類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其他自身免疫疾病的多重免疫試驗(yàn)的制作方法
【專利摘要】通過(guò)多重試驗(yàn)診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其他自身免疫疾病，所述試驗(yàn)涉及針對(duì)一組抗原的抗體，所述抗原包括環(huán)化瓜氨酸化肽和至少五個(gè)來(lái)自列表的成員，所述列表包括BRAF1 506-525、BRAF2 656-675、瓜氨酸化波形蛋白(蛋白)、環(huán)化波形蛋白415-433cit、環(huán)化波形蛋白58-77cit3、環(huán)化凝聚素231-250cit sm1、環(huán)化血纖蛋白原A 556-575cit sm、環(huán)化血纖蛋白原A 616-635cit sm、環(huán)化組蛋白2A H2A/a1-20cit sm2、環(huán)化絲聚蛋白48-65cit2v1、BRAF(來(lái)自v raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1的催化結(jié)構(gòu)域，氨基酸416-766)。
【專利說(shuō)明】類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其他自身免疫疾病的多重免疫試驗(yàn)
[0001] 相關(guān)專利申請(qǐng)的交叉參考
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年4月16日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/624,871 W及2013 年3月13日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?3/801，275的優(yōu)先權(quán)，上述文獻(xiàn)都通過(guò)引用納入本文 W用于所有目的。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 1.【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005] 本發(fā)明涉及免疫診斷領(lǐng)域，特別感興趣的是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
[0006] 2.現(xiàn)有技術(shù)說(shuō)明
[0007] 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種常見的自身免疫疾病，影響全世界0. 5-1 %的人口。該系統(tǒng) 性疾病的特征是滑膜關(guān)節(jié)的慢性炎癥，導(dǎo)致軟骨和骨破壞，并最終導(dǎo)致患者殘疾。雖然類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎不是威脅生命的疾病，但其可嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診 斷大多基于臨床觀察，但診斷中越來(lái)越多地使用特異性血清蛋白和血清學(xué)測(cè)試進(jìn)行輔助。 通常用作該些測(cè)試祀標(biāo)的生物標(biāo)記物是類風(fēng)濕因子、抗環(huán)化瓜氨酸化膚和C反應(yīng)蛋白。
[0008] 類風(fēng)濕因子（R巧是用于描述一組自身抗體的術(shù)語(yǔ)，所述自身抗體獨(dú)立稱作類風(fēng) 濕因子。RF測(cè)試被認(rèn)為是對(duì)于自身免疫疾病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)的基本篩選和標(biāo)志。RF 被認(rèn)為是早期標(biāo)記，原因在于其存在與具有輕度關(guān)節(jié)炎癥狀的人中出現(xiàn)RA的風(fēng)險(xiǎn)升高相 關(guān)。類風(fēng)濕因子包括立個(gè)亞組，其與免疫球蛋白G(IgG)的可結(jié)晶片段（Fe片段）反應(yīng)W形 成處于關(guān)節(jié)和組織中的沉淀。
[0009] 類風(fēng)濕因子存在于患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者中，但也存在于患有其他自身免疫 病癥的患者中（如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)、干燥綜合征W及偶發(fā)性硬皮病和多肌炎的患者 中）。其也見于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎重疊綜合征中，如RA/SLE重疊和硬皮病/RA重疊。在其他 病癥中W及不存在疾病的情況下（尤其是年齡增長(zhǎng)時(shí)），RF測(cè)試也可能產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果?？蓪?dǎo) 致陽(yáng)性RF測(cè)試結(jié)果的其他病癥包括慢性活動(dòng)性肝炎、結(jié)節(jié)病、慢性感染、多種癌癥和梅毒。
[0010] 針對(duì)瓜氨酸化蛋白的自身抗體（如抗CCP(環(huán)化瓜氨酸化膚）抗體）是針對(duì)類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎的特異性血清標(biāo)記?？稍诩s50-60%的具有早期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者中檢測(cè) 至IJ"基線期"的抗CCP抗體（在他們最初遇到專家時(shí)，通常是癥狀發(fā)生后的3-6個(gè)月）。參 見例如，Nell, V.，等，Art虹itis Res. Ther. 5 (增刊1) : 16 (2003)。對(duì)于不發(fā)展成為RA的 未分化的關(guān)節(jié)炎形式，抗CCP的特異性約為95-98%。IgM RF通常發(fā)現(xiàn)于同一患者中，但其 對(duì)RA的特異性低得多。使用抗CCP試驗(yàn)的一項(xiàng)研究顯示，在關(guān)節(jié)炎的早期階段中，當(dāng)抗CCP 和IgM RF都是陽(yáng)性時(shí)，對(duì)RA具有55 %的敏感性和97 %的特異性。參見例如，Jansen, A. L，等，J.化eumatol. 29:2074-6(2002)。另一項(xiàng)研究顯示，首次就診時(shí)的普遍程度甚至更 高一抗CCP抗體發(fā)現(xiàn)于70%的該類患者中。有趣的是，使用儲(chǔ)存的樣品發(fā)現(xiàn)，可在關(guān)節(jié) 炎開始前1. 5至9年時(shí)檢測(cè)到抗CCP。參見例如，Rantapaa -D址Iqvist, S.,等,Art虹itis 化eum. 48:2741-9 (2003)。使用抗CCP試驗(yàn)的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，跟蹤3年后，抗CCP陽(yáng)性患者 中93%存在從未分化多關(guān)節(jié)炎到RA的進(jìn)展，但在抗CCP陰性患者中僅為25%。參見例如， ￥31163316]1,尸.4.,等，41'1：虹；[1：18 1?63.化61\5(增刊 1):28(2003)。數(shù)項(xiàng)觀察表明，與沒(méi)有 抗CCP的患者相比，早期RA患者中的抗CCP陽(yáng)性結(jié)果可導(dǎo)致發(fā)生更糜爛性的疾病。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可使用來(lái)自人對(duì)象的生物樣品分析針對(duì)抗原組的抗體，所述抗原 組不必然包括類風(fēng)濕因子或CCP或上述兩者，從而確定人對(duì)象是否患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (RA)或者患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的對(duì)象中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的階段或上述全部。然而，在許多 情況下，所述抗原組可包括CCP和選自特定列表的一種、二種、H種、四種或至少五種（例 女口，5、6、7、8、9、10種或全部）其他抗原。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，所述特定列表是：
[0012] (i) BRAFl 506-525 (SEQ ID NO: 1)，
[0013] (U)BRAF2 656-675(SEQ ID N0:2)，
[0014] (iii)瓜氨酸化波形蛋白（蛋白）（SEQ ID NO:3)，
[0015] (iv)環(huán)化波形蛋白415-433cit(SEQ ID N0:4)，或環(huán)化瓜氨酸化變體結(jié)合的RA自 身抗體；
[0016] (V)環(huán)化波形蛋白58-77cit3(SEQ ID N0:5)，或環(huán)化瓜氨酸化變體結(jié)合的RA自身 抗體；
[0017] (￥1)環(huán)化凝聚素231-250。^31111669 10^:6)，或環(huán)化瓜氨酸化變體結(jié)合的^ 自身抗體；
[0018] (Vii)環(huán)化纖維蛋白原A 556-575cit sm(SEQ ID N0:7)，或環(huán)化瓜氨酸化變體結(jié) 合的RA自身抗體；
[0019] (viii)環(huán)化纖維蛋白原A 616-635citsm(SEQIDN0:8)，或環(huán)化瓜氨酸化變體結(jié) 合的RA自身抗體；
[0020] (1義）環(huán)化組蛋白24肥4/3 1-20(3^31112 669 10^:9)，或環(huán)化瓜氨酸化變體結(jié) 合的RA自身抗體；
