本發(fā)明涉及突變或遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種表達(dá)犬血清白蛋白融合干擾素γ的重組桿狀病毒及其應(yīng)用。

技術(shù)背景

干擾素(Interferon，IFN)是由病毒或者其他種類的干擾素誘導(dǎo)劑，刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及體細(xì)胞所產(chǎn)生的一種糖蛋白。這種蛋白具有多種生物活性，包括抗增殖、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和誘導(dǎo)分化作用。根據(jù)特異性受體和序列同源性將干擾素分成I型和II型干擾素。IFN-γ是唯一的II型干擾素，也稱為免疫干擾素。Young(1996)和Frucht(2001)提出，主要由CD4⁺Th1、CD8⁺細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌，有些B細(xì)胞、NKT細(xì)胞和APC細(xì)胞也可分泌IFN-γ。Cantin(1999)提出，雖然I型和II型干擾素在對病毒早期細(xì)胞應(yīng)答都很重要，但是IFN-γ在免疫應(yīng)答后期起關(guān)鍵作用并且建立了抗病毒的長效控制機(jī)制。綜合來看，I型干擾素起到的抗病毒活性作用要優(yōu)于它的免疫調(diào)節(jié)作用，II型干擾素-IFN-γ則被認(rèn)為免疫調(diào)節(jié)作用要強(qiáng)于抗病毒作用。同時(shí)Chin(1996)提出，IFN-γ抗腫瘤活性要比I型干擾素強(qiáng)很多，通過刺激巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞等先天免疫應(yīng)答來發(fā)揮抗腫瘤作用，同時(shí)還可抑制腫瘤細(xì)胞的有絲分裂和增殖的作用。IFN-γ在抗病毒，抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要作用，在臨床有一定的應(yīng)用價(jià)值。相對于人IFN-γ而言，動(dòng)物IFN-γ的研究相對比較落后，基本停留在實(shí)驗(yàn)室的基因誘導(dǎo)與構(gòu)建重組等階段。盡管如此，鄭仲金等(2007)研究表明IFN-γ作為疫苗佐劑或者治療制劑表現(xiàn)出一定的效果。如對雛雞急性新城疫、仔豬黃白痢、雞傳染性法氏囊等畜禽病毒性疾病效果明顯；曹瑞兵等(2004)提出，豬重組IFN-γ能夠?qū)SV起到有效 的抗病毒作用；許金俊(2004)提出，重組奶牛IFN-γ對試驗(yàn)性大腸埃希菌引起的乳房炎具有較好的預(yù)防和控制效果；Schijns(2002)提出，重組貓IFN-γ能增強(qiáng)貓疫苗抗體的產(chǎn)生；龍小海等(1999)提出，重組雞IFN-γ能明顯抵抗球蟲的作用；龍小海等(1999)提出，重組的犬IFN-γ能作為佐劑輔助性治療病毒性腸炎、乙肝、病毒性感冒等。各研究都表明IFN-γ對動(dòng)物體疾病的預(yù)防和控制具有良好的應(yīng)用前景。而且畜禽感染致病菌后主要依賴疫苗和抗生素。但抗生素的殘留及引起細(xì)菌的耐藥性等因素影響人類和動(dòng)物的健康，而疫苗只是針對特定病原產(chǎn)生長期保護(hù)。所以湯一葦(1996)提出，干擾素制劑不僅能提高抗體對抗原的免疫應(yīng)答水平，而且能誘導(dǎo)機(jī)體選擇性的調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，因此被稱為免疫激素的細(xì)胞因子正逐漸作為佐劑用于研制。

