專利名稱：：與腫瘤轉(zhuǎn)移的新生血管有關(guān)的纖連蛋白的ed-a抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)移瘤的檢測(cè)和治療，即在不同于原發(fā)性腫瘤的部位的部位產(chǎn)生的繼發(fā)性腫瘤的一企測(cè)和治療。本發(fā)明涉及一種結(jié)合于纖連蛋白的ED-A同種型(isoform)的結(jié)合成員的應(yīng)用，尤其是結(jié)合于纖連蛋白的結(jié)構(gòu)域ED-A的結(jié)合成員。
背景技術(shù)：
：大多凄t與癌癥有關(guān)的死亡涉及疾病的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散(HanahanandWeinberg2000)并且有活力的新生血管是侵襲性肺瘤轉(zhuǎn)移瘤的特征。肺瘤分為良性肺瘤或惡性肺瘤。惡性腫瘤能夠從原發(fā)性部位(原發(fā)性肺瘤)擴(kuò)散到身體的其它部位，而良性肺瘤則不能擴(kuò)散。惡性肺瘤可以通過侵襲和轉(zhuǎn)移自它們的原發(fā)性部位擴(kuò)散。由于轉(zhuǎn)移而形成的肺瘤纟皮稱作，例如，轉(zhuǎn)移瘤、繼發(fā)性腫瘤、轉(zhuǎn)移性病變或轉(zhuǎn)移性病灶。血管生成描述了新血管從現(xiàn)有血管的生長(zhǎng)。肺瘤可以通過分泌各種生長(zhǎng)因子(例如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)而誘導(dǎo)血管生成。腫瘤血管生成4吏得腫瘤可以生長(zhǎng)超過幾毫米的直徑并且還是胂瘤轉(zhuǎn)移的先決條件。由于血管生成而形成的新血管會(huì)形成肺瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移瘤的*斤生血管。纖連蛋白(FN)是一種糖蛋白并且在各種正常組織和體液中廣泛表達(dá)。它是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的一種成分，并在許多生物學(xué)過程中發(fā)揮作用，其中上述生物過程包括細(xì)胞粘附、細(xì)胞遷移、止血、血才全形成、傷口愈合、組織分化以及致癌性轉(zhuǎn)化。不同的FN同種型是通過初級(jí)轉(zhuǎn)錄物FN前mRNA的三個(gè)區(qū)域(ED-A、ED-B、niCS)的可變剪接而產(chǎn)生的，是一種通過細(xì)胞因子和細(xì)月包夕卜pH^f直來調(diào)節(jié)的過禾呈(Balza1988;Carnemolla1989;Borsi1990;Borsi1995)。纖連蛋白包含兩種可以經(jīng)受可變剪4妾的III型J求^)犬額外結(jié)構(gòu)i或ED-A和ED國(guó)B(ffrench畫Constant1995,Hynes1990,Kasparetal.2006)。小鼠纖連蛋白和人纖連蛋白的ED-A的96.7%是相同的(在兩個(gè)90個(gè)氨基酸的序列之間僅3個(gè)氨基酸不同，參見圖5)。已才艮道了在m腦A水平(參見例如，Jacobsetal.2002,Matsumotoetal.1999,Oyamaetal.1989,Tavianetal.1994)、在分離蛋白的水平(Borsietal.1987)以及在免疫組織化學(xué)水平(Borsietal,1998,Heikmheimoetal.1991,Koukoulisetal.1993,Koukoulisetal.1995，Lohietal.1995，Scarpinoetal.1999),纟f連蛋白的ED畫A在月中瘤細(xì)月包和實(shí)體月中瘤中的表達(dá)。Borsietal.，1998,ExpCellRes,240,244-251也已才艮道了ED-A存在于原發(fā)性腫瘤的新血管中。然而，先前并沒有指出ED-A與腫瘤轉(zhuǎn)移的新血管有關(guān)。我們?cè)诒疚闹斜砻?，纖連蛋白的ED-A在腫瘤轉(zhuǎn)移瘤的新生血管中選擇性地表達(dá)。因?yàn)槟[瘤血管容易受到靜脈給予的治療劑的作用(Neri和Bicknell2005,Rybaketal.2006，Thorpe2004,Trachsel和Neri2006),所以例如結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A的抗體分子的結(jié)合分子代表新型制劑，其可以用于制備用來治療一種和/或多種腫瘤轉(zhuǎn)移瘤的藥物。肺瘤新血管(腫瘤血管^fe向)的療法是一種用于治療肺瘤轉(zhuǎn)移瘤的有前途的方法。腫瘤血管把向的目的是破壞腫瘤本身內(nèi)的血管，減少血流量以使肺瘤喪失氧和營(yíng)養(yǎng)物，從而引起腫瘤細(xì)月包死亡。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了抗ED-A抗體，其選擇性地識(shí)別肺瘤轉(zhuǎn)移瘤的新形成血管。本發(fā)明在一個(gè)方面涉及結(jié)合纖連蛋白的額外結(jié)構(gòu)域-A(ED-A)同種型(A-FN)的結(jié)合成員(例如抗體分子)在用于制備用來治療一種和/或多種腫瘤轉(zhuǎn)移瘤的藥劑中的應(yīng)用。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員(例如抗體分子)在用于制備用來治療一種和/或多種胂瘤轉(zhuǎn)移瘤的藥劑中的應(yīng)用。在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員(例如抗體分子)用于將結(jié)合(共軛或軛合)于該結(jié)合成員的分子遞送到腫瘤轉(zhuǎn)移瘤的新生血管的應(yīng)用。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員(例如抗體分子)用于將結(jié)合(共輒或軛合)于該結(jié)合成員的分子遞送到腫瘤轉(zhuǎn)移瘤的新生血管的應(yīng)用。在其〗也的方面，該結(jié)合成員可以用于制備用來遞送上述分子的藥劑。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員(例如抗體分子)用于制備用于診斷肺瘤轉(zhuǎn)移瘤的診斷產(chǎn)品的應(yīng)用。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員(例如抗體分子)用于制備用于診斷腫瘤轉(zhuǎn)移瘤的診斷產(chǎn)品的應(yīng)用。本發(fā)明在一個(gè)方面還涉及在人或動(dòng)物體內(nèi)4企測(cè)或診斷腫瘤轉(zhuǎn)移瘤的方法，包4舌以下步-驟(a)對(duì)人或動(dòng)物鄉(xiāng)合予結(jié)合成員，例如結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的抗體分子，以及(b)確定在人或動(dòng)物體內(nèi)在遠(yuǎn)離由原發(fā)性腫瘤目前或以前占據(jù)部位的部位存在或不存在該結(jié)合成員；其中，在人或動(dòng)物體內(nèi)結(jié)合成員定位于遠(yuǎn)離目前或以前由原發(fā)性肺瘤占據(jù)部位的部位表明了肺瘤轉(zhuǎn)移瘤的存在。本發(fā)明在另一個(gè)方面涉及在人或動(dòng)物體內(nèi)才僉測(cè)或it斷腫瘤轉(zhuǎn)移瘤的方法，包>^以下步艱《(a)對(duì)人或動(dòng)物《合予結(jié)合成員，例如結(jié)合纖連蛋白的ED-A的抗體分子，以及(b)確定在人或動(dòng)物體內(nèi)在遠(yuǎn)離由原發(fā)性腫瘤目前或以前占據(jù)部^立的部^立存在或不存在該結(jié)合成員；其中，在人或動(dòng)物中結(jié)合成員定位于遠(yuǎn)離目前或以前由原發(fā)性腫瘤占據(jù)部位的部位表明了腫瘤轉(zhuǎn)移瘤的存在。本發(fā)明在一個(gè)方面還涉及治療個(gè)體體內(nèi)的腫瘤轉(zhuǎn)移瘤的方法，包括癥合予該個(gè)體治療有效量的包含結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員(例如抗體分子)的藥劑。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及治療個(gè)體體內(nèi)的肺瘤轉(zhuǎn)移瘤的方法，包括給予該個(gè)體治療有效量的包含結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員(例如抗體分子)的藥劑。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及在人或動(dòng)物體內(nèi)將分子遞送到腫瘤轉(zhuǎn)移瘤的新生血管的方法，包括向人或動(dòng)物給予結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員，例如抗體分子，其中該結(jié)合成員結(jié)合于上述分子。在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及在人或動(dòng)物中將分子遞送到肺瘤4爭(zhēng)移瘤的新生血管的方法，包4舌向人或動(dòng)物主會(huì)予結(jié)合纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員，例如抗體分子，其中該結(jié)合成員結(jié)合于上述分子。本發(fā)明的結(jié)合成員可以是結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型和/或纖連蛋白的ED畫A的#元體，包含4元體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9、或它們的變體的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。優(yōu)選地，本發(fā)明的結(jié)合成員是結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型和/或纖連蛋白的ED-A的抗體，包含抗體B2、C5、D5、C8、F8、B7或G9、或它們的變體的一個(gè)或多個(gè)互^卜決定區(qū)(CDR)。最優(yōu)選地，本發(fā)明的結(jié)合成員是結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型和/或纖連蛋白的ED-A的抗體，包含抗體F8或其變體的一個(gè)或多個(gè)互4卜決定區(qū)(CDR)。本發(fā)明的結(jié)合成員可以包含抗體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9的一組H和/或LCDR，或在所4皮露的H和/或LCDR組中具有10個(gè)或更少，例如，1、2、3、4、或5個(gè)氨基酉吏置4奐的#元體Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9的一組H和/或LCDR。優(yōu)選地，本發(fā)明的結(jié)合成員包含抗體B2、C5、D5、C8、F8、B7或G9的一纟且H和/或LCDR,其中在所才皮露的H和/或LCDR組中具有10個(gè)或更少，例如，1、2、3、4、或5個(gè)氨基酸置換。優(yōu)選地，本發(fā)明的結(jié)合成員包含抗體F8的一組H和/或LCDR,其中在所4皮露的H和/或LCDR組中具有10個(gè)或更少，例如，1、2、3、4、或5個(gè)氨基酸置才奐?？梢詽撛诘卦贑DR組內(nèi)、以及可以在CDR1、CDR2和/或CDR3內(nèi)的任4可殘基處發(fā)生置換。例如，本發(fā)明的結(jié)合成員可以包含一個(gè)或多個(gè)CDR(如本文中描述的)，例如，CDR3,以及可選地CDR1和CDR2,以形成一組CDR。200本發(fā)明的結(jié)合成員還可以包含抗體分子，例如人抗體分子。結(jié)合成員通常包含抗體VH和/或VL結(jié)構(gòu)域。作為本發(fā)明的一部分，還^是供了結(jié)合成員的VH結(jié)構(gòu)域。在每個(gè)VH和VL結(jié)構(gòu)域內(nèi)有互補(bǔ)決定區(qū)("CDR")、以及骨架區(qū)("FR")。VH結(jié)構(gòu)i或包含一組HCDR,而VL結(jié)構(gòu)i或包含一組LCDR。4元體分子可以包含抗體VH結(jié)構(gòu):威，抗體VH結(jié)構(gòu)i或包含VHCDR1、CDR2和CDR3，以及骨架。它可以可一,纟奐地或還包括抗體VL結(jié)構(gòu)域，抗體VL結(jié)構(gòu)域包含VLCDR1、CDR2和CDR3,以及骨架。本文描述了抗體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8以及G9的VH禾口VL結(jié)構(gòu)i或和CDR。本文4皮露的所有VH和VL序列、CDR序列、CDR組、HCDR組以及LCDR組是供本發(fā)明之用的結(jié)合成員的方面和實(shí)施方式。如本文所描述的，"CDR組"包括CDR1、CDR2以及CDR3。因此，一組HCDR是指HCDR1、HCDR2以及HCDR3，而一組LCDR是指LCDR1、LCDR2以及LCDR3。除非另有說明，"CDR組"包括HCDR和LCDR。本發(fā)明的結(jié)合成員可以包括抗體VH結(jié)構(gòu)域，該抗體VH結(jié)構(gòu)i或包含互補(bǔ)決定區(qū)HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及骨架，其中HCDR1是SEQID110:3、23、33、43、53、63、73、83、93、103或113,以及其中可選;也HCDR2是SEQIDNO:4和/或HCDR3是SEQIDNO:5。優(yōu)選地，HCDR1是SEQIDNO:23、33、43、53、73、83或103。最優(yōu)選;也，HCDR1是SEQIDMO:83。通常，VH結(jié)構(gòu)域與VL結(jié)構(gòu)域配對(duì)以提供抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)，雖然如下文進(jìn)一步描述的，VH或VL結(jié)構(gòu)域可以單獨(dú)地用來結(jié)合抗原。因此，本發(fā)明的結(jié)合成員可以進(jìn)一步包括抗體VL結(jié)構(gòu)域，該抗體VL結(jié)構(gòu)域包含互補(bǔ)決定區(qū)LCDR1、LCDR2和LCDR3,以及骨架，其中LCDR1是SEQIDNO:6、26、36、46、56、66、76、86、96、106或116，以及其中可選地LCDR2是SEQIDNO:7和/或LCDR3是SEQIDNO:8。優(yōu)選地，LCDR1是SEQIDNO:26、36、46、56、76、86或106。最優(yōu)選地，LCDR1是SEQIDNO:86。在一個(gè)方面，本發(fā)明的結(jié)合成員是纖連蛋白的ED-A的分離的抗體分子，其包括VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域，其中VH結(jié)構(gòu)域包括骨架和一組互補(bǔ)決定區(qū)HCDR1、HCDR2以及HCDR3，并且其中VL結(jié)構(gòu)i或包4舌互^卜決定區(qū)LCDR1、LCDR2和LCDR3以及骨架，以及其中HCDR1具有氨基酸序歹'JSEQIDNO:3、23、33、43、53、63、73、83、93、103或113，HCDR2具有氨基酸序列SEQIDNO:4，HCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:5,LCDR1具有氨基酸序列SEQIDNO:6、26、36、46、56、66、76、86、96、106或116;LCDR2具有氨基酸序列SEQIDNO:7;以及LCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:8?？贵w的一個(gè)或多個(gè)CDR或一組CDR可以一皮移才直(4如汰，graft)到骨架，(例如人骨架)以纟是供本發(fā)明〗吏用的抗體分子。骨架區(qū)可以包含人類種系基因片段序列。因此，骨架可以被種系化，從而改變骨架內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)殘基，以與最類似于人類種系骨架中的等效位置處的殘基匹配。本發(fā)明的結(jié)合成員可以是具有VH結(jié)構(gòu)i或的分離的抗體分子，該VH結(jié)構(gòu)域包含人類種系骨架中的一組HCDR,例如DP47。通常，該結(jié)合成員還具有VL結(jié)構(gòu)域，該VL結(jié)構(gòu)域包含一纟且LCDR，例3口，在人類種系骨架中。VL結(jié)構(gòu)i或的人類種系骨架可以是DPK22。本發(fā)明的VH結(jié)構(gòu)域可以具有氨基S吏序列SEQIDNO:1、21、31、41、51、61、71、81、91、101或111。4尤選i也，本發(fā)明的VH結(jié)構(gòu)域具有氨基酸序列SEQIDNO:21、31、41、51、71、81或101。最優(yōu)選地，本發(fā)明的VH結(jié)構(gòu)域具有氨基酸序列SEQIDNO:81。本發(fā)明的VL結(jié)構(gòu)域可以具有氨基酸SEQIDNO:2、22、32、42、52、62、72、82、92、102或112。4尤選i也，本發(fā)明的VL結(jié)構(gòu)i或具有氨基酸SEQIDNO:22、32、42、52、72、82或102。最優(yōu)選地，本發(fā)明的VL結(jié)構(gòu)i或具有氨基酸SEQIDNO:82。本發(fā)明的結(jié)合成員可以是單鏈Fv(scFv),其包含借助于連接肽(peptidelinker)相連的VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域。4支術(shù)人員可以選擇連接肽的適當(dāng)長(zhǎng)度和序列，例如長(zhǎng)度為至少5個(gè)或10個(gè)氨基酸，長(zhǎng)度長(zhǎng)達(dá)約15、20或25個(gè)氨基S臾。scFv可以由氨基酸序列SEQIDNO:9組成或包含氨基酸序列SEQIDNO:9。本發(fā)明的結(jié)合成員可以是雙1介抗體(或雙特異抗體，diabody)(WO94/13804;Holliger1993a)，該乂K介抗體是一種包含具有經(jīng)由連4妄肽相連的VH結(jié)構(gòu)i或和VL結(jié)構(gòu)i或的第一多肽和具有經(jīng)由連4妻肽相連的VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域的第二多肽的分子，其中第一多肽的VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域分別與第二多肽的VL結(jié)構(gòu)域和VH結(jié)構(gòu)域配對(duì)。該第一和第二多肽可以是相同的(從而配對(duì)形成二價(jià)分子)或不同的(乂人而配對(duì)形成雙特異性分子)。才支術(shù)人員可以選才奪連4姿肽的適當(dāng)長(zhǎng)度和序列，例如，長(zhǎng)度為5個(gè)或更少氨基酸。該連接肽可以具有氨基酸序列SEQIDNO:28。本發(fā)明的結(jié)合成員可以包含非抗體分子內(nèi)的抗原結(jié)合位點(diǎn)，通常由一個(gè)或多個(gè)CDR^是供，例如，非抗體蛋白質(zhì)支架中的一組CDR。在本文其它地方詳細(xì)描述了結(jié)合成員，包括非抗體分子和抗體分子。本發(fā)明的結(jié)合成員可以結(jié)合于具有殺生物活性或細(xì)月包毒活性的分子。可替換地，本發(fā)明的結(jié)合成員可以結(jié)合于放射性同位素。作為進(jìn)一步的替換方式，本發(fā)明的結(jié)合成員可以用可檢測(cè)標(biāo)記物力口以標(biāo)記。下文更詳細(xì)地描述了本發(fā)明的這些和其它方面。