[002。 （X)環(huán)化絲聚蛋白48-65cit2vl (SEQ ID NO: 10)，或環(huán)化瓜氨酸化變體結(jié)合的RA 自身抗體；
[0022] (Xi)BRAF(來(lái)自V raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物Bl的催化結(jié)構(gòu)域，氨基酸 416-766)(SEQ ID NO:11)。
[0023] 在一些實(shí)施方式中，所述抗原組中的抗原是上述膚，例如使生物樣品接觸環(huán)化瓜 氨酸化膚和至少五種上述膚。
[0024] 或者，在一些實(shí)施方式中，使生物樣品接觸多個(gè)膚，所述膚具有各環(huán)化瓜氨酸化膚 和至少五個(gè)成員的至少一種表位。對(duì)于另一種方法，應(yīng)理解所述抗原組可相對(duì)于特定列表 選擇性地包含額外的氨基酸或更少的氨基酸，前提是所述膚包含上述表位。因此，在一些 實(shí)施方式中，所述抗原還包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸，所述氨基酸對(duì)于所述抗原是異源的，即不 是來(lái)自同一天然產(chǎn)生的蛋白。例如，在一些實(shí)施方式中，可將特定的膚連接至接頭氨基酸 序列或天然條件下不與天然蛋白中抗原相鄰的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述抗原 可包含來(lái)自天然產(chǎn)生的蛋白的一個(gè)或多個(gè)（例如1、2、3、4、5、6、7、8、10或更多個(gè)）其他天 然（非異源）氨基酸（例如，包含BRAFl 500-530的膚包含特定抗原BRAFl 506-525)。在 其他實(shí)施方式中，與上述膚相比，所述抗原可含有較少的氨基酸（少1、2、3、4、5、6、7、8、9或 更多個(gè)），前提是所述膚中保留至少一個(gè)祀標(biāo)特異性抗原。作為一個(gè)實(shí)施例，可使用BRAFl 507-525 代替 BRAFl 日06-525。
[002引多種上文所列抗原（即iii-x)是瓜氨酸化的（"cit"、"cit3"等），即在天然的 精氨酸位置包含一個(gè)或多個(gè)（例如2、3、4、5、6、7、8或更多個(gè)）瓜氨酸。如下文"序列"部 分所示，可使用瓜氨酸取代多個(gè)精氨酸。所述抗原將包含至少一個(gè)瓜氨酸但可包含一個(gè)W 上。
[0026] 此外，多種抗原（iv-x)表示為環(huán)化的。通過(guò)添加位于天然膚序列中的一對(duì)半脫氨 酸的方式使膚環(huán)化。在一些實(shí)施方式中，所述半脫氨酸位于膚的任一末端。該選項(xiàng)如下文 SEQ ID N0:4中所示，其中"C"位于序列的任一末端。或者，一個(gè)或兩個(gè)半脫氨酸可位于膚 的內(nèi)部（非末端）位置。例如，SEQ ID N0:5在內(nèi)部位置處具有全部?jī)蓚€(gè)導(dǎo)入的半脫氨酸。 在一些實(shí)施方式中，所述半脫氨酸可跨越膚序列中的瓜氨酸。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)或兩 個(gè)半脫氨酸可距離瓜氨酸3、4、5或6個(gè)氨基酸。雖然SEQ ID NO:4-10中顯示了具體設(shè)置 半脫氨酸W形成環(huán)化膚，應(yīng)理解對(duì)于各天然膚序列（天然序列是SEQ ID N0:4、5、6、7、8、9 或10中任意的缺少半脫氨酸的序列），可考慮其他的半脫氨酸對(duì)設(shè)置，從而使得相同或基 本相同的抗原/表位中具有不同的環(huán)化選擇。如上文所使用的那樣，該類選擇被認(rèn)為是"環(huán) 化瓜氨酸化變體結(jié)合的RA自身抗體"。
[0027] 使用某些組，可確定經(jīng)測(cè)試CCP (即針對(duì)CCP的抗體）陰性的對(duì)象是否存在類風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎或其階段，因此CCP可從所述抗原組中省略。
[0028] 無(wú)論所述抗原組的組成如何，通過(guò)比較各組成員的結(jié)果與該組成員的截止值并使 用容易獲得的算法評(píng)估所有組成員的全部結(jié)果W定義給定樣品是"陽(yáng)性"或"陰性"，可將所 得結(jié)果與對(duì)象中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的存在、不存在或階段關(guān)聯(lián)。所述截止值可從代表已知患 有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的對(duì)象或者已知沒(méi)有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的對(duì)象或者已知患有類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎且已知類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎階段的對(duì)象的樣品中容易地確定。
[0029] 可將樣品與抗原組的分子賠育并檢測(cè)任意抗原分子是否免疫結(jié)合至來(lái)自樣品的 抗體，從而做出本發(fā)明所述的決定。在該賠育步驟中與樣品賠育的抗原分子是抗原的外 源性分子，即外部供應(yīng)的抗原分子，且不是樣品中存在的那些分子（如果任何該類分子確 實(shí)都存在于樣品中）。該些外源性分子可W是已生成所檢測(cè)抗體的對(duì)象中的那些分子的 相同拷貝，或者它們可W是對(duì)象中抗原分子的部分或片段，或者與具有相同特異性和結(jié)合 親和性的抗體免疫結(jié)合的分子。在某些情況下，可確定該賠育步驟中形成結(jié)合的特定外 源性抗原分子，W及該些抗原分子中多少形成了結(jié)合或結(jié)合的程度。因此，在本發(fā)明的某 些實(shí)施方式中，樣品中存在的抗體經(jīng)鑒定表示為賠育步驟中與其形成結(jié)合的抗原。該類 鑒定的一種方法是利用固定在固體支持物上的抗原分子，對(duì)各抗原使用不同的固體支持 物，即使用在任意單獨(dú)固體支持物上僅固定一種抗原分子，和使用通過(guò)抗原本身W外的方 法進(jìn)行彼此區(qū)分的不同抗原的固體支持物。該可W通過(guò)使用固體支持物相關(guān)的區(qū)分參數(shù) (differentiation parameter)實(shí)現(xiàn)，通過(guò)區(qū)分參數(shù)可區(qū)分具有任意一種抗原的所有支持 物與具有任意其他抗原的所有支持物。
[0030] 可通過(guò)使用經(jīng)標(biāo)記的抗人抗體實(shí)現(xiàn)對(duì)來(lái)自樣品的抗體和與樣品賠育的抗原分子 之間免疫結(jié)合的檢測(cè)。通過(guò)樣品與抗原組中抗原進(jìn)行賠育形成的抗原-抗體復(fù)合物本身可 在第二賠育步驟中與經(jīng)標(biāo)記的抗體賠育。隨后可檢測(cè)并在需要時(shí)定量所述標(biāo)記。隨后可通 過(guò)上述區(qū)分參數(shù)，基于經(jīng)標(biāo)記的抗體結(jié)合的樣品中抗體，實(shí)現(xiàn)標(biāo)記的區(qū)分，即確定檢測(cè)的標(biāo) 記與來(lái)自樣品的何種抗體相關(guān)。因此，將所述檢測(cè)的標(biāo)記與所述區(qū)分參數(shù)關(guān)聯(lián)。在該種情 況下，關(guān)聯(lián)指將標(biāo)記檢測(cè)與所述標(biāo)記（通過(guò)抗人抗體）結(jié)合的來(lái)自樣品的抗體聯(lián)系在一起。
[0031] 如果檢測(cè)到類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的存在或該疾病的特定階段，該方法還可包括開處 方、提出建議或進(jìn)行一種或多種醫(yī)療治療，包括但不限于給予一種或多種藥物，用于治療或 改善疾病。
[0032] 本發(fā)明還涉及一種試劑盒，所述試劑盒用于確定人對(duì)象是否患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 或用于確定人對(duì)象患有的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的階段。所述試劑盒包含至少一種來(lái)自上述列表 的抗原，并在一些實(shí)施方式中包含抗原組，各抗原都固定在固體支持物上。所述抗原組可包 括例如任意上述多種抗原（例如，CCP和一種、二種、H種、四種或至少五種（例如，5、6、7、 8、9、10種或全部）其他抗原），且所述固體支持物還包含選擇的區(qū)分參數(shù)，從而可通過(guò)該些 參數(shù)區(qū)分具有所述抗原組中任意一種抗原的所有支持物與具有所述抗原組中其他抗原的 所有支持物。
[0033] 定義
[0034] 本文所用術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記"或"可檢測(cè)部分"指可通過(guò)光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化 學(xué)、化學(xué)或其它物理手段檢測(cè)的組合物。標(biāo)記的示例是32P、英光染料、高電子密度試劑、酶 (例如，ELISA中常用）、生物素、地高辛W及可被檢測(cè)的半抗原和蛋白或其他實(shí)體（例如通 過(guò)將放射性標(biāo)記物整合至膚中或用于檢測(cè)與膚特異性反應(yīng)的抗體）。所述標(biāo)記可整合至例 如抗體和/或其它蛋白的任何位置?？蒞采用本領(lǐng)域已知的用于使抗體接合所述標(biāo)記物的 任何方法，例如，使用如下文獻(xiàn)中所述的方法；Hermanson, Biocon化gate Techniques (《生 物結(jié)合技術(shù)》）1996,學(xué)術(shù)出版社有限公司（Academic Press, Inc.)，圣迭戈。或者，使用高 親和性相互作用的方法可W獲得相同的效果，其中一對(duì)結(jié)合伴侶化inding partner)中的 一個(gè)能夠結(jié)合另一個(gè)，例如生物素和鏈霉親和素。本文所述本發(fā)明的蛋白可直接標(biāo)記有同 位素、發(fā)色團(tuán)、發(fā)光團(tuán)、色原體，或者被間接標(biāo)記，例如通過(guò)生物素，該生物素隨后可被復(fù)合 體中的鏈霉親和素（包含英光、放射性或可被直接檢測(cè)的其他部分）結(jié)合。因此，生物素化 的抗體被認(rèn)為是本文使用的"經(jīng)標(biāo)記的抗體"。