隨著干擾素類藥物的廣泛應(yīng)用，其缺點(diǎn)不斷暴露，半衰期短、穩(wěn)定性差很大程度上限制干擾素的藥用價(jià)值。長效干擾素的開發(fā)中采用了多種不同的方式，包括物理方法、化學(xué)方法和生物學(xué)方法。目前研究最為廣泛的為生物學(xué)修飾法，其優(yōu)勢在于工業(yè)污染小、投入低、能夠批量生產(chǎn)，并且有很大的優(yōu)化改進(jìn)空間。血清白蛋白融合技術(shù)是長效干擾素開發(fā)中最成熟的技術(shù)之一，Oborn(2002)首次采用人血清白蛋白制備融合干擾素蛋白，并以猴為試驗(yàn)動(dòng)物，對其藥效以及穩(wěn)定性進(jìn)行研究。目前該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)在美國等國家被批準(zhǔn)用于治療丙型肝炎等慢性傳染病。

犬類作為伴侶動(dòng)物在人類生活中扮演的角色越來越重要，寵物醫(yī)療保健水平的也不斷提高，病毒性疾病嚴(yán)重影響犬類健康。而干擾素蛋白與血清白蛋白融合表達(dá)的研究主要集中于人醫(yī)臨床，目前國內(nèi)外尚未見到針對犬IFN-γ的相關(guān)研究。我們通過基因融合技術(shù)，將犬IFN-γ基因與犬血清白蛋白基因相融合，利用昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，成功表達(dá)了CSA-IFNγ蛋白，并對其生物活性 性進(jìn)行研究，為其在犬病毒性疾病的預(yù)防、免疫治療及疫苗佐劑方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

現(xiàn)有技術(shù)存在以下技術(shù)問題：

1.通過血清白蛋白與干擾素相融合來延長干擾素半衰期在人類醫(yī)學(xué)研究較為深入，但獸醫(yī)臨床關(guān)于融合蛋白干擾素的研究及應(yīng)用均比較少。目前臨床上常用的犬免疫增強(qiáng)用干擾素為常規(guī)干擾素，多次反復(fù)注射會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受和其他不良反應(yīng)，影響其治療效果。

2.獸用干擾素制品大都采用原核表達(dá)方式，產(chǎn)物多為包涵體形式，制備方法復(fù)雜。純化過程中需要變性、復(fù)性等過程，產(chǎn)物生物活性較差，藥物療效一般。

3.獸用干擾素制品在結(jié)構(gòu)和功能上與天然蛋白差異大。

4.獸用干擾素制品的高水平表達(dá)蛋白質(zhì)占細(xì)胞總蛋白量低。

5.獸用干擾素制品提純困難。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是：

1)提供一種表達(dá)犬血清白蛋白融合干擾素γ的重組桿狀病毒的基因片段，與現(xiàn)有技術(shù)不同的是，可翻譯為如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，用于擴(kuò)增其序列的上下游引物包含上游酶切位點(diǎn)EcoR I、上游酶切位點(diǎn)Hind III，具有如SEQ ID NO.2所示的犬血清白蛋白核苷酸序列、柔性linker序列和犬IFNγ成熟蛋白核苷酸序列；

2)提供一種利用所述的基因片段在構(gòu)建表達(dá)犬血清白蛋白融合干擾素γ的重組桿狀病毒的應(yīng)用，與現(xiàn)有技術(shù)不同的是，本發(fā)明采用的載體質(zhì)粒是pFastBac^TM I，重組質(zhì)粒是pF-CSA-IFNγ；

3)提供一種表達(dá)犬用血清白蛋白融合干擾素γ的重組桿狀病毒及其應(yīng)用，與現(xiàn)有技術(shù)不同的是，采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)出修飾合理、活性優(yōu)、穩(wěn)定性佳的犬血清白蛋白融合干擾素，為開發(fā)半衰期長、成本低、功效高的犬用血清白蛋白融合干擾素奠定基礎(chǔ)；

4)提供了一種表達(dá)犬血清白蛋白融合干擾素γ的重組桿狀病毒，與現(xiàn)有技術(shù)不同的是，可表達(dá)具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，以及所述的表達(dá)犬血清白蛋白融合干擾素γ的重組桿狀病毒在制備增強(qiáng)免疫力藥物中的應(yīng)用，所述的免疫治療藥物為犬類免疫力增強(qiáng)的藥物；