圖1:A:示出了基于灌注的蛋白質(zhì)組方法的示意圖，其中基于灌注的蛋白質(zhì)組方法用于比較分析來自健康小鼠肝臟和來自小鼠的F9肝專爭(zhēng)移瘤中的可及蛋白(accessibleprotein)。B:示出了由F9肝轉(zhuǎn)移瘤發(fā)展的較大的轉(zhuǎn)移性病灶。C:示出了F9肝轉(zhuǎn)移瘤(轉(zhuǎn)移灶)的血管的選沖奪性和有效染色以及血管的強(qiáng)染色和正常肝臟(肝)中的一些竇狀隙的標(biāo)記。染色對(duì)應(yīng)于深色的線，并且它是在纟冬端麻醉(terminalanaesthesis)下用PBS(pH7.4)中的15ml的1.8mM石黃基琥珀酰亞胺基-6-[生物素-氨基]己酸酯(lmg/ml);容液(補(bǔ)充有10%右旋糖酐-40作為血漿增容劑)灌注荷瘤小鼠，接著用4連霉親和素-石咸性-疇酸酶結(jié)合物進(jìn)4亍組織化學(xué)染色而獲得的。圖2:A:示出了通過對(duì)正常小鼠肝臟(正常)和來自小鼠的F9肝專爭(zhēng)牙多夕雷(月中夕窗)的纟千連"蛋白結(jié)斗勾i或纟吉片勾的-蛋白乂貢纟且分-木f戶斤馮角定的纖連蛋白肽的位置。B:對(duì)通過正常小鼠肝臟樣品和來自小鼠的F9肝轉(zhuǎn)移瘤的蛋白質(zhì)組分析所鑒定的肽進(jìn)行LC-MS/MS實(shí)驗(yàn)。通過HPLC首先分離肽，隨后洗脫成192個(gè)流^分。每個(gè)流4分在MALDI目標(biāo)板上標(biāo)記為一個(gè)分離的點(diǎn)并且獲得每個(gè)流份的MALDITOFMS語。針對(duì)三個(gè)重復(fù)的F9小鼠肝轉(zhuǎn)移瘤樣品(參見圖片標(biāo)記"肝轉(zhuǎn)移")和正常小鼠肝臟的三個(gè)重復(fù)樣品(參見圖片標(biāo)記"正常肝臟")示出了兩種不同的特定HPLC流份(分別為上部的行和中間行)的質(zhì)譜。按照內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)將離子峰高度歸一化(參見材料和方法)，因而使得可以半定量比較在不同樣品中的相應(yīng)的肽。在上部的行中，用箭頭指示的峰(在示出的第一樣品中標(biāo)記為"FU")對(duì)應(yīng)于肽FLTTTPNSLLVSWQAPR(SEQIDNo:15)，其書亍生自纖連蛋白的恒定區(qū)(纖連蛋白-in型結(jié)構(gòu)域16)。此肽的離子峰在F9小鼠肝轉(zhuǎn)移瘤樣品(肝轉(zhuǎn)移)中更高，4旦也存在于正常小鼠肝臟樣品(正常肝臟)中，這表明纖連蛋白分子原則上存在于F9小鼠肝轉(zhuǎn)移瘤和正常小鼠肝臟中，^旦似乎在F9小鼠肝轉(zhuǎn)移瘤樣品中更豐富。在中間4亍中，由右手箭頭指示的峰(標(biāo)記為"EDA")對(duì)應(yīng)于肽IAWESPQGQVSR(SEQIDNO:16)，其書f生自纖連蛋白的可變剪接的額外結(jié)構(gòu)域A。此ED-A肽僅在F9小鼠肝轉(zhuǎn)移瘤樣品(肝轉(zhuǎn)移)可4企測(cè)到而在正常小鼠肝臟才羊品(正常肝臟)則4企測(cè)不到。由左手箭頭指示的參比肽(標(biāo)記為"ref')用來鑒定其中ED-A肽洗脫的HPLC流yf分。這意味著，在正常小鼠肝臟樣品(正常肝臟)的譜中參比肽的峰的存在表明，示出了其中ED-A肽是可檢測(cè)的流份的質(zhì)譜(如果它存在于正常小鼠肝樣品中)。最下一行示出了在ED-A肽離子峰的位置(由箭頭指示)處質(zhì)譜的放大視圖，其證明在正常肝臟樣品中不存在這種肽。圖3:A:具有flag-標(biāo)記親代抗ED-A抗體(抗ED-A)的F9肝轉(zhuǎn)移瘤和相鄰正常小鼠肝臟組織的免疫組織〗匕學(xué)染色(深色的線)展示出了在轉(zhuǎn)移瘤中強(qiáng)烈染色的血管樣式，而在相鄰的正常肝臟組織中則檢測(cè)不到任何特異性染色。在陰性對(duì)照(對(duì)照)中，省略了flag-標(biāo)i己的親4戈抗ED-A抗體。4昔助于flag-標(biāo)記親^抗ED-A抗體7見測(cè)到的染色才羊式類似于借助于flag-標(biāo)記的抗ED-BscFv(L19)才元體(抗EDB)只見測(cè)到的染色才羊式，flag-標(biāo)i己的抗ED畫BscFv(L19)抗體(抗EDB)識(shí)別纖連蛋白額外結(jié)構(gòu)域B，是新生血管結(jié)構(gòu)的一種既定標(biāo)記。B:示出了Svl90小鼠的器官(脾臟、心臟、肺臟以及具有兩個(gè)轉(zhuǎn)移瘤的肝部分)，其中上述小鼠一皮注射F9DR肺瘤細(xì)胞，并在三周以后進(jìn)一步在尾靜脈被注射(200(il/小鼠，即60pg抗體/小鼠)Alexa750-標(biāo)記的親抗ED-A抗體(終濃度為0.3mg/ml)。在注射Alexa750-標(biāo)i己的親^U元ED-A抗體后6小時(shí)，切除小鼠器官。利用國(guó)產(chǎn)的紅外線熒光成像儀(Birchleretal.1999)來可一見化Alexa750-標(biāo)記的親K抗ED-A抗體染色，其中該成傳Z義裝備有卣鴒燈、專門用于Alexa750的激發(fā)和發(fā)射濾光片、以及單色CCD照詳目才幾。圖4:示出了ED-A在人轉(zhuǎn)移瘤中的表達(dá)。通過免疫組織化學(xué)，利用flag-標(biāo)記的親代抗ED-A抗體來評(píng)估ED-A在人轉(zhuǎn)移瘤中的表達(dá)。雖然在省略flag-標(biāo)記的親代抗ED-A抗體的陰性對(duì)照(對(duì)照)中沒有4企測(cè)到陽性染色并且對(duì)于具有flag-標(biāo)記的親代抗ED-A抗體的人正常肺組織切片(正常人肺)僅觀測(cè)到非常弱的背景染色，但人肺轉(zhuǎn)移瘤(RCC[腎細(xì)胞癌]的人肺轉(zhuǎn)移)—皮flag-標(biāo)記的親代抗ED-A抗體(抗EDA)強(qiáng)烈陽性染色，如深色的線和陰影所示。flag-標(biāo)記的親代抗ED-A抗體的染色樣式主要是血管染色并且類似于用flag-標(biāo)記的抗ED-BscFv(L19)抗體(抗EDB)所7見測(cè)到的染色樣式，該flag-標(biāo)記的抗ED-BscFv(L19)抗體(抗EDB)識(shí)別纖連蛋白額外結(jié)構(gòu)域B,是一種新生血管結(jié)構(gòu)的既定標(biāo)記。借助于flag-標(biāo)記的親代抗ED-A抗體并通過結(jié)腸直腸癌的人類肝臟轉(zhuǎn)移瘤(CRC的人類肝轉(zhuǎn)移)的免疫組織化學(xué)分析獲得了類似結(jié)果。flag-標(biāo)記的親^抗ED-A抗體展示了結(jié)腸直腸癌的人類肝臟轉(zhuǎn)移瘤的強(qiáng)烈血管和間質(zhì)染色樣式。圖5:示出了人ED-A(上方序列)和小鼠ED-A(下方序列)之間的序列比對(duì)。星號(hào)表示人ED-A和小鼠ED-A的氨基酸相同的氨基酸位置。圖6:A:示出了抗ED-A抗體H1重鏈(VH)的核普酸序列(SEQIDNO:12)?？笶D-A抗體HI的重鏈CDR1的核苷酸序列力口下劃線?？笶D-A抗體HI的重《連CDR2的核苷酸序列以#f體示^并加7^廁?？笶D-A抗體HI的重《連CDR3的核香酸序列以黑體示出并加下劃線。B:示出了抗ED-A抗體HI4妻頭序列的核普酸序列(SEQIDNO:14)。C:示出了抗ED-A抗體HI輕鏈(VL)的核香酸序列(SEQIDNO:13)?？笶D-A抗體HI的輕《連CDR1的核苷酸序列加下劃線?？笶D-A抗體HI的輕鏈CDR2的核苷酸序列以^爭(zhēng)伴示^#》口T^V戲'。抗ED-A抗體HI的輕《連CDR3的核苦酸序列以黑體示出并加下劃線。圖7:A:示出了抗ED-A抗體H1重鏈(VH)的氨基酸序列(SEQIDNO:1)?？笶D-A抗體HI的重《連CDR1的氨基酸序列(SEQIDNO:3)力口下劃線?？笶D-A抗體HI的重鏈CDR2的氨基酸序歹'J(SEQIDNO:4)以#爭(zhēng)體示^7~^/錄?？笶D-A抗體HI的重鏈CDR3的氨基酸序列(SEQIDNO:5)以黑體示出并加下劃線。B:示出了抗ED-A抗體H1接頭序列的氨基酸序列(SEQIDNO:11)。C:示出了抗ED-A抗體HI輕《連(VL)的氨基酸序列(SEQIDNO:2)?？笶D-A抗體HI的輕鏈CDR1的氨基酸序列(SEQIDNO:6)力口下劃線?？笶D-A抗體HI的輕4連CDR2的氨基酸序列(SEQIDNO:7)以-爭(zhēng)伴示^#》口T^v/試?？笶D-A抗體HI的輕鏈CDR3的氨基酸序列(SEQIDNO:8)以黑體示出并加下劃線。圖8:示出了F8雙價(jià)抗體在F9帶瘤小鼠中的生物分布。4只F9帶瘤小鼠一皮靜力永注射1125標(biāo)記的F8雙j介抗體。在24小時(shí)以后處死小鼠并切除肺瘤、肝、肺、脾、心臟、腎、腸、尾以及血液。然后對(duì)肺瘤、肝、肺、脾、心臟、腎、腸、尾以及血液進(jìn)行放射性計(jì)數(shù)。圖8中示出了每克(g)腫瘤、肝、肺、脾、心臟、腎、腸、尾以及血液中4企測(cè)到的1125標(biāo)記的F8雙價(jià)抗體的注射劑量(ID)的百分比(％)。F9肺瘤(腫瘤)包含比所分析的任何其它小鼠組織多約4倍的ID。具體實(shí)施例方式術(shù)語如在本文其它地方所述，纖連蛋白是易遭受可變剪接的抗原，并且纖連蛋白的許多可變同種型是已知的。額外結(jié)構(gòu)域-A(EDA或ED-A)還^皮稱為ED、額外III型重復(fù)A(EIIIA)或EDI。Kornblihttetal.(1984)，NucleicAcidsRes.12,5853-5868和Paolellaetal.(1988):NucleicAcidsRes.16,3545-3557已經(jīng)^>布了人ED-A的序列。人ED-A的序列還可以獲自SwissProt凄t寺居庫(kù)，4乍為以登錄號(hào)P02751保藏的氨基S臾序列的氨基酸1631-1720(纖連蛋白III型12;額外結(jié)構(gòu)域2)。小鼠ED-A的序列可獲自SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)，作為以登錄號(hào)PI1276保藏的氨基酸序列的氨基酸1721-1810(纖連蛋白III型13;額外結(jié)構(gòu)i或2)。纖連蛋白的ED-A同種型(A-FN)包含額外結(jié)構(gòu)域-A(ED-A)。人A-FN的序列可以由相應(yīng)的人纖連蛋白前體序列推斷得到，該前體序列可獲自SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為P02751。小鼠A-FN的序列可以由相應(yīng)的小鼠纖連蛋白前體序列推斷得到，該前體序列可獲自SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為PI1276。A-FN可以是纖連蛋白的人ED-A同種型。ED-A可以是人纖連蛋白的額外結(jié)構(gòu)域-A。ED-A是90個(gè)氨基酸序列，其通過可變剪接而被插入纖連蛋白(FN)中并^立于FN的結(jié)構(gòu)i或11和12之間(Borsietal.，1987,J.CellBiol.,104,595-600)。ED-A基本上不存在于血漿形式的FN中，但匸在胚胎發(fā)生、組織重構(gòu)、纖維4匕、心臟移才直以及實(shí)體肺瘤生長(zhǎng)期間卻是豐富的。22可變剪接是指發(fā)生DNA的初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄物以產(chǎn)生不同的mRNA的剪接存在不同模式。在切除內(nèi)含子以后，可以確定選擇哪些外顯子一皮一起剪4妄以形成mRNA。可變剪4妻導(dǎo)至丈產(chǎn)生包含不同的外顯子和/或不同凄t目的外顯子的不同同種型。例如，一種同種型可以包含對(duì)應(yīng)于一個(gè)或多個(gè)外顯子的另外的氨基酸序列，其可以包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)^t潛合顛其描述彼此結(jié)合的一對(duì)分子的一個(gè)成員。結(jié)合對(duì)的成員可以是來自天然的或全部或部分地合成產(chǎn)生的。分子對(duì)的一個(gè)成員具有在其表面上的區(qū)域、或空腔，其結(jié)合于并因而互補(bǔ)于上述分子對(duì)的另一成員的特定的空間和才及性組織。結(jié)合對(duì)類型的實(shí)例是抗原-抗體、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受體、受體-配體、酶-底物。本發(fā)明涉及抗原-抗體型反應(yīng)。結(jié)合成員通常包括具有抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。例如，結(jié)合成員可以是抗體分子或包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的非抗體蛋白。抗原結(jié)合位點(diǎn)可以通過以下方式來4是供排列在非抗體蛋白支架如纖連蛋白或細(xì)月包色素B等上的互4卜決定區(qū)(CDR)(Haan&Maggos，2004;Koide1998;Hygren1997)，或隨才幾化或突變?cè)诘鞍字Ъ軆?nèi)的環(huán)的氨基酸殘基以賦予對(duì)于預(yù)期靶的結(jié)合特異性。Nygren等(1997)已詳細(xì)綜述了用于在蛋白質(zhì)中設(shè)計(jì)新結(jié)合位點(diǎn)的支架。WO/0034784披露了抗體模擬物的蛋白支架，其全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文，其中發(fā)明人描述了包括具有至少一個(gè)隨才幾化環(huán)的纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(抗體模擬物)。其中移植一個(gè)或多個(gè)CDR(例如，一組HCDR)的適宜支架可以由免疫球蛋白基因超家族的任何結(jié)構(gòu)域成員來提供。該支架可以是人類蛋白或非人蛋白質(zhì)。非抗體蛋白支架的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，它可以在支架分子中提供抗原結(jié)合位點(diǎn)，其中該支架分子比至少某些抗體分子更小和/或更容易制造。小尺寸的結(jié)合成員可以賦予有用的生理學(xué)特性，如進(jìn)入細(xì)胞、深入滲透到組織中或達(dá)到其它結(jié)構(gòu)內(nèi)的靶標(biāo)的能力，或在蛋白質(zhì)內(nèi)結(jié)合耙抗原的空腔的能力。Wess,2004綜述了抗原結(jié)合位點(diǎn)在非抗體蛋白支架中的應(yīng)用。蛋白質(zhì)通常具有穩(wěn)定的骨架以及一個(gè)或多個(gè)可變環(huán)，其中該一個(gè)或多個(gè)環(huán)的氨基酸序列發(fā)生特異性地或隨才幾地突變以產(chǎn)生結(jié)合靶抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)。這樣的蛋白質(zhì)包括來自金黃色葡萄球菌(S."MM)的蛋白A、運(yùn)鐵蛋白、四連接素、纖連蛋白(例如，第10個(gè)纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域)以及脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(lipocalins)的IgG結(jié)合域。其它方式包括合成基于植物環(huán)蛋白(cyclotides)的"樣吏體(Microbodies)，，(SelecoreGmbH)，it植物環(huán)蛋白是具有分子內(nèi)二硫鍵的小蛋白。除抗體序列和/或抗原結(jié)合位點(diǎn)以外，根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合成員可以包含其它氨基酸，例如，形成肽或多肽，如折疊結(jié)構(gòu)域，或賦予分子除結(jié)合抗原能力之外的另一種功能特點(diǎn)。本發(fā)明的結(jié)合成員可以攜帶可一企測(cè)標(biāo)記，或可以結(jié)合于毒素或革巴標(biāo)部分或酶(例如，經(jīng)由肽4建(peptidylbond)或接頭)。例如，結(jié)合成員可以包含催化部位(例如，在酶結(jié)構(gòu)域中)以及抗原結(jié)合位點(diǎn)，其中抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合于抗原并因而使催化部位靶向于抗原。催化部位可以例如通過切割來抑制抗原的生物學(xué)功能。如前所述，雖然非抗體支架可以攜帶CDR，j旦用于攜帶本發(fā)明的CDR或CDR組的結(jié)構(gòu)將通常是抗體重鏈或輕鏈序列或其實(shí)質(zhì)部分，其中CDR或CDR組位于對(duì)應(yīng)于由重排免疫球蛋白基因編碼的天然存在的VH和VL抗體可變i或的CDR或CDR組的位置?？梢酝ㄟ^參考Kabat1987及其更新來確定免疫J求蛋白可變i或的結(jié)構(gòu)和^f立置，現(xiàn)可獲自互4關(guān)網(wǎng)(在immuno.bme.nwu.edu或利用任何搜索引擎查找"Kabat")。CDR區(qū)或CDR用來指免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的高變區(qū)，如由Kabat等(1987)(Kabat1991a，以及最新片反本)所定義的?？贵w通常包含3個(gè)重《連CDR和3個(gè)輕鏈CDR。本文中的術(shù)語CDR(才艮據(jù)情況)用來指這些區(qū)域之一、或這些區(qū)域的若干或甚至全部，這些區(qū)域包含負(fù)責(zé)通過抗體對(duì)于它所識(shí)別的抗原或表位的親和力而進(jìn)行結(jié)合的大多數(shù)氨基酸殘基。在6個(gè)短CDR序列中，重《連的第三CDR(HCDR3)具有4交大的尺寸可變性(基本上是由于產(chǎn)生它的基因的排列機(jī)制而具有較大的多樣性)。它可以短至2個(gè)氨基酸，雖然已知的最長(zhǎng)尺寸是26個(gè)氨基酸。功能上，HCDR3在確定抗體的特異性方面具有部分作用(Segal1974;Amit1986;Chothia1987;Chothia1989;Caton1990;Sharon1990a;Sharon1990b;Kabatetal.,1991b)。拔體為\子其描述了免疫球蛋白，不管是天然的還是部分或全部合成產(chǎn)生的。該術(shù)語還涵蓋包含抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的任何多肽或蛋白質(zhì)。這里必須明了，本發(fā)明并不涉及天然形式的纟元體，即抗體并不處于它們的天然環(huán)境中，而是已能夠通過乂人天然來源純化、通過基因重組、或通過化學(xué)合成而分離或獲得，因而它們包含如后文將描述的非天然氨基酸。包含抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段包括但不限于抗體分子如Fab、Fab'、Fab'-SH、scFv、Fv、dAb、Fd,以及雙價(jià)抗體?？梢圆捎脝慰寺】贵w和其它抗體并使用重組DNA技術(shù)來產(chǎn)生結(jié)合靶抗原的其它抗體或嵌合分子。這樣的技術(shù)可以涉及將編碼抗體的免疫球蛋白可變區(qū)、或CDR的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)、或恒定區(qū)加上骨架區(qū)。參見，例如，EP-A-184187、GB2188638A或EP-A-239400、以及大量隨后的文獻(xiàn)?？梢?吏產(chǎn)生抗體的雜交瘤或其它細(xì)力包經(jīng)受基因突變或其它變化，這會(huì)4吏所產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特異性發(fā)生改變或不發(fā)生改變。由于可以用許多方式來^f奮飾抗體，所以術(shù)語"抗體分子，，應(yīng)被解釋為涵蓋具有所需要的特異性的抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)和/或結(jié)合于抗原的任何結(jié)合成員或物質(zhì)。