[0035] 本文所用術(shù)語(yǔ)"抗體"指由一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白基因編碼的多膚，或其特異性結(jié) 合并識(shí)別分析物（抗原）的片段。識(shí)別的免疫球蛋白輕鏈被歸類為K或A。免疫球蛋白重 鏈分為Y、y、a、5或e，它們進(jìn)而分別定義免疫球蛋白類型IgG、IgM、IgA、I曲和I班。
[0036] 免疫球蛋白GQgG抗體）的結(jié)構(gòu)單元的一個(gè)示例是四聚體。各該類四聚體由相同 的兩對(duì)多膚鏈組成，每對(duì)包含一條"輕"鏈（約25kD)和一條"重"鏈（約50-70kD)。每條 鏈的N末端確定約100至110個(gè)或更多個(gè)氨基酸構(gòu)成的可變區(qū)，所述可變區(qū)主要負(fù)責(zé)抗原 識(shí)別。術(shù)語(yǔ)"輕鏈可變區(qū)"（VL)和"重鏈可變區(qū)"（VH)分別指該些輕鏈和重鏈。
[0037] 抗體W完整的免疫球蛋白形式或用不同膚酶對(duì)完整的免疫球蛋白進(jìn)行消化產(chǎn)生 的具有良好表征的片段形式存在。因此，例如，胃蛋白酶在較鏈區(qū)中的二硫鍵連接附近消 化抗體，產(chǎn)生F (油'）2, F油的二聚體，其本身是由二硫鍵連接于Vh-ChI的輕鏈?？稍跍睾?條件下還原F(油'）2二聚體W打斷較鏈區(qū)中的二硫連接，從而將F(油'）2二聚體轉(zhuǎn)化為 兩個(gè)F油'單體。F油'單體實(shí)質(zhì)上是具有部分較鏈區(qū)的F油（參見Paul編，化ndamental Immunology (《基礎(chǔ)免疫學(xué)》），第H版，雷文出版社（Raven Press),紐約，1993)。雖然根據(jù) 對(duì)完整抗體的消化定義了多種抗體片段，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，該類片段也可用化 學(xué)方法或重組DM方法從頭合成。因此，本文中所用術(shù)語(yǔ)"抗體"也包括通過(guò)全抗體修飾或 用重組DNA方法從頭合成所產(chǎn)生的抗體片段，如單鏈Fv。
[0038] 涉及蛋白、膚或抗原時(shí)，描述與抗體結(jié)合的術(shù)語(yǔ)"特異性（或選擇性）"或"特異性 (或選擇性）與……發(fā)生免疫反應(yīng)"或"具有對(duì)……的結(jié)合特異性"指能在蛋白和其它生物 物質(zhì)的異質(zhì)群體存在的情況下確定是否存在蛋白、膚或抗原的結(jié)合反應(yīng)。因此，在給定的 免疫測(cè)定條件下，特定的抗體結(jié)合樣品中的特定蛋白而不W顯著量結(jié)合樣品中存在的其他 蛋白。在該樣的條件下與抗體的特異性結(jié)合可能需要就抗體對(duì)特定蛋白的特異性來(lái)選出 的抗體。例如，可W選擇針對(duì)某一蛋白產(chǎn)生的抗體W得到不與其他蛋白而與該蛋白發(fā)生特 異性免疫反應(yīng)的抗體?？衫酶鞣N免疫測(cè)定形式來(lái)選擇與特定蛋白發(fā)生特異性免疫反應(yīng) 的抗體。例如，常規(guī)使用固相化ISA免疫測(cè)定、Western印跡或免疫組化法來(lái)選擇與某一蛋 白發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的單克隆抗體。參見，Harlow和Lane, Antibodies, A L油oratory Manual(《抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》），冷泉港出版社（Cold Spring化rbor化blications)，紐約 (1988)，來(lái)獲得關(guān)于可用于確定特定免疫反應(yīng)性的免疫測(cè)定形式和條件的描述。通常，特異 性或選擇性反應(yīng)會(huì)是背景信號(hào)或噪音的至少2倍，更通常而言是超過(guò)背景10至100倍。
[0039] 用于本發(fā)明的某些實(shí)施方式的抗體是抗人抗體，尤其是那些標(biāo)記的抗人抗體。該 些抗人抗體中優(yōu)選針對(duì)人IgG的那些抗體、針對(duì)人IgM的那些抗體和針對(duì)人IgA的那些抗 體。
[0040] 術(shù)語(yǔ)"生物樣品"包括從生物體中得到的多種樣品類型。該術(shù)語(yǔ)包括體液諸如血 液、唾液、血清、血漿、尿液和生物來(lái)源的其它液體樣品，固體組織樣品諸如活檢樣品或組織 培養(yǎng)物或來(lái)源于其中的細(xì)胞及其子代。如本文所述，通常所述生物樣品是包含可檢測(cè)量抗 體的體液或組織。該術(shù)語(yǔ)包含獲得后經(jīng)任何方式處理的樣品，如試劑處理、溶解、沉降或?qū)?某些組分的富集。該術(shù)語(yǔ)包括臨床樣品，也包括細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞、細(xì)胞上清液、細(xì)胞裂 解物、血清、血漿、其他生物液體和組織樣品。優(yōu)選的生物樣品是血液樣品、血漿樣品和血清 樣品。
[0041] 本文所用術(shù)語(yǔ)"固體支持物"指可固定試劑（如抗體或抗原）的固體惰性表面或 主體，所述試劑在本文所述任意結(jié)合反應(yīng)中具有反應(yīng)活性。本文所用術(shù)語(yǔ)"固定"指分子基 礎(chǔ)的偶聯(lián)，其在本文所述試驗(yàn)的任意步驟期間、在任意施加的條件下都不會(huì)移開或去偶聯(lián)。 該類固定可通過(guò)共價(jià)鍵、離子鍵、親和型鍵或任意其他化學(xué)鍵實(shí)現(xiàn)。
[0042] 本文所用術(shù)語(yǔ)"顆粒"指固體主體，通常任意形狀或表面結(jié)構(gòu)的線性尺寸為微米級(jí) (即小于100微米）。本文中術(shù)語(yǔ)"珠"指形狀為球形或近球形的顆粒，通常在組合物中多 聚化。
[0043] "多重"試驗(yàn)是在單個(gè)樣品中同時(shí)測(cè)量超過(guò)一種分析物的分析方法。
[0044] 本文所用術(shù)語(yǔ)"內(nèi)源性"指從提取生物樣品的人對(duì)象W外的來(lái)源導(dǎo)入本發(fā)明的試 驗(yàn)培養(yǎng)基中的分子或試劑。內(nèi)源性分子或試劑包括與對(duì)象體內(nèi)存在的分子或試劑相同的那 些W及不同的那些。
[0045] 所選實(shí)施方式詳述
[0046] 在本文所述試驗(yàn)中可使用根據(jù)上文所列標(biāo)準(zhǔn)選自上述列表的多組抗原，而可通過(guò) 比較使用所述抗原組獲得的結(jié)果與使用針對(duì)RA的常規(guī)測(cè)試獲得的那些結(jié)果，并確定該兩 種結(jié)果之間是否存在一致，尤其是本發(fā)明的范圍中所進(jìn)行的試驗(yàn)是否具有優(yōu)越性，從而確 定任意組的有效性。在該種情況下，優(yōu)越性指假陽(yáng)性、假陰性或兩者的數(shù)目下降，因此該試 驗(yàn)提供了較好的特異性。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的多種算法中的任意一種。在多 數(shù)情況下，技術(shù)人員會(huì)希望確定算法中使用的各抗原（"標(biāo)記物"）的截止值，而用于對(duì)單個(gè) 標(biāo)記物指定截止值的方法的一個(gè)示例是研究來(lái)自大量健康成年人對(duì)象的樣品（如50人或 更多，或者可能是50至500人），并鑒定第95百分點(diǎn)處，或可能第98百分點(diǎn)處的該抗原水 平，將其作為截止值。隨后對(duì)來(lái)自測(cè)試對(duì)象（即需要確定其是否患有RA)的樣品進(jìn)行單獨(dú) 標(biāo)記物的分析，并使用算法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。所述算法應(yīng)能確定何種樣品是"陽(yáng)性的"，剩余 樣品則是"陰性的"。根據(jù)該類算法的一個(gè)示例，"陽(yáng)性"樣品指符合W下H個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中任意一 個(gè)的那些樣品：
[0047] 瓜氨酸化波形蛋白標(biāo)記物的值等于或大于截止值的10. 0倍。
[0048] (2)瓜氨酸化波形蛋白W外任意瓜氨酸標(biāo)記物的值等于或大于該標(biāo)記物截止值的 5.0 倍。
[0049] (3) CCP標(biāo)記物或BRAF標(biāo)記物的值等于或大于該標(biāo)記物截止值的2. 0倍。
[0050] (4) CCP標(biāo)記物的值等于或大于CCP截止值的0. 5倍且任意其他標(biāo)記物的值等于或 大于截止值的2. 0倍。
[0051] 可通過(guò)比較一組已知樣品上本發(fā)明的范圍內(nèi)任意標(biāo)記物組的結(jié)果與針對(duì)抗CCP 的基于化ISA試驗(yàn)獲得的結(jié)果（例如在同組樣品上），確定在本發(fā)明范圍內(nèi)使用標(biāo)記物組的 有效性和改善（如需要）。最理想的標(biāo)記物組是假陰性數(shù)目比針對(duì)抗CCP的基于化ISA試 驗(yàn)所獲得的結(jié)果少至少5 %的那些，或者可能少至少10 %，且可能進(jìn)一步少至少10 %。按絕 對(duì)值計(jì)，本發(fā)明的范圍內(nèi)最理想組中的假陰性數(shù)目?jī)?yōu)選為30%或更少，更優(yōu)選為20%或更 少，且最優(yōu)選為10 %或更少。