5)提供了一種含有表達(dá)犬血清白蛋白融合干擾素γ的重組桿狀病毒的增強(qiáng)免疫力藥物和一種含有表達(dá)犬血清白蛋白融合干擾素γ的重組桿狀病毒的犬類免疫力增強(qiáng)的藥物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1.本發(fā)明使用搭橋PCR技術(shù)，使基因的融合快捷方便，又可以避免酶切位點(diǎn)的引入干擾后續(xù)試驗(yàn)這個(gè)缺點(diǎn)；

2.本發(fā)明采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)與細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：

(1)重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能，表達(dá)產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)及功能上更接近天然蛋白；

(2)能夠進(jìn)行翻譯后加工修飾，使表達(dá)產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)上最大限度接近于天然蛋白；

(3)能夠高水平表達(dá)蛋白質(zhì)，可高水平獲得重組蛋白，最高可達(dá)細(xì)胞總蛋白量的50％；

(4)能夠使表達(dá)產(chǎn)物通過分泌形式進(jìn)行表達(dá)，進(jìn)一步簡化了分離純化工作。

與傳統(tǒng)方法表達(dá)的犬干擾素相比較，本發(fā)明通過采用基因融合技術(shù)實(shí)現(xiàn)了犬血清白蛋白與犬γ干擾素的融合表達(dá)，且蛋白表達(dá)量高，活性好，為犬血清白蛋白融合干擾素的產(chǎn)品化創(chuàng)造了先決條件。犬γ干擾素具有抑制病毒復(fù)制、抗腫瘤、抗寄生蟲及免疫調(diào)節(jié)等作用，作為一種重要的免疫增強(qiáng)劑，其在犬類病毒性疾病預(yù)防、免疫治療及免疫佐劑方面應(yīng)用前景廣闊。

附圖說明：

圖1為犬血清白蛋白基因和犬γ基因PCR擴(kuò)增圖；

圖2為犬血清白蛋白基因與犬IFNγ基因PCR融合圖；

圖3為pF-CSA-IFNγ重組質(zhì)粒雙酶切鑒定圖；

圖4為攜帶Bacmid-CSA-IFNγ重組桿狀病毒質(zhì)粒菌株的篩選；

圖5為攜帶Bacmid-CSA-IFNγ重組桿狀病毒質(zhì)粒菌株的純化；

圖6為CSA-IFNγ融合蛋白表達(dá)情況監(jiān)測；

圖7為CSA-IFNγ融合蛋白純化。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖，通過實(shí)施例對本發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不是對本發(fā)明的限制。

實(shí)施例

(一)犬CSA-IFNγ融合基因的制備：

根據(jù)犬血清白蛋白基因序列(GenBank登陸號(hào)為AB090854.1)；以犬IFNγ基因序列(GenBank登陸號(hào)：EF095772.1)為原始序列，依據(jù)昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)密碼子的偏嗜性，優(yōu)化合成新的犬γ干擾素成熟肽核苷酸序列(該序列經(jīng)南京金斯瑞生物科技有限公司優(yōu)化合成)，設(shè)計(jì)合成引物，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列表

步驟一，犬血清白蛋白基因的擴(kuò)增方法：

取0.5cm³的犬肝臟樣品，十字研磨器冰浴研磨，將研磨液收集于1.5mL離心管，-20℃凍融3次后，12,000×g離心5min，收集上清液提取總RNA，操作步驟按照AxyPrep DNA/RNA提取制備試劑盒說明書進(jìn)行。進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增犬血清白蛋白全基因序列：

1)取200μl犬肝臟研磨液，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中；

2)加入200μl BufferV-L，漩渦振蕩混合均勻，室溫靜置5min；

3)加入75μl BufferV-N，漩渦振蕩混合均勻，12,000×g離心5min；

4)將上清轉(zhuǎn)移到新的2mL離心管中，加250μl異丙醇(1％冰乙酸)，上下倒置6-8次，混合均勻；

5)將制備管置于2mL離心管中，取步驟4中的混合液移入制備管中，6,000×g離心1min；

6)棄掉濾液，將制備管置回2mL離心管中，加500μl Buffer W1A，室溫靜置1min，12,000×g離心1min；

7)棄掉濾液，將制備管置回2mL離心管中，加800μl Buffer W2，12,000×g離心1min；

8)將制備管置回2mL離心管中，12,000×g離心1min；

9)將制備管置于潔凈的1.5mL離心管中，在制備管中央加40-60μl Buffer TE(DNase&RNase-free)，室溫靜置1min，12,000×g離心1min洗脫RNA。

