專利名稱：缺失型人β干擾素及其重組制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA重組技術(shù)和藥物領(lǐng)域，涉及重組缺失型人β干擾素， 含編碼該缺失蛋白的DNA序列，含該DNA序列的載體，含該載體的宿主細(xì)胞，用于基因工程制備該蛋白的方法，以及該蛋白在治療疾病領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人β干擾素是成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生的一類具有廣泛生物學(xué)活性，包括抗病毒、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)作用的重要細(xì)胞因子(KozovsKa ME, et al. Neurology〔J〕，1999，53 :1692-1697)，具有 5 個 α 螺旋和 22KDa 的分子量，其中 β 干擾素-Ib 無糖基化，其分子量為 18KDa(Arduini，et al. Protein Science (J), 1999,8 1867-1877)。目前人β干擾素分為β干擾素-Ia和β干擾素_lb，其中β干擾素-Ia是天然結(jié)構(gòu)，包含有糖基化結(jié)構(gòu)，而β干擾素-Ib是將17位的Cys突變成Ser而成，且N端不含甲硫氨酸，由 165 個氨基酸組成(Goodkin DE, et al. Lancet〔J〕，1994，344 :1057-1060)。 大量研究表明，人β干擾素可在大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細(xì)胞中實現(xiàn)穩(wěn)定高效的表達(dá) (Jacobs L，et al. Curr Opin Neuro〔J〕，1994，7 :250-254)。1993 年以來國外已批準(zhǔn)多種重組β干擾素上市用于治療多發(fā)性硬化癥(multiplesCler0SiS，MS)。國外用于臨床的IFN-β有IFN-β-Ia和IFN-β-Ib兩種類型，均系基因重組產(chǎn)品。β干擾素作為治療多發(fā)性硬化癥的藥物已經(jīng)在國外上市的有先靈公司的Betaferon、 諾華歐化公司的Extavia以及雪蘭諾公司的Rebif和Biogen公司的Aronex。其中先靈公司的Betaferon和諾華歐化公司的Extavia屬于IFN-β _lb，通過在E. coli中以包涵體形式表達(dá)的重組人β干擾素_lb，工藝中需經(jīng)SDS變性后再復(fù)性。而雪蘭諾公司的Rebif和 Biogen &司的 Aronex ^lil CHO (Chinese hamster ovary) ^iiWMSA IFN—β —la。 i 組IFN-β -Ib和IFN-β -la在結(jié)構(gòu)與生物活性方面存在明顯的差異，主要表現(xiàn)為CHO表達(dá)的IFN-β -Ia的體外抗病毒比活性高于大腸桿菌包涵體表達(dá)制備的IFN-β -lb。本發(fā)明提供了一種缺失型人β干擾素突變體Δ Il-IFN-β及其表達(dá)制備的方法， 制備的蛋白不僅溶解性更好、穩(wěn)定性更高，同時具有更高的抗病毒活性。發(fā)明目的目前人β干擾素-lb(IFN-β-lb)在大腸桿菌中以包涵體的形式表達(dá)，工藝中需用SDS先變性后再復(fù)性，制備工藝相對復(fù)雜，且含有SDS的殘留，其抗病毒比活性僅為2X 107IU/mg ；人β干擾素-la(IFN-β-la)是以CHO細(xì)胞為宿主細(xì)胞表達(dá)的有糖基化的糖蛋白，抗病毒比活性為 2X108IU/mg(Laura Runkel，et al. Pharmaceutical Research 〔J〕，1998，15 :641-649)。本發(fā)明重組制備的缺失型人β干擾素突變體與天然結(jié)構(gòu)比具有溶解性更高、 穩(wěn)定性更好的優(yōu)勢。制備的重組缺失型人β干擾素突變體包括All-IFN-^-Ia和 Δ Il-IFN- β -lb。其中，Δ Il-IFN- β -Ib采用大腸桿菌以融合表達(dá)的方式表達(dá)制備，其N端第1位氨基酸可替換為甘氨酸(Gly)或精氨酸(Arg)或甲硫氨酸(Met)，第6位氨基酸為絲氨酸Ger)；而All-FN_i3-la可采用酵母細(xì)胞或CHO細(xì)胞表達(dá)制備，其N端第1位氨基酸可替換為甘氨酸(Gly)或精氨酸(Arg)或甲硫氨酸(Met)，第6位氨基酸為半胱氨酸(Cys)。 其次，該重組缺失型人β干擾素突變體蛋白的第1位氨基酸前可帶有甘氨酸(Gly)或精氨酸(Arg)或甲硫氨酸(Met)。