[0052] 在涉及使用經(jīng)標(biāo)記的抗人抗體檢測(cè)抗原-抗體結(jié)合的本發(fā)明實(shí)施方式中，所 述標(biāo)記可W是直接或間接發(fā)射或生成可檢測(cè)信號(hào)的任何物質(zhì)或組分。在一些實(shí)施方式 中，所述標(biāo)記是英光團(tuán)，其中許多在文獻(xiàn)中報(bào)道并因此為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，并且其 多數(shù)易于從生物技術(shù)工業(yè)的市場(chǎng)供應(yīng)商處購(gòu)得。英光團(tuán)的文獻(xiàn)來(lái)源包括Caixlullo等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8790-8794(1988) ;Dexter,D. L., J. of Qiemical Physics 21:836-850(1953) ;Hochstrasser 等，Biophysical Qiemistry 45:133-141 (1992); Selvin, P. , Methods in Enzymology 246:300-334(1995) ；Steinberg, I. Ann.Rev. Biochem.,40:83-114(1971) ；Stryer,L.Ann.Rev.Biochem.,47:819-846 (1978)； Wang 等，Tetrahedron Letters 31:6493-6496(1990) ; W 及 Wang 等，Anal. Chem. 67:1197-1203(1995)O
[0053] W下是可用作標(biāo)記的英光團(tuán)示例：
[0054] 4-己醜胺基-4'-異硫氯酸根合巧-2, 2'二賴酸 [00巧]嚇巧
[0056] 嚇巧異硫氯酸醋
[0057] 5-(2' -氨基己基）氨基蔡-1-賴酸巧DAN巧
[0058] 4-氨基-N-巧-己帰基賴醜基）苯基]蔡醜亞胺-3, 5二賴酸醋
[0059] N- (4-苯胺基-1-蔡基）馬來(lái)醜亞胺
[0060] 鄰氨基苯甲醜胺（ant虹aniIamide)
[0061] B 孤 IPY
[0062] 亮黃炬riIIiant Yellow)
[0063] 香豆素
[0064] 7-氨基-4-甲基香豆素（AMC，香豆素120)
[0065] 7-氨基-4-H氣甲基香豆素（香豆素151)
[006引花青染料
[0067] 四氯四漠英光素（巧anosine)
[0068] 4,，6-二脈基-2-苯基巧隙（DAPI)
[0069] 5'，5"-二漠連苯H酷-賴駄（漠鄰苯H酷紅）
[0070] 7-二己基氨基-3-(4'-異硫氯酸根合苯基）4-甲基香豆素
[0071] 二亞己基H胺五己酸醋
[0072] 4, 4' -二異硫氯根合二氨-巧-2, 2' -二賴酸
[0073] 4, 4' -二異硫氯酸根合巧-2, 2' -二賴酸
[0074] 5-[二甲基氨基]蔡-1-賴醜氯值NS,丹醜氯）
[00巧]4-(4' -二甲基氨基苯基偶氮）苯甲酸（DABCYL)
[0076] 4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4'-異硫氯酸醋（DABUC)
[0077] 曙紅
[0078] 曙紅異硫氯酸醋
[0079] 赤薛紅B
[0080] 赤薛紅異硫氯酸醋
[0081] 漠己非巧（ethidium)
[00的]5-駿基英光素（FAM)
[008引 5- (4, 6-二氯H嗦-2-基）氨基英光素值TAF)
[0084] 2'，7' -二甲氧基-4' 5' -二氯-6-駿基英光素（JOE)
[00財(cái)英光素
[0086] 英光素異硫氯酸醋
[0087] 英光胺
[0088] IR144
[0089] IR1446
[0090] 孔雀石綠異硫氯酸醋
[00川 4-甲基傘形麗
[009引 鄰甲酷駄
[0093] 硝基酪氨酸
[0094] 副品紅
[0095] 酷紅
[0096] 藻紅蛋白（包括但不限于B型和R型）
[0097] 鄰苯二甲酵
[0098] 巧
[0099] 下酸巧
[0100] 玻巧醜亞胺基I-下酸巧
[0101] 量子點(diǎn)
[0102] 活性紅 4 (Cibacron 亮紅 3B-A)
[0103] 6-駿基-X-若丹明（ROX)
[0104] 6-駿基若丹明做G)
[0105] 麗絲胺若丹明B賴醜氯
[0106] 若丹明B
[0107] 若丹明123
[0108] 若丹明X異硫氯酸醋
[0109] 賴基若丹明B
[0110] 賴基若丹明101
[0111] 賴基若丹明101的賴醜氯衍生物（德州紅）
[0112] N，N，N'，N' -四甲基-6-駿基若丹明（TAMRA)
[011引四甲基若丹明
[0114] 四甲基若丹明異硫氯酸醋（TRITC)
[0115] 核黃素
[0116] 攻紅酸
[0117] 銅系馨合衍生物
[0118] 用于免疫試驗(yàn)的優(yōu)選的一組英光團(tuán)是英光素、英光素異硫氯酸醋、藻紅蛋白、若丹 明B和德州紅（賴基若丹明101的賴醜氯衍生物）。特別優(yōu)選藻紅蛋白。本段前列表中的 任意英光團(tuán)都可使用英光團(tuán)和抗體上的適當(dāng)功能基團(tuán)、通過(guò)常規(guī)的共價(jià)結(jié)合連接至抗人抗 體。對(duì)此類基團(tuán)的識(shí)別W及形成所述連接的反應(yīng)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
[0119] 可用于代替英光團(tuán)的其他標(biāo)記是放射性標(biāo)記和酶標(biāo)記。該些方法為本領(lǐng)域熟知。
[0120] 免疫結(jié)合發(fā)生的確定由本發(fā)明的某些實(shí)施方式中的一個(gè)或多個(gè)步驟組成，且該可 涉及從未結(jié)合的抗原或抗體中分離或回收抗原-抗體復(fù)合物。一種實(shí)現(xiàn)該類分離或回收的 方法是使用固體支持物，尤其是對(duì)第一免疫結(jié)合反應(yīng)中與生物樣品賠育的抗原使用。
[0121] 本發(fā)明中可使用任何類型的固體支持物。所述固體支持物可W是試驗(yàn)容器的壁或 底面、或者插入試驗(yàn)容器中的浸潰條或其他器具、或者置于試驗(yàn)容器內(nèi)部或息浮于試驗(yàn)容 器中的顆粒。在許多實(shí)施方式中顆粒（尤其是珠）特別有用，包括微觀尺寸（即微粒）和 由聚合物材料形成的珠。用作微粒的聚合物是相對(duì)于生物樣品的組分和固定在微粒表面的 結(jié)合成員W外的試驗(yàn)試劑具有化學(xué)惰性的那些。優(yōu)選的微粒材料（尤其當(dāng)試驗(yàn)中使用英光 標(biāo)記時(shí)）是具有最低自英光的那些，在樣品W及試驗(yàn)中使用的任何緩沖液、溶劑、載劑、稀 釋劑或息浮劑中是固體且不溶，此外還可固定試驗(yàn)試劑。合適的聚合物的示例是聚苯己帰、 聚醋、聚離、聚帰姪、聚環(huán)氧焼、聚醜胺、聚氨醋、多糖、纖維素和聚異戊二帰。在許多聚合物 中交聯(lián)用于賦予微粒結(jié)構(gòu)完整性和剛性。微粒的尺寸范圍可W變化。在一些實(shí)施方式中， 微粒的直徑范圍是約0. 3微米至約100微米，在另一些實(shí)施方式中為約0. 5微米至約40微 米，在又一些實(shí)施方式中為約2微米至約10微米。
[0122] 可通過(guò)使用由磁性反應(yīng)材料（即任何對(duì)磁場(chǎng)反應(yīng)的材料）構(gòu)成或包含磁性反應(yīng)材 料的顆粒W方便顆粒的回收和清洗。隨后，在顆粒和樣品賠育的反應(yīng)容器上施加磁場(chǎng)，使得 顆粒粘附于容器壁上并通過(guò)傾謹(jǐn)或吸除除去液體，從而實(shí)現(xiàn)賠育后或清洗步驟后固相與液 相的分離。本發(fā)明中感興趣的磁性反應(yīng)材料包括順磁性材料、鐵磁性材料、亞鐵磁性材料和 變磁性材料。示例包括例如鐵、媒和鉆，W及金屬氧化物，如化3〇4、BaFei2〇i9、CoO、NiO、Mn2〇3、 化2〇3 和 CoMnP。
[0123] 作為試驗(yàn)一部分的施加和移除磁場(chǎng)的方法和儀器是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的且已 在文獻(xiàn)中報(bào)道。文獻(xiàn)報(bào)道的示例是化rrest等，美國(guó)專利號(hào)4, 141，687 (泰克尼康儀器公 司(Technicon Instruments Corporation)，1979 年 2 月 27 日）；Ithakissios,美國(guó)專利 號(hào) 4, 115, 534 (3M 公司（Minnesota Mining and Manufac1:u;ring Company)，1978 年 9 月 19 日）；Vlieger, A. M.,等，Analytical Biochemistry 205:1-7(1992) ;Dudley, Journal of Clinical Immunoassay 14:77-82(1991);封及Smart, Journal of Clinical Immunoassay 15:246-251(1992)。
[0124] 磁性反應(yīng)材料可分散在聚合物中，作為聚合物表面上的涂層或作為表面上的兩種 或多種涂層之一施用，或者W能夠?qū)⒉牧瞎潭ㄓ陬w粒的任意其他方式整合或附連。顆粒中 磁性反應(yīng)材料的含量不是關(guān)鍵，且可在較寬范圍內(nèi)變動(dòng)。然而，含量會(huì)影響微粒的密度，含 量和微粒尺寸都可W影響將微粒保持在息浮狀態(tài)的容易程度，該息浮狀態(tài)能夠使液相和固 相間達(dá)到最大接觸并方便流式細(xì)胞術(shù)的進(jìn)行。微粒中過(guò)量的磁性反應(yīng)材料會(huì)產(chǎn)生足夠高水 平從而干擾試驗(yàn)結(jié)果的自英光。因此，在一些實(shí)施方式中，磁性反應(yīng)材料的濃度足夠低W最 小化材料發(fā)出的任何自英光?；谠撔┛紤]，根據(jù)本發(fā)明，顆粒中的磁性反應(yīng)材料是例如重 量百分比為約0.05%至約75% (相對(duì)于顆粒整體）。在一些實(shí)施方式中，重量百分比范圍 是約1 %至約50 %，例如約2 %至約25 %，例如約2 %至約8 %。