因此，此術(shù)語涵蓋抗體片革殳和書f生物，包括包含抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的任何多肽，不管是天然的或是全部或部分合成的。因而包括融合于另一種多肽(例如，來自另一物種或?qū)儆诹硪环N抗體類型或子類)的包含抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的嵌合分子、或等^介物。在EP-A-0120694和EP-A-0125023、以及大量的隨后文獻(xiàn)中描述了嵌合抗體的克隆和表達(dá)。在抗體工程領(lǐng)域可獲得的其他技術(shù)已經(jīng)使得分離人類抗體和人源化抗體稱為可能。例如，可以才艮據(jù)Kontermann和Dubel(2001)的描述來制備人雜交瘤。噬菌體展示是另一種用于產(chǎn)生結(jié)合成員的已知4支術(shù)，其已在許多出版物中有詳細(xì)描述，如WO92/01047(下文進(jìn)一步"i侖述)詳口美國(guó)專矛JUS5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、US5885793、US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、US6492160、US6521404以及Kontermann和Dubel(2001)。專爭(zhēng)基因小鼠可以用于分離人抗體，其中小鼠抗體基因被滅活并且功能上由人抗體基因替換并同時(shí)完全保留小鼠免疫系統(tǒng)的其它成分(Mendezl997)。核苷酸產(chǎn)生的基因來產(chǎn)生合成的抗體分子，例如Knappik等(2000)或Krebs等(2001)所4苗述的。已表明，整個(gè)抗體的片段能夠?qū)崿F(xiàn)結(jié)合抗原的功能。結(jié)合片段的實(shí)例是(i)Fab片段，其含有VL、VH、CL以及CH1結(jié)構(gòu)域；(ii)Fd片段，其由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成；(iii)Fv片段，其由單一抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)i或纟且成；(iv)dAb片,殳(Ward1989;McCafferty1990;Holt2003)，其由VH或VL結(jié)構(gòu)i或纟且成；(v)分離的CDR區(qū)；(vi)F(ab')2片段，其為一種二價(jià)片段，包含兩個(gè)相連的Fab片段；(vii)單4連Fv分子(scFv)，其中VH結(jié)構(gòu)i或和VL結(jié)構(gòu)域通過連4妻肽相連，該連接肽使得兩個(gè)結(jié)構(gòu)域可以if關(guān)合以形成抗原結(jié)合位點(diǎn)(Bird1988;Huston1988);(viii)雙特異性單《連Fv二聚體(PCT/US92/09965)以及(ix)"雙價(jià)抗體"，其是通過基因融合構(gòu)造的多價(jià)或多特異性片l殳(WO94/13804;Holliger1993a)?？梢酝ㄟ^加入連才妻VH和VL結(jié)構(gòu)域的二石克橋來穩(wěn)、定Fv、scFv或雙1"介抗體分子(Peiter1996)。包含連孑妄于CH3結(jié)構(gòu)域的scFv的樣吏抗體(minibody)也是可以力口以制備的(Hu1996)。結(jié)合片段的其它實(shí)例是Fab'，其與Fab片段的不同之處在于在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端加入幾個(gè)殘基，包括來自抗體4交《連區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半月光氨酸，以及Fab'-SH，其是一種Fab'片段，其中恒定域的半胱氨酸殘基攜帶一個(gè)游離的巰基?？梢杂杀疚拿枋龅娜魏慰贵w分子起始來獲得本發(fā)明的抗體片孚殳，例如，包含本文描述的4壬4可抗體的VH和/或VL結(jié)構(gòu)i或或CDR的抗體分子，通過一些方法如酶(如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化、和/或借助于化學(xué)還原的二碌^橋的切割。在另一種方式中，本發(fā)明的抗體片革殳可以通過本領(lǐng)域^支術(shù)人員同樣眾所周知的基因重組4支術(shù)或通過月太合成(4昔^力于例長(zhǎng)口自動(dòng)肽合成4義，長(zhǎng)口由AppliedBiosystems等公司提供的)、或通過核酸合成和表達(dá)來獲得。根據(jù)本發(fā)明的功能抗體片段包括任何功能片段，該功能片段的半衰期通過化學(xué)々務(wù)飾、尤其通過聚乙二醇化、或通過結(jié)合到脂質(zhì)體中而增力口。dAb(結(jié)構(gòu)域抗體)是抗體的小單體(monomeric)抗原結(jié)合片段，即抗體重纟連或輕鏈的可變區(qū)(Holt2003)。VHdAb天然存在于^^駝(例如，^^駝、美洲駝)體內(nèi)并且可以通過用靶抗原免疫-格駝、分離抗原特異性B細(xì)胞以及直接克隆來自個(gè)體B細(xì)胞的dAb基因來產(chǎn)生。還可以通過細(xì)胞培養(yǎng)來產(chǎn)生dAb。它們的小尺寸、良好的可;容性以及溫度穩(wěn)定性4吏它們?cè)谏砩嫌绕溆杏玫牟⑶疫m合用于選擇和親和力成熟。本發(fā)明的結(jié)合成員可以是dAb,其包含基本上如在本文中陳述的VH或VL結(jié)構(gòu)i或，或包含基本上如在本文中陳述的一纟且CDR的VH或VL結(jié)構(gòu)i或。如在本文中所7吏用的，短語"基本上如陳述的"是指與本文描其序列的特定區(qū)域相同或高度類似。如本文所描述的，相對(duì)于一個(gè)或多個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的特定區(qū)域，短語"高度類似的"是指，在CDR和/或VH或VL結(jié)構(gòu)i或中可以進(jìn)4亍1至約5個(gè)，例如1至4個(gè)，包4舌1至3個(gè)，或1個(gè)或2個(gè)，或3個(gè)或4個(gè)氨基酸置才奐。雙特異性或雙功能抗體形成第二代單克隆抗體，其中兩個(gè)不同可變區(qū)凈皮結(jié)合在相同分子中(Holliger1999)。沖艮據(jù)它們補(bǔ)充新效應(yīng)子功能或靶向在胂瘤細(xì)胞表面上的若干分子的能力，已證明了它們?cè)谠\斷領(lǐng)域和治療領(lǐng)域的應(yīng)用。在使用雙特異性抗體的情況下，它們可以是常規(guī)的雙特異性抗體，其能夠用多種方法加以制備(Holliger1993b),例如，4匕學(xué)制備或由二次雜交瘤(hybridhybridoma)制備，或可以是任何上述雙特異性抗體片4殳。這些抗體可以通過4b學(xué)方法(Glennie1987;Repp1995)或體細(xì)月包方法(Staerz1986;Suresh1986)獲得，但同樣可以通過基因工程技術(shù)獲得，其會(huì)迫4吏異二聚體形成并因而促進(jìn)所尋找抗體的純化過程(Merchand1998)。雙特異性抗體的實(shí)例包4舌BiTETM纟支術(shù)的那些雙特異性抗體，可Jv28柔性肽直接連接。這樣就將兩種抗體結(jié)合在一個(gè)短的多肽單鏈上。可以構(gòu)造雙《介抗體和scFv而沒有Fc區(qū)，其中^叉利用可變結(jié)構(gòu)域，乂人而潛在地降低抗獨(dú)特型反應(yīng)的影響。雙特異性抗體可以^皮構(gòu)造成整個(gè)IgG、乂又特異性Fab'2、Fab'PEG、雙1介抗體或雙特異性scFv。另外，可以利用本領(lǐng)i或已知的常*見方法來連接兩個(gè)雙特異性抗體以形成四價(jià)抗體。相對(duì)于雙特異性全長(zhǎng)抗體，雙特異性雙鏈抗體也可以是特別有用的，因?yàn)樗鼈兛梢匀菀讟?gòu)建并表達(dá)在大腸桿菌(Eco//)中。利用，寇菌體展示(WO94/13804)，可以容易地/人文庫(kù)選才奪具有適當(dāng)結(jié)合特異性的雙價(jià)抗體(和許多其它多肽如抗體片段)。如果雙價(jià)抗體的一個(gè)臂保持恒定，例如，具有指向靶抗原的特異性，那么就可以建造文庫(kù)，其中另一個(gè)臂是變化的并選擇具有適當(dāng)特異性的抗體。可以通過如在Ridgeway1996中所描述的其他/沒計(jì)方法來制備雙特異性全長(zhǎng)抗體。在本領(lǐng)域可以利用多種方法來獲得針對(duì)耙抗原的抗體?？贵w可以是單克隆抗體，尤其是人、鼠、嵌合或人源化起源的單克隆抗體，其可以4要照本領(lǐng)域4支術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法來獲4尋。通常，為了制備單克隆抗體或它們的功能片段(尤其是鼠來源的)，可以參照尤其是在手冊(cè)"Antibodies"(Harlow和Lane1988)中描述的4支術(shù)或參照由Kohler和Milstem，1975描述的由雜交瘤制備的技術(shù)。單克隆抗體可以獲自，例如，于A-FN、或其片段之一加以免疫的動(dòng)物細(xì)胞，其中該片段包含由所述單克隆抗體識(shí)別的表位，例如，包含ED-A或由ED-A組成的片l殳、或ED-A的肽片l殳。A-FN、或其片,殳之一尤其可以4安照通常的工作方法加以制備，其中通過起29始于核酸序列(包含在為A-FN或其片段編碼的cDNA序列中)的基因重組，通過起始于包含在A-FN和/或其片段的肽序列中的氨基酉臾序列的力太合成。可以例如用親和柱來純〗匕單克隆抗體，在親和4主上已預(yù)先固定A-FN或包含由所述單克隆抗體識(shí)別的表^立的片l殳之一，例如包含ED-A或由ED-A組成的片段或ED-A的肽片革殳。單克隆抗體的純化可以如下進(jìn)4亍在A蛋白和/或G蛋白上的層沖斤，4妻著進(jìn)4亍或不進(jìn)行離子交換層析，其目的在于除去其自身殘留的蛋白質(zhì)污染物以及DNA和LPS,接著進(jìn)行或不進(jìn)行在瓊脂糖凝膠上的排阻層析以除去由于存在二聚體或其它多聚體而引起的潛在聚集物?？梢酝瑫r(shí)或接連使用所有這些技術(shù)。抗肩/#合位,《抗體分子中，它纟皮稱為抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)，并且包含結(jié)合于并且互補(bǔ)于所有或部分的乾"抗原的那部分抗體。在抗原4交大的情況下，抗體可以〗又與抗原的特定部分結(jié)合，該部分4皮稱作表位?？贵w抗原結(jié)合位點(diǎn)可以由一個(gè)或多個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域提供?？贵w抗原結(jié)合位點(diǎn)可以包含抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和抗體重《連可變區(qū)(VH)。分離的其是指這樣的狀態(tài)，其中本發(fā)明的結(jié)合成員或編碼上述結(jié)合成員的核酸將通常是與本發(fā)明一致的。因此，本發(fā)明的結(jié)合成員、VH和/或VL結(jié)構(gòu)域可以分離和/或純化自例如它們的自然環(huán)境，并且為基本上純的或均勻的形式，或者，對(duì)于核酸而言，沒有或基本上沒有不同于編碼具有所需功能的多肽的序列的核酸或基因。分離的成員和分離的核酸將不含有或基本上不含有與其天然伴隨的物質(zhì)，如其它多肽或核酸，在它們的自然環(huán)境中，或它們-故制備的環(huán)境中(例如細(xì)胞培養(yǎng))其與這樣的物質(zhì)相伴存在，上述制備是通過體外或體內(nèi)實(shí)施的重組DMA纟支術(shù)而進(jìn)^f亍的?？梢杂孟♂寗┗蜃魟﹣砼渲瞥蓡T和核酸并仍然用于^皮分離的實(shí)際用途，例如，如果用來涂布供免疫測(cè)定之用的微量滴定板，則通常會(huì)使得成員與明膠或其它載體混合，或當(dāng)用于診斷或治療時(shí)則將其與藥用載體或稀釋劑混合。結(jié)合成員可以#皮#唐基化，天然一唐基化或通過異源真核細(xì)月包(例如CHO或NSO(ECACC85110503細(xì)月包))的系統(tǒng)^皮并唐基化，或它們可以是(例如如果通過在原核細(xì)胞中的表達(dá)所產(chǎn)生)非糖基化的。包含4元體分子的異質(zhì)制劑(heterogeneouspreparation)也形成本發(fā)明的一部分。例如，上述制劑可以是抗體與全長(zhǎng)重^t連和缺少C端賴氨酸的重鏈的混合物，并具有不同程度的糖基化和/或具有衍生氨基酸，如N端谷氨酸的環(huán)化以形成焦谷氨酸殘基?？乖囊环N或多種結(jié)合成員，例如，纖連蛋白的A-FM或ED-A,可以通過下述方式獲得使才艮據(jù)本發(fā)明的結(jié)合成員的文庫(kù)接觸抗原或其片4殳，例如包含ED-A或由ED-A組成的片段或ED-A的肽片l殳，然后選l奪能夠結(jié)合該抗原的文庫(kù)的一種或多種結(jié)合成員?？梢岳肐terativeColonyFilterScreening(ICFS)來篩查4元體文庫(kù)。在ICFS中，包含編碼若干結(jié)合特異性的DNA的細(xì)菌生長(zhǎng)在液體培養(yǎng)基中，并在已達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期以后，使數(shù)以十億計(jì)的細(xì)菌分布在由適合的預(yù)處理薄膜濾器組成的生長(zhǎng)載體上，對(duì)其進(jìn)行溫育直到出現(xiàn)完全匯合的細(xì)菌菌落。第二捕獲襯底(trapsubstrate)包括另一個(gè)薄膜濾器，其被預(yù)加濕和覆蓋有所期望的抗原。然后將捕獲薄膜濾器放置在平板上，該平板包含適宜的培養(yǎng)基并覆有生長(zhǎng)過濾器，其表面覆蓋有朝上的細(xì)菌菌落。在室溫下溫育如此獲得的夾層大約16小時(shí)。因此可以獲得編碼抗體片段scFv(具有擴(kuò)散作用)的基因的表達(dá)，以致那些特異性地結(jié)合于存在于捕獲膜上的抗原和片賴:被捕獲。然后借助于通常用于此目的的比色才支術(shù)處理捕獲膜以示出結(jié)合的抗體片段scFv。據(jù)捕獲過濾器上著色斑點(diǎn)的位置可以追溯到存在于生長(zhǎng)膜上并產(chǎn)生捕獲的抗體片段的相應(yīng)細(xì)菌菌落。聚集上述菌落并生長(zhǎng)，然后將幾百萬細(xì)菌分布在新的培養(yǎng)力莫上并重復(fù)上述程序。然后進(jìn)4亍類似的循環(huán)直到在捕獲膜上的陽性信號(hào)對(duì)應(yīng)于單個(gè)陽性菌落，每一個(gè)陽性菌落都是指向在選擇中所用抗原的單克隆抗體片段的潛在來源。ICFS描述在例如WO0246455中，其以引用方式結(jié)合于本文。文庫(kù)還可以在顆?；蚍肿訌?fù)合物上展示，例如，可復(fù)制的基因組(geneticpackage)如噬菌體(例如T7)顆粒，或其它體外展示系統(tǒng)，每種顆?；蚍肿訌?fù)合物包含編碼展示在其上的抗體VH可變域的核S臾，以及可選地還包含展示的VL結(jié)構(gòu)i或(3口果存在的i舌)。噬菌體展示描述于WO92/01047和例如美國(guó)專利US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、US5885793、US5962255、US61據(jù)71、US6172197、US6225447、US6291650、US6492畫以及US6521404,其全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文。在選4奪能夠結(jié)合抗原的結(jié)合成員并展示在噬菌體或其它文庫(kù)顆?；蚍肿訌?fù)合物上以后,核酸可以獲自展示所述選4奪的結(jié)合成員的噬菌體或其它顆并立或分子復(fù)合物。這樣的核酸可以用于隨后的通過從核酸表達(dá)來產(chǎn)生結(jié)合成員或抗體VH或VL可變結(jié)構(gòu)域，該核酸具有獲自展示所述選才奪的結(jié)合成員的噬菌體或其它顆?；蚍肿訌?fù)合物的核酸的序列。的抗體VH可變域可以分離的形式提供，正如包含上述VH結(jié)構(gòu)域的結(jié)合成員可以分離的形式4是供一樣?？梢赃M(jìn)一步測(cè)-試結(jié)合A-FN或纖連蛋白的ED-A或其它革巴:阮原或同種型的能力，例如，與例如抗ED-A4元體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9中的4壬4可一種竟?fàn)幋缟Y(jié)合于A-FN或A-FN的片4殳，例如纖連蛋白的ED-A,的能力。本發(fā)明的結(jié)合成員可以4爭(zhēng)異性』也結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A。本發(fā)明的結(jié)合成員可以結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A,并且親禾口力坤目同于^元ED-A^t體Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9(例如具有scFv格式)，或具有更好的親和力。本發(fā)明的結(jié)合成員可以結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A,其中KD為3xl(T8M或具有更好的親和力。優(yōu)選地，本發(fā)明的結(jié)合成員以Ko為2x10—SM或更好的親和力結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A。更4尤選i也，本發(fā)明的結(jié)合成員以Ko為1.7xl(T8M或更好的親和力結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A。還要更優(yōu)選地，本發(fā)明的結(jié)合成員以Ko為1.4xl(T8M或更好的親和力結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A。最優(yōu)選地，本發(fā)明的結(jié)合成員結(jié)合纖連蛋白的A-FN和/或ED-A,其中K。為3xl0一M或具有更好的親和力。本發(fā)明的結(jié)合成員可以與抗ED-A抗體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9—才羊結(jié)合于A-FN和/或纖連蛋白的ED-A上的相同表位。本發(fā)明的結(jié)合成員可以不顯示4壬4可顯著結(jié)合于不同于A-FN和/或纖連蛋白的ED-A的分子。尤其是該結(jié)合成員可以不結(jié)合纖連蛋白的其它同種型，例如纖連蛋白的ED-B同種型和/或IIICS同種型?？梢援a(chǎn)生本文披露的抗體分子的變體并用于本發(fā)明。在CDR、抗體VH或VL結(jié)構(gòu)域以及結(jié)合成員的氨基酸序列內(nèi)進(jìn)行置換所需要的纟支術(shù)是本纟支術(shù)領(lǐng)域通?？色@知的。借助于置換可以構(gòu)建變體序列，并測(cè)試結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A的能力和/或測(cè)試4壬4可其它所期望的性能，其中置換可以或不可以預(yù)測(cè)是否對(duì)活性具有最小或有利影響。如所討論的，根據(jù)本發(fā)明，可以采用本文具體披露了其序列的VH和VL結(jié)構(gòu)域中的任一種的可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列變體。特定的變體可以包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列改變(氨基酸殘基的加入、缺失、置換和/或插入)，可以少于約20個(gè)改變，少于約15個(gè)改變，少于約10個(gè)文變或少于約5個(gè)支變，可以是5、4、3、2或1個(gè)改變?？梢栽谝粋€(gè)或多個(gè)骨架區(qū)和/或一個(gè)或多個(gè)CDR中進(jìn)4亍改變。上述改變通常并不導(dǎo)致功能喪失，所以包含如此改變的氨基酸序列的結(jié)合成員可以保留結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A的能力。