構(gòu)建的表達(dá)Δ Il-IFN-β-Ib的工程菌經(jīng)發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)后，加入IPTG誘導(dǎo)后收集菌體。在特定的破菌緩沖液中破菌后離心收集上清，通過M柱純化回收融合蛋白， 經(jīng)特定的蛋白酶酶切后通過離子交換和反相C18柱精純化，制備的重組All-IFN-i3-lb 抗病毒生物學(xué)比活性達(dá)到7.3X107IU/mg以上。構(gòu)建的表達(dá)Δ Il-IFN-β-Ia酵母細(xì)胞或CHO細(xì)胞株經(jīng)擴大培養(yǎng)后分泌表達(dá)的Δ Il-IFN-β-la,經(jīng)進(jìn)一步的分離純化制備的 Δ Il-IFN-β -Ia抗病毒生物學(xué)比活性分別達(dá)到3. 1 X 108IU/mg和4. 3X108IU/mg以上。本發(fā)明的目的在于提供一種缺失型人β干擾素突變體(包括Δ Il-IFN-β -Ib和 Δ Il-IFN-β-la)并進(jìn)行有效的重組制備。還提供了編碼所述缺失型人β干擾素突變體蛋白的DNA分子、含該DNA序列的載體以及含該載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一目的提供一種缺失型人β干擾素突變體的制備工藝，獲得抗病毒比活性更高的缺失型人β干擾素突變體蛋白的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種可用于治療病毒性疾病如病毒性丙型肝炎或乙型肝炎，或者免疫性疾病如多發(fā)性硬化癥的重組缺失型人β干擾素突變體蛋白。發(fā)明概述在本發(fā)明的第一方面，提供了一種缺失型人β干擾素突變體蛋白為N 端缺失 11 個氨基酸的 Δ Il-IFN-β (包括 Δ Il-IFN-β-Ia 和 Δ Il-IFN-β-lb)。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種在大腸桿菌中通過與TRX融合表達(dá)的融合蛋白，更具體的，該融合蛋白中包含不同的Linker，在Linker中設(shè)計不同的蛋白酶酶切位點， 包括EK、TEV、thrombin、凝血因子)(a等。所述Δ Il-IFN-β-Ib蛋白具有以下結(jié)構(gòu)首先， 第1位氨基酸可替換為甲硫氨酸(Met)或甘氨酸(Gly)或精氨酸(Arg)，第6位氨基酸為絲氨酸(Ser)；其次，第1位氨基酸前可帶有(Met)或甘氨酸(Gly)或精氨酸(Arg)。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種在酵母細(xì)胞或CHO細(xì)胞中表達(dá)的重組 Δ Il-IFN-β-Ia蛋白，所述重組Δ Il-IFN-β-Ia蛋白具有以下結(jié)構(gòu)首先，第1位氨基酸可替換為甲硫氨酸(Met)或甘氨酸(Gly)或精氨酸(Arg)，第6位氨基酸為半胱氨酸(Cys)， 第69位氨基酸的天(門)冬酰胺被糖基化修飾；其次，第1位氨基酸前可帶有(Met)或甘氨酸(Gly)或精氨酸(Arg)。在本發(fā)明的第四方面，提供了編碼本發(fā)明上述的重組缺失型人β干擾素-Ia和Ib 突變體蛋白的DNA分子。在本發(fā)明的第五方面，提供了含有上述DNA分子的載體，以及構(gòu)建該表達(dá)載體的方法。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種適合特異性載體的宿主細(xì)胞(包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等；常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、C-127細(xì)胞、BHK細(xì)胞、大鼠H印I細(xì)胞、大鼠H印II細(xì)胞、 TCMK細(xì)胞、人肺細(xì)胞、HEK293細(xì)胞等；常用的昆蟲細(xì)胞如蠶培養(yǎng)細(xì)胞等)。