[01巧]使用合適的試驗(yàn)試劑包被顆粒表面可通過(guò)靜電吸引、特異的親和相互作用、疏水 相互作用或共價(jià)鍵連接實(shí)現(xiàn)。可通過(guò)常規(guī)方法使用用于試驗(yàn)試劑共價(jià)連接的功能基團(tuán)對(duì)聚 合物進(jìn)行衍生化，特別是通過(guò)使用含有功能基團(tuán)的單體，如作為唯一單體或共聚單體的單 體。合適的功能基團(tuán)的示例是氨基（一畑2)、饋基（一 MC或一NIC)、輕基（一 OH)、駿酸基 團(tuán)（一COOH)和異氯酸醋基（一NC0)。用于將駿酸基團(tuán)導(dǎo)入聚帰姪的有用的單體是例如丙 帰酸和甲基丙帰酸。
[0126] 連接基團(tuán)可用作增加顆粒表面反應(yīng)基團(tuán)密度的方法，也可用作減少空間位阻的方 法。連接基團(tuán)也可用作將涂層材料固定至顆粒表面的方法。某些連接基團(tuán)是包含一個(gè)反應(yīng) 基團(tuán)的單官能接頭，W及包含兩個(gè)或多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)的多官能交聯(lián)劑，能夠與兩個(gè)或多個(gè)不 同的功能性祀標(biāo)（例如膚、蛋白、大分子、半導(dǎo)體納米晶體或底物）形成鍵。在一些實(shí)施方式 中，所述多官能交聯(lián)劑是包含兩個(gè)不同反應(yīng)基團(tuán)的異雙官能交聯(lián)劑。合適的反應(yīng)基團(tuán)的示 例是硫醇基（-SH)、駿酸醋（-C00R)、駿基（-C00H)、撰基（-C(O)-)、胺（N&)、輕基（-0H)、酵 基（-C冊(cè))、輕基（-0H)、活性氨、醋、磯酸鹽/醋（-P〇3)和光敏部分。胺活性基團(tuán)的示例是異 硫氯酸醋、異氯酸醋、醜基疊氮、N服醋、賴醜氯、酵和己二酵、環(huán)氧化物和環(huán)氧己焼、碳酸鹽 /醋、芳基化劑、亞氨酸醋、碳二亞胺和酸酢。硫醇反應(yīng)基團(tuán)的示例是團(tuán)化己醜和焼基團(tuán)衍生 物、馬來(lái)醜亞胺、氮丙巧、丙帰醜基衍生物、芳基化劑和硫醇-二硫化物交換試劑。駿酸醋反 應(yīng)基團(tuán)的示例是重氮焼和重氮己醜基化合物，如撰基二咪哇和碳二亞胺。輕基反應(yīng)基團(tuán)的 示例是環(huán)氧化物和環(huán)氧己焼、撰基二咪哇、高楓酸鹽氧化、N，N' -二玻巧醜亞胺基碳酸醋或 N-輕基玻巧醜亞胺氯甲酸醋、酶促氧化、焼基團(tuán)素和異氯酸醋。酵和麗反應(yīng)基團(tuán)的示例是用 于席夫堿形成或還原胺化的脫衍生物?；钚园狈磻?yīng)基團(tuán)的示例是用于曼尼希（Mannich)縮 合和楓化反應(yīng)的重氮衍生物。光敏基團(tuán)的示例是芳基疊氮化物和團(tuán)代芳基疊氮化物、二苯 甲麗、重氮化合物和雙嚇丙巧（diazirine)衍生物。
[0127] 本發(fā)明實(shí)踐中有用的其他合適的反應(yīng)基團(tuán)和反應(yīng)類型通常是生物共輛化學(xué)領(lǐng)域 公知的那些。目前優(yōu)選的使用反應(yīng)馨合物的反應(yīng)類型是在相對(duì)溫和條件下進(jìn)行的那些反 應(yīng)。該些包括但不限于親核取代（例如胺和醇與醜基團(tuán)、活性醋反應(yīng)）、親電取代（例如帰 胺反應(yīng)）W及碳-碳和碳-雜原子多鍵的加成反應(yīng)（例如邁克爾反應(yīng)、狄爾斯-阿爾德加成 值iels-Alder addition))。該些和其他有用的反應(yīng)可參見例如March, Advanced Organic Chemistry (《高級(jí)有機(jī)化學(xué)》），第H版，約翰威力和桑斯公司（John Wiley&Sons)，紐約， 1985 ;Hermanson，Biocon化gate Techniques (《生物共輛技術(shù)》），學(xué)術(shù)出版社（Academic Press),圣地亞哥，1996; W及 I^en 巧等，Modification Of Proteins (《蛋白質(zhì)修飾》）； Advances in Qiemistry Series (《化學(xué)進(jìn)展系列》），第198卷，美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)（American Qiemical Society),華盛頓特區(qū)，1982。
[0128] 在一些實(shí)施方式中，所述官能基團(tuán)是包含兩個(gè)不同反應(yīng)基團(tuán)的異雙官能交聯(lián)劑， 所述反應(yīng)基團(tuán)含有能夠與膚和蛋白相互作用的雜環(huán)。例如，異雙官能交聯(lián)劑（如N-[y-馬 來(lái)醜亞胺基了醜氧基]玻巧醜亞胺醋（GMB巧或4-[N-馬來(lái)醜亞胺甲基]環(huán)己焼-1-駿酸 玻巧醜亞胺醋（SMCC))包含能夠與膚或蛋白中的氨基或硫醇基團(tuán)相互作用的胺反應(yīng)基團(tuán) 和硫醇反應(yīng)基團(tuán)。適用于異雙官能交聯(lián)劑的其他反應(yīng)基團(tuán)組合包括，例如，撰基和琉基反應(yīng) 基團(tuán)；胺和光敏基團(tuán)；琉基和光敏基團(tuán)；撰基和光敏基團(tuán)；駿酸醋和光敏基團(tuán)；W及精氨酸 和光敏基團(tuán)。合適的連接基團(tuán)的示例是聚賴氨酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸和聚精氨酸。可使 用N-輕基玻巧醜亞胺（N服）、CMCl-環(huán)己基-3-(2-嗎晰基己基）碳二亞胺（CMC)、N-輕基 苯并H哇（HOBt)和/或其他交聯(lián)劑。
[0129] 來(lái)自多種起始單體的常規(guī)乳化聚合技術(shù)形成的顆粒在許多情況下都適用，因?yàn)槠?具有最低水平的自英光。相反地，經(jīng)修飾增加孔隙從而增加其表面積的顆粒（即在文獻(xiàn)中 稱作"多孔"顆粒的那些）傾向于發(fā)出高水平的自英光，通常是不理想的。自英光隨著尺寸 和二己帰基苯單體含量的增加而增加。
[0130] 可利用上文所述區(qū)分參數(shù)使用固體支持物進(jìn)行多重化，即對(duì)給定組內(nèi)的所有抗體 和所有抗原同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。
[0131] 區(qū)分參數(shù)的一個(gè)示例是顆粒直徑，其中固體支持物是被分入具有非重疊直徑子范 圍的組中的顆粒。在該些實(shí)施方式中，對(duì)直徑子范圍的寬度和相鄰子范圍平均直徑之間間 隔進(jìn)行了選擇，從而能夠通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)區(qū)分子范圍，且該類選擇對(duì)于熟知流式細(xì)胞術(shù)的 使用和儀器的技術(shù)人員而言是顯而易見的。在該說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)"平均直徑"指數(shù)字平均直 徑。在一些實(shí)施方式中，子范圍寬度是平均直徑的約±5% CV或更小，其中"CV"代表"變 異系數(shù)"并定義為顆粒直徑的標(biāo)準(zhǔn)偏差除W平均顆粒直徑再乘W 100%。多個(gè)子范圍中平 均直徑之間的最小間隔可根據(jù)微粒尺寸分布、通過(guò)尺寸區(qū)分微粒用于附連不同試驗(yàn)試劑的 難易程度W及流式細(xì)胞術(shù)設(shè)備的類型和靈敏度而變化。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)不同子范圍 的平均直徑間隔其中一個(gè)子范圍的平均直徑的至少約6%時(shí)，例如其中一個(gè)子范圍的平均 直徑的至少約8%時(shí)，例如其中一個(gè)子范圍的平均直徑的至少約10%時(shí)，會(huì)獲得最佳結(jié)果。 在一些實(shí)施方式中，各子范圍中顆粒直徑的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于相鄰子范圍的平均直徑間隔的H 分之一。
[0132] 可用于區(qū)分不同顆粒組的區(qū)分參數(shù)的另一個(gè)示例是英光。通過(guò)將一種或多種英光 材料整合至顆粒中，英光材料具有不同英光發(fā)射光譜并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行區(qū)分，從而實(shí)現(xiàn)通 過(guò)英光進(jìn)行區(qū)分?？赏ㄟ^(guò)使用具有不同英光強(qiáng)度或W不同波長(zhǎng)發(fā)射英光的英光材料，或通 過(guò)改變整合的英光材料的含量來(lái)實(shí)現(xiàn)區(qū)分。還可通過(guò)使用針對(duì)各顆粒亞組的英光團(tuán)的組合 實(shí)現(xiàn)通過(guò)英光團(tuán)進(jìn)行區(qū)分。例如，可制備顆粒使其含有紅色英光物（如切5) W及遠(yuǎn)紅英光 物（如切5. 5)，對(duì)于不同的亞組采用不同的相對(duì)含量?？墒褂闷渌⒐馕镞M(jìn)一步擴(kuò)展該系 統(tǒng)。因此，各微?？珊胁ㄩL(zhǎng)各異的多種英光染料。
[0133] 通過(guò)使用不同波長(zhǎng)下的英光發(fā)射，波長(zhǎng)的差異可用于顆粒組之間彼此的區(qū)分，還 同時(shí)區(qū)分了經(jīng)標(biāo)記的抗人抗體中的標(biāo)記與區(qū)分各顆粒組的標(biāo)記。可用作區(qū)分顆粒組的方法 的英光底物的一個(gè)示例是英光素，并且可用于試驗(yàn)檢測(cè)的底物的一個(gè)示例是藻紅蛋白。在 該示例的使用中，可使用不同濃度的英光素對(duì)不同顆粒組進(jìn)行染色W區(qū)分彼此，而藻紅蛋 白被用作該試驗(yàn)中使用的多種經(jīng)標(biāo)記結(jié)合成員上的標(biāo)記。
