專利名稱：一類新的抑制新生血管的小肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地，涉及一類新的抑制新生血管的小肽，所述的小肽是源于胎盤生長因子(Placenta Growth Factor,P1GF)的多肽。本發(fā)明還涉及所述多肽的制法和應(yīng)用以及含所述多肽的藥物組合物。
背景技術(shù)：
新生血管的形成是一個極其復(fù)雜的過程，它包括現(xiàn)存血管的擴(kuò)張、血管通透性的增加、血管周圍基質(zhì)的降解、內(nèi)皮細(xì)胞的激活增殖、遷移以及新的毛細(xì)血管樣管腔的形成。在眼部，約2/3的致盲性疾病均與病理性新生血管有關(guān)，例如單純皰疹性角膜基質(zhì)炎引起的角膜新生血管，年齡相關(guān)性黃斑變性中的脈絡(luò)膜新生血管，以及糖尿病視網(wǎng)膜病變或早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變中的視網(wǎng)膜新生血管等。目前臨床上，對于眼部病理性新生血管常規(guī)運(yùn)用激光光凝、光動力學(xué)療法(Wiotodynamic therapy, PDT)以及經(jīng)瞳孔溫?zé)岑煼?(Thermal transpupillary therapy,TTT)等進(jìn)行治療。然而，這些治療手段不僅對局部組織易造成破壞，此外其遠(yuǎn)期療效也并不十分令人滿意。因此，近年來人們不斷嘗試開發(fā)治療眼部病理性新生血管更有效的方法。在開發(fā)有效的血管新生抑制劑時，應(yīng)充分考慮到眼科用藥的特殊性。第一，眼部存在多個解剖性和功能性的屏障。全身給藥常常由于血-房水屏障和血-視網(wǎng)膜屏障而無法在眼組織局部達(dá)到足夠的藥物濃度；局部給藥，如玻璃體腔注射，大于76. 5kDa的大分子在理論上很難穿透視網(wǎng)膜作用于視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜新生血管。對于眼表給藥，藥物必須要先后穿透親脂性的角膜上皮細(xì)胞緊密連接和親水性的角膜基質(zhì)，因此只有具備適當(dāng)脂溶性、低分子量或能與眼表組織內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)體(如氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體、寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)體等)結(jié)合的藥物才能到達(dá)前房發(fā)揮作用。第二，藥物在親水的淚液、房水、玻璃體液中溶解的程度與其有效性呈正相關(guān)。第三，基于上述主要原因，眼科用藥的生物利用度很低；要使之提高，可加大給藥的濃度。用于治療腫瘤新生血管的化合物毒副作用較為明顯，全身和局部均無法高劑量給藥。此外，分子量較大的外源性蛋白質(zhì)也是敏感的異物源，可對眼部組織(如葡萄膜)造成免疫損傷。第四，目前雖然已經(jīng)有一系列相對安全的內(nèi)源性血管新生抑制劑被先后證實(shí)，如血管抑素(angiostatin)，它由纖溶酶原 Kringle 結(jié)構(gòu)域 1-4 (plasminogen Kringle 1-4) 組成，可明顯抑制血管依賴性腫瘤的生長，但由于其分子量較大且空間構(gòu)象復(fù)雜，故在制備過程中存在重組表達(dá)純化工藝繁瑣和內(nèi)毒素殘留等不足。正是由于上述種種條件的限制，目前用于治療眼部新生血管的藥物十分有限， 比如重組抗人VEGF單克隆抗體bevacizumab (Avastin)、重組抗人VEGF單克隆抗體片段 ranibizumab (Lucentis)等，但它們價格高昂，并且需反復(fù)經(jīng)玻璃體腔給藥，甚至可引起血
管栓塞等風(fēng)險。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種適于眼球組織的有效安全的小分子新生血管抑制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一類適于眼球組織的有效安全的可抑制血管新生的小分子多肽以及其片段、類似物和衍生物。本發(fā)明的另一目的是提供含所述多肽的制法和應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種下式I表示的多肽，或其藥學(xué)上可接受的鹽[XaaO]-[Xaal]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9] -[XaalO]-[Xaal1]-[Xaal2]-[Xaal3]-[Xaal4]-[Xaal5]-[Xaal6]-[Xaal7]-[Xaal8] (I)式中，XaaO是無，或1_3個氨基酸構(gòu)成肽段；Xaal是選自下組的氨基酸Val或Leu ；Xaa2是選自下組的氨基酸Ser或Thr ；Xaa3是選自下組的氨基酸:Leu, lie，Val，或Ala ；)(aa4是選自下組的氨基酸Leu，lie，Val，或Ala ；Xaa5是選自下組的氨基酸Arg或Lys ；Xaa6是選自下組的氨基酸Cys或kr ；Xaa7是選自下組的氨基酸Thr或kr ；Xaa8是選自下組的氨基酸Gly或Ala ；Xaa9是選自下組的氨基酸Cys或kr ；XaalO是選自下組的氨基酸Cys或kr ；Xaall是選自下組的氨基酸Gly或Ala;Xaa 12是選自下組的氨基酸Asp或Glu ；Xaa 13是選自下組的氨基酸Glu或Asp ；Xaa 14是選自下組的氨基酸Asn或Gln ；Xaal5是選自下組的氨基酸:Leu, lie，Val，或Ala ；Xaa 16是選自下組的氨基酸His或Arg ；Xaa 17是選自下組的氨基酸Cys或kr ；XaalS是選自下組的氨基酸無，或1_3個氨基酸構(gòu)成肽段；并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性，且所述多肽的長度為17-23個氨基酸。