以及可以通過公知的方法將含有目的基因的DNA序列的載體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)。在本發(fā)明的第七方面，提供了包含上述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞以及可能的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的方法。在本發(fā)明的第八方面，提供了一種重組產(chǎn)生本發(fā)明重組缺失型人β干擾素突變體蛋白的方法，它包括以下步驟在適合表達(dá)所述重組缺失型人β干擾素突變體的條件下，培養(yǎng)上述的宿主細(xì)胞，表達(dá)出所述的重組缺失型人β干擾素突變體蛋白，經(jīng)分離純化制備重組缺失型人β干擾素突變體蛋白的方法。在本發(fā)明的第九方面，提供了一種重組產(chǎn)生本發(fā)明中大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白， 通過不同蛋白酶酶切的方法，以及分離純化制備重組缺失型人β干擾素-Ib突變體蛋白的方法。在本發(fā)明的第十方面，提供了一種重組產(chǎn)生本發(fā)明中酵母表達(dá)的缺失型人β干擾素-Ia突變體蛋白，通過分離純化制備缺失型人β干擾素-Ia突變體蛋白的方法。在本發(fā)明的第十一方面，提供了一種重組產(chǎn)生本發(fā)明中CHO細(xì)胞表達(dá)的缺失型人 β干擾素-Ia突變體蛋白，通過分離純化制備缺失型人β干擾素-Ia突變體蛋白的方法。在本發(fā)明的第十二方面，提供了一種該重組缺失型人β干擾素-Ia和-Ib突變體蛋白的藥物組合物，它包括藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑。至此已對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述，參照以下實例能夠?qū)χ懈宄睦斫?，所述實例僅為說明目的而并不旨在對本發(fā)明進(jìn)行限制。


圖 1 :pET-32a-EK-Δ Il-IFN-β -Ser6 經(jīng) Kpn I 和 Hind III 雙酶切驗證(1-4 重組質(zhì)粒 pET-32a-EK- Δ Il-IFN- β -Ser6 經(jīng) Kpn I 和 Hind III 雙酶切)。圖2 :A =SDS-PAGE 分析融合蛋白(TRX-EK-Δ 11-IFN-β -Ser6)表達(dá)水平(1 誘導(dǎo)后；2:誘導(dǎo)前)。B:融合蛋白TRX-EK-Δ Il-IFN-β-Ser6的EK酶酶切(1 酶切前；2 酶切 10小時；3 酶切12小時；4 酶切16小時)。圖3 :A =SDS-PAGE 分析制備的 Δ Il-IFN-β -Ser6 蛋白。B =RP-HPLC 分析制備的 Δ 11-IFN-β -Ser6 蛋白。圖4 體外抗病毒活性比較曲線(1 β干擾素國際活性標(biāo)準(zhǔn)品；2 TRX-EK- Δ 11-IFN- β -Ser6 ；3 Δ Il-IFN-β -Ser6 ；4 Δ Il-IFN-β -Cys6 (酵母表達(dá))；5 Δ 11-IFN- β -Cys6 (CH0 表達(dá)))。
具體實施例方式實例1融合蛋白TRX-EK- Δ 11-IFN- β -Ser6在大腸桿菌中的重組融合表達(dá)和目的蛋白 Δ Il-IFN-β-Ser6 (SEQ ID NO :4)的制備。在本實施例中，所涉及的融合蛋白具有TRX-EK-All-IFN_i3-Ser6結(jié)構(gòu)。根據(jù) IFN-β的氨基酸序列，并按照大腸桿菌偏愛的密碼子，委托寶生物(大連)有限公司進(jìn)行全基因合成 Δ Il-IFN-β 的 cDNA 序歹Ij (SEQ IDNO 5)。根據(jù)設(shè)計要求合成2條引物PI、P2 Pl 5' -CGGGTACCGATGACGATGACAAGTCTTCCAATTTTCAGTCT-3' (SEQ ID NO 6)P2 5' -GCAAGCTTTCATTAGTTTCGGAGGTAACCTGT-3' (SEQ ID NO 7)注P1中CG為引物保護(hù)堿基，GGTACC為Kpn I酶切位點；P2中GC為引物保護(hù)堿基，AAGCTT為Hand III酶切位點。以人工合成Δ Il-IFN-β的cDNA序列(SEQ ID NO 5)為模板，用引物Pl和P2擴增EK-Δ Il-IFNH6 (SEQ ID NO 8)基因(Pl頭部含有Kpn I酶切位點和編碼腸激酶酶切位點DDDDK的核苷酸序列，Ρ2尾部含有終止密碼子和Hand III酶切位點)。擴增的