[0134] 可用于區(qū)分多個(gè)顆粒組的區(qū)分參數(shù)的另一個(gè)示例是光散射。側(cè)角光散射根據(jù)顆 粒尺寸、粒度、吸光度和表面粗趟度的變化而變化，而前角光散射主要受尺寸和折射率的影 響。該些特性中任一項(xiàng)的改變都會(huì)導(dǎo)致光散射差異，所述光散射差異可用作區(qū)分多個(gè)組的 方法。
[0135] 區(qū)分參數(shù)的又一個(gè)示例是吸光度。對(duì)顆粒施加光時(shí)，顆粒對(duì)光的吸收主要由側(cè)向 (側(cè)角）散射光的強(qiáng)度變化顯示，而正向散射光的強(qiáng)度相對(duì)不受影響。因此，顆粒相關(guān)的多 個(gè)有色染料之間的吸光度差異是通過(guò)觀察側(cè)向散射光強(qiáng)度的差異確定的。
[0136] 區(qū)分參數(shù)的又一個(gè)示例是各組中的顆粒數(shù)目。當(dāng)各組中的顆粒數(shù)目W已知方式變 化時(shí)，可通過(guò)具有各反應(yīng)的顆粒數(shù)目將具有多個(gè)試驗(yàn)反應(yīng)的顆粒計(jì)數(shù)與特定試驗(yàn)相關(guān)聯(lián)。
[0137] 如上述示例所示，可將廣泛的參數(shù)或特征用作區(qū)分參數(shù)W區(qū)分一組的顆粒和另一 組的顆粒。區(qū)分參數(shù)可來(lái)自顆粒尺寸、來(lái)自顆粒組成、來(lái)自影響光散射的顆粒物理特征、來(lái) 自將不同發(fā)射光譜和/或散射特征賦予顆粒的可激發(fā)英光染料或有色染料，或者來(lái)自不同 濃度的一種或多種英光染料。當(dāng)可區(qū)分的顆粒參數(shù)是英光染料或顏色時(shí)，可將其包被于顆 粒表面上，包埋在顆粒內(nèi)或者連接至顆粒材料的分子。因此，可通過(guò)將聚合物材料與英光 染料混合、或通過(guò)使用染料浸潰顆粒來(lái)制造英光顆粒。已整合有染料并因此適于在本發(fā)明 中使用的顆粒是市售可得的，可購(gòu)自供應(yīng)商，如斯菲羅公司（Spherotech，Inc.，利伯蒂維 爾，伊利諾伊州，美國(guó)）和分子探針有限公司（Molecular Probes, Inc.，尤金，俄勒岡州，美 國(guó)）。
[0138] 使用顆粒（尤其是微粒）時(shí)，使用流式細(xì)胞術(shù)是一種通過(guò)區(qū)分參數(shù)分選顆粒的簡(jiǎn) 便方法，并在多種情況下確定標(biāo)記是否已通過(guò)試驗(yàn)組分連接至顆粒，作為試驗(yàn)反應(yīng)的結(jié)果。
[0139] 流式細(xì)胞術(shù)的方法和儀器是本領(lǐng)域已知的，且可用于本發(fā)明的實(shí)踐中。通常，流 式細(xì)胞術(shù)涉及顆粒（或細(xì)胞）W流動(dòng)的方式通過(guò)光束并偶聯(lián)至電光傳感器，通過(guò)方式為一 次僅有一個(gè)顆粒能夠通過(guò)傳感器的區(qū)域。當(dāng)各顆粒通過(guò)該區(qū)域時(shí)，由于顆粒的存在，光束 被擾亂，檢測(cè)到產(chǎn)生的散射光和英光。儀器使用光信號(hào)鑒定各顆粒屬于哪個(gè)亞組，連同標(biāo) 記的存在和量，從而可實(shí)現(xiàn)單獨(dú)的試驗(yàn)結(jié)果。用于流式細(xì)胞術(shù)的儀器和方法的描述可在文 獻(xiàn)中找至Ij。不例是 McHugh,"Flow Microsphere Immunoassay for the Quantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes (用于多個(gè)可溶性分析物的定 量和同時(shí)檢測(cè)的流式微球免疫試驗(yàn)）"，Methods in Cell Biology 42(《細(xì)胞生物學(xué)方法 42》），B 部分，（學(xué)術(shù)出版社（Academic Press)，1994) ;M地U曲等，"Micros地ere-Based Fluorescence Immunoassays Using Flow Cytometry Instrumentation(使用流式細(xì)胞 術(shù)儀器的基于微球的英光免疫試驗(yàn)）"，Clinical Flow切tometry(《臨床流式細(xì)胞術(shù)》）， Bauer，K.D.，等編（己爾的摩，馬里蘭州，美國(guó)：威廉姆斯和威廉姆斯公司（Williams and Williams)，1993)， 第 535-544 頁(yè)；Lindmo 等，''Immunometric Assay Using Mixtures of Two Particle Types of Different Affinity (使用不同親和性的兩種顆?；旌衔?的免疫試驗(yàn)）"，J. Immunol. Meth. 126:183-189 (1990) ;M地u曲，"Flow 切tometry and the Application of Microsphere-Based Fluorescence Immunoassays (流式細(xì)胞術(shù) 和基于微球的英光免疫試驗(yàn)的應(yīng)用）"，Immunochemica 5:116(1991) ;Horan等,"Fluid Phase Particle Fluorescence Analysis:Rheumatoid Factor Speci円city Evaluated by Laser Flow切tophotometry(流相顆粒英光分析：激光流式光度術(shù)評(píng)估的類風(fēng)濕 因子特異性）"，Immunoassays in the Clinical L油oratory(《臨床實(shí)驗(yàn)室中的免 疫試驗(yàn)》），185-189(利斯公司（Liss) 1979) ;Wilson 等，"A New Microsphere-Based Immunofluorescence Assay Using Flow 切tometry( -種新的使用流式細(xì)胞術(shù)的基 于微球的免疫英光試驗(yàn)）"，J. Immunol. Meth. 107:225-230(1988) ;Rilw}der 等，"Flow Microsphere Immunoassay for the Quantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes (用于多種可溶性分析物的定量和同時(shí)檢測(cè)的流式微球免疫 試驗(yàn)），，，Meth. Cell Biol.33:613-629(1990);庫(kù)爾特電子公司（Coulter Electronics Inc.)，英國(guó)專利號(hào) I, 561, 042 (1980 年2月 13 日公開）；W 及 Steinkamp 等，Review of Scientific Instruments 44 (9) :1301-1310 (1973)。
[0140] 本發(fā)明的方法W及含有用于實(shí)踐該方法的材料的本發(fā)明的試劑盒能夠同時(shí)檢測(cè) 并可選地定量生物樣品中的多個(gè)抗體。該些抗體或該些抗體的亞組的存在是相關(guān)的，可W 作為提取樣品的對(duì)象中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎W及其他自身免疫疾病存在、不存在或其階段的指 示。在一些實(shí)施方式中，對(duì)樣品中多種抗體的一部分或全部的檢測(cè)和/或定量被用于提供 預(yù)后或評(píng)估藥物（例如抗關(guān)節(jié)炎藥物）治療的有效性。診斷、預(yù)后或評(píng)估藥物有效性可通 過(guò)例如將樣品中某些抗體的量與健康個(gè)體、患病個(gè)體或上述兩者相關(guān)的已知量相關(guān)聯(lián)來(lái)實(shí) 現(xiàn)。
[0141] 實(shí)施例1
[0142] 該實(shí)施例顯示了本發(fā)明的一項(xiàng)在一組389份樣品上進(jìn)行的試驗(yàn)，所述樣品來(lái)自在 該研究前6個(gè)月內(nèi)已經(jīng)首次診斷為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)的成年人對(duì)象，W確定試驗(yàn)的靈敏 度。通過(guò)在正常的一組168份樣品（即來(lái)自未出現(xiàn)RA癥狀的個(gè)體的樣品）中進(jìn)行相同試 驗(yàn)的方式設(shè)立截止值。使用標(biāo)準(zhǔn)的LUMINEX⑥珠-珠試驗(yàn)技術(shù)（路明克斯公司（Luminex Co巧oration),奧斯汀，德克薩斯州，美國(guó)）進(jìn)行研究，涉及將血清樣品與連接有抗原的珠 賠育，對(duì)各組血清自身抗體有特異性的抗體與各組標(biāo)記賠育，隨后將珠與藻紅蛋白標(biāo)記的 抗人IgG賠育W檢測(cè)結(jié)合的抗體。使用了 9種標(biāo)記物；CCP、瓜氨酸化波形蛋白（重組）、 環(huán)化波形蛋白58-77cit3、環(huán)化波形蛋白415-433cit、環(huán)化波形蛋白58-77cit3sml、BRAFl 506-525、BRAF2 656-675、環(huán)化組蛋白 2A/a l-20cit 小-2 W及環(huán)化血纖蛋白原M616-635) Ci口小。所有數(shù)據(jù)均W相對(duì)英光單位（RFI)的形式報(bào)道。3個(gè)"正常"樣品顯示了 RA的存 在并從截止值確定中排除。使用來(lái)自剩余的165份正常樣品的結(jié)果，選擇各標(biāo)記物的98百 分位作為該標(biāo)記的截止值。
[0143] 通過(guò)W下算法完成數(shù)據(jù)的分選：
[0144] 對(duì)于瓜氨酸化波形蛋白標(biāo)記物，如果任意測(cè)試樣品的值等于或大于截止值的10. 0 倍，則結(jié)果為"陽(yáng)性"。