例如，它可以-f呆留與沒有進(jìn)4亍改變的結(jié)合成員相同的定量結(jié)合，例如，如在本文描述的測(cè)定中所測(cè)得的。包含如此改變的氨基酸序列的結(jié)合成員可以具有改善的結(jié)合A-FN和/或纖連蛋白的ED-A的能力?？梢岳靡环N或多種所選VH和/或VL基因的隨才幾i秀變以在整個(gè)可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)產(chǎn)生突變，從而產(chǎn)生本發(fā)明的新的攜帶CDR衍生序列的VH或VL區(qū)。在某些實(shí)施方式中，在CDR組的整個(gè)可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)進(jìn)行一個(gè)或兩個(gè)氨基酸置換?？梢允褂玫牧硪环N方法是將誘變定向于VH或VL基因的CDR區(qū)。如前所述，基本上如本文陳述的CDR氨基酸序列可以作為在人抗體可變結(jié)構(gòu)域中的CDR或其實(shí)質(zhì)部分?；旧先绫疚年愂龅腍CDR3序列代表本發(fā)明的實(shí)施方式并且例如這些序列中的每一個(gè)可以4乍為人重鏈可變結(jié)構(gòu):威中的HCDR3或其實(shí)質(zhì)部分。本發(fā)明采用的可變結(jié)構(gòu)域可以獲自或衍生自任何種系或重排的人可變結(jié)構(gòu)i或，或可以是基于已知人可變結(jié)構(gòu)i或的共有序列或?qū)嶋H序列合成的可變結(jié)構(gòu)域?？勺兘Y(jié)構(gòu)域可以衍生自非人抗體。利用重組DNA^支術(shù)，可以將本發(fā)明的CDR序列(例如CDR3)引入缺少CDR(例如CDR3)的全套的可變結(jié)構(gòu):威。例如，Marks等(1992)描述了產(chǎn)生全套抗體可變結(jié)構(gòu)域的方法，其中位于或相鄰于可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域的5'端的共有引物連同共有與1物一起用于人VH基因的第三骨架區(qū)以^是供在夾少CDR3的VH可變結(jié)構(gòu)i或的基因i普型(repertoire)。Marks等進(jìn)一步4翁述了上述基因i普型(repertoire)如何結(jié)合于特定抗體的CDR3。利用類似的4支術(shù)，本發(fā)明的CDR3衍生序列可以混合于缺少CDR3的VH或VL結(jié)構(gòu)域的基因譜型，以及混合的完全VH或VL結(jié)構(gòu)域結(jié)合于關(guān)寫關(guān)VL或VH域以4是供本發(fā)明的結(jié)合成員。然后可以用適宜的宿主系統(tǒng)如WO92/01047的噬菌體展示系統(tǒng)(其全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文)、或隨后的大量文獻(xiàn)的噬菌體展示系統(tǒng)，包4舌Kay、Winter&McCafferty(1996)，來展示上述抗體的基因譜型，以便可以選擇適合的結(jié)合成員。該全套可以由來自4壬4可物種(anything)的104個(gè)以上的單獨(dú)成員組成，例3。由至少105、至少106、至少107、至少108、至少109或至少101G個(gè)成員組成。類似、:t也，可以爿尋一個(gè)或多個(gè)、或所有三個(gè)CDR移才直到全套的VH或VL結(jié)構(gòu)域，然后對(duì)其進(jìn)行篩選以獲得纖連蛋白的A-FN和/或ED-A的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合成員?？梢圆捎?元體Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9的HCDR1、HCDR2以及HCDR3中的一種或多種，或HCDR纟且，禾口/或可以采用4元體Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8或G9的XLCDR1、LCDR2以及LCDR3中的一種或多種，或抗體H1、B2、C5、D5、E5、CB、F8、Fl、B7、E8或G9的LCDR組。類4以i也，可以采用本文4皮露的其它VH和VL結(jié)構(gòu)i或、CDR組以及HCDR組和/或LCDR組。纖連蛋白的A-FN和/或ED-A可以用于篩選例如抗體分子的結(jié)合成員，以用來制備用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移瘤的藥劑。如在本文其它地方所4皮露的，該篩選可以是基因i普型(r印ertoire)的篩選。在某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白可變域的實(shí)質(zhì)部分將包含至少三個(gè)CDR區(qū)、以及它們的間隔骨架區(qū)。該部分還可以包4舌至少約50%的第一和第四骨架區(qū)的一者或兩者，該50%是第一骨架區(qū)的C端50。/。和第四骨架區(qū)的N端50。/。。在可變域的實(shí)質(zhì)部分的N端或C端的另外的殘基可以是那些并不通常伴隨天然存在的可變域區(qū)的殘基。例如，通過重組DMA技術(shù)制備的本發(fā)明的結(jié)合成員的結(jié)構(gòu)可以導(dǎo)致引入由引入的接頭編碼的N端或C端殘基，以便于進(jìn)行克隆或其它操作步驟。其它操作步驟包括引入接頭以將本發(fā)明的可變結(jié)構(gòu)域連接于另外的蛋白質(zhì)序列，該另外的蛋白質(zhì)序列包括如在本文別處更詳細(xì)討論的抗體恒定區(qū)、其它可變結(jié)構(gòu)域(例如在雙-階抗體的生產(chǎn)中)或可4企測(cè)/功能標(biāo)記。雖然在本發(fā)明的某些方面中，結(jié)合成員包含一對(duì)VH和VL結(jié)構(gòu)域，但基于VH或VL結(jié)構(gòu)域序列的單個(gè)結(jié)合域則形成本發(fā)明的進(jìn)一步的方面。已知，單個(gè)免疫^求蛋白結(jié)構(gòu)域，尤其是VH域，能夠以特異性的方式結(jié)合草巴抗原。例如，參見以上dAb的討論。在^f壬一單個(gè)結(jié)合i或的情況下，這些結(jié)構(gòu)i或可以用來篩選能夠形成兩結(jié)構(gòu)域結(jié)合成員的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域，該兩結(jié)構(gòu)i或結(jié)合成員能夠結(jié)合纖連蛋白的A-FN和/或ED-A。這可以通過噬菌體展示篩選方法并利用如在WO92/01047中所4皮露的所謂分級(jí)雙重組合方法(其全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文)來實(shí)現(xiàn)，其中包含H或L鏈克隆的單個(gè)菌落用來感染編碼其它鏈(L或H)的克隆的完全文庫(kù)并且4安照噬菌體展示技術(shù)如在該參考文獻(xiàn)中所描述的那些技術(shù)來選擇所得到的雙《連結(jié)合成員。此才支術(shù)還4皮露在Marks1992中。本發(fā)明的結(jié)合成員可以進(jìn)一步包含抗體恒定區(qū)或其部分，例如人抗體恒定區(qū)或其部分。例如，VL結(jié)構(gòu)域可以在其C端連接于抗體輕鏈恒定域，其包括人CK或CX鏈，例如C人。類似地，基于VH結(jié)構(gòu)域的結(jié)合成員可以在其C端連接于所有或部分(例如CH1域)的衍生自抗體同種型的免疫球蛋白重鏈，例如，IgG、IgA、IgE和IgM以及任何同種型子類，尤其是IgGl和IgG4。具有這些性能并明的實(shí)施方式。本發(fā)明的結(jié)合成員可以標(biāo)記有可4企測(cè)的或功能標(biāo)記。標(biāo)記可以是產(chǎn)生或可以被誘導(dǎo)產(chǎn)生信號(hào)的任何分子，包括但不限于熒光劑、》文射性標(biāo)記、酶、化學(xué)發(fā)光劑或光壽丈劑。因此，可以通過纟企測(cè)熒光或發(fā)光、放射性、酶活性或光吸收來檢測(cè)和/或測(cè)量結(jié)合。可以利用本領(lǐng)域已知的常規(guī)化學(xué)性能來將可^r測(cè)標(biāo)記附于本發(fā)明的抗體。存在i午多方法，z借助于這些方法，才示i己可以產(chǎn)生通過外部方式可4全測(cè)的信號(hào)，例如，通過目一見斗企查、電^茲輻射、熱、以及化學(xué)試劑。該標(biāo)記還能夠與結(jié)合本發(fā)明的抗體的另一結(jié)合成員結(jié)合，或與載體結(jié)合。標(biāo)記的結(jié)合成員例如標(biāo)i己有可才企測(cè)標(biāo)i己的scFv，可以用于體內(nèi)或體外i貪斷，和/或用于治療。例如，放射性標(biāo)記的結(jié)合成員(例如結(jié)合(共軛或軛合)于放射性同位素的結(jié)合成員)可以用于放射診斷和放射治療?？梢越Y(jié)合(共輒或輒合)于本發(fā)明的結(jié)合成員的放射性同位素包括以下同位素，如一Tc、99mTc、186Re、188Re、203Pb、67Ga、68Ga、47Sc、川In、97Ru、62Cu、64Cu、86Y、88Y、卯Y、121Sn、161Tb、153Sm、166Ho、105Rh以及"7Lu。例如，標(biāo)記有可4企測(cè)標(biāo)記的本發(fā)明的結(jié)合成員可以用來4企測(cè)、-珍斷或監(jiān)測(cè)人或動(dòng)物體內(nèi)的一種和/或多種腫瘤轉(zhuǎn)移瘤?？梢詫⒔Y(jié)合成員給予人或動(dòng)物，通常是人類患者,然后可以確定人或動(dòng)物體體內(nèi)在遠(yuǎn)離由原發(fā)性肺瘤目前或以前占據(jù)部位的部位是否存在抗體；抗體分子定位于人或動(dòng)物體內(nèi)在遠(yuǎn)離由原發(fā)性肺瘤目前或以前占據(jù)部位的部位則表明存在一種和/或多種腫瘤轉(zhuǎn)移瘤。本發(fā)明的結(jié)合成員可以用于制造供診斷腫瘤轉(zhuǎn)移瘤之用的診斷產(chǎn)品。法，包纟舌以下步-驟(a)纟會(huì)予人或動(dòng)物本發(fā)明的結(jié)合成員，例如標(biāo)記有可4僉測(cè)標(biāo)記的結(jié)合成員，其結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型和/或纖連蛋白的ED-A,以及(b)確定在人或動(dòng)物體體內(nèi)在遠(yuǎn)離由原發(fā)性肺瘤目前或以前占據(jù)部位的部位是否存在結(jié)合成員；其中結(jié)合成員定位于人或動(dòng)物體內(nèi)在遠(yuǎn)離由原發(fā)性腫瘤目前或以前占據(jù)部位的部位則表明存在腫瘤轉(zhuǎn)移瘤。在結(jié)合成員標(biāo)記有可才企測(cè)標(biāo)i己的情況下，可以通過沖企測(cè)標(biāo)^己來確定可才企測(cè)標(biāo)i己的存在或不存在。如本文所描述的結(jié)合成員還可以用于在竟?fàn)幮詼y(cè)定中測(cè)量抗原水平，即在竟?fàn)幮詼y(cè)定中通過采用如由本發(fā)明提供的結(jié)合成員來測(cè)量樣品中抗原水平的方法。這樣就不需要將結(jié)合與未結(jié)合抗原進(jìn)4亍物理分離。將凈艮道分子連4妄于結(jié)合成員以致結(jié)合時(shí)會(huì)發(fā)生物理或光學(xué)變化是一種可能性。報(bào)道分子可以直接或間接地產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)，該信號(hào)可以是可量化的。報(bào)道分子的連接可以是直接或間接的，38共價(jià)的，例如借助于肽鍵，或非共價(jià)的。借助于肽鍵的連接可以是由于編碼抗體和才艮道分子的基因融合的重組表達(dá)。竟?fàn)幮詼y(cè)定還可以用于表位作圖。在一個(gè)實(shí)例中，表位作圖可以用來鑒定由結(jié)合成員結(jié)合的表位。這樣的表位可以是線性的或構(gòu)象的。構(gòu)象表^立可以包含纖連蛋白的A-FN或ED-A的至少兩個(gè)不同的片,史，其中當(dāng)纖連蛋白的A-FN或ED-A^L折疊成其三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，所述片賴:;波此4妄近地定位以形成^皮纖連蛋白結(jié)合成員的A-FN或ED-A所識(shí)別的構(gòu)象表位。在測(cè)試竟?fàn)幮詴r(shí)，可以采用抗原的肽片段，尤其是包括感興趣的表位的肽或基本上由感興趣的表^立的肽組成的肽片,殳?？梢?吏用在4壬一未端具有表^f立序列加上一個(gè)或多個(gè)氨基酸的肽。才艮據(jù)本發(fā)明的結(jié)合成員這樣就可以4吏它們與抗原的結(jié)合受到具有或包括:纟合定序列的肽的抑制。本發(fā)明的另外的方面采用結(jié)合物(或輒合物)或本發(fā)明的結(jié)合成員與對(duì)病變處的耙細(xì)胞施加殺生物性或細(xì)胞毒性作用的分子以及存在于上述病變處的針對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)成分的抗體之間的融合。例如，殺生物分子或細(xì)胞毒性分子可以是白細(xì)胞介素-2(IL-2)、多柔比星、白細(xì)胞介素-12(IL-12)、干擾素-y(IFN-y)、腫瘤壞死因子a(TMFa)或組織因子(優(yōu)選截短的)。這樣的結(jié)合物(軛合物)可以治療上用于例如治療如本文4是及的肺瘤轉(zhuǎn)移瘤和/或肺瘤。例如在WO01/62298中描述了結(jié)合成員與殺生物分子或細(xì)胞毒性分子的融合或結(jié)合物(軛合物)的生產(chǎn)和應(yīng)用，其以引用方式結(jié)合于本文。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療一種和/或肺瘤轉(zhuǎn)移瘤的方法，該方法包括給予個(gè)體治療有效量的包含本發(fā)明的結(jié)合成員的藥物。結(jié)合成員可以是(i)通過細(xì)胞間相互作用對(duì)草巴細(xì)月包施加殺生物性或細(xì)胞毒性作用的分子的結(jié)合物(軛合物)和(ii)纖連蛋白的ED-A同種型和/或纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員的結(jié)合物(扼合物)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的結(jié)合成員用于制備藥物的應(yīng)用，該藥物用于治療一種和/或多種月中瘤專爭(zhēng)移瘤。結(jié)合成員可以結(jié)合于或融合于如本文所描述的施加殺生物性或細(xì)胞毒性作用的分子。結(jié)合成員可以是(i)通過細(xì)胞間相互作用對(duì)靶細(xì)胞施加殺生物性或細(xì)胞毒性作用的分子的結(jié)合物和(ii)根據(jù)本發(fā)明的人纖連蛋白的結(jié)合成員的結(jié)合物。在又一個(gè)方面，本發(fā)明^是供了將(i)通過細(xì)胞間相互作用對(duì)靶細(xì)胞施加殺生物性或細(xì)胞毒性作用的分子的結(jié)合物和(ii)根據(jù)本發(fā)明的人纖連蛋白的結(jié)合成員的結(jié)合物用于治療人或動(dòng)物體的方法。這樣的治療可以是一種和/或多種胂瘤轉(zhuǎn)移瘤的治療。本發(fā)明的又一方面提供了(i)通過細(xì)胞間相互作用對(duì)靶細(xì)胞施加殺生物性或細(xì)胞毒性作用的分子的結(jié)合物和(ii)根據(jù)本發(fā)明的人纖連蛋白的結(jié)合成員的結(jié)合物。這沖羊的結(jié)合物優(yōu)選包含融合蛋白(包含殺生物分子或細(xì)胞毒性分子)和所述結(jié)合成員，或者，其中結(jié)合成員是雙鏈或多鏈的，融合蛋白包含殺生物分子或細(xì)胞毒性分子以及所述結(jié)合成員的多肽鏈成分。優(yōu)選地，該結(jié)合成員是單鏈多肽，例如，單鏈抗體分子，如scFv。因此，本發(fā)明的進(jìn)一步的方面提供了融合蛋白，其包含殺生物分子或細(xì)胞毒性分子以及本發(fā)明的單《連Fv抗體分子。通過細(xì)胞間相互作用對(duì)耙細(xì)胞施加其作用的殺生物分子或細(xì)胞毒性分子可以與靶細(xì)胞直接發(fā)生相互作用，可以與耙細(xì)胞上的膜結(jié)合受體相結(jié)合，或擾動(dòng)細(xì)胞膜的電化學(xué)勢(shì)。與膜結(jié)合受體相結(jié)合的分子包括趨化因子、細(xì)胞因子以及激素。擾動(dòng)細(xì)胞膜的電化學(xué)勢(shì)的化合物包括溶血素、離子載體、作用于離子通道的藥物。在示例性的優(yōu)選實(shí)施方式中，上述分子是白細(xì)胞介素-2、組織因子(優(yōu)選截短的)或阿霉素。其它實(shí)施方式可以采用白細(xì)胞介素12、干擾素-y、IP-IO以及腫瘤壞死因子-a(TNF-a)。40正如下文將進(jìn)一步討i侖的，特異性結(jié)合成員優(yōu)選為一種抗體或包含抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)。便利地，特異性結(jié)合成員可以是單鏈多肽，如單《連抗體。這^f吏得可以方使j也生產(chǎn)包含單4連抗體和殺生物分子或細(xì)胞毒性分子(例如，白細(xì)胞介素-2或組織因子)的融合蛋白。在其它實(shí)施方式中，可以通過在分離的多肽中，例如在完整抗體中或在如Fab或雙1介抗體的抗體片,殳中結(jié)合抗體VH結(jié)構(gòu)域和抗體VL結(jié)構(gòu)域，來提供抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)。在特異性結(jié)合成員是雙鏈或多《連分子(例如分別為Fab或整個(gè)抗體)的情況下，殺生物分子或細(xì)胞毒性分子可以被結(jié)合為具有特異性結(jié)合成員中的一個(gè)或多個(gè)多肽鏈的融合多肽。結(jié)合成員可以借助于肽4建而結(jié)合于殺生物分子或細(xì)胞毒性分子，即在融合多肽內(nèi)包含所述分子和特異性結(jié)合成員或其多肽鏈成分。關(guān)于可用于制備包含IL-2的融合多肽的IL-2序列信息，參見Taniguchietal.(1983)Nature302,305-310;MaED-Aetal.(1983)Biochem.Biophys.Res.Comm.115:1040-1047;Devosetal.(1983)Nucl.AcidsRes.11:4307-4323。Scarpatietal.(1987)Biochemistry26:5234-5238、以及Rufetal.(1991)J.Biol.Chem.226:15719-15725提供了關(guān)于截短的組織因子的序列信息。用于結(jié)合的其它方式包括化學(xué)結(jié)合，尤其是利用雙功能試劑的交聯(lián)(例如采用DOUBLE-PEAGENTSTM交寫關(guān)劑選才奪指南(DOUBLE-PEAGENTSTMCross-linkingReagentsSelectionGuide),Pierce)。在期望緩釋的情況下，例如，在殺生物分子或細(xì)胞毒性分子是阿霉素或擾動(dòng)細(xì)胞膜的電化學(xué)勢(shì)的其它分子的情況下，化學(xué)結(jié)合可以是借助于在特異性結(jié)合成員(多肽，如抗體或抗體片段)的伯氨基基團(tuán)和殺生物分子或細(xì)胞毒性分子(如阿霉素)的氧化糖部分(六碳氨糖)之間形成席夫石咸(亞胺)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種編碼本發(fā)明的結(jié)合成員的分離的核酸。核酸可以包括DNA和/或RNA。在一個(gè)方面，本發(fā)明一是供了核酸，其編碼如上述所定義的本發(fā)明的CDR或CDR組或VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)i或或抗體抗原結(jié)合〗立點(diǎn)或抗體分子，例如scFv或IgG,例如IgGl。優(yōu)選的核香酸序列是編碼本文4皮露的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了質(zhì)粒、載體、轉(zhuǎn)錄或表達(dá)盒形式的構(gòu)建體，其包含至少一種如上所述的多核香酸。