5ΕΚ-Δ Il-IFN-β-Ser6(SEQ ID NO :8)基因首尾分別加入Kpn I和Hand III酶切位點，插入原核表達(dá)載體pET-32a，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-3h-EK- Δ Il-IFN- β -Ser6。延伸PCR方法擴增EK-Δ Il-IFN-β Ier6(SEQ ID NO :8)基因的反應(yīng)體系均采用PCR反應(yīng)試劑盒(TAKARA，大連)，按商家的說明書設(shè)置。PCR反應(yīng)條件為94°C lmin, 58°C lmin, 72°C lmin，共30個循環(huán)，第一個循環(huán)94°C變性lOmin，最后一個循環(huán)72°C延伸 lOmin，結(jié)果顯示獲得了 500bp(EK-All-IFN-3-Ser6) (SEQ ID NO 8)的目標(biāo)條帶。PCR產(chǎn)物經(jīng)低熔點瓊脂糖純化后，用Kpn I和Hind III雙酶切后，回收的目的片段與同樣經(jīng)Kpn I和Hind III雙酶切回收的質(zhì)粒pET_32a(購于hvitrogen)用 T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆宿主菌ToplOF'，用雙酶切驗證的方法篩選重組質(zhì)粒pET-32a-EK- Δ 11-IFN- β -Ser6 (附圖1)，經(jīng)DNA測序(TAKARA,大連)后表明，擴增的 ΕΚ-Δ Il-IFN-β-Ser6基因與設(shè)計完全一致(SEQ ID NO :8)。將上述測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主菌 Origami DE3 (Novagen)，成功構(gòu)建 ρΕΤ-3^ι_ΕΚ-Δ Il-IFN-β -Ser6/ Origami DE3重組工程菌。將表達(dá)最佳工程菌株劃線接種于LA瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過夜。從過夜培養(yǎng)的LA 平板上挑取菌苔接種于含LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加水定容至1000mL，12rC，高壓滅菌30min即可)試管中，30°C培養(yǎng)12小時，然后按的比例轉(zhuǎn)接到含200mL LB培養(yǎng)液的IOOOmL三角瓶中，30°C培養(yǎng)過夜即成為上罐種子液。將上罐種子液按5%的比例接種于含YT培養(yǎng)液的30L發(fā)酵罐中，37°C培養(yǎng)，整過發(fā)酵過程中，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、通空氣量、通純氧量來保持溶氧在30%以上，用的氨水調(diào)節(jié)pH并保持在7. 0。 至菌液0D600 = 10 14時，加入終濃度為0. 3mmol/L IPTG，同時下調(diào)溫度為32°C，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后停止發(fā)酵(附圖2 :A)，收集菌液，SOOOrpm離心10分鐘，棄上清，收集菌體放入-20°C冰箱保存?zhèn)溆?。?20 V冰箱中取出菌體，放入細(xì)菌裂解液(50mmol/LTriS-HCl、l % Zwittergent3-14、pH9. 0)中溶解菌體，37°C下攪拌1小時后加入終濃度為10 μ g/ml的DNA 酶作用3小時至鏡檢完全破菌，12000rpm離心10分鐘，棄沉淀。收集上清。粗純化將收集的上清通過M離子螯和純化回收融合蛋白 TRX-EK-Δ Il-IFN-β-Ser6，在透析液(50mmol/L Tris_HCl、0. 15M Nacl、pH8.0)中透析過夜。融合蛋白(TRX-EK-Δ Il-IFN-β -Ser6) EK酶酶切取透析過夜的融合蛋白，按質(zhì)量比1 200加入EK酶，于4°C下酶切16小時即可，酶切效率不低于90% (附圖2: 。