一種用于篩選具有促血管新生活性的藥物的細(xì)胞模型及其用途和使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種用于篩選具有促血管新生活性的藥物的細(xì)胞模型，屬于醫(yī)藥生物
技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 血管可為機(jī)體提供氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子、荷爾蒙及蛋白水解酶等，對于機(jī)體 組織起著至關(guān)重要的作用。血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)家族是一類能與肝素結(jié)合的二聚體糖蛋白分子，并能特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞， 是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異的有絲分裂素，具有增加微靜脈、小靜脈通透性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分 裂、增殖W及誘導(dǎo)血管形成等作用。此外，腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散及生長過程中往往設(shè)及血管的新 生和VEGF的高表達(dá)，目前已有針對VEGF及其受體的抗腫瘤藥物。
[0003] 隨著生命科學(xué)的快速發(fā)展，基于檢測報告基因的藥物篩選方法近年來取得了較大 的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用，其設(shè)及完整細(xì)胞，在活細(xì)胞自然條件下研究藥物對生命體功能的影 響，更接近體內(nèi)的生化過程，可W較為準(zhǔn)確地了解藥物的生物學(xué)特性。
[0004] 現(xiàn)有的體外篩選模型多是W祀基因調(diào)控序列中的特定轉(zhuǎn)錄因子或受體的結(jié)合位 點為祀點，其祀點單一，篩選得到的只是單單針對某一結(jié)合位點的有效物質(zhì)，而基因啟動子 序列中往往含有多個、多種不同調(diào)控因子的結(jié)合位點。動子為篩選序列(祀點），可望獲得影 響該基因表達(dá)的一大類物質(zhì)，在具備特異性篩選的同時，又涵蓋了更廣的篩選范圍，對于藥 物的分類篩選及隨后的分子藥理學(xué)研究提供更為方便的線索。
[000引若一種物質(zhì)能使VEGF的表達(dá)上調(diào)(增加），則表明此物質(zhì)很可能是一種很好的具有 促血管新生活性的藥物;若一種物質(zhì)能使VEGF的表達(dá)下調(diào)(減少），則表明此物質(zhì)很可能是 一種具有抑制腫瘤的活性的藥物。
[0006] 盧瓊報道了基于VEGF啟動子構(gòu)建的藥物篩選模型，但并沒有公開所用的基因片段 的堿基序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員無從知曉此篩選模型的具體結(jié)構(gòu)和構(gòu)建方法(盧瓊，腦缺血藥 物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建及應(yīng)用研究，西南交通大學(xué)學(xué)位論文，2014年）。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了構(gòu)建一種用于篩選具有促血管新生活性的藥物的細(xì)胞模型，本發(fā)明提供了一 種基因構(gòu)建物。
[000引本發(fā)明提供的基因構(gòu)建物從5'端到3'端依次含有:VEGF啟動子基因-110化P~+ 113bp序列和報告基因序列。
[0009] W大鼠為例，VEGF基因 -1106bp~+113bp序列詳見沈Q N0.1: 進(jìn)一步地，上述報告基因選自：巧光蛋白基因和/或巧光素酶基因。
[0010] 優(yōu)選地，上述巧光蛋白基因為綠色巧光蛋白（GFP)基因或紅色巧光蛋白（RFP)基 因；上述巧光素酶基因為蛋火蟲巧光素酶基因。
[0011] 紅色巧光蛋白中E2-化imson較為常用。
[0012] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種重組載體，此載體含有上述的基因構(gòu)建物。
[001引本發(fā)明中的載體指在基因工程重組DNA技術(shù)中將DNA片段（目的基因）轉(zhuǎn)移至受體 細(xì)胞的一種能自我復(fù)制的DNA分子，常用的有質(zhì)粒、隧菌體和動植物病毒。
[0014] 本發(fā)明進(jìn)一步構(gòu)建了一種穩(wěn)定的細(xì)胞，此細(xì)胞含有上述的重組載體或其基因組中 整合上述的基因構(gòu)建物。
[0015] 進(jìn)一步地，此細(xì)胞選自HEK293細(xì)胞、化la細(xì)胞、C冊細(xì)胞或干細(xì)胞中的任一種。
[0016] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了構(gòu)建上述重組載體的方法，它包括如下步驟： (1) 合成VEGF啟動子基因-1106bp~+113bp序列； (2) 將步驟(1)合成的序列與帶有報告基因的報告載體分別進(jìn)行酶切，連接報告載體與 啟動子片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，抗性篩選，挑選陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即得重組載體。
[0017] 進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述報告載體為帶有報告基因的pSC基礎(chǔ)質(zhì)粒。
[0018] 此處所述的報告基因同上述，即選自巧光蛋白基因和/或巧光素酶基因。
[0019] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了構(gòu)建上述的穩(wěn)定的細(xì)胞的方法，即將上述的重組載體轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞、Hela細(xì)胞、CH0細(xì)胞或干細(xì)胞中的任一種。
[0020] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述的穩(wěn)定的細(xì)胞的用途，其用于篩選可提高VEGF表達(dá)水平 的藥物。