本發(fā)明還提供了重組宿主細(xì)胞，其包含如上所述的一種或多種構(gòu)建體。編碼"壬4可CDR或CDR《且或VH結(jié)構(gòu)i或或VL結(jié)構(gòu)i或或4元體抗原結(jié)合位點(diǎn)或抗體分子，例如所l是供的scFv或IgGl或IgG4，其本身形成本發(fā)明的一個(gè)方面，正如產(chǎn)生編碼產(chǎn)物的方法形成本發(fā)明的一個(gè)方面一才羊，該方法包4舌來自編碼核酸的表達(dá)。通過在適當(dāng)條件下培養(yǎng)包含核酸的重組宿主細(xì)胞可以方便地實(shí)現(xiàn)表達(dá)。在通過表達(dá)進(jìn)行生產(chǎn)以后，可以利用任何適宜的技術(shù)來分離和/或純化VH或VL結(jié)構(gòu)i^、或結(jié)合成員，然后在適當(dāng)情況下4吏用。分合成的。除非上下文另有要求，如本文所述的核苷酸序列包括具有特定序列的DNA分子，并包括具有其中用U替換T的特定序列的RNA分子。又一個(gè)方面纟是供了生產(chǎn)纟元體VH可變結(jié)構(gòu)i或的方法，該方法包括引起來自編碼核酸的表達(dá)。這才羊的方法可以包括在用于生產(chǎn)所述抗體VH可變結(jié)構(gòu)域的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。作為本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，4是供了生產(chǎn)VL可變結(jié)構(gòu)域和包含VH和/或VL結(jié)構(gòu)域的結(jié)合成員的類似方法。生產(chǎn)方法可以包4舌產(chǎn)物的分離和/或純步-驟。生產(chǎn)方法可以包括將產(chǎn)物配制成組合物，該組合物包括至少一種另外的成分，如藥用賦形劑。用于在多種不同宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)多肽的系統(tǒng)是眾所周知的。適宜的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、一直物細(xì)胞、絲狀真菌、酵母菌和桿狀病毒系統(tǒng)以及轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物。在本領(lǐng)域已很好確立了抗體和抗體片段在原核細(xì)胞中的表達(dá)。關(guān)于綜述，參見例如Pliickthun1991。一種常用細(xì)菌宿主是大腸桿菌(￡.co//)。.鄰戮儀個(gè)八貝ioi可^作為一種選擇來生產(chǎn)結(jié)合成員，例如Chadd&Chamow(2001)、Andersen&Kmmmen(2002)、Larrick&Thomas(2001)。本領(lǐng)域中可用于表達(dá)異源多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)月包、海拉細(xì)胞(HeLacells)、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞、NSO小鼠黑素瘤細(xì)月包、YB2/0大鼠骨髓瘤細(xì)月包、人胚腎細(xì)胞、人胚胎一見網(wǎng)膜細(xì)月包以及許多其他細(xì)胞?？梢赃x4奪或構(gòu)建適宜的載體，其包含適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列，包括啟動(dòng)子序列、終止序列、多&i苷酸化序列、增強(qiáng)子序列、標(biāo)記基因以及在適當(dāng)?shù)那闆r下包括其他序列。在適當(dāng)情況下載體可以是質(zhì)粒例如p藍(lán)菌4立，或病毒例如p盆菌體。關(guān)于進(jìn)一步的詳'lt,參見例如，Sambrook&Russell(2001)。例如在制備核酸構(gòu)建物、i秀變、測(cè)序、DNA引入細(xì)胞和基因表達(dá)、以及蛋白質(zhì)分析中，用于l喿作核酸的許多已知4支術(shù)和實(shí)-瞼方案詳細(xì)描述在Ausubel1999中。本發(fā)明的進(jìn)一步的方面提供了一種宿主細(xì)月包，其包含如本文所披露的核酸。這樣的宿主細(xì)胞可以是體外的并且可以是在培養(yǎng)物中的。這樣的宿主細(xì)胞可以是體內(nèi)的。宿主細(xì)胞的體內(nèi)存在可以便于本發(fā)明的結(jié)合成員細(xì)胞內(nèi)表達(dá)為"胞內(nèi)抗體(intrabody)，，或細(xì)胞內(nèi)抗體。胞內(nèi)抗體可以用于基因治療。又一個(gè)方面提供了一種方法，該方法包括將本發(fā)明的核酸引入宿主細(xì)胞中。上述引入可以采用任何可獲得的技術(shù)。對(duì)于真核細(xì)胞，適宜的技術(shù)可以包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、二乙氨基乙基葡聚糖(DEAE-Dextran)、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中利用逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒，例如牛痘，或?qū)τ诶ハx細(xì)胞為桿狀病毒。在宿主細(xì)胞，尤其是在真核細(xì)月包中引入核酸可以-使用基于病毒或質(zhì)粒的系統(tǒng)。質(zhì)粒系統(tǒng)可以被附加地保持或可以凈皮摻入到宿主細(xì)胞或人工染色體中。摻入可以通過在單個(gè)或多個(gè)基因座處隨機(jī)或定向整合一個(gè)或多個(gè)拷貝來實(shí)現(xiàn)。對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞，適宜的技術(shù)可以包括氯化4丐轉(zhuǎn)化、電穿孔以及利用噬菌體的轉(zhuǎn)染。引入以后，可以4妻著引起或使得核酸表達(dá)，例如通過在表達(dá)基因的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。可以借助于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來純化表達(dá)的產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的核酸可以被整合到宿主細(xì)胞的基因組(例如染色體)中。可以按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過包括促進(jìn)與基因組重組的序列來促進(jìn)整合。本發(fā)明還提供了一種方法，該方法包括在表達(dá)系統(tǒng)中使用如上所述的構(gòu)建物以表達(dá)如上所述的結(jié)合成員或多肽。本發(fā)明的結(jié)合成員被設(shè)計(jì)用于在人或動(dòng)物受試者(例如人)中進(jìn)行診斷或治療的方法。結(jié)合成員可以用于一種和/或多種腫瘤轉(zhuǎn)移瘤的it斷或治療。44因此，本發(fā)明的進(jìn)一步的方面提供了治療方法，該方法包括給予如所提供的結(jié)合成員、包含這樣的結(jié)合成員的藥物組合物、以及這樣的結(jié)合成員用于制備所給予的藥物的應(yīng)用，例如在包括將結(jié)合成員與藥用賦形劑配制在一起的制備藥劑或藥物組合物的方法中。藥用載體是眾所周知的并由本領(lǐng)域^支術(shù)人員才艮據(jù)所選4奪的活性化合物的特性和給予方式來采用。通常以藥物組合物的形式《合予本發(fā)明的結(jié)合成員，該藥物組合物可以包含除結(jié)合成員以外的至少一種成分。因此才艮據(jù)本發(fā)明并才安照本發(fā)明使用的藥物組合物除活性組分之外還可以包含藥用賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或本領(lǐng)域4支術(shù)人員熟知的其他物質(zhì)。這才羊的物質(zhì)應(yīng)該是無毒的并且不應(yīng)干護(hù)G活性組分的效力。載體或其他物質(zhì)的準(zhǔn)確特性將取決于纟會(huì)予途徑，其中纟合予途徑可以是口月l、吸入或通過注射，例3。靜月永內(nèi)注射。本發(fā)明還設(shè)想了用于口服的藥物組合物，例如納米抗體(nanobody)等。這樣的口服制劑可以是片劑、膠嚢劑、散劑、液體或半固體形式。片劑可以包含如明膠或佐劑之類的固體載體。液體藥物組合物通常包含液體載體如水、石油(或石蠟油)、動(dòng)物油或才直物油、礦物油或合成油?？梢园?舌生理鹽水溶液、葡萄糖或其^4t〉容液或二醇類，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。對(duì)于靜脈內(nèi)注射、或在痛苦部位的注射，活性組分將具有胃腸道外用水溶液的形式，其是無熱原的并且具有適宜的pH、等滲性以及穩(wěn)、定性。本領(lǐng)域:技術(shù)人員能夠4艮好地制備適宜的溶液，其中利用例如，等、滲載體3口氯4匕鈉注射、液(SodiumChlorideInjection)、沐木才各氏注射液(Ringer'sInjection)、孝LS^/f匕才木才各氏:;主射-液(LactatedRinger'sInjection)。才艮才居需要，可以采用防腐劑、牙急定劑、纟爰沖劑、抗氧化劑和/或其他添加劑。用于制備藥物制劑的許多方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見例如，Robinson,1978?？梢詥为?dú)主會(huì)予或耳關(guān)合其他治療、同時(shí)或相繼或作為與另一種治療劑或多種治療劑的聯(lián)合制劑，來給予組合物，這取決于要治療的病癥。纖連蛋白的A-FN和/或ED-A的結(jié)合成員可以連同一種另外的藥用成分用作聯(lián)合治療的一部分。聯(lián)合治療可以用來提供顯著的協(xié)同效應(yīng)，尤其是結(jié)合纖連蛋白的A-FN和/或ED-A的結(jié)合成員與一種或多種其4也藥物的耳關(guān)合。可以同時(shí)會(huì)會(huì)予或相繼^合予或作為與另一種治療劑或多種治療劑的聯(lián)合制劑來^^予纖連蛋白的A-FN和/或ED-A的結(jié)合成員，以用于治療本文所列的一種或多種病癥。例如，本發(fā)明的結(jié)合成員可以和現(xiàn)有治療劑一起用于治療一種和/或多種肺瘤轉(zhuǎn)移瘤。用于治療一種和/或多種腫瘤轉(zhuǎn)移瘤的現(xiàn)有治療劑包括多柔比星、紫杉醇、吉西他濱、索拉非尼、美法倫、以及阿瓦其斤丁。本發(fā)明的結(jié)合成員和一種或多種上述另外的藥物成分可以用于制備藥劑。該藥劑可以用于單獨(dú)《會(huì)予或組合纟會(huì)予個(gè)體，因而可以包含結(jié)合成員和作為聯(lián)合制劑或作為單獨(dú)制劑的其他成分。單獨(dú)的制劑可以用來^f更于分開給予和順序給予或同時(shí)給予，并^f吏得可以通過不同途徑來給予上述成分，例如通過口力良和腸胃外給予。根據(jù)本發(fā)明，可以將所提供的組合物給予哺乳動(dòng)物?？梢?治療有效量，，給藥，這足以顯示出對(duì)患者的益處。這樣的益處可以至少是至少一種癥狀的改善。給予的實(shí)際量、以及給予的速率和時(shí)間過程(time-course)將取決于待治療病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重性、待治療的特定哺乳動(dòng)物、個(gè)體患者的臨床癥狀、病因、組合物的遞送部位、結(jié)合成員的類型、給予的方法、給藥的時(shí)間安排以及醫(yī)生已知的其他因素。治療處方，例如劑量的確定等，是全科醫(yī)生和其他醫(yī)生的責(zé)任，并且可以才艮據(jù)4寺治療疾病的癥狀的嚴(yán)重性和/或進(jìn)展來確定處方。在本領(lǐng)i或中，抗體的適當(dāng)劑量是眾所周知的(Ledermann1991以及Bagshawe1991)。在適當(dāng)情況下，可以4吏用在本文、或在《醫(yī)師桌上手冊(cè)》(Physician'sDeskReference(2003))中4十對(duì)要纟會(huì)予的藥劑類型所指定的具體劑量。可以通過在動(dòng)物模型中比較其體外活性和體內(nèi)活性來確定本發(fā)明的結(jié)合成員的治療有效量或合適劑量。將在小鼠和其他試驗(yàn)動(dòng)物中的有效劑量類推到人類的方法是已知的。精確劑量將取決于若干因素，包括抗體是否是用于診斷、預(yù)防或用于治療、要治療區(qū)域的大小和位置、抗體(例如整個(gè)抗體、片段或雙價(jià)抗體)的精確特性、以及任何可4企測(cè)標(biāo)記或連接于抗體的其他分子的特性。對(duì)于系統(tǒng)應(yīng)用，典型的抗體劑量范圍是100pg至1g，而對(duì)于局部應(yīng)用是1昭至1mg?？梢越o予最初專交高的負(fù)荷劑量，接著給予一次或多次較低劑量?？贵w可以是整個(gè)抗體，例如IgGl或IgG4同種型。這是用于成人患者的單一治療的劑量，對(duì)于兒童和嬰兒可以4安比例;也調(diào)節(jié)，并且只t于其它^t體形式(antibodyformat)還與分子量成比例地加以調(diào)節(jié)。才艮據(jù)醫(yī)生的決定，可以以每曰、每周兩次、每周或每月間隔進(jìn)行重復(fù)治療。對(duì)于皮下給予，治療可以是每?jī)芍苤撩克闹芤淮危鴁j"于靜"永內(nèi)主合予，則治療可以是每四周至八周一次。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，治療是周期性的，并且主會(huì)予之間的期間為約兩周或更長(zhǎng)時(shí)間，例如約三周或更長(zhǎng)時(shí)間，約四周或更長(zhǎng)時(shí)間，或約每月一次。在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，可以在外并牛手術(shù)以前和/或以后纟合予治療，并且可以直4妻纟會(huì)予或施用于手術(shù)治療的解剖部位。技術(shù)人員來說，本發(fā)明的另外的方面和實(shí)施方式將是顯而易見的。實(shí)驗(yàn)材料與方法動(dòng)物模型動(dòng)物實(shí)-驗(yàn)由瑞士耳關(guān)邦獸醫(yī)局(SwissFederalVeterinaryOffice)i午可并4要照J(rèn)離士動(dòng)凈勿^f呆護(hù)條例(SwissAnimalProtectionOrdinance)進(jìn)行。定期監(jiān)測(cè)小鼠。當(dāng)顯示疼痛或痛苦的任何征兆時(shí)、或在體重?fù)p失>15%的情況下，對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂死。雄性Svl29小鼠(RCC,Fiillingsdorf,瑞士)接受靜脈內(nèi)注射約106突變F9鼠畸胎癌細(xì)胞(Terranaetal.1987),其由DarioRusciano(SIFI，Catania,意大利)友情提供。小鼠在腫瘤細(xì)胞注射以后3周用于體內(nèi)生物素化、耙向試—驗(yàn)或用于免疫組織化學(xué)的器官切除。體內(nèi)生物素化^口先前4翁述的(Roeslietal.2006,Rybaketal.2005),進(jìn)4亍體內(nèi)生物素化實(shí)-險(xiǎn)。筒言之，通過正中胸骨切開術(shù)對(duì)麻醉小鼠實(shí)施開胸。用灌注針對(duì)左心室實(shí)施穿刺并在右心房形成小切口以使灌注溶液可以流出。其后立即進(jìn)4亍體循環(huán)的灌注，其中壓力為lOOmmHg，流速為1.5ml/分鐘。在第一步驟中，用15ml生物素化溶液(預(yù)熱至38。C)實(shí)施灌注，其中該生物素^f匕-容、液包含在PBS中的1mg/ml石黃基畫NHS-LC-生物素(Pierce,Rockford,IL，USA)，pH7.4,并補(bǔ)充有1C)o/o(w/v)右旋糖酐-40(AmershamBiosciences,Uppsala,瑞典)作為血漿增容劑。/人而，可與生物素化反應(yīng)竟?fàn)幍难撼煞衷诠嘧?以及某些糖脂和磷脂)可以被生物素共價(jià)修飾。為了中和未反應(yīng)的生物素化J式劑，體內(nèi)生物素4b以后用50mMTris、10%(w/v)右旋糖酐-40(在PBS中，pH7.4，預(yù)熱至38。C)進(jìn)行洗滌步驟10分鐘。在用生物素化試劑灌注期間(以及在接著用淬滅溶液(quenchingsolution);蘀';主的最#刀3分4中內(nèi))，用50mMTris(在PBS中)，pH7.4(38。C)洗J條心臟周圍的區(qū)i或，以淬滅;危出的未反應(yīng)的生物素化試劑并避免在器官表面分子的不希望的標(biāo)記。在灌注以后，切除器官和肺瘤，才羊品^皮新鮮速凍以用于制備器官勻漿或一皮包埋在4氐溫包埋化合物(Microm,Walldorf,德國(guó))中并在液氮中冷凍于異戊烷中以用于制備用于組織化學(xué)分析的冰凍切片。未灌注小鼠用作用于蛋白質(zhì)組分析的陰性對(duì)照。蛋^^^紐為\沐的蛋冷炎取#的*備將樣品再懸浮于40ial/克組織的裂解緩沖液(2%SDS、50mMTris、10mMEDTA、完全E蛋白酶承卩制劑〉'昆合物(RocheDiagnostics,Mannheim,德國(guó))，在PBS中，pH7.4)中，然后利用Ultra-TurraxT8分散器(IKA-Werke,Staufen,德國(guó))力口以勻4b。利用Vibra-cell(Somes,NewTown,CT，USA)對(duì)勻漿進(jìn)行超聲處理，接著在99。C溫育15分鐘并在15000xg下離心20分鐘。上清液用作總蛋白提耳又物。利用BCA蛋白;農(nóng)度測(cè)定^式劑盒(BCAProteinAssayReagentKit(Pierce))來確定蛋白質(zhì)濃度。蘭^》,化蛋白的^化只于于每個(gè)才羊品，用纟爰沖液A(NP401%、SDS0.1%，在PBS中)洗:條960pi4連霉親和素-瓊脂#唐凝月交(AmershamBiosciences,Uppsala,瑞典)淤漿三次，制成顆粒并與15毫克總蛋白l是取物混合。在RT下在旋轉(zhuǎn)混合器中進(jìn)行生物素化蛋白的捕獲持續(xù)兩小時(shí)。除去上清液并用緩沖液A洗滌樹脂三次，用緩沖液B(NP400.1%,NaCl1M,在PBS中)洗滌兩次，并用50mM碳酸氫銨洗滌一次。最后，將樹脂再懸浮于400pi的50mM碳酸氬銨溶液并添加20(al測(cè)序級(jí)改性豬胰蛋白酶(在50mM碳酸氫銨中40ngVl的貯存液)(Promega，Madison,WI,USA)。在37。C和不斷凈覺4半下進(jìn)4亍蛋白酶消4匕過夜。用C18樣W主(ZipTipCI8，Millipore,Billerica,MA,USA)對(duì)肽進(jìn)行脫鹽、純化和濃縮。在凍干以后，將肽儲(chǔ)存在-20。C。勁術(shù)毛細(xì)管-7/尸丄C，其^動(dòng)化在錄流份定位fM4丄D/^標(biāo)我通過反相高效液相色i普法(RP-HPLC)來分離力夷蛋白酶肽，其中利用UltiMate納米尺度LC系統(tǒng)和FAMOS微型自動(dòng)采樣器(LCPackings,阿姆斯特丹，荷蘭)，其通過Chromeleon軟件(Dionex，Sunnyvale,CA，USA)力口以4空制。流動(dòng)相A由水中的2%乙腈和0,1%三氟乙酸(TFA)組成，流動(dòng)相B則由水中的80%乙腈和0.1%TFA組成。流速是300nl/分鐘。將來自生物素化蛋白(親和純化自1.5mg總蛋白)的消化的凍干肽溶解于5nl緩沖液A并裝填在柱(內(nèi)徑75拜，長(zhǎng)度15cm,填充有C18PepMap100,3,,100人微珠；LCPackings)上。用梯度為0-30%的B洗脫肽7分鐘，用30-80%的B洗脫67分鐘，用80-100%的B洗脫3分鐘，然后用100%的B洗脫5分鐘；在分析下一個(gè)才羊品前，用100%A對(duì)柱進(jìn)4亍平4軒20分鐘。將洗脫流份與3mg/mla-氰基-4-羥基肉桂酸、277pmol/ml神經(jīng)降壓肽(內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn))、0.1%TFA、以及70%的乙腈水溶液混合，然后力文置在利用在線Probot系統(tǒng)(Dionex)的192孑LMALDI目標(biāo)板上。