精純化酶切后的樣品經(jīng)RP-HPLC(Waters公司C18柱)純化(流動相A液0. 1% 三氟乙酸、5%乙腈，流動相B液0. 三氟乙酸、95%乙腈)，0-100% B線性洗脫進(jìn)行純化，離子交換(SP Sepharose FF)以及 Superdex-75 (Amersham Biosciences)(緩沖為 PBS， ρΗ7· 4)凝膠柱層析獲得重組Δ 11-IFN-β-Ser6 (SEQIDN0 :4)蛋白，純度大于98. 0% (附圖 3 :A、B)。實例2缺失型重組Δ Il-IFN-β-Cys6 (SEQ IDNO :1)蛋白在酵母中的重組表達(dá)和制備。在本實施例中，所涉及的缺失型重組蛋白具有All-IFN-^-Cys6的結(jié)構(gòu)。根據(jù) Δ Il-IFN-β 的 cDNA 序列(SEQ ID NO 5)設(shè)計合成 2 條引物 P3、P4
P3 5' -CGCTCGAGAAAAGATCTTCCAATTTTCAGTGTCAGAAG-3' (SEQ ID NO 9)P4 5' -CGGCGGCCGCTCATTAGTTTCGGAGGTAACC-3' (SEQ ID NO 10)注P3中CG為引物保護(hù)堿基，CTCGAG為Bio I酶切位點；P2中CG為引物保護(hù)堿基，GCGGCCGC為Not I酶切位點。以人工合成Δ Il-IFN-β的cDNA序列(SEQ ID NO 5)為模板，用引物P3和 P4擴增Δ Il-IFN-β-Cys6(SEQ ID NO :11)基因(P3頭部含有Xho I酶切位點，P4尾部含有終止密碼子和Not I酶切位點)，用)(ho I和Not I雙酶切后與pGAPZaA連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGAPZ a A- Δ 11-IFN- β -Cys6,經(jīng)DNA測序(TAKARA，大連)后表明，擴增的 Δ Il-IFN-^-Cys6 基因與設(shè)計完全一致(SEQ ID NO: 11)。將重組質(zhì)粒用Avr II線性化，用電轉(zhuǎn)儀將線性化的重組質(zhì)粒 pGAPZ a A-Δ Il-IFN-β-Cys6 導(dǎo)入 GSl 15 畢赤酵母 Qnvitrogen)中，經(jīng) His+和 kocin 篩選，獲得抗kocinlOOOmg/ml的高拷貝克隆菌。挑取表達(dá)菌，接種于5ml YPD培養(yǎng)基中，30°C過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接入250ml YPD培養(yǎng)基中表達(dá)96小時。收集上清，經(jīng)超濾后，用 SP Sepharose FF、反相 C18、SP Sepharose FF 和 Superdex-75 純化制備重組融合蛋白 Δ Il-IFN-β -Cys6(SEQ ID NO :1)，純度大于 97. 0%。實例3缺失型重組Δ Il-IFN-β-Cys6 (SEQ ID NO :1)蛋白在CHO細(xì)胞中的重組表達(dá)和制備。在本實施例中，所涉及的缺失型重組蛋白具有Δ Il-IFN-^-Cys6的結(jié)構(gòu)。根據(jù)設(shè)計要求，委托寶生物(大連)有限公司進(jìn)行全基因合成All-IFN-^-Cys6的cDNA序列(SEQ IDNO 12)ο將全人工合成All-IFN-^-Cys6的基因序列(SEQ ID NO :1 ，經(jīng) Hind III和EcoR I雙酶切后與同樣雙酶切的質(zhì)粒的ecTag2A連接構(gòu)建重組質(zhì)粒 pSecTag2A- Δ 11-IFN- β -Cys60 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 jToplOF ‘，經(jīng) Hind III 和 EcoR I雙酶切驗證正確，DNA測序(TAKARA，大連)結(jié)果顯示，擴增的Δ Il-IFN-β-Cys6基因與設(shè)計完全一致(SEQ ID而1幻。將上述測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CH0-k細(xì)胞，通過加壓篩選獲得能穩(wěn)定、高效分泌表達(dá)All-IFN-i3-Cys6的細(xì)胞株。