在另一優(yōu)選例中，XaalS是3個氨基酸構(gòu)成的肽段。更佳地，所述的肽段為VPV、在另一優(yōu)選例中，XaaO為Cys。在另一優(yōu)選例中，所述多肽的長度為18-21個氨基酸。在另一優(yōu)選例中，所述多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO :1、2、3或4所示氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO :1、2、3或4所示氨基酸序列經(jīng)過1_5個(較佳地1_3，更佳地 1-2個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的衍生多肽保留了 > 70%的SEQ ID NO 1的所示多肽的抑制血管新生活性。在另一優(yōu)選例中，所述的衍生多肽與SEQ ID NO 1的相同性彡80 %，較佳地 ^ 90% ；更佳地彡95%。本發(fā)明還提供了抑制血管新生功能的、式I化合物的二聚體和多聚體形式。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的核酸分子，它編碼本發(fā)明上述的多肽。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，它含有(a)本發(fā)明上述的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽；和(b)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。在另一優(yōu)選例中，所述組合物的劑型為眼藥水、針劑(如眼周和眼內(nèi)注射液)、眼用凝膠或眼藥膏。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物為緩釋劑型。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種本發(fā)明所述多肽或藥學(xué)上可接受的鹽的用途， 它們被用于制備抑制血管新生或防治與血管新生相關(guān)疾病的藥物。在另一優(yōu)選例中，所述的與血管新生相關(guān)疾病的選自下組新生血管性眼病、腫瘤、缺血性心臟病、非炎癥性心肌病、冠狀動脈硬化、閉塞性動脈硬化、動脈栓塞、動脈血栓、 Berger's病、慢性炎癥、炎癥性腸病、潰瘍、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮癥、銀屑病、不育癥或肉瘤狀病等。在另一優(yōu)選例中，所述的新生血管性眼病包括累及脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜、角膜或虹膜， 包括老年性黃斑變性、增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜血管阻斷性疾病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、角膜感染、新生血管性青光眼等。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種抑制哺乳動物血管新生的方法，包括步驟給需要的對象施用本發(fā)明所述的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽。在另一優(yōu)選例中，所述的對象是人。在另一優(yōu)選例中，所述的血管新生是與新生血管性眼病相關(guān)的血管新生。


下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。圖1顯示了小肽ZYl的高效液相色譜分析的純度鑒定。圖2顯示了小肽ZYl對雞胚尿囊膜上新生血管的影響。其中，圖A :PBS組(陰性對照組)；圖B 小肽ZYl低濃度(2ug/ul)組；圖C 小肽ZYl高濃度(10ug/ul)組。圖D中， 縱坐標(biāo)為濾紙片周2. 5mm范圍內(nèi)3_5級微血管數(shù)。圖3A至3C分別顯示了小肽ZY2-4對雞胚尿囊膜上新生血管的抑制作用。其中， 縱坐標(biāo)為濾紙片周2. 5mm范圍內(nèi)3_5級微血管數(shù)，*表示P < 0. 05 ；^表示P < 0. 01。圖4A顯示小肽ZYl對小鼠角膜病理性新生血管的影響小肽ZYl明顯具有抑制新生血管的效應(yīng)。圖中，*表示小顆粒所在部位，Δ表示新生血管生長部位。圖4Β中，橫坐標(biāo)分別為1 空白對照組(即陰性對照組)；2 =VEGF組(即陽性對照組)；3 =VEGF+小肽ZYl低濃度(lug/粒)組；4 =VEGF+小肽ZYl中濃度(5ug/粒)組； 5 =VEGF+小肽ZYl高濃度(IOug/粒)組；縱坐標(biāo)為小鼠角膜病理性新生血管面積(mm2)。 ** 表示:P < 0. 01。圖5顯示了小肽ZYl對小鼠視網(wǎng)膜病理性新生血管的影響小肽ZYl明顯具有抑制新生血管的效應(yīng)。圖中，橫坐標(biāo)分別為1 空白對照組PBS(即陰性對照組)；2 小肽ZYl 低濃度(500ng/ul)組；3 小肽ZYl中濃度(lug/ul)組；4 小肽ZYl高濃度(2ug/ul)組； 縱坐標(biāo)為小鼠視網(wǎng)膜病理性新生血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)；**表示P < 0. 01。