MALDI基質(zhì)溶液的流量設(shè)置為1.083(al/分鐘。因此，在20秒期間內(nèi)收集的每個(gè)流^f分包含361nlMALDI基質(zhì)溶液和100nl樣品。神經(jīng)降壓肽的最終濃度是100fmol/孔。M4丄D/畫rOF/r(9Fl潘法用4700蛋白質(zhì)纟且分4斤4義(AppliedBiosystems,Frammgham，MA,USA)進(jìn)一亍MALDI-TOF/TOF質(zhì)"i普分析。對(duì)于前體離子選^奪，在進(jìn)4亍MS/MS以前，以MS方式測(cè)量所有部分。選沖奪最多15個(gè)前體/樣品斑點(diǎn)用于隨后的石皮碎，其中通過碰撞誘導(dǎo)離解。由GlobalProteinServerWorkstation(AppliedBiosystems)只寸i普進(jìn)4亍處J里和分才斤，其4吏用內(nèi)部MASCOT(MatrixScience,London,UK)壽欠件，用于將MS和MS/MS數(shù)據(jù)匹配于珪消化蛋白的婆t據(jù)庫(kù)。相對(duì)于下載自NCBI主頁(http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov/)小鼠凝:據(jù)庫(kù)篩查所獲得的數(shù)據(jù)。借助于MASCOT軟件進(jìn)行的蛋白質(zhì)鑒定被認(rèn)為是對(duì)于最好的肽離子在95%置4言區(qū)間內(nèi)的正確調(diào)用。利用4700蛋白質(zhì)纟且分4斤4義(AppliedBiosystems)進(jìn)4亍MALDI-TOF和MALDI-TOF/TOF質(zhì)i普分沖斤。在750至4000m/z的范圍內(nèi)獲得肽質(zhì)量，其中焦點(diǎn)質(zhì)量(focusmass)為2000m/z。MSi普總、纟吉自2000個(gè);款光散灃立，其來自在355nm,口200Hz下才喿4乍的Nd:YAG激光器。在6個(gè)才交準(zhǔn)孔中利用5個(gè)肽標(biāo)準(zhǔn)(質(zhì)量900-2400m/z;AppliedBiosystems)進(jìn)4亍自動(dòng)的4反才交準(zhǔn)?！坟?反才交準(zhǔn)用來更tf儀器默認(rèn)的用于所有MS和MS/MS譜的質(zhì)量校準(zhǔn)。另外，利用力口入MALDI基質(zhì)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)肽進(jìn)4亍每個(gè)MSi普的內(nèi)部沖交準(zhǔn)。自動(dòng)選擇信噪比〉100的最多15個(gè)前體/樣品孔用于隨后的破碎，其中通過碰撞誘導(dǎo)離解。MS/MS譜總結(jié)自2500至5000個(gè)激光散粒。由GlobalProteinServerWorkstation(AppliedBiosystems)對(duì)譜進(jìn)行處理和分析，其4吏用內(nèi)部MASCOT(MatrixScience)專欠件，用于將MS和MS/MS數(shù)據(jù)匹配于硅消化蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。MASCOT搜索參數(shù)是(i)2006年9月9曰下載自歐洲生4勿4言息學(xué)十辦會(huì)(EuropeanBioinformaticsInstitute(EBI))主頁(ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/SPproteomes/fasta/proteomes/59.M_musculus.fasta.gz)的小鼠數(shù)據(jù)庫(kù)；(ii)酶胰蛋白酶和半胰蛋白酶(semi-trypsin);(iii)允許的若干錯(cuò)誤切割1;(iv)可變翻譯后寸'務(wù)飾蛋氨酸氧化；(v)肽容差±30ppm;(vi)MS/MS容差±0.2Da;(vii)肽電荷+1;(viii)用于肽的最低離子評(píng)分C.I.%:95以及(ix)排名最高肽1。另夕卜，使用了用以下參數(shù)過濾的MS/MS峰(i)質(zhì)量51范圍低于前體質(zhì)量60Da至20Da;(ii)最小信噪比6;(iii)峰值密度過濾器最多30個(gè)峰值/200Da以及(iv)最大數(shù)量的峰/譜65。拔#先前已描述了抗ED-B抗體片革殳scFv(L19)的分離(Pinietal.1998)。利用發(fā)布的禾呈序(Giovannom，Nucleic.AcidResearch,2001,29(5):E27),乂人ETH-2文庫(kù)分離親4戈抗ED-A抗體。在以下部分描述了親代抗ED-A抗體的親和力成熟，產(chǎn)生高親和力抗ED-A抗體?！闦)-y4拔伴的,;fp力成熟親代抗ED-A抗體(ETH-2書亍生抗體)用作構(gòu)建親和力成熟文庫(kù)的才莫才反。在VHCDR1的位置31、32和33以及在VLCDR1的位置31、31a和32產(chǎn)生隨才幾突變的過程中，通過PCR在文庫(kù)的VHCDR1(DP47種系)和VLCDR1(DPK22種系)中引入序列變異性，其中對(duì)于VH4吏用部分簡(jiǎn)并引物AGGTGAATCCAGA誦3'(SEQIDNO:17)而對(duì)于VL4吏用ACACTCTGACTGGCCCTGC畫3'(SEQIDNO:18)(所有寡核芬酸購(gòu)買自德、國(guó)考牛隆的OperonBiotechnologies)。通過PCR裝配以scFv格式對(duì)VHVL組合進(jìn)行組裝，其中利用引物L(fēng)MB31ong(5'畫CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC-3')(SEQIDNO:19)和fdseqlong(5'-GACGTTAGTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3')(SEQIDNO:20),并利用凝月交純化的VH和VL節(jié),殳作為才莫^反。用NcoI/NotI雙重消化組裝的VH-VL片,殳并克隆到NcoI/NotI消化的pHENl噬菌粒載體(Hoogenboometal.，1991)。按照(Vitietal"2000)將獲得的連接產(chǎn)物電穿孔到電感受態(tài)大腸桿菌TG-l細(xì)胞，產(chǎn)生包含1.5xl(^個(gè)個(gè)體抗體克隆的文庫(kù)，其對(duì)具有改善的親和力結(jié)合ED-A的抗體進(jìn)行篩查。戎五ZX4it體的逸舉篩查上述抗體文庫(kù)，以獲得比親代抗ED-A抗體具有更大親和力結(jié)合ED-A的抗體，其中利用BIAcore分才斤。在BIAcore分牙斤中所4吏用的抗原(11A12)包含人纖連蛋白的ED-A結(jié)構(gòu)域并具有以下氨基酸序列(SEQIDNO:120):TLTSRPAQGVVTTLENVRSHHHHHH抗原(11A12)的核苷酸序列(SEQIDNO:121)如下atgagatcctaccgaacagaaattgacaaaccatcccagatgcaagtgaccgatgttcaggacaacagcattagtgtcaagtqgctgccttcaagttcccctgttactggttacagagtaaccaccactcccaaaaatggacc3gg3ccaacEi犯犯cte^actgc3ggtcc3gatc犯3C3g33atg3ctattg犯ggcttgcagcccacagtggagtatgtggttagtgtctatgctcagaatccaagcggagagagtcagcctcttccatcaaaattgcttgggaaagcccacaggggcaagtttccaggtacagggtgacctactcgagccctgaggatggaatccatgagctattccctgcacctgatggtgaagaagacactgcagagctgcaaggcctcagaccgggttctgagtacacagtcagtgtggttgccttgcacgatgatatggagagccagcccctgattggaacccagtccacagctattcctgcaccaactgacctgaagttcactcaggtcacacccacaagcctgagcgcccagtggacaccacccaatgttcagctcactggatatcgagtgcgggtgacccccaaggagaagaccggaccaatgaaagaaatcaaccttgctcctgacagctcatccgtggttgtatcaggacttatggtggccaccaaatatgaagtgagtgtctatgctcttaagqacactttgacaagcagaccagctcagggagttgtcaccactctggagaatgtcagatctcatcaccatcaccatcactaa通過PCR并利用引物來擴(kuò)增抗原的核苷酸序列，其中引物在5'和3'分另'J包含BamHI和BglII限制酶切4立點(diǎn)。用BamHI和BglII限制性內(nèi)切核酸酶消化獲得的PCR產(chǎn)物和載體pQE12(QIAGEN),隨后在包含3:1的插入片段與載體的反應(yīng)中加以連接。對(duì)所獲得的載體進(jìn)4亍測(cè)序以斥僉查序列的正確斗生?？乖闹苽淙缦略谟?pi的11A12的DNA樣史量制劑存在的條件下，在10ml2TY、Amp、1%葡萄糖中TG1電感受態(tài)預(yù)培養(yǎng)物一皮電穿孔。然后預(yù)培養(yǎng)物-波稀釋i:ioo(8ml在800ml的2TY、Amp、0.1°/。葡萄#唐中)并生長(zhǎng)至0.4-0.6的OD600,然后一皮IPTGi秀導(dǎo)過夜。第二天翁:轉(zhuǎn)沉淀細(xì)月包并過濾上清'液(Millipore0.22jam)。在離心并澄清液體i咅養(yǎng)基以后，利用在FPLC上的Hitrap柱純化11A12。Ni/柱的再生如下用5個(gè)柱容積(CV)的H20,4妻著用3CV的0.5MEDTA/0.2MTrispH8對(duì)柱進(jìn)行沖洗以從柱洗出用過的4臬。接著用5CV的H20沖洗柱。然后用2CV的100mMNiSO4重新裝填柱，4妻著用若干CV的H20沖洗柱。然后用5CV裂解纟爰沖液(20mM。米峻/250mMNaCl/PBSpH7.4)對(duì)柱進(jìn)一亍平tf。過濾細(xì)月包裂解液(Millipore0.45pm)并裝填到柱上(手動(dòng))。然后將柱放回到FPLC上并使(約3CV)裂解緩沖液流動(dòng)，直到UV信號(hào)變得穩(wěn)定(恒定)。然后開始洗脫程序在5CV中，梯度從0%至100%的洗脫緩沖液(400mM口米唑/250mMNaCl/PBSpH7.4)。匯聚包含洗脫抗原的流l分，然后在PBS中透才斤過夜?？笶D-A抗體的表達(dá)和純4匕抗ED-A抗體的表達(dá)和純4b如下在有1nl的抗ED-A抗體之一的DNA《效量制劑存在的條件下，在10ml2TY、Amp、1%葡萄糖中，將TG1電感受態(tài)預(yù)培養(yǎng)物電穿孔。然后預(yù)培養(yǎng)物被稀釋1:10054(8ml在800ml的2TY、Amp、0.1%葡萄4唐中)并生長(zhǎng)至0.4-0.6的OD600，然后纟皮IPTGi秀導(dǎo)過夜。第二天》走轉(zhuǎn)沉淀細(xì)力包并過濾上清液(Millipore0.22pm)。用蛋白-瓊脂沖唐;疑月交柱純化scFv并且三乙胺用來/人柱洗脫scFv。在4°C下在PBS中透析包含洗脫scFv的流份過夜。然后將scFv流傷"故置在Superdex75柱上，其中PBS以0.5ml/分鐘流過并收集0.25ml流4分。單體流-除用于BIAcore分4斤。BIAcore分析1用HBS-EP纟爰沖液BIACORE、0.01MN-2-羥乙基哌口秦畫N'畫2畫乙火克石黃酉臾(Hepes)pH7.4、0.15MNaCl、3mMEDTA、0.005%表面活性劑P20(用于測(cè)定的相同緩沖液)以5(al/分鐘的流速?zèng)_洗BIAcore芯片過4復(fù)?？乖?11A12)在醋酸鹽》爰沖液(pH4.0)中一皮稀釋至50pg/ml的濃度并且通過注射50pi的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和乙基-N-(二曱基氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)的混合物來激活芯片上的COOH基團(tuán)。將40jil的11A12^元原注射到芯片上并用30pl乙醇胺封閉剩余的游離COOH基團(tuán)。在0.22(im過濾以后，將20pl每一個(gè)體細(xì)菌上清液注射到芯片上并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與抗原的相互作用。BIA匿e分析2利用表面等離子體共振評(píng)價(jià)了親代抗ED-A抗體和抗ED-A抗體B2、C5、D5、C8、F8、B7以及G9的k。n、k。ff以及KD。用在測(cè)定期間使用的相同的緩沖液平衡芯片過夜，其中緩沖液流速為5(il/分鐘。以上述流速進(jìn)行整個(gè)涂布程序。用醋酸鹽緩沖液pH4.00(由BIACORE才是供)稀釋(1:25)抗原11A12至20pg/ml的終濃度。然后混合NHS和EDC并注射50pl以激活CM5芯片上的COOH基團(tuán)。接著是注射40pi的抗原(持續(xù)約40")。然后注射30pi的乙醇胺以阻斷最終游離的COOH的反應(yīng)性。以20pl/分鐘的流速測(cè)定每個(gè)才羊品。注射20pi未《希釋的單體蛋白(它來自凝膠過濾)。離解時(shí)間為約200"。然后注射10pl的HC110mM以再生芯片。以不同牙希釋度，即1:2稀釋度(在PBS中)重復(fù)注射單體蛋白，接著用HC1再生。接著以1:4的稀釋度第三次注射蛋白，接著再次用HC1再生。利用BIA評(píng)價(jià)軟件評(píng)價(jià)了每種抗ED-A抗體的k。n、k。ff以及KD^直。遂織化孛為了i正實(shí)成功的體內(nèi)生物素化，如在(Rybaketal.2005)中所描述的，之后進(jìn)4亍生物素化結(jié)構(gòu)的染色。乂人新鮮冷凍4羊品切割切片(10nm),用丙酮固定，依次用《連霉親和素生物素化』成性^粦酸酶復(fù)合物(Biospa,Milano，意大矛J)禾口用Fast-RedTP(Sigma)溫育[在有1mM左旋咪唑存在的條件下來抑制內(nèi)源性堿性磷酸酶],然后用蘇木素溶液(Sigma)復(fù)染。如先前描述的(參見例如，(Bracketal.200c))，用scFv國(guó)抗體(其攜帶FLAG標(biāo)記)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。簡(jiǎn)言之，同時(shí)用scFv片,殳(終濃度為2-10!ig/mL)和用單克隆抗Flag抗體M2來溫育切片。用兔4元鼠免疫3求蛋白#元體(Dakocytomation,Glostrup,丹麥)，接著用小鼠單克隆石威性磷酸酶抗堿性磷酸酶復(fù)合物(Dakocytomation)來才企測(cè)結(jié)合的4元體。FastRed(Sigma)用]乍石粦酸酶底物，并且用蘇木素(Sigma)7于切片實(shí)施復(fù)染。用Glycergel(Dakocytomation,Glostrup，丹麥)去于固,斤有^刀片并4昔助于AxiovertSI00TV顯樣M竟(CarlZeiss,Feldbach,瑞士)并利用Axiovision庫(kù)欠4牛(CarlZeiss)進(jìn)4亍分才斤。/#勿于拔五Z)-v4戎體迷/f謬^7定位用商用紅外熒光團(tuán)書f生物AlexaFluor750羧酸琥珀酰亞胺酯(Invitrogen)并4要照供應(yīng)商的實(shí)-驗(yàn)方案來標(biāo)記該親4戈抗ED-A抗體scFv。通過凝月交過濾并利用PD-10一主(GEHealthcare)將標(biāo)^己的抗體與未反應(yīng)的染泮+分離。接照Invitrogen標(biāo)記實(shí)-驗(yàn)方案估計(jì)的標(biāo)記程度為5個(gè)染料分子/抗體分子。在注射F9DR腫瘤細(xì)胞三周后，在Svl90小鼠的尾請(qǐng)爭(zhēng)月永注射Alexa750標(biāo)記的親代抗ED-AscFv抗體(纟冬;農(nóng)度為0.3mg/ml)(200pl/小鼠，即60pg#元體/小鼠)。在注射標(biāo)記的抗體6小時(shí)以后，切除小鼠器官并用國(guó)產(chǎn)(home-built)的紅外線熒光成像4義(Birchleretal.1999)成像，其中上述成4象儀裝備有卣鴒燈、專門針對(duì)Alexa750的激發(fā)和發(fā)射濾光片、以及單色CCD照相機(jī)。FS雙,拔體的蘭F8雙^介抗體包含與抗ED-A抗體F8相同的VH和VL結(jié)構(gòu)域，例如，采用scFv才各式。F8只又《介抗體和抗ED-AscFvF8在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間具有不同的接頭序列。F8雙價(jià)抗體接頭的氨基酸序列是GSSGG(SEQIDNO:28)(核苷酸序列g(shù)ggtccagtggcggt[SEQIDNO:29])。因此，F(xiàn)8雙價(jià)抗體接頭序列的長(zhǎng)度為5個(gè)氨基酸，而在抗ED-AscFvF8中接頭長(zhǎng)度為20個(gè)氨基酸(參見SEQIDNO:11)。在VL和VH結(jié)構(gòu)域之間接頭長(zhǎng)度的減小意味著有利于VL和VH結(jié)構(gòu)域的分子間而不是分子內(nèi)配對(duì)。因此，對(duì)于一個(gè)F8多肽的VL結(jié)構(gòu)域而言，和它西己對(duì)的相同F(xiàn)8多肽的VH結(jié)構(gòu)域相比，更可能與另一個(gè)F8多肽的VH結(jié)構(gòu)域配對(duì)。在大腸桿菌TGI細(xì)胞中表達(dá)F8雙價(jià)抗體，具體如下利用電穿孔，將編碼F8雙《介抗體的DNA引入電感受態(tài)大腸桿菌TGI細(xì)胞中。在10ml2YT培養(yǎng)基、Amp、1%葡萄糖中預(yù)培養(yǎng)該電穿孔的大腸桿菌細(xì)月包。將預(yù)培養(yǎng)物稀釋1:100成800ml2YTi咅養(yǎng)基、Amp、0.1%葡萄糖并且培養(yǎng)物生長(zhǎng)至0.6的密度(OD600nm)。然后利用1mM的IPTG"i秀導(dǎo)F8雙-階抗體的表達(dá)。用1251標(biāo)記表達(dá)的F8雙價(jià)抗體，具體如下將10pl無菌PBS加入非水溶性」碘化試劑(iodogen)管(涂布有50fil溶氯仿中的0.1mg/ml非水溶性石輿化試劑)，4妻著添力卩21251石典化鈉(約200pCi)并在室溫(RT)下溫育5分鐘。然后一夸在OD0.2處(約60fig)的400jal的F8只又1"介4元體力口入石典原管并在RT下溫育25分鐘。收集1/100的上述混合物以測(cè)量在混合物中包含的》丈射性(稱作'INPUT')。然后將標(biāo)記的F8雙-f介抗體裝填在尺寸排阻層對(duì)斤柱(PD10:SephadexG-25M,GEHealthcare)上以將石典化的F8雙《介抗體與游離石典分離。測(cè)量所收集的石典化F8雙價(jià)抗體的放射性并且計(jì)算得到的摻入F8雙價(jià)抗體中的碘的百分比(石典化F8雙價(jià)抗體的CPM[每分鐘計(jì)凄幻/CPMINPUT)為30-40%。將四只F9荷瘤小鼠;改置在Lugol上兩天(600pl變成300ml)以封閉甲狀腺并且對(duì)每只小鼠靜脈注射200|al^典化F8雙價(jià)抗體(約5-8lag石典4匕F8雙^N元體[18^Ci]/小鼠)。在24小時(shí)以后，處死小鼠并切除腫瘤、肝臟、肺臟、脾臟、心臟、腎臟、腸、尾以及血液(本文中統(tǒng)稱為小鼠'組織，)并用于方文射性計(jì)^L利用Perkin，計(jì)數(shù)器測(cè)量每個(gè)組織樣品中的放射性水平。通過注射劑量(以CPM為單位)的百分比除以組織的重量(以克為單位)來計(jì)算'輸出，(%ID/g)。58結(jié)果^弄衷這蛋^和f接f伴的鑒定在圖1A中描述了基于灌注的化學(xué)蛋白質(zhì)組方法，其用于在肝臟和在F9肝轉(zhuǎn)移瘤中可及蛋白的比4交分析(Terranaetal，1987)。