經(jīng)擴大培養(yǎng)后通過SP Sepharose FF、Blue、反相 C18 柱、SP Sepharose FF 和 Superdex-75 等純化方法，制備的重組 Δ Il-IFN-β-Cys6 (SEQ ID NO :1)蛋白，純度大于 98. 0%。實例4制備的缺失型重組人β干擾素的體外抗病毒生物學(xué)活性試驗采用VSV (水泡口炎病毒)病毒攻擊Wish細(xì)胞病變法。按藥典2005版第三部中干擾素生物活性測定方法(附錄VIII)，每孔按2 X IO4個細(xì)胞鋪入96孔平底培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜，然后將待檢樣品與不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品分別加入已接種Wish細(xì)胞的培養(yǎng)板中作用 16-24小時。吸出所有培養(yǎng)液，將VSV用攻擊培養(yǎng)稀釋液稀釋至IOOTCID5ci，加入攻擊M小時。結(jié)晶紫染色沖洗后70%乙醇溶解，OD57tl測定OD值。通過與β干擾素國際活性標(biāo)準(zhǔn)品作對照，所測數(shù)據(jù)用Softmax pro5. 3軟件分析。通過軟件SoftmaXpro53分別計算的A值， B值，C值，D值及相關(guān)系數(shù)R~2 (表1)。同時用Softmax pro5. 3軟件計算的缺失型重組人 β干擾素抗病毒比活性，結(jié)果見表2。其中干擾素國際活性標(biāo)準(zhǔn)品(NIBSC)的半效稀釋倍數(shù)(Er)為90. 9，Es為測定樣品的半效稀釋倍數(shù)。表 權(quán)利要求
1.一種在氨基末端缺失11位氨基酸的人β干擾素突變體蛋白(SEQ ID NO :1)。
2.權(quán)利1中所述缺失型人β干擾素突變體，其氨基酸序列第6位的半胱氨酸(Cys)可替換為絲氨酸(kr)。
3.權(quán)利要求1、2中所述的缺失型人β干擾素突變體蛋白的第1位氨基酸可替換為甲硫氨酸(Met)或甘氨酸(Gly)或精氨酸(Arg)。
4.權(quán)利要求1、2中所述的缺失型人β干擾素突變體蛋白的第1位氨基酸前可帶有甲硫氨酸(Met)或甘氨酸(Gly)或精氨酸(Arg)。
5.權(quán)利要求1、2、3中所述缺失型人β干擾素突變體適用于基因工程重組表達(dá)并制備， 其重組表達(dá)宿主包含大腸桿菌、哺乳動物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或植物、動物的任何一種。
6.權(quán)利要求5中所述缺失型人β干擾素突變體的重組表達(dá)和制備，指通過含有其編碼的相應(yīng)cDNA序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化相應(yīng)宿主細(xì)胞，經(jīng)表達(dá)篩選、培養(yǎng)、提取和純化目的蛋白的過程。
7.權(quán)利要求5所述的哺乳動物細(xì)胞優(yōu)選CH0，構(gòu)建的含缺失型人β干擾素突變體基因序列的重組真核表達(dá)載體含有信號肽的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)及其DNA序列(SEQ IDNO 3)。
8.權(quán)利要求1、2、3所述缺失型人β干擾素突變體可作為一種用于治療多發(fā)性硬化癥或病毒性感染疾病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人β干擾素的氨基末端缺失11個氨基酸的突變體(Δ11-IFN-β)以及其制備方法。Δ11-IFN-β經(jīng)重組制備后具有比未缺失型更高的體外抗病毒比活性和穩(wěn)定性，更適合用于治療多發(fā)性硬化癥和病毒性感染等疾病。
文檔編號A61P31/12GK102260344SQ201010182659
公開日2011年11月30日 申請日期2010年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月26日
發(fā)明者劉日勇, 張淳, 羅嵐, 范開, 陳清 申請人:重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司