圖6顯示小肽ZYl對原代人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs增殖的影響小肽ZYl明顯具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的效應(yīng)。圖中，橫坐標(biāo)分別為1 無血清培養(yǎng)基組(即陰性對照組)；2 VEGF組(即陽性對照組)；3 VEGF+小肽ZYl (lug/ul)組；4 VEGF+小肽ZYl (1 Oug/ ul)組；5 =VEGF+ 小肽 ZYl (25ug/ul)組；6 =VEGF+ 小肽 ZYl (50ug/ul)組；縱坐標(biāo)為原代人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的0D490值；**表示P < 0. 01。圖7顯示小肽ZYl對原代人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs遷移的影響小肽ZYl明顯具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移的效應(yīng)。圖中，橫坐標(biāo)分別為1 無血清培養(yǎng)基組(即陰性對照組)；2 VEGF組(即陽性對照組)；3 VEGF+小肽ZYl (lug/ul)組；4 VEGF+小肽ZYl (1 Oug/ ul)組；5 =VEGF+ 小肽 ZYl (25ug/ul)組；6 =VEGF+ 小肽 ZYl (50ug/ul)組；縱坐標(biāo)為人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞平均遷移率；**表示P < 0.01。圖8顯示小肽ZYl對原代人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs趨化的影響小肽ZYl 明顯具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞趨化的效應(yīng)。圖中，橫坐標(biāo)分別為1 無血清培養(yǎng)基組(即陰性對照組)；2 =VEGF組(即陽性對照組)；3 =VEGF+小肽ZYl (10ug/ul)組；4 =VEGF+小肽 ZYl (25ug/ul)組；5 :VEGF+小肽ZYl (50ug/ul)組；縱坐標(biāo)為=Transwell小室膜下表面內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)；#表示P <0.01。圖9顯示小肽ZYl對原代人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs管腔形成的影響小肽 ZYl明顯具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成的效應(yīng)。圖中，橫坐標(biāo)分別為1 無血清培養(yǎng)基組(即 陰性對照組)；2 VEGF組(即陽性對照組)；3 VEGF+小肽ZYl (lug/ul)組；4 VEGF+小肽 ZYl (10ug/ul)組；5 =VEGF+ 小肽 ZYl (25ug/ul)組；6 =VEGF+ 小肽 ZYl (50ug/ul)組；縱坐標(biāo)為人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞形成的管腔數(shù)；**表示P < 0. 01。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次制備了一類源自胎盤生長因子的、具有抑制血管新生功能的，分子量小于5kD(如僅約3k D)的小分子多肽。具體而言，本發(fā)明人應(yīng)用生物信息學(xué)的方法，基于同源性分析和生物學(xué)特性等分析，設(shè)計了數(shù)個候選序列，采用固相法將其合成后，再經(jīng)雞胚尿囊膜血管模型、VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞株增殖模型和缺氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型篩選，獲得了一類新型的、具有預(yù)防和治療血管新生功能的小分子多肽。本發(fā)明的小肽的分子量小，可透過各種眼組織屏障；水溶性好，能在中性淚液、房水和玻璃體液中保持較高的濃度；安全性高，對生物組織毒副作用?。谎劬植坑盟幧锢枚雀?，可減少劑量，從而減小全身副作用。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明?；钚远嚯脑诒景l(fā)明中，術(shù)語“本發(fā)明多肽”、“ZY多肽”、“ZY小肽”、“短肽ZY”，或“肽ZY”可互換使用，都指具有血管新生抑制活性的肽ZY氨基酸序列(SEQ ID NO 1-4)的蛋白或多肽。 此外，所述術(shù)語還包括具有抑制血管新生功能的、SEQ ID NO :1-4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)1-5個(通常為1-4個，較佳地1-3個，更佳地1-2個，最佳地 1個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數(shù)個 (通常為5個以內(nèi)，較佳地為3個以內(nèi)，更佳地為2個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/ 或N末端添加或缺失一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。此外，所述術(shù)語還包括單體和多聚體形式本發(fā)明多肽。該術(shù)語還包括線性以及非線性的多肽(如環(huán)肽)。