這些肺瘤在小鼠肝表面和內(nèi)部發(fā)展成較大的轉(zhuǎn)移性病灶(圖1B)。在終端麻醉下，對(duì)荷瘤小鼠灌注15ml的1.8mM石黃基琥珀酰亞胺基-6-[生物素酰氨基]己酸酯(1mg/ml)在PBS中的〉容液，pH7.4，其補(bǔ)充有10%右旋糖酐-40作為血漿增容劑。該程序(其通常持續(xù)10分鐘)使得可以從大循環(huán)的所有器官除去血液并選擇性地使可及蛋白生物素化(在血管的腔和近腔方面)。借助于這種程序，高效率和選纟奪性地標(biāo)記了F9肝轉(zhuǎn)移瘤和幾乎所有血管，如通過用鏈霉親合素-堿性磷酸酶結(jié)合物進(jìn)行的組織化學(xué)染色所證實(shí)的(圖1C)。在正常肝臟中，血管^皮強(qiáng)染色，^f旦還才企測(cè)到某些竇狀隙的標(biāo)記，其與肝臟的生理過濾功能并不沖突(圖1C)。通過灌注包含伯胺的;容液來淬滅體內(nèi)生物素化。其后，乂人肝臟切除肝轉(zhuǎn)移瘤樣品，勻化并在有強(qiáng)洗滌劑SDS存在的條件下通過用鏈霉親合素樹脂的親和層析來回收生物素化蛋白(圖1A)。為了將轉(zhuǎn)移瘤蛋白在宿主肝臟中的擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)降低到最小程度，來自體內(nèi)生物素化的健康小鼠的肝臟用于研究正常肝血管。來自F9荷瘤小鼠的宿主肝臟的應(yīng)用也是有問題的，這是由于幾乎沒有殘余的Y建康組織并且難以以肉眼排除沒有微小轉(zhuǎn)移。總計(jì)利用來自7只體內(nèi)生物素化的健康小鼠和9只體內(nèi)生物素化的F9荷瘤小鼠的樣品用于蛋白質(zhì)組分析。另外，來自2只1^康小鼠和3只荷轉(zhuǎn)移瘤非生物素4b小鼠的^^羊品用作陰性對(duì)照。來自F9轉(zhuǎn)移瘤和正常肝(并4于處理)的鏈霉親合素捕獲蛋白的嚴(yán)格洗滌程序和在樹脂上胰蛋白酶消化產(chǎn)生了肽的集合，其可以#皮分離、鑒定和比4交，其中利用納米HPLC和MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜程序(Roeslietal"2006)?？偣茶b定了1291種不同的肽0950/。Mascot置信水平)，通過Mascot軟件將其分為480個(gè)不同肽組。在來自非生物素化小鼠的陰性對(duì)照樣品中也發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)這樣的肽組(如羧化酶，其攜帶內(nèi)源性生物素作為輔因子，角蛋白作為污染物，或非常豐富的蛋白質(zhì)如血清白蛋白)。其余的435個(gè)鑒定的肽《且中的331個(gè)可以通過Mascot軟件明白地注解為單種蛋白，而104個(gè)肽組被注解為多種(總計(jì)為358種)蛋白。在大多數(shù)情況下，注解為相同肽組的多種蛋白屬于相關(guān)蛋白家族(例如，免疫球蛋白)或甚至可以是具有不同數(shù)據(jù)庫(kù)條目(databaseentry)的相同蛋白。在435個(gè)不同肽組中，117個(gè)只存在于轉(zhuǎn)移瘤樣品中，193個(gè)僅存在于健康肝臟樣品中以及125個(gè)存在于兩種類型的《且織中。例如，匹配于纖連蛋白的肽(美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心[NCBI]登錄號(hào)為P11276)存在于4個(gè)健康肝臟樣品中以及8個(gè)轉(zhuǎn)移瘤才羊品中。存在于1"建康肝臟和轉(zhuǎn)移瘤樣品中的蛋白(例如纖連蛋白)可以以顯著不同的水平存在于兩種樣品中。如果是這樣的話，這應(yīng)由在其中檢測(cè)到蛋白的樣品數(shù)目來反映，和/或由在肝臟和轉(zhuǎn)移樣品中觀測(cè)到的肽數(shù)目來反映(以及歸一化的肽信號(hào)強(qiáng)度；(Scheureretal.2005,Scheureretal.2005))。例如，來自纖連蛋白(NCBI登錄號(hào)為P11276)的38種月夷蛋白酶肽V叉存在于轉(zhuǎn)移瘤才羊品中，而一種肽僅存在于健康肝臟樣品中。11種肽存在于兩種典型的樣品中。盡管肝臟是纖連蛋白生物合成的部位，但在肝臟轉(zhuǎn)移瘤中4企測(cè)到的纖連蛋白衍生肽的顯著豐度促使我們研究了纖連蛋白衍生肽的相對(duì)豐度的差異以及可變剪接域的過度表達(dá)。表1列出了在蛋白質(zhì)組分析中鑒定的所有纖連蛋白肽。小鼠纖連蛋白包含兩個(gè)可以經(jīng)受可變剪4妄的III型J求4犬額夕卜結(jié)構(gòu)i或ED-A和ED-B(ffrench-Constant1995,Hynes1990，Kasparetal.2006)。jt匕夕卜，IIICS節(jié)段在小鼠和人類中經(jīng)受不同的剪接模式。有趣的是，僅在腫瘤樣品中觀測(cè)到所有三種ED-A衍生肽以及IIICS衍生肽。在此分析中看不到ED-B書f生肽，這是由于ED-B不包含賴氨酸殘基而兩個(gè)4青氨酸產(chǎn)生的力太的尺寸太大以致^r測(cè)不到。圖2A示出了在腫瘤樣品(腫瘤)和健康肝臟樣品(正常)中鑒定的肽在纖連蛋白域結(jié)構(gòu)上的位置。圖2B示出了兩種纖連蛋白衍生肽的歸一化MS信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度位于ED-A結(jié)構(gòu)域內(nèi)的IAWESPQGQVSR(SEQIDNO:16),以及^立于結(jié)構(gòu)i或14中的FLTTTPNSLLVSWQAPR(SEQIDNO:15)。后一種肽在轉(zhuǎn)移瘤樣品中更加豐富，j旦在正常肝只于應(yīng)物中也明確可斥企測(cè)到。相比之下，ED-A書亍生肽在轉(zhuǎn)移瘤才羊品中產(chǎn)生強(qiáng)信號(hào)，j旦在正常肝臟中則完全才企測(cè)不到(即，4氐〉10(H咅的信號(hào))。龍瘦逸織化夢(mèng)在肝臟結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)移性新生血管之間觀測(cè)到纖連蛋白的ED-A和ED-B結(jié)構(gòu):威的最顯著區(qū)別。在兩種情況下，均見測(cè)到轉(zhuǎn)移性血管的強(qiáng)和特異性染色，而在此免疫組織化學(xué)分碎斤中正常肝臟和幾乎所有正常器官(除在增生期的子宮內(nèi)膜和卵巢的有些血管之外)均為負(fù)分(圖3A)。重要的是，還發(fā)現(xiàn)在人肺轉(zhuǎn)移瘤和肝臟轉(zhuǎn)移瘤的新血管中，ED-A一皮強(qiáng)烈表達(dá)(圖4)。為了測(cè)試ED-A作為用于轉(zhuǎn)移瘤的基于配體的血管耙向的耙標(biāo)的有效性，利用近紅外熒光成i象進(jìn)行體內(nèi)靶向試驗(yàn)。用AlexaFluor750標(biāo)記親^抗ED-AscFv抗體并l爭(zhēng)月永注射到F9荷轉(zhuǎn)移瘤小鼠。切除器官的近紅外熒光成像揭示了在轉(zhuǎn)移性病變中靶向劑的顯著累積(圖3B)。61拔^我體的逸斧BIAcore分析1BIAcore分析產(chǎn)生每種抗ED-A抗體的圖l象，對(duì)其加以分析以推斷抗體對(duì)抗原的親和力，具體如下每幅圖j象的X軸對(duì)應(yīng)于時(shí)間而y軸對(duì)應(yīng)于共才展單位(ResonanceUnit)(—種度量，其指示所測(cè)試抗體對(duì)于涂布在BIAcore芯片上的抗原的結(jié)合親和力)。每幅圖示出了3個(gè)峰和1個(gè)對(duì)應(yīng)于緩沖液的變化的斜坡(dig)，因而與結(jié)果的解釋無關(guān)。每幅圖的上升部分表示結(jié)合期。在圖4象的此部分曲線越陡峭，則抗體與抗原的結(jié)合得越快。每幅圖的下降部分表示抗體與抗原的離解期。在此圖^象部分曲線越平坦，則抗體與抗原的離解越十曼。由親4、抗ED-A抗體書亍生的抗ED-A抗體HI、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8以及G9均顯示出比親4戈抗ED-A抗體更平坦的離解曲線，這表明它們以比親代抗ED-A抗體更大的親和力結(jié)合ED-A，因而還結(jié)合A-FN。4元體E5、Fl、F8以及H1的圖4象顯示出所測(cè)試的所有抗ED-A抗體的最平坦的離解曲線?？贵wHl、C5、D5、E5、C8、F8以及F1的結(jié)合曲線比4十只寸親^U元ED-A抗體所7見測(cè)到的結(jié)合曲線更平坦，而抗體B2、B7、E8以及G9所)現(xiàn)測(cè)到的結(jié)合曲線與親4戈抗ED-A抗體所7見測(cè)到的結(jié)合曲線一樣陡峭。然而，當(dāng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌TG-1細(xì)胞的細(xì)菌上清液用于抗體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8以及G9的BIAcore分析時(shí)，所測(cè)試的抗體樣品的濃度是未知的，但最有可能低于用于比砵交的親^R抗ED-A抗體才羊品的濃度。因此，抗體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8以及G9的結(jié)合曲線可以^皮人為地降低，這是由于在用于BIAcore分析的樣品中的抗體濃度較低。然而，由于在BIAcore分析中濃度并不顯著影響抗體與其靶抗原的離62解，所以針對(duì)抗體Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8以及G9所7見測(cè)到的平坦的離解曲線表明這些抗體結(jié)合ED-A，并且和親代抗ED-A抗體相比具有至少相等、以及可能更高的親和力。因此，當(dāng)利用親代抗ED-A抗體進(jìn)行相同體內(nèi)和免疫組織化學(xué)研究時(shí)(如在本文其它地方所描述的)，抗ED-A抗體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8以及G9才及有可能產(chǎn)生相同或更好的結(jié)果。因此，利用親代抗ED-A抗體獲得的體內(nèi)和免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)提供了抗ED-A抗體Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8以及G9可以用于治療肺瘤轉(zhuǎn)移瘤的i正據(jù)。BIAcore分析2利用BIA評(píng)價(jià)軟件評(píng)價(jià)了每種抗ED-A抗體的k。n、k。ff以及KXH直。親^U元ED-A抗體和抗ED-A抗體B2、C5、D5、C8、F8、B7以及G9對(duì)于抗原11A12的k。n、koff以及KD^f直詳細(xì)列在表3中。由親代抗ED-A抗體書亍生的抗ED-A抗體B2、C5、D5、C8、F8、B7以及G9對(duì)于抗原11A12均比親代抗ED-A抗體具有更好的KD值，這表明它們以比親代抗ED-A抗體更大的親和力結(jié)合ED-A,因而還結(jié)合A-FN。因此，當(dāng)利用親代抗ED-A抗體進(jìn)行相同體內(nèi)和免疫組織化學(xué)研究時(shí)(如在本文其它地方所描述的)，抗ED-A4元體B2、C5、D5、C8、F8、B7以及G9才及有可能產(chǎn)生相同或更好的結(jié)果。因此，利用親代抗ED-A抗體獲得的體內(nèi)和免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)提供了抗ED-AB2、C5、D5、C8、F8、B7以及G9可以用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移瘤的i正據(jù)。FS雙/介^t體的_^參為、布每克(g)小鼠組織中才全測(cè)到的1125標(biāo)記(;碘化)F8雙價(jià)抗體的注射劑量(ID)的百分比(％)非常類似于肝臟、肺臟、脾臟、心臟、腎臟、腸、尾以及血液，并且除腎臟之外均顯示小于2%ID/g(圖8)。相反，F(xiàn)9腫瘤比所分析的任何其它小鼠組織平均包含多約四倍的ID(圖8)。這表明，F(xiàn)8雙j介抗體^皮選4奪性地靶向于F9小鼠腫瘤。在其他組織中4企測(cè)到的ID的百分比最有可能表示小鼠體內(nèi)存在的F8雙價(jià)抗體或其他小鼠組織的非特異性標(biāo)記的背景負(fù)載(backgroundload)。如在本文其他地方所描述的，利用四只小鼠進(jìn)行生物分布實(shí)驗(yàn)，并且雖然每只小鼠組織中才企測(cè)到的ID的百分比是不同的(參見圖8中的誤差條線)，^f旦在F9腫瘤中才全測(cè)到的F8雙1"介抗體的百分比一致地高于所測(cè)試的^f壬何其他小鼠組織。對(duì)F9原發(fā)性腫瘤進(jìn)4亍了生物分布研究，結(jié)果表明，才艮據(jù)本發(fā)明的抗ED-A抗體被選擇性地靶向于體內(nèi)腫瘤組織。結(jié)果進(jìn)一步表明，當(dāng)利用親代抗-ED-A抗體進(jìn)行相同的體內(nèi)和免疫組織化學(xué)研究時(shí)(如在本文其它地方描述的)，本發(fā)明的抗ED-A抗體可以用來獲得相同或更好的結(jié)果。承#抗ED畫A抗體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8以及G9均是scFv4元體，并利用常頭見方法力口以測(cè)序。4元ED-A4元體Hl的核苷酸序列示于圖6中?？笶D-A抗體H1的氨基酸序列示于圖7中。編碼抗ED-A抗體B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8以及G9的VH和/或VL的優(yōu)選的核苷酸序列與編碼抗ED-A抗體Hl的VH和/或VL的核苷S臾序列相同，只'是編碼輕(VL)和重(VH)鏈的HICDR1的核苦酸序列被編碼相應(yīng)抗體輕《連(VL)和重鏈(VH)CDR1(列在表2中)的核苷酸序列取代。編碼抗ED-AF8雙1"介抗體的VH和/或VL結(jié)構(gòu)i或的某些優(yōu)選的核苷g交序列與編碼抗ED-A抗體Hl的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列相同，只是編碼輕鏈(VL)和重鏈(VH)的HICDR1的核苷酸序列一皮編碼抗ED-A抗體F8的輕鏈(VL)和重鏈(VH)CDR1(列在表2中)的核香酸序列取代。編碼接頭(其連接抗ED-AF8雙價(jià)抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域)的一個(gè)優(yōu)選核苷酸序列是gggtccagtggcggt(SEQIDNO:29)?？笶D畫A抗體B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8以及G9具有與抗ED-A抗體HI相同的氨基酸序列，只是輕鏈(VL)和重《連(VH)的HICDR1的氨基S吏序列^皮相應(yīng)抗體的輕《連(VL)和重鏈(VH)CDR1(列在表2中)的氨基酸序列取代?？笶D-AF8雙1介抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)i或的氨基酸序列與抗ED-A抗體HI的氨基酸序列相同，只是輕(VL)和重(VH)鏈的HICDR1的氨基酸序列一皮抗ED-A抗體F8的輕4連(VL)和重《連(VH)CDR1(歹'J在表2中)的氨基酸序列取代，以及在H1中的接頭的氨基酸序列被接頭氨基酸序列GSSGG(SEQIDNO:28)耳又代。抗ED-A抗體B2VH結(jié)構(gòu)i或的氨基酸序歹'J(SEQIDNO:21)與抗ED-A抗體HI的VH結(jié)構(gòu)i或的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:23代替HI的VHCDR1?？笶D-A抗體C5VH結(jié)構(gòu)i或的氨基酸序列(SEQIDNO:41)與抗ED-A抗體HI的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:43代替HI的VHCDR1?？笶D-A抗體D5VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQIDMO:51)與抗ED-A抗體H1的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:53代替HI的VHCDR1?？笶D-A抗體E5VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQIDNO:61)與抗ED-A抗體HI的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:63代替HI的VHCDRl。抗ED-A抗體C8VH結(jié)構(gòu)域的-氤基酸序列(SEQIDNO:71)與抗ED-A抗體HI的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同，只是SEQIDNO:73代替HI的VHCDR1。抗ED-A抗體F8VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQIDNO:81)與抗ED-A抗體HI的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同，只是SEQIDNO:83^R^齊HI的VHCDRl。抗ED-AF8只又^f介抗體的VH結(jié)構(gòu)i或具有與抗ED-AscFv抗體F8的VH結(jié)構(gòu)域相同的氨基酸序列(即SEQIDNO:81)?？笶D-A抗體FlVH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQIDNO:91)與抗ED-A抗體H1的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:93代替HI的VHCDRl?？笶D-A抗體B7VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQIDNO:101)與抗ED-A抗體HI的VH結(jié)構(gòu)i或的氨基酸序列相同，只是SEQIDNO:103替HI的VHCDRl?？笶D-A抗體E8VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQIDNO:111)與抗ED-A抗體H1的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:113代替HI的VHCDRl?？笶D-A抗體G9VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQIDNO:31)與抗ED-A抗體H1的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:33代替HI的VHCDRl?？笶D-A抗體B2VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQIDNO:22)與抗ED-A抗體HI的VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:26代替HI的VLCDRl。抗ED-A抗體C5VL結(jié)構(gòu)域的氨基S吏序列(SEQIDNO:42)與抗ED-A抗體H1的VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:46代替HI的VLCDRl?？笶D-A抗體D5VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQIDNO:52)與抗ED-A抗體H1的VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:56代替HI的VLCDRl?？笶D-A抗體E5VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQIDNO:62)與抗ED-A抗體H1的VL結(jié)構(gòu)域的氨基S交序列相同，只是由SEQIDNO:66代替HI的VLCDRl?？