其中，所述Fab的Ch1 結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸氨基酸和Ca結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸氨基酸缺失，或者被除了半胱氨酸之外的 其它任意氨基酸殘基取代，所述其它任意氨基酸殘基包括絲氨酸;并且其中，所述生物活性 效應(yīng)物部分是蛋白或(多)肽;并且其中，所述Fab和所述生物活性效應(yīng)物部分通過基因融合 共價(jià)連接。8. -種根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的抗原結(jié)合片段(Fab)與生物活性效應(yīng)物部分 的融合構(gòu)建體，其中，所述生物活性效應(yīng)物部分是蛋白或(多)肽;并且其中，所述Fab和所述 生物活性效應(yīng)物部分通過基因融合共價(jià)連接。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的融合構(gòu)建體，其中，所述Fab和所述生物活性效應(yīng)物部分使 用0~20個氨基酸的肽接頭，通過基因融合共價(jià)連接。10. 根據(jù)權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)所述的融合構(gòu)建體，其中，所述生物活性效應(yīng)物部分是 選自由激素、細(xì)胞因子、酶、抗體、生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、血液因子、疫苗、結(jié)構(gòu)蛋白、配體蛋白 和受體組成的組中的一種。11. 根據(jù)權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)所述的融合構(gòu)建體，其中，所述生物活性效應(yīng)物部分是 選自由人類生長激素(hGH)、生長激素釋放激素(GHRH)、生長激素釋放肽、干擾素、干擾素受 體、集洛刺激因子(CSF)、膜尚血糖素樣妝、G蛋白偶聯(lián)受體、白細(xì)胞介素、白細(xì)胞介素受體、 酶、白細(xì)胞介素結(jié)合蛋白、細(xì)胞因子結(jié)合蛋白、巨噬細(xì)胞活化因子、巨噬細(xì)胞肽、B細(xì)胞因子、 T細(xì)胞因子、蛋白A、變態(tài)反應(yīng)抑制因子、細(xì)胞壞死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、腫瘤壞死因 子、腫瘤抑制子、轉(zhuǎn)移生長因子、α?-抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、載脂蛋白-E、促紅細(xì) 胞生成素、高度糖基化的促紅細(xì)胞生成素、血管生成素、血紅蛋白、凝血酶、凝血酶受體激活 肽、血栓調(diào)節(jié)蛋白、因子VII、因子Vila、因子VIII、因子IX、因子XIII、纖溶酶原激活因子、纖 維蛋白結(jié)合肽、尿激酶、鏈激酶、水蛭素、蛋白C、C反應(yīng)蛋白、腎素抑制劑、膠原酶抑制劑、超 氧化物歧化酶、瘦蛋白、血小板衍生生長因子、上皮生長因子、表皮生長因子、血管抑素、血 管緊張肽、骨生長因子、骨刺激蛋白、降鈣素、胰島素、心鈉素、軟骨誘導(dǎo)因子、依降鈣素、結(jié) 締組織活化因子、組織因子途徑抑制物、促卵泡激素、促黃體激素、促黃體激素釋放激素、神 經(jīng)生長因子、甲狀旁腺激素、松弛素、分泌素、生長調(diào)節(jié)素、胰島素樣生長因子、腎上腺皮質(zhì) 激素、胰高血糖素、膽囊收縮素、胰多肽、胃泌素釋放肽、促皮質(zhì)素釋放因子、促甲狀腺激素、 自體毒素、乳鐵蛋白、肌肉生長抑制素、受體、受體拮抗體、細(xì)胞表面抗原、病毒衍生的疫苗 抗原、單克隆抗體、多克隆抗體和抗體片段組成的組中的一種。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的融合構(gòu)建體，其中，所述生物活性效應(yīng)物部分是hGH、GCSF或 IFN013. 