反應(yīng)體系見表2，反應(yīng)條件如下：50℃ 30min；94℃ 3min；94℃ 30s，57.5℃ 30s，72℃ 2min，30cycles；72℃ 10min；4℃保存。

表2犬血清白蛋白(CSA)全基因序列RT-PCR反應(yīng)體系

經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分析，獲得大小為1827bp的目的片段，結(jié)果如圖1所示。將目的片段切膠回收，具體方法參照DNA凝膠回收試劑盒(Omega)說明書進(jìn)行。將目的片段連接至pMD18-T載體(方法按照Takara pMD18-T載體說明書進(jìn)行)連接體系見表3。

表3犬血清白蛋白基因與pMD18-T載體連接體系

充分混勻后，16℃連接過夜。取30μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞，冰浴融化，加入10μl連接產(chǎn)物，溫和混勻，置于冰上30min，42℃熱休克90s，冰浴2min，加入1ml無抗LB培養(yǎng)液，37℃ 220rpm/min培養(yǎng)50min，5000rpm/min室溫離心5min收集菌體，將菌體涂布于LB氨芐抗性瓊脂平板，37℃培養(yǎng)12h，挑取單菌落接種于LB氨芐抗性培養(yǎng)液37℃ 220rpm/min培養(yǎng)12h后，進(jìn)行菌液PCR鑒定，篩選陽性菌株送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序鑒定。鑒定正確后采用AxyPrep質(zhì)粒小量提取試劑盒制備重組質(zhì)粒pMD-CSA。

步驟二，犬血清白蛋白基因(linker序列)與犬IFNγ成熟蛋白基因的融合：

分別利用自行設(shè)計(jì)的融合引物擴(kuò)增CSA基因與IFNγ成熟蛋白基因，在PCR過程中成功引入上游酶切位點(diǎn)EcoR I、下游酶切位點(diǎn)Hind III、柔性linker序列(用于連接CSA基因與IFNγ成熟蛋白基因)，并在基因序列末端加入6個(gè)組氨酸標(biāo)簽用于蛋白純化，反應(yīng)體系如表4和表5所示。

表4 CSA基因的擴(kuò)增

CSA基因的擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：94℃ 3min；94℃ 30s，57.5℃ 30s，72℃ 2min，15個(gè)循環(huán)。

表5 IFNγ成熟蛋白基因的擴(kuò)增

CSA基因的擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：94℃ 3min；94℃ 30s，57.5℃ 30s，72℃ 30s，15個(gè)循環(huán)。

將上述兩個(gè)反應(yīng)體系的反應(yīng)體系的產(chǎn)物混合進(jìn)行融合PCR，反應(yīng)條件如下94℃ 3min；94℃ 30s，57.5℃ 30s，72℃ 3min，5個(gè)循環(huán)。取出后加入一定量的酶和引物，進(jìn)行最終目的基因的擴(kuò)增，體系如表6所示，反應(yīng)條件如下94℃ 3min；94℃ 30s，57.5℃ 30s，72℃ 3min，15個(gè)循環(huán)；4℃保存。

表6 CSA-IFNγ基因的擴(kuò)增

經(jīng)1％凝膠電泳分析融合效果，電泳結(jié)果顯示獲得2316bp左右的目的片段，結(jié)果如圖2所示。利用DNA凝膠回收試劑盒(Omega)回收目的片段，采用Mighty TA-cloning Kit試劑盒進(jìn)行加A尾反應(yīng)，反應(yīng)體系如表7所示。