[0021] 本發(fā)明還提供了一種篩選可調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)水平或具有促血管新生活性的藥物的 方法，其包括如下步驟： (1) 將候選藥物給予上述的穩(wěn)定的細(xì)胞； (2) 檢測所述細(xì)胞中報告基因的表達(dá)情況； (3) 判斷結(jié)果，若所述候選藥物能提高報告基因的表達(dá)，則表明該候選藥物可提高VEGF 表達(dá)水平或具有促血管新生活性。
[002引進(jìn)一步地， 步驟(1)包括將候選藥物加入上述的穩(wěn)定的細(xì)胞培養(yǎng)體系中共培養(yǎng)； 步驟(2)包括檢測實驗組的報告基因的表達(dá)，并與空白對照組比較，所述空白對照組是 不添加所述候選藥物的與實驗組相同條件培養(yǎng)的上述的穩(wěn)定的細(xì)胞； 若實驗組中報告基因的表達(dá)水平高于對照組，表明候選藥物可提高VEGF表達(dá)水平或具 有促血管新生的活性。
[0023] 更進(jìn)一步地， 實驗組的報告基因的表達(dá)水平/對照組的報告基因的表達(dá)水平>150%，表明候選藥物 可能具有提高VEGF表達(dá)水平或可能具有促血管新生活性； 本發(fā)明構(gòu)建了 WVEGF啟動子為祀點的細(xì)胞篩選模型，可系統(tǒng)、有效、多方面地篩選可提 高VEGF表達(dá)水平或促血管新生活性的藥物。
【附圖說明】
[0024] 圖1質(zhì)粒構(gòu)建示意圖 圖2單克隆細(xì)胞株的構(gòu)建(巧光場和明場，200 X) 圖3構(gòu)建得到的穩(wěn)定293-pVp-E2細(xì)胞株(巧光場，100 X ) 圖4紅色巧光蛋白（E2)細(xì)胞模型功能鑒定(巧光場，100 X )， A:293-P化-E2(OygLPS);B:293-P化-E2(化gLPS) 圖5巧光素酶細(xì)胞模型(293-P化-Luc)功能鑒定 圖6 17個中藥提取物的篩選結(jié)果。
【具體實施方式】
[00巧]材料 1.1菌株與細(xì)胞株大腸桿菌菌株D冊α(四川大學(xué)國家生物醫(yī)學(xué)材料工程研究技術(shù)中屯、 505實驗室保藏）、人胚腎上皮細(xì)胞皿Κ293(四川大學(xué)國家生物醫(yī)學(xué)材料工程研究技術(shù)中屯、 505實驗室保藏）。
[0026] 1.2質(zhì)粒PSC-E2,即連接有報告基因 E2-Crimson(E2)(紅色巧光蛋白）的pSC質(zhì) 粒巧05實驗室構(gòu)建）、pSC-Luc，即連接有報告基因 Luciferase化UC)(巧光素酶）的pSC質(zhì)粒 巧05實驗室構(gòu)建）（構(gòu)建方法參見S Liu, L Ma，R Tan,et al. Safe and efficient local gene delivery into skeletal musLPS via a combination of Pluronic L64 and modified electrotransfer. Gene Therapy (2014) 21, 558-565)。
[0027] 1.3 主要試劑 LA Taq聚合酶（TaKaRa)、Pfu DNA聚合酶(F'e;rmen1:as)、Platimum? Taq聚合酶（Invitrogen);限制性內(nèi)切酶(Ferments) :MluI、Afl Π 、MunI、BamHI、NotI、Hind 虹、Xbal; T4 DNA連接酶(TaKaRa);E.Z.N.A.? 質(zhì)粒小量提取試劑盒(E.Z.N.A.? Plasmid Mini KitI, Omega)、膠回收試劑盒（BioSpin Gel Extraction Kit, Bioflux);哺乳動物 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑化ip〇fec1:amine ? 2000, Invihogen)、巧光素酶檢測試劑盒化uciferase Assay System with Reporter Lysis Buffer, Promega)、蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(Pierce ? BCA Protein Assay Kit, The;rmo)、G418(Amresco)、二甲亞諷（DMSO, Sigma)、脂多糖 (LPS，Sigma)、細(xì)胞培養(yǎng)皿(Thermo)、各種規(guī)格培養(yǎng)板(Corning);其它化學(xué)試劑除注明外， 均為國產(chǎn)分析純。
[002引 1.4 儀器 PCR儀（S1000 ? Thermal 切LPSr, BI0-RAD)、電泳儀(DYY-虹型，北京 六一儀器廠）、凝膠成像分析系統(tǒng)（ChemiDoc XRS+型，BI0-RAD)、超微量分光光度計 (Nano化op 2000，Thermo Scientific)、顯微鏡(DMIL, Leica)、倒置相差巧光顯微鏡(DMI 4000B, Leica)、C02培養(yǎng)箱(MAC0-15AC, SANYO)、超凈工作臺（SW-CJ-2N型，哈爾濱東聯(lián)公 司）、酶標(biāo)儀（化rioskan? Flash, Thermo Scientific)。
[0029] 實施例1重組質(zhì)粒的構(gòu)建 1.1試驗方法 W大鼠基因組DNA為模板，設(shè)計引物在rVEGF啟動子序列的上下游分別引入Mlul和Afl Π 酶切位點PCR擴(kuò)增得到啟動子片段:rVEGFpro(縮寫為化）（-1106bp~+113bp)(+l為基因 轉(zhuǎn)錄起始位點），正向引物的堿基序列見SEQ NO. 2，反向引物的堿基序列見SEQ NO. 3。1%瓊 脂糖凝膠電泳鑒定，乙醇沉淀回收得到各啟動子片段。分別雙酶切載體PSC-E2及各啟動子 片段(化），1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目的片段，連接載體與啟動子片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，氨 節(jié)青霉素平板抗性篩選，挑選陽性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行快速裂解鑒定，陽性者擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì) 粒，進(jìn)行酶切和PCR鑒定，對鑒定成功的質(zhì)粒進(jìn)行測序，最后獲得重組質(zhì)粒P化-E2。
[0030] 同理制備獲得重組質(zhì)粒P化-Luc。
[0031 ] 1.2實驗結(jié)果 如圖1的示意圖所示，本研究構(gòu)建了兩種報告基因體系，其中報告基因 E2為紅色巧光蛋 白，用于快速定性觀察和判斷;Luc為巧光素