根據(jù)權(quán)利要求7至12中任一項(xiàng)所述的融合構(gòu)建體，其中，所述生物活性(多)肽(或蛋 白）與Fab的摩爾比在1:1至10:1之間，優(yōu)選在1:1至4:1之間。14. 一種表達(dá)載體，包括：（a)啟動子；（b)編碼權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的Fab的第一 核酸序列；和(c)編碼生物活性(多）肽或蛋白以及可選的接頭的第二核酸序列，其中，所述 啟動子、所述第一核酸序列和所述第二核酸序列被可操作地連接在一起。15. -種宿主細(xì)胞，包括權(quán)利要求14所述的表達(dá)載體。16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的宿主細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌E.coli。17. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的宿主細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞是SUPEX5(KCTC 12657BP)。18. -種提高生物活性蛋白或（多）肽在大腸桿菌E.coli的細(xì)胞周質(zhì)中的可溶性表達(dá)的 方法，所述方法包括將表達(dá)載體引入大腸桿菌E. coI i中；其中，所述表達(dá)載體包括(a)啟動 子、（b)編碼抗原結(jié)合片段(Fab)的第一核酸序列和(c)編碼接頭和生物活性(多）肽或蛋白 的第二核酸序列;其中，所述啟動子、所述第一核酸序列和所述第二核酸序列被可操作地連 接在一起;并且其中，所述Fab的Chi結(jié)構(gòu)域和C kl結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸缺失或被絲氨酸殘基取 代。19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的提高生物活性蛋白或（多)肽在大腸桿菌E. coli的細(xì)胞周質(zhì) 中的可溶性表達(dá)的方法，其中，所述大腸桿菌E. coli是SUPEX5(KCTC 12657BP)。20. -種提高生物活性蛋白或（多）肽在大腸桿菌E.coli的細(xì)胞周質(zhì)中的可溶性表達(dá)的 方法，包括將權(quán)利要求13所述的表達(dá)載體引入大腸桿菌E. col i中。21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的提高生物活性蛋白或（多)肽在大腸桿菌E. coli的細(xì)胞周質(zhì) 中的可溶性表達(dá)的方法，其中，所述大腸桿菌E. coli是SUPEX5(KCTC 12657BP)。22. 根據(jù)權(quán)利要求18至21中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述生物活性蛋白或(多）肽是選 自由激素、細(xì)胞因子、酶、抗體、生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、血液因子、疫苗、結(jié)構(gòu)蛋白、配體蛋白和 受體組成的組中的一種。23. 根據(jù)權(quán)利要求18至21中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述生物活性蛋白或(多）肽是選 自由人類生長激素(hGH)、生長激素釋放激素(GHRH)、生長激素釋放肽、干擾素、干擾素受 體、集洛刺激因子(CSF)、膜尚血糖素樣妝、G蛋白偶聯(lián)受體、白細(xì)胞介素、白細(xì)胞介素受體、 酶、白細(xì)胞介素結(jié)合蛋白、細(xì)胞因子結(jié)合蛋白、巨噬細(xì)胞活化因子、巨噬細(xì)胞肽、B細(xì)胞因子、 T細(xì)胞因子、蛋白A、變態(tài)反應(yīng)抑制因子、細(xì)胞壞死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、腫瘤壞死因 子、腫瘤抑制子、轉(zhuǎn)移生長因子、α?-抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、載脂蛋白-E、促紅細(xì) 胞生成素、高度糖基化的促紅細(xì)胞生成素、血管生成素、血紅蛋白、凝血酶、凝血酶受體激活 肽、血栓調(diào)節(jié)蛋白、因子VII、因子Vila、因子VIII、因子IX、因子XIII、纖溶酶原激活因子、纖 維蛋白結(jié)合肽、尿激酶、鏈激酶、水蛭素、蛋白C、C反應(yīng)蛋白、腎素抑制劑、膠原酶抑制劑、超 氧化物歧化酶、瘦蛋白、血小板衍生生長因子、上皮生長因子、表皮生長因子、血管抑素、血 管緊張肽、骨生長因子、骨刺激蛋白、降鈣素、胰島素、心鈉素、軟骨誘導(dǎo)因子、依降鈣素、結(jié) 締組織活化因子、組織因子途徑抑制物、促卵泡激素、促黃體激素、促黃體激素釋放激素、神 經(jīng)生長因子、甲狀旁腺激素、松弛素、分泌素、生長調(diào)節(jié)素、胰島素樣生長因子、腎上腺皮質(zhì) 激素、胰高血糖素、膽囊收縮素、胰多肽、胃泌素釋放肽、促皮質(zhì)素釋放因子、促甲狀腺激素、 自體毒素、乳鐵蛋白、肌肉生長抑制素、受體、受體拮抗體、細(xì)胞表面抗原、病毒衍生的疫苗 抗原、單克隆抗體、多克隆抗體和抗體片段組成的組中的一種。24. -種增加生物活性蛋白或（多)肽的體內(nèi)半衰期的方法，該方法包括通過基因融合， 使生物活性蛋白或(多)肽與權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的Fab連接在一起。25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的增加生物活性蛋白或(多）肽的體內(nèi)半衰期的方法，其中，所 述生物活性蛋白或（多)肽通過〇~20個氨基酸的肽接頭與Fab連接在一起。26. 根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的方法，其中，生物活性蛋白或(多）肽是選自由人類生長 激素 (hGH)、生長激素釋放激素 (GHRH)、生長激素釋放肽、干擾素 (IFN)、干擾素受體、集落刺 激因子(CSF)、粒細(xì)胞-集落刺激因子(GCSF)、胰高血糖素樣肽、G蛋白偶聯(lián)受體、白細(xì)胞介 素、白細(xì)胞介素受體、酶、白細(xì)胞介素結(jié)合蛋白、細(xì)胞因子結(jié)合蛋白、巨噬細(xì)胞活化因子、巨 噬細(xì)胞肽、B細(xì)胞因子、T細(xì)胞因子、蛋白A、變態(tài)反應(yīng)抑制因子、細(xì)胞壞死糖蛋白、免疫毒素、 淋巴毒素、腫瘤壞死因子、腫瘤抑制子、轉(zhuǎn)移生長因子、α?-抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋 白、載脂蛋白-Ε、促紅細(xì)胞生成素、高度糖基化的促紅細(xì)胞生成素、血管生成素、血紅蛋白、 凝血酶、凝血酶受體激活肽、血栓調(diào)節(jié)蛋白、因子VII、因子Vila、因子VIII、因子IX、因子 XIII、纖溶酶原激活因子、纖維蛋白結(jié)合肽、尿激酶、鏈激酶、水蛭素、蛋白C、C反應(yīng)蛋白、腎 素抑制劑、膠原酶抑制劑、超氧化物歧化酶、瘦蛋白、血小板衍生生長因子、上皮生長因子、 表皮生長因子、血管抑素、血管緊張肽、骨生長因子、骨刺激蛋白、降鈣素、胰島素、心鈉素、 軟骨誘導(dǎo)因子、依降鈣素、結(jié)締組織活化因子、組織因子途徑抑制物、促卵泡激素、促黃體激 素、促黃體激素釋放激素、神經(jīng)生長因子、甲狀旁腺激素、松弛素、分泌素、生長調(diào)節(jié)素、胰島 素樣生長因子、腎上腺皮質(zhì)激素、胰高血糖素、膽囊收縮素、胰(多）肽、胃泌素釋放肽、促皮 質(zhì)素釋放因子、促甲狀腺激素、自體毒素、乳鐵蛋白、肌肉生長抑制素、受體、受體拮抗體、細(xì) 胞表面抗原、病毒衍生的疫苗抗原、單克隆抗體、多克隆抗體和抗體片段組成的組中的一 種。27. -種藥物組合物，包括權(quán)利要求7至13中任一項(xiàng)所述的融合構(gòu)建體，和藥學(xué)上接受 的賦形劑。
【文檔編號】C07K16/46GK105899532SQ201480056265
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年8月29日
【發(fā)明人】車相勛
【申請人】艾普麗爾生物有限公司