表7 CSA-IFNγ序列加“A”反應(yīng)體系

65℃反應(yīng)10min，反應(yīng)液直接用于連接反應(yīng)。取1μl加“A”后PCR產(chǎn)物至新的的1.5ml EP管中，加入1μl pMD20-T vector和3μl滅菌蒸餾水混勻，加入5μl Ligation Mighty Mix，輕輕混勻，16℃保溫30min，加入50μl Competent Cells中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將菌體涂布于LB氨芐抗性瓊脂平板，37℃培養(yǎng)12h，挑取單菌落接種于LB氨芐抗性培養(yǎng)液37℃ 220rpm/min培養(yǎng)12h后，進(jìn)行菌液PCR鑒定，篩選陽性菌株送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序鑒定。鑒定正確后采用AxyPrep質(zhì)粒小量提取試劑盒制備重組質(zhì)粒pMD-CSA-IFNγ。

(二)表達(dá)CSA-IFNγ蛋白重組桿狀病毒的構(gòu)建：

步驟一，pF-CSA-IFNγ重組質(zhì)粒的構(gòu)建：

利用EcoR I和Hind III同時(shí)對pMD-CSA-IFNγ重組質(zhì)粒和pFastBac^TM I載體質(zhì)粒進(jìn)行處理，酶切體系如表8所示。

表8雙酶切體系

酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示分別獲得4700bp左右的pFastBac^TMI載體骨架和2300bp左右的CSA-IFNγ融合基因靶片段，結(jié)果如圖3所示。采用DNA凝膠回收試劑盒(Omega)回收目的片段。利用T4 DNA連接酶將純化回收的載體骨架與融合基因靶片段進(jìn)行融合，連接體系見表9。

表9 CSA-IFNγ與pFastBac^TMI連接

充分混勻后，16℃連接過夜。取30μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞，冰浴融化，加入10μl連接產(chǎn)物，溫和混勻，置于冰上30min，42℃熱休克90s，冰浴2min，加入1ml無抗LB培養(yǎng)液，37℃ 220rpm/min培養(yǎng)50min，5000rpm/min室溫離心5min收集菌體，將菌體涂布于LB氨芐抗性瓊脂平板，37℃培養(yǎng)12h，挑取單菌落接種于LB氨芐抗性培養(yǎng)液37℃ 220rpm/min培養(yǎng)12h后，進(jìn)行菌液PCR鑒定，篩選陽性菌株送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序鑒定。鑒定正確后采用AxyPrep質(zhì)粒小量提取試劑盒制備重組質(zhì)粒pF-CSA-IFNγ。

步驟二，表達(dá)CSA-IFNγ重組桿狀病毒的構(gòu)建：

將pF-CSA-IFNγ重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于LB瓊脂糖平板(含50μg/ml卡那霉素，7μg/ml慶大霉素，10μg/ml四環(huán)素，100μg/ml Bluo-gal，40μg/ml IPTG)進(jìn)行DH10Bac^TM轉(zhuǎn)化株的篩選。37℃培養(yǎng) 48h，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，結(jié)果如圖4所示。挑取10個(gè)白色的單菌落，重新劃線于新鮮LB瓊脂糖平板(含50μg/ml卡那霉素，7μg/ml慶大霉素，10μg/ml四環(huán)素，100μg/ml Bluo-gal，40μg/ml IPTG)，37℃過夜培養(yǎng)，結(jié)果如圖5所示。挑取白色單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(含50μg/ml卡那霉素，7μg/ml慶大霉素，10μg/ml四環(huán)素)，37℃220rpm/min培養(yǎng)24h，PCR鑒定出陽性菌株后，采用AxyPrep去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒制備Bacmid-CSA-IFNγ重組桿狀病毒質(zhì)粒。并將其轉(zhuǎn)染至生長狀態(tài)良好的SF9細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染步驟按照Invitrogen Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行。

轉(zhuǎn)染步驟按照Invitrogen Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行，操作步驟如下：

1)將生長良好的SF9細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，27℃至少培養(yǎng)1h；