[0145] 所有測(cè)試樣品（即來(lái)自389份樣品組）中，對(duì)于瓜氨酸化波形蛋白W外的瓜氨酸 標(biāo)記物，等于或大于該標(biāo)記截止值5. 0倍的結(jié)果為"陽(yáng)性"。
[0146] 在所有測(cè)試樣品中，CCP或BRAF標(biāo)記物值等于或大于該標(biāo)記截止值2. 0倍的結(jié)果 為"陽(yáng)性"。
[0147] 在所有測(cè)試樣品中，CCP值等于或大于CCP截止值的0. 5倍且任意其他標(biāo)記物的 值等于或大于截止值的2. 0倍為"陽(yáng)性"。
[0148] 根據(jù)該算法，389份測(cè)試樣品中的254份為"陽(yáng)性"，表明該試驗(yàn)的靈敏度為 65. 3%。為進(jìn)行比較，使用伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)室公司炬io-Rad L油oratories, Inc.，赫爾克里斯，力口 利福尼亞州，美國(guó)）的BI0PLEX?200系統(tǒng)對(duì)相同的389份測(cè)試樣品進(jìn)行了抗CCP的測(cè)試。 BI0PLEX?200測(cè)試僅測(cè)得226份陽(yáng)性樣品巧8. 1% )。
[0149] 實(shí)施例2
[0150] 該實(shí)施例顯示了本發(fā)明的一項(xiàng)試驗(yàn)，該試驗(yàn)在來(lái)自323名成年人對(duì)象的血清樣 品上進(jìn)行，各對(duì)象都接受了 RA的臨床診斷，并使用根據(jù)106名正常患者（未顯示RA癥 狀）的樣品所確立的截止值分析試驗(yàn)結(jié)果。使用與實(shí)施例1相同的LUMINEX⑥珠-珠 試驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行所有確定。使用了 9種標(biāo)記；CCP、瓜氨酸化波形蛋白（重組）、環(huán)化波形蛋 白 58-77cit3、環(huán)化波形蛋白 415-433cit、環(huán)化波形蛋白 58-77ci口sml、BRAFl 506-525、 BRAF2 656-675、環(huán)化組蛋白2A/a l-20cit小-2 W及環(huán)化血纖蛋白原A(616-635)ci口小。 使用與實(shí)施例1相同的算法分析結(jié)果。根據(jù)商品化化ISA試劑盒值IASTAT?，軸盾診斷公司 (Axis-化ield Dia即OStics pic)，敦提，蘇格蘭）對(duì)來(lái)自診斷患有RA對(duì)象的323份測(cè)試樣 品單獨(dú)測(cè)試了抗CCP。323份測(cè)試樣品的DIASTAT ELISA測(cè)試顯示241份為陽(yáng)性且82份為 陰性。經(jīng)DIASTAT ELISA測(cè)試顯示為陽(yáng)性的所有241份測(cè)試樣品在本發(fā)明的測(cè)試中也為陽(yáng) 性。經(jīng)DIASTAT ELISA測(cè)試顯示為陰性的82份測(cè)試樣品中，12份（或15% )在本發(fā)明的 測(cè)試中為陽(yáng)性，因此DIASTAT ELISA測(cè)試的靈敏度為78. 3%對(duì)比74. 6%。
[0151] 為總結(jié)實(shí)施例1和2,兩項(xiàng)實(shí)施例中本發(fā)明的測(cè)試方法都產(chǎn)生較少的假陰性一 在實(shí)施例中少12%而在實(shí)施例2中少15%。在兩者情況下，使用本發(fā)明的測(cè)試方法所獲得 的假陽(yáng)性數(shù)目都少于2%。
[0152] 在所附的權(quán)利要求書中，術(shù)語(yǔ)"一個(gè)"或"一種"是用來(lái)表示"一個(gè)（種）或多個(gè) (種）"。在述及步驟或要素時(shí)，其前導(dǎo)術(shù)語(yǔ)"包含"及其變化形式例如"包括"和"含有"旨 在表示其它步驟或要素的增加是可任選且不被排除的。本說(shuō)明書中引用的所有專利、專利 申請(qǐng)和其它公開的參考材料都通過(guò)引用全文納入本文中。當(dāng)本說(shuō)明書的內(nèi)容與本發(fā)明引用 的任何參考材料或任何現(xiàn)有技術(shù)之間存在矛盾之處的時(shí)候，W本說(shuō)明書為準(zhǔn)。所述矛盾之 處包括現(xiàn)有技術(shù)對(duì)詞或詞組的定義與本說(shuō)明書對(duì)相同的詞或詞組明確給出的定義之間的 差異。
[0153] 序列
[0154] (i)BRAFl 506-525(SEQ ID NO:I)
[0 巧引 服 TRHVNILLFMGYSTKP 化
[015引 （U)BRAF2 656-675(SEQ ID N0:2)
[0157] YSNINNRDQIIFMVGRGYLS
[015引 （iii)瓜氨酸化波形蛋白（蛋白）（SEQ ID NO:3)
[0159] MSTRSVSSSSYRRMFGGPGTASRPSSSRSYVTTSTRTYSLGSALRPSTSR化YASSPGGVYATRSSAV 化 RSSVPGVR化孤 SVDFSLADAINT 邸KNTRTOEKVELQ化NDRFANYIDKVR 化EQQNKILLA化EQLKGQGKS 化 GDLY 邸 EMRELRRQVD 化 TNDKARVEVE 畑 NLA 抓 IM 化 REKL 犯 Emlqreeaewlqsfr 孤 VDNASLA 化 D LE 服 VE 化犯 EIA化邸 L皿邸 IQ化 QAQI 犯地 VQIDVDVSKPDLTAAL 畑 VRQQYESVAAKNL犯 A邸 WYKSK FADLSEAANRNNDALRQAKQESTEYRRQVQ 化 TCEVDALKGT 肥化 ERQMREMEENFAVEAANYQDTIGRL 孤 EI QNMK 邸 MA 畑 LREY 孤化 NVKMALDIEIATY 服化 EG 邸 SRISLPLPNFSSLNLRETNLD 化 PLVDTHSKR 化 LI KTVET 畑 GQVI 肥 TSQHH 孤 LE
[0160] (iv)環(huán)化波形蛋白 415-433cit(SEQ ID N0:4)
[016" GLPNFSSLNLKIUETNLDSLPLG
[0162] 由于第一和最后一個(gè)半脫氨酸（C)之間的二硫鍵，該膚是環(huán)化的；
[0163] [CIIl =瓜氨酸
[0164] (V)環(huán)化波形蛋白 58-77cit3(SEQ ID N0:5)
[01 巧]GG￡VYAT「R/CITlSSACV「R/CITlL「R/CITlSSVPGV
[0166] 由于粗體和帶下劃線的半脫氨酸（C)之間的二硫鍵，該膚是環(huán)化的；[R/CIT]=精 氨酸或瓜氨酸，但該膚包含至少一個(gè)CIT ;粗體和帶下劃線的選項(xiàng)是實(shí)施例中測(cè)試的那些。
[0167] (Vi)環(huán)化凝聚素 231-250cit sml(SEQ ID N0:6)
[0168] CHFS[R/CITl ASS￡IDELF孤「R/CITlFFT「R/CITl
[0169] 由于粗體和帶下劃線的半脫氨酸（C)之間的二硫鍵，該膚是環(huán)化的；[R/CIT]=精 氨酸或瓜氨酸，但該膚包含至少一個(gè)CIT ;粗體和帶下劃線的選項(xiàng)是實(shí)施例中測(cè)試的那些。
[0170] (Vii)環(huán)化血纖蛋白原 A 556-575cit sm(SEQ ID N0:7)
[0171] NT 邸 SSSHHPGGAEFPSKIUGKG
[0172] 由于粗體和帶下劃線的半脫氨酸（C)之間的二硫鍵，該膚是環(huán)化的；[CIT]=瓜氨 酸
[017引（ViU)環(huán)化血纖蛋白原 A 616-635cit sm(SEQ ID N0:8)
[0174] T服TK[R/CITl CHAKS「R/CITl PV「R/CITl GIHTSC
[01巧]由于粗體和帶下劃線的半脫氨酸（C)之間的二硫鍵，該膚是環(huán)化的；[R/CIT]=精 氨酸或瓜氨酸，但該膚包含至少一個(gè)CIT ;粗體和帶下劃線的選項(xiàng)是實(shí)施例中測(cè)試的那些。
[0176] (ix)環(huán)化組蛋白 2A 肥A/a l-20cit sm2(SEQ ID N0:9)
[0177] MSG[R/CITlGKQGCKA「R/CITlAKAKT「R/CITlSSC
[0178] 由于粗體和帶下劃線的半脫氨酸（C)之間的二硫鍵，該膚是環(huán)化的；[R/CIT]=精 氨酸或瓜氨酸，但該膚包含至少一個(gè)CIT ;粗體和帶下劃線的選項(xiàng)是實(shí)施例中測(cè)試的那些。
[0179] (Xii)環(huán)化絲聚蛋白 48-65cit2vl(SEQ ID N0:10)
[0180] CTIHAHPGS「R/CITl「R/CITl GG 旺/Clll HGYHHG
[0181] 由于粗體和帶下劃線的半脫氨酸（C)之間的二硫鍵，該膚是環(huán)化的；[R/CIT]=精 氨酸或瓜氨酸，但該膚包含至少一個(gè)CIT ;粗體和帶下劃線的選項(xiàng)是實(shí)施例中測(cè)試的那些。
[0182] (Xiii)BRAF(來(lái)自V raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物Bl的催化結(jié)構(gòu)域，氨基酸 416-766)(SEQ ID NO:11)
[0183] LQKSPGPQRE服SSSS沈DRNRMKTLGR畑SSDDWEIPDGQITVGQRIGSGSFGTVYKGKWHGDVAVKM LNVTAPTPQQLQAFKNEVG 化服 TRHV …LLFMGYSTKPQLAIVTQWCEGS 化 YHHUniETKFEMIKLIDIARQTA QGMDYLHAKSIIH畑 LKS 順 I 化肥 DLTVKIGDFGLATVKSRWSGS 冊(cè)陽(yáng)化 SGSI LWMAPEV IRMQDKNPYSFQSD VYAFGIVLYELMTGQLPYSNINNRDQIIFMVGRGYLSPDLSKVRSNCPKAMKRLMAECLKKK畑ERPLFPQILASIE LLARSLPKIHRSA沈PSLNRAGFQT邸FSLYACASPKTPIQAGGYGAFPVH