笶D-A抗體C8VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQIDNO:72)與抗ED-A抗體HI的VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:76代替HI的VLCDRl?？笶D-A抗體F8VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQIDNO:82)與抗ED-A抗體H1的VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:86^^齊HI的VLCDRl?？笶D-AF8雙l介抗體的VL結(jié)構(gòu)i或具有與抗ED-A抗體F8的VL結(jié)構(gòu)域相同的氨基酸序列(即SEQIDNO:82)?？笶D-A抗體FlVL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQIDNO:92)與抗ED-A抗體H1的VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:96代替HI的VLCDRl?？笶D-A抗體B7VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQIDNO:102)與抗ED-A抗體H1的VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:106HI的VLCDR1?？笶D-A抗體E8VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQIDNO:112)與抗ED-A抗體H1的VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:116代替HI的VLCDR1。抗ED-A抗體G9VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQIDNO:32)與抗ED-A抗體H1的VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相同，只是由SEQIDNO:36代替HI的VLCDRl?？蛇x地，長(zhǎng)口圖7A所示，在#元ED-A4元體Hl、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8、G9的VH結(jié)構(gòu)i或的^f立置5處的氨基酸可以是亮氨酸殘基(L)而不是纈氨酸殘基(V)。此外或可替換地，如圖7C所示，在抗ED畫A抗體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F8、Fl、B7、E8、G9的VL結(jié)構(gòu)域的位置18處的氨基酸可以是精氨酸殘基(R)而不是賴氨酸殘基(K)。參考文獻(xiàn)在本說明書中任何地方引用的所有參考文獻(xiàn)，包括那些在上述有目的。Amitetal.(1986),Science,233:747-753.Andersenetal.(2002)CurrentOpinionmBiotechnology13:117.Ausubeletal.(1999)4theds.，ShortProtocolsmMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons.BagshaweK.D，etal.(1991)Antibody,ImmunoconjugatesandRadiopharmaceuticals4:915-922Balzaetal.(1988),FEBSLett"228:42-44.Birchleretal.(1999)，J,Immunol.Methods,231,239-248.Birdetal.(1988)Science,242，423-426Borsietal.(1987)，J.Cell.Biol"104,595-600.Borsietal.(1990),FEBSLett.,261:175-178.Borsietal.(1995)，J.Biol,Chem.,270:6243-6245.Borsietal.(1998),Exp.CellRes"240,244-251.Bracketal.(2006)，Clin.CancerPes.,12，3200-3208.Carnemollaetal.(1989),J.Cell.Biol"108:1139-1148.Catonetal.(1990),J.Immunol"144:1965-1968.Chaddetal.(2001)，CurrentOpinioninBiotechnology12:188-194Chothiaetal.(1987)，J，Mol.Biol"196:901-917.Chothiaetal.(1989)，nature,342:877-883.Devosetal.(1983),Nucl.AcidsRes.11:4307-4323.ffrench-Constant(1995),Exp.CellRes.,221，261-271.69Research,2001,29(5):E27.Gle皿ieMJetal.，1987J.Immunol.139,2367-2375Haanetal.(2004),BioCentury,12(5):A1-A6.Hanahanetal.(2000),Cell200,57-70.HarlowandLane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborKornblihttetal.(1984)，NucleicAcidsRes.12,5853-5868.Laboratory,ColdSpringHarborN.Y.,pp.726，1988Heikmheimoetal.(1991)，VirchowsArch.BCellPathol.Incl.Mol.Pathol"61,101-109.HolligerandBohlen1999Cancerandmetastasisrev.18:411-419.Holligeretal.(1993a)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448.Holligeretal.(1993b),CurrentOpinionBiotechnol4,446-449.Holtetal.(2003)TrendsinBiotechnology21，484-490.Hoogenboometal.(1991)，NucleicAcidsRes.,19(15)4133-7.Huetal.(1996)，CancerRes"56，3055-3061.Hustonetal.(1988)PNASUSA,85,5879-5883.Hynes,R.O.(1990).Fibronectins(NewYork:Springer-Verlag).Jacobsetal.(2002),Hum.Pathol"33，29-38.Kabatetal.(1987)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest.4thEdition.USDepartmentofHealthandHumanServices。Kabatetal.(1991a),SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEdition.USDepartmentofHealthandHumanServices,PublicService,NIH，Washington,(a)Kabatetal.(1991b),J.Immunol"147:1709-1719.Kasparetal.(2006)，Int..Cancer,118,1331-1339.Knappiketal,,(2000)J.Mol，Biol.296,57-86.KohlerandMilstein,Nature,256:495-497，197570Koideetal.(1998),JournalofMolecularBiology,284:1141-1151.Kontermannetal.(2001),S,AntibodyEngineering,Springer-VerlagNewYork,LLC;ISBN:3540413545.Koukoulisetal.(1993),J.Submicrosc.Cytol.Pathol"25,285-295.Koukoulisetal.(1995)，UltrastmctPathol"19,37-43.Rrebsetal.(2001),JournalofImmunologicalMethods,25467-84.LarrickJWandThomasDW(2001)CurrentOpinioninBiotechnology12:411-418.LedermannJ.A.etal,(1991)Int.J.Cancer47:659-664Lohietal.(1995),Int.J.Cancer,63,442-449.MaED國(guó)Aetal.(1983)Biochem.Biophys.Res,Comm.115:1040-1047;Matsumotoetal.(1999),Jpn.J.CancerRes.,90,320-325.McCaffertyetal"(1990)Nature,348,552-554.Mendez，M.etal,,(1997)NatureGenet,15(2):146-156.Merchandetal"1998Nat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種型和/或纖連蛋白的ED-A的結(jié)合成員，包含VH結(jié)構(gòu)域，其中所述VH結(jié)構(gòu)域包含骨架和一組互補(bǔ)決定區(qū)HCDRl、HCDR2以及HCDR3，其中HCDRl具有氨基酸序列SEQIDNO:3、23、·33、43、53、63、73、83、93、103或113,HCDR2具有氨基酸序列SEQIDNO:4,以及HCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:5;或其中所述VH結(jié)構(gòu)域包含一組在所述互補(bǔ)決定區(qū)HCDRl、HCDR2以及HCDR3內(nèi)具有10個(gè)或更少的氨基酸置換的互補(bǔ)決定區(qū)。21.才艮據(jù)4又利要求19所述的結(jié)合成員，其中，所述VH結(jié)構(gòu)域骨架是人種系骨架。22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的結(jié)合成員，其中，所述VH結(jié)構(gòu)域具有氨基酸序列SEQIDNO:1、21、31、41、51、61、71、81、91、101或111。23.根據(jù)權(quán)利要求19至21中任一項(xiàng)所述的結(jié)合成員，其中，所述結(jié)合成員進(jìn)一步包含VL結(jié)構(gòu)域，其中所述VL結(jié)構(gòu)域包含一組互補(bǔ)決定區(qū)LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及骨架。24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的結(jié)合成員，其中，LCDR1具有氨基酸序列SEQIDNO:6、26、36、46、56、66、76、86、96、106或116,LCDR2具有氨基酉交序列SEQIDNO:7,以及LCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:8;或其中所述VL結(jié)構(gòu)域包含一組在所述互補(bǔ)決定區(qū)LCDRl、LCDR2以及LCDR3內(nèi)具有IO個(gè)或更少的氨基酸置才奐的互4卜決定區(qū)。25.根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的結(jié)合成員，其中，所述VL結(jié)構(gòu)域骨架是人種系骨架。26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的結(jié)合成員，其中，所述VL結(jié)構(gòu)域具有氛基酉交序歹11SEQIDNO:2、22、32、42、52、62、72、82、92、102或112。27.根據(jù)權(quán)利要求22至25中任一項(xiàng)所述的結(jié)合成員，其中，所述結(jié)合成員是單鏈Fv。28.根據(jù)權(quán)利要求22至25中任一項(xiàng)所述的結(jié)合成員，其中，所述結(jié)合成員是雙價(jià)抗體。29.根據(jù)權(quán)利要求19至26中任一項(xiàng)所述的結(jié)合成員，其中，所述結(jié)合成員結(jié)合于可檢測(cè)標(biāo)記。30.根據(jù)權(quán)利要求19至26中任一項(xiàng)所述的結(jié)合成員，其中，所述結(jié)合成員結(jié)合于具有殺生物活性或細(xì)胞毒活性的分子。31.根據(jù)權(quán)利要求19至26中任一項(xiàng)所述的結(jié)合成員，其中，所述結(jié)合成員結(jié)合于放射性同位素。32.—種結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員用于制造i貪斷腫瘤轉(zhuǎn)移瘤的診斷產(chǎn)品的應(yīng)用。33.根據(jù)權(quán)利要求30所述的應(yīng)用，其中，所述結(jié)合成員結(jié)合纖連蛋白的ED-A。34.根據(jù)權(quán)利要求19至27中任一項(xiàng)所述的結(jié)合成員用于制造診斷腫瘤轉(zhuǎn)移瘤的診斷產(chǎn)品的應(yīng)用。35.—種用于在人或動(dòng)物中4企測(cè)或i貪斷腫瘤轉(zhuǎn)移瘤的方法，包括以下步驟(a)將結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員給予所述人或動(dòng)物，以及(b)確定在所述人或動(dòng)物體中在遠(yuǎn)離由原發(fā)性腫瘤目前或以前占據(jù)部^立的部位是否存在所述結(jié)合成員；其中在所述人或動(dòng)物中所述結(jié)合成員定位于遠(yuǎn)離由所述原發(fā)性肺瘤目前或以前占據(jù)部位的部位則表明腫瘤轉(zhuǎn)移瘤的存在。36.4艮據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述結(jié)合成員結(jié)合纖連蛋白的ED-A。37.根據(jù)權(quán)利要求33或34所述的方法，其中，所述結(jié)合成員結(jié)合于可才全測(cè)標(biāo)i己。38.才艮據(jù)4又利要求33或34所述的方法，其中，所述結(jié)合成員結(jié)合于放射性同位素。39.—種用于在個(gè)體中治療肺瘤轉(zhuǎn)移瘤的方法，包括給予所述個(gè)體治療有效量的包含結(jié)合成員的藥劑，其中所述結(jié)合成員結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型。40.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中，所述結(jié)合成員結(jié)合纖連蛋白的ED-A。41.根據(jù)權(quán)利要求37或38所述的方法，其中，所述結(jié)合成員結(jié)合于可才企測(cè)沖示i己。42.根據(jù)權(quán)利要求37或38所述的方法，其中，所述結(jié)合成員結(jié)合于具有殺生物活性或細(xì)胞毒活性的分子。43.根據(jù)權(quán)利要求37或38所述的方法，其中，所述結(jié)合成員結(jié)合于》文射性同位素。44.一種在人或動(dòng)物中將分子遞送到肺瘤轉(zhuǎn)移的新生血管的方法，包括將結(jié)合纖連蛋白的ED-A同種型的結(jié)合成員給予所述人或動(dòng)物，其中所述結(jié)合成員結(jié)合于所述分子。45.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中，所述結(jié)合成員結(jié)合纖連蛋白的ED-A。46.根據(jù)權(quán)利要求42或43所述的方法，其中，所述分子是可檢測(cè)標(biāo)記。47.根據(jù)權(quán)利要求42或43所述的方法，其中，所述分子具有殺生物活性或細(xì)月包毒活性。48.根據(jù)權(quán)利要求42至43中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述分子是放射性同位素。49.根據(jù)權(quán)利要求33至46中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述結(jié)合成員包含VH結(jié)構(gòu)域，以及其中所述VH結(jié)構(gòu)域包含骨架和一組互補(bǔ)決定區(qū)HCDR1、HCDR2以及HCDR3，其中HCDR1具有氨基酸序列SEQIDNO:3、23、33、43、53、63、73、83、93、103或113,HCDR2具有氨基酸序列SEQIDNO:4,以及HCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:5;或其中所述VH結(jié)構(gòu)域包含一組在所述互補(bǔ)決定區(qū)HCDR1、HCDR2以及HCDR3內(nèi)具有10個(gè)或更少的氨基酸置才奐的互4卜決定區(qū)。50.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中，所述VH結(jié)構(gòu)域骨架是人種系骨架。51.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述VH結(jié)構(gòu)域具有氨基酸序列SEQIDNO:1、21、31、41、51、61、71、81、91、101或111。52.根據(jù)權(quán)利要求47至49中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述結(jié)合成員進(jìn)一步包含VL結(jié)構(gòu)域，其中所述VL結(jié)構(gòu)域包含一組互才卜決定區(qū)LCDR1、LCDR2,口LCDR3，以及骨架。53.才艮據(jù)4又利要求50所述的方法，其中，LCDR1具有氨基酸序列SEQIDNO:6、26、36、46、56、66、76、86、96、106或116,LCDR2具有氨基酸序列SEQIDNO:7,以及LCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:8;或其中所述VL結(jié)構(gòu)i或包含一《且在所述互^卜決定區(qū)LCDR1、LCDR2以及LCDR3內(nèi)具有10個(gè)或更少的氨基酸置換的互補(bǔ)決定區(qū)。54.才艮據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中，所述VL結(jié)構(gòu)域骨架是人種系骨架。55.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中，所述VL結(jié)構(gòu)域具有氨基酸序列SEQIDNO:2、22、32、42、52、62、72、82、92、102或112。56.根據(jù)權(quán)利要求50至53中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述結(jié)合成員是單鏈Fv。57.根據(jù)權(quán)利要求50至53中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述結(jié)合成員是雙價(jià)抗體。全文摘要本發(fā)明涉及一種結(jié)合成員，其結(jié)合纖連蛋白的額外結(jié)構(gòu)域-A(ED-A)同種型，用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移瘤。文檔編號(hào)A61K39/395GK101687923SQ200880018310公開日2010年3月31日申請(qǐng)日期2008年3月31日優(yōu)先權(quán)日2007年4月2日發(fā)明者喬瓦尼·內(nèi)里,亞歷山德拉·維拉,克里斯托夫·勒斯利,達(dá)里奧·內(nèi)里,雅舍·雷巴克申請(qǐng)人:菲洛根股份公司