本發(fā)明還包括ZY多肽的活性片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持抑制血管新生功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、 衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii) ZY多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(與前導(dǎo)序列、分泌序列或 6His等標(biāo)簽序列融合而形成的然后蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。一類優(yōu)選的活性衍生物指與式I的氨基酸序列相比，有至多5個，較佳地至多3 個，更佳地至多2個，最佳地1個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表I進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。一類特別優(yōu)選的衍生多肽的序列如 SEQ ID NO 3 所示。表 I
權(quán)利要求
1.一種下式I表示的多肽，或其藥學(xué)上可接受的鹽[XaaO]-[Xaal]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[Xa alO]-[Xaal1]-[Xaal2]-[Xaal3]-[Xaal4]-[Xaal5]-[Xaal6]-[Xaal7]-[Xaal8] (I) 式中，XaaO是無，或1-3個氨基酸構(gòu)成肽段；Xaal是選自下組的氨基酸Val或Leu ；Xaa2是選自下組的氨基酸Ser或Thr ；Xaa3是選自下組的氨基酸:Leu, lie，Val，或Ala ；Xaa4是選自下組的氨基酸:Leu, lie，Val，或Ala ；Xaa5是選自下組的氨基酸Arg或Lys ；Xaa6是選自下組的氨基酸Cys或kr ；Xaa7是選自下組的氨基酸Thr或kr ；XaaS是選自下組的氨基酸Gly或Ala ；Xaa9是選自下組的氨基酸Cys或kr ；XaalO是選自下組的氨基酸Cys或kr ；Xaall是選自下組的氨基酸Gly或Ala ；Xaal2是選自下組的氨基酸Asp或Glu ；Xaal3是選自下組的氨基酸Glu或Asp ；Xaal4是選自下組的氨基酸Asn或Gln ；Xaa 15是選自下組的氨基酸Leu，lie, Val，或Ala ；Xaa 16是選自下組的氨基酸His或Arg ；Xaal7是選自下組的氨基酸Cys或kr ；XaalS是選自下組的氨基酸無，或1-3個氨基酸構(gòu)成肽段；并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性，且所述多肽的長度為17-23個氨基酸。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，XaalS是3個氨基酸構(gòu)成的肽段。
3.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，XaaO為Cys。
4.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽選自下組(a)具有SEQID N0:l、2、3或4所示氨基酸序列的多肽；(b)將SEQID NO :1、2、3或4所示氨基酸序列經(jīng)過1-5個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的多肽。
5.一種分離的核酸分子，其特征在于，它編碼權(quán)利要求1所述的多肽。
6.一種藥物組合物，其特征在于，它含有(a)權(quán)利要求1所述多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽；和(b)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
7.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物的劑型為眼藥水、針劑、 眼用凝膠或眼藥膏。
8.如權(quán)利要求1所述的多肽或藥學(xué)上可接受的鹽的用途，其特征在于，用于制備抑制血管新生或防治與血管新生相關(guān)疾病的藥物。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的與血管新生相關(guān)疾病的選自下組新生血管性眼病、腫瘤、缺血性心臟病、非炎癥性心肌病、冠狀動脈硬化、閉塞性動脈硬化、動脈栓塞、動脈血栓、Berger' s病、慢性炎癥、炎癥性腸病、潰瘍、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮癥、銀屑病、不育癥和肉瘤狀病。
10. 一種抑制哺乳動物血管新生的方法，其特征在于，包括步驟給需要的對象施用本發(fā)明所述的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及預(yù)防和治療血管新生的多肽及其應(yīng)用。本發(fā)明還涉及所述多肽的制法和應(yīng)用以及含所述多肽的藥物組合物。本發(fā)明多肽具有多種優(yōu)點(diǎn)，例如分子量小，可透過各種眼組織屏障；水溶性好，能在中性淚液、房水和玻璃體液中保持較高的濃度等。
文檔編號A61P13/12GK102336811SQ201010235580
公開日2012年2月1日 申請日期2010年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月26日
發(fā)明者許迅, 趙卉, 鄭穎 申請人:上海市第一人民醫(yī)院