【權(quán)利要求】
1. 一種確定人對(duì)象是否患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或所患類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎所屬階段的方法， 所述方法包括： (a) 檢測(cè)來(lái)自所述對(duì)象的生物樣品中結(jié)合一組抗原中抗原的抗體的水平，所述抗原組 包括環(huán)化瓜氨酸化肽和至少五個(gè)選自下組的成員： (i) BRAF1506-525, (ii) BRAF2656-675, (iii) 瓜氨酸化波形蛋白（蛋白）， (iv) 環(huán)化波形蛋白415-433cit,以及 (V)環(huán)化波形蛋白58-77cit3， (vi) 環(huán)化凝聚素 231_250cit sml， (vii) 環(huán)化血纖蛋白原A 556_575cit sm， (viii) 環(huán)化血纖蛋白原A 616_635cit sm， (ix) 環(huán)化組蛋白 2A H2A/a l-20cit sm2 (X)環(huán)化絲聚蛋白48_65cit2vl，以及 (xi)BRAF(來(lái)自v raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物BI的催化結(jié)構(gòu)域，氨基酸416-766) 以及 (b) 將檢測(cè)得到的所述水平與所述對(duì)象中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的存在、不存在或階段相關(guān) 聯(lián)。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法包括使所述生物樣品接觸所述抗原組。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法包括使所述生物樣品接觸多個(gè)肽，所述肽具有 環(huán)化瓜氨酸化肽和至少五個(gè)成員各自的至少一種表位。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟（a)包括： (1) 將所述樣品與多個(gè)其上固定有所述抗原分子的固體支持物孵育，各所述固體支持 物上僅固定有所述抗原組的一種所述抗原分子并且所述固體支持物具有選定的區(qū)分參數(shù)， 使得具有所述抗原組中任一抗原的支持物都能夠與具有所述抗原組中其他抗原的支持物 區(qū)分開來(lái)，并在特定條件下進(jìn)行所述孵育，所述條件促進(jìn)所述樣品中可能存在的所述抗體 與固定在所述固體支持物上的所述抗原之間免疫結(jié)合； (2) 從所述樣品中回收所述固體支持物； (3) 將回收得到的所述固體支持物與經(jīng)標(biāo)記的抗人抗體的溶液在特定條件下孵育，所 述條件促進(jìn)所述固體支持物上可能存在的所述抗體與所述經(jīng)標(biāo)記的抗人抗體結(jié)合； (4) 從所述經(jīng)標(biāo)記的抗人抗體的溶液中回收所述固體支持物；以及 (5) 檢測(cè)從所述經(jīng)標(biāo)記的抗人抗體的溶液中回收得到的所述固體支持物上連接的標(biāo) 記，并將檢測(cè)到的所述標(biāo)記與所述區(qū)分參數(shù)相關(guān)聯(lián)以獲得分別代表所述樣品中各所述抗體 水平的值。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，所述固體支持物是珠，步驟（1)包括將所述樣品與所述珠 的混合物在包含所述珠和所述樣品的第一懸浮液中孵育，步驟（2)包括從所述第一懸浮液 中回收所述珠，步驟（3)包括將所述珠在包含所述珠和所述經(jīng)標(biāo)記的抗人抗體的溶液的第 二懸浮液中孵育，且步驟（4)包括從所述第二懸浮液中回收所述珠。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，所述區(qū)分參數(shù)可通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)區(qū)分，且步驟（5)包括通 過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)所述標(biāo)記并分選所述珠。
7. 如權(quán)利要求4所述的方法，所述經(jīng)標(biāo)記的抗人抗體是經(jīng)標(biāo)記的抗人IgG。
8. 如權(quán)利要求4所述的方法，所述經(jīng)標(biāo)記的抗人抗體是經(jīng)標(biāo)記的抗人IgM。
9. 如權(quán)利要求4所述的方法，所述經(jīng)標(biāo)記的抗人抗體是經(jīng)標(biāo)記的抗人IgA。
10. 如權(quán)利要求5所述的方法，所述珠具有磁力反應(yīng)性，且步驟（2)和（4)包括將所述 第一和第二懸浮液分別暴露于磁場(chǎng)中以從所述懸浮液中吸引所述珠。
11. 如權(quán)利要求4所述的方法，所述經(jīng)標(biāo)記的抗人抗體是使用熒光標(biāo)記標(biāo)記的抗人抗 體。
12. 如權(quán)利要求11所述的方法，所述熒光標(biāo)記選自：熒光素、熒光素異硫氰酸酯、藻紅 蛋白、若丹明B和磺基若丹明101的磺酰氯衍生物。
13. 如權(quán)利要求11所述的方法，所述熒光標(biāo)記是藻紅蛋白。
14. 如權(quán)利要求5所述的方法，所述區(qū)分參數(shù)是珠直徑。
15. 如權(quán)利要求5所述的方法，所述區(qū)分參數(shù)是熒光光譜的差異。
16. 如權(quán)利要求5所述的方法，所述區(qū)分參數(shù)是光散射的差異。
17. 如權(quán)利要求5所述的方法，所述區(qū)分參數(shù)是吸光度的差異。
18. 如權(quán)利要求1所述的方法，所述生物樣品選自：血液樣品、血漿樣品和血清樣品。
19. 如權(quán)利要求1所述的方法，所述對(duì)象的環(huán)化瓜氨酸化肽測(cè)試呈陰性。
20. -種用于確定人對(duì)象是否患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或者所患類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎所屬階段 的試劑盒，所述試劑盒包括一組抗原，各抗原固定在固體支持物上，所述抗原組包括環(huán)化瓜 氨酸化肽和至少一個(gè)選自下組的成員： (i) BRAFl 506-525, (ii) BRAF2 656-675， (iii) 瓜氨酸化波形蛋白（蛋白）， (iv) 環(huán)化波形蛋白415-433cit,以及 (V)環(huán)化波形蛋白58-77cit3， (vi) 環(huán)化凝聚素 231_250cit sml， (vii) 環(huán)化血纖蛋白原A 556_575cit sm， (viii) 環(huán)化血纖蛋白原A 616_635cit sm， (ix) 環(huán)化組蛋白 2A H2A/a l-20cit sm2， (X)環(huán)化絲聚蛋白48_65cit2vl，以及 (xi) BRAF (來(lái)自v raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物BI的催化結(jié)構(gòu)域，氨基酸416-766)， 所述固體支持物還具有選定的區(qū)分參數(shù)，從而能夠?qū)⒕哂兴隹乖M中任一抗原的所 述支持物區(qū)分于具有所述抗原組中其他抗原的所述支持物。
21. 如權(quán)利要求20所述的試劑盒，所述抗原組包括至少五個(gè)選自所述組中的成員。
22. 如權(quán)利要求20所述的試劑盒，進(jìn)一步包括經(jīng)標(biāo)記的抗人抗體。
23. 如權(quán)利要求20所述的試劑盒，所述固體支持物是珠。
24. 如權(quán)利要求20所述的試劑盒，所述區(qū)分參數(shù)可通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)區(qū)分。
25. 如權(quán)利要求23所述的試劑盒，所述珠具有磁力反應(yīng)性。
26. 如權(quán)利要求22所述的試劑盒，所述經(jīng)標(biāo)記的抗人抗體是經(jīng)標(biāo)記的抗人IgG。
27. 如權(quán)利要求22所述的試劑盒，所述經(jīng)標(biāo)記的抗人抗體是經(jīng)標(biāo)記的抗人IgM。
28. 如權(quán)利要求22所述的試劑盒，所述經(jīng)標(biāo)記的抗人抗體是經(jīng)標(biāo)記的抗人IgA。
29. 如權(quán)利要求22所述的試劑盒，所述經(jīng)標(biāo)記的抗人抗體是使用熒光標(biāo)記標(biāo)記的抗人 抗體。
30. 如權(quán)利要求29所述的試劑盒，所述熒光標(biāo)記選自：熒光素、熒光素異硫氰酸酯、藻 紅蛋白、若丹明B和磺基若丹明101的磺酰氯衍生物。
31. 如權(quán)利要求29所述的試劑盒，所述熒光標(biāo)記是藻紅蛋白。
32. 如權(quán)利要求20所述的試劑盒，所述區(qū)分參數(shù)是珠直徑。
33. 如權(quán)利要求20所述的試劑盒，所述區(qū)分參數(shù)是熒光光譜的差別。
34. 如權(quán)利要求20所述的試劑盒，所述區(qū)分參數(shù)是光散射的差別。
35. 如權(quán)利要求20所述的試劑盒，所述區(qū)分參數(shù)是吸光度的差別。
【文檔編號(hào)】G01N33/53GK104321650SQ201380020421
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2013年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月16日
【發(fā)明者】S·R·賓德, R·P·沃克, M·L·德蘭諾伊 申請(qǐng)人:生物輻射實(shí)驗(yàn)室股份有限公司