2)將1μg純化的Bacmid-CSA-IFNγ重組桿狀病毒質(zhì)粒DNA加至100μl Grace培養(yǎng)基中，溫和混勻；

3)完全混勻Cellfectin試劑，翻轉(zhuǎn)混合5-10次，吸取6μl Cellfectin試劑加至100μl Grace培養(yǎng)基中，溫和混勻；

4)將2)和3)中的液體溫和混勻，室溫孵育45min，在孵育過程中除去細(xì)胞中原有培養(yǎng)基并用Grace培養(yǎng)基清洗3次；

5)向孵育液中加入0.8ml Grace培養(yǎng)基，溫和混勻后加至細(xì)胞培養(yǎng)板中，27℃培養(yǎng)5h。

6)棄去，向細(xì)胞中加入2ml SF900 II液(含雙抗)；

7)27℃潮濕條件培養(yǎng)72h或者直至能夠看到病毒感染的現(xiàn)象，提取P1病毒株；

8)P1代病毒液中病毒粒子含量較低，需要將其接種于生長良好的SF9細(xì)胞進(jìn)行P2代病毒擴(kuò)增培養(yǎng)；

9)獲得表達(dá)CSA-IFNγ重組蛋白的桿狀病毒，命名為Baculovirus-C-γ

(三)CSA-IFNγ重組蛋白表達(dá)情況檢測及蛋白純化：

將重組病毒Baculovirus-C-γ接種于生長良好的SF9細(xì)胞，在感染后24h、48h、72h和96h收集細(xì)胞液，500×g離心5min去除細(xì)胞和較大的碎片，加入1/4體積5×SDS上樣緩沖液，沸水浴煮沸10min，冰上放置5min，置于-20℃保存。對樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示重組桿狀病毒接種SF9細(xì)胞后24h目的蛋白開始表達(dá)，48h表達(dá)水平較高，72h開始出現(xiàn)較多的雜蛋白，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明重組蛋白可在桿狀病毒系統(tǒng)中穩(wěn)定的分泌表達(dá)，表達(dá)量較高，接毒后48h培養(yǎng)液中雜蛋白含量較少，故于接毒后48h收獲表達(dá)產(chǎn)物更有利于CSA-IFNγ重組蛋白的純化。

將SF9細(xì)胞懸浮培養(yǎng)于75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶中并同時(shí)接種Baculovirus-C-γ，于接毒后48h收獲細(xì)胞液，500×g4℃離心15min去除細(xì)胞和較大的碎片，采用BeyoGold^TM His-tag Purification Resin蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化，具體步驟按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行，結(jié)果如圖7所示。

(四)重組干擾素蛋白的生物活性測定：

參考Wish-VSV法評(píng)價(jià)CSA-IFNγ的體外生物活性，但需要將Wish細(xì)胞替換為犬腎細(xì)胞MDCK。具體方法如下：將生長狀態(tài)良好MDCK細(xì)胞培養(yǎng)于96孔細(xì)胞板中，37℃ 5％CO₂恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6h，直至細(xì)胞貼壁生長良好；將待測樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、對照分別培養(yǎng)基做4倍倍比稀釋12個(gè)梯度，分別接種于培養(yǎng)在96孔板的細(xì)胞中，每孔100μl，37℃ 5％CO₂恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h；棄掉96孔板中的上清液，用攻毒培養(yǎng)基稀釋VSV病毒，攻毒劑量為100TCID₅₀，每孔100μl，37℃ 5％CO₂恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，倒置顯微鏡下觀察病變情況。結(jié)果見表10。

表10干擾素體外活性測定結(jié)果

根據(jù)公式計(jì)算：IFN效價(jià)(IU/m1)＝Pr×(其中Pr為標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)；Ds為待測樣品的預(yù)稀釋倍數(shù)；ES為待測樣品相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品半效價(jià)的稀釋倍數(shù)；Dr為標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋倍數(shù)；Er為標(biāo)準(zhǔn)品半數(shù)稀釋倍數(shù))計(jì)算干擾素融合蛋白體外生物活性，結(jié)果為2.68IU/ml。