重組內(nèi)皮抑素的新型純化復(fù)性方法及其抗腫瘤應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程W及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及重組內(nèi)皮抑素的 新型純化復(fù)性方法及其抗腫瘤應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 抑制血管生成已經(jīng)成為臨床抗腫瘤治療的新祀點。腫瘤的發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移依賴 于腫瘤周圍的血管提供營養(yǎng)和途徑，沒有正常血供的腫瘤最大生長不超過l-2mm2。切斷腫 瘤組織的血液供應(yīng)就有可能間接殺死腫瘤細(xì)胞并抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，從而達(dá)到治療腫瘤 的目的。更重要的是，傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性化療藥物都會因劑量累積導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞毒效應(yīng)，并 且由于腫瘤細(xì)胞本身的基因異質(zhì)性導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生，極大地限制了此類化療藥物對腫瘤 的治療效果。因此聯(lián)合使用血管生成抑制藥成為了目前臨床研究的新熱點。
[0003] 目前在臨床試驗期的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制素（riiEndostatin，rhED)多 來源于真核酵母表達(dá)系統(tǒng)，造價高且產(chǎn)率低，極大地限制了該蛋白藥物的臨床推廣使用。
[0004] 原核表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的內(nèi)皮抑素因復(fù)性困難，可溶性蛋白的得率極低，研究實驗多 采用包涵體直接注射的方法進行，限制了其治療效果的有效性。
[0005] 鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)中原核表達(dá)W及酵母表達(dá)重組人內(nèi)皮抑素的困難因素，目前中 國已經(jīng)上市的一種重組人內(nèi)皮抑素其半衰期很短，僅2小時，極大地限制了其抗癌活性的 發(fā)揮。
[0006] 綜上，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)成本低廉、得率高的大規(guī)模生產(chǎn)內(nèi)皮抑素蛋白的表達(dá) 和純化方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供重組內(nèi)皮抑素的新型純化復(fù)性方法及其抗腫瘤應(yīng)用。
[0008] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種從重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制素包涵體蛋白制 備可溶性蛋白的方法，所述方法包括：
[0009] (1)將重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制素包涵體進行變性，獲得變性溶液；
[0010] (2)將（1)的變性溶液進行柱純化，獲得經(jīng)過柱純化的溶液；
[0011] (3)應(yīng)用透析液將（2)的經(jīng)過柱純化的溶液進行梯度透析；透析液包括；醋酸鋼、 尿素、甘氨酸、EDTA，透析液P冊.0 + 0. 3 ;較佳地P冊.0 + 0. 2。
[0012] 在一個優(yōu)選例中，所述的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制素的N末端起始密碼子之 后還包括H個氨基酸，依次為；精氨酸、甘氨酸和絲氨酸。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，步驟（1)中，所述的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制素包涵體溶 解于鹽酸脈中；較佳地，所述的鹽酸脈濃度為6+ 0. 5mol/L。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制素攜帶化S純化標(biāo)簽（較 佳地，His純化標(biāo)簽存在于其C端；更佳地位于C端終止子之前）；
[0015] 并且，步驟（2)中，采用Ni-NTA柱純化。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，步驟（2)中，Ni-NTA柱純化方法包括：
[0017] (a)清洗親和柱，用8mol/L的尿素（較佳地5個柱體積，溶于磯酸鹽緩沖液， P冊.0)平衡系統(tǒng)；
[0018] 化）W 5ml/min的速度上樣所述的變性溶液，上樣結(jié)束后W P冊.0的磯酸鋼（較佳 地5個柱體積）洗脫雜蛋白；和
[001引 （C)WPH4. 5的磯酸鋼收集目的蛋白。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，步驟（3)中，Wmol/L為單位，所述的透析液包括：
[0021] 透析液A;醋酸鋼0. 25,尿素3,甘氨酸0. 5,邸TA0. 4 ;
[002引透析液B;醋酸鋼0. 25,尿素2,甘氨酸0. 5,邸TA0. 4;
[0023] 透析液C;醋酸鋼0. 25,尿素1. 5,甘氨酸0. 5,邸TA0. 4;
[0024] 透析液D;醋酸鋼0. 25,尿素1，甘氨酸0. 5,邸TA0. 4;
[00巧]透析液E;醋酸鋼0. 25,尿素0. 5,甘氨酸0. 5,邸TA0. 4;
[0026] 透析液F;醋酸鋼0.2,甘氨酸0.25;
[0027] 透析液G;醋酸鋼0.2;
[0028] 依次用透析液A-G透析1次，每次24 + 4;較佳地24 + 2小時。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，透析袋內(nèi)外液的比例為1:4-6,最佳地為1:5。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（1)之前，還包括；利用大腸桿菌，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重 組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制素包涵體。
[0031] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制素的用途，用于制 備與細(xì)胞毒性化療藥物或放療療法聯(lián)合應(yīng)用W抑制腫瘤的藥物組合物或藥盒。
[0032] 在一個優(yōu)選例中，所述的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制素是利用前述任一所述的 方法制備的。
[0033] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種抑制腫瘤的藥盒，所述藥盒包括：
[0034] a)重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制素；和
[003引 扣）選自下組的化療藥物；順笛或環(huán)磯醜胺。
[0036] 在一個優(yōu)選例中，所述的腫瘤包括；肺癌，肝癌，乳腺癌，黑色素瘤。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥盒中，按照重量比，所述的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑 巧憬與順笛的比例是；3~30:3;較佳地5~15:3;或
[0038] 按照重量比，所述的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制素與環(huán)磯醜胺的比例是；3~ 30:15;較佳地 5 ~15:15。
[0039] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0040] 圖1、rh邸的表達(dá)和純化。
[0041]A、SDS-PAGE膠分析。電泳條帶分別是Lanel;預(yù)染分子量標(biāo)記；Lane2 ;His親和柱 純化rh邸蛋白；Lane3JPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌全菌裂解液；Lane4;未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌全 菌裂解液。
[0042]B、免疫印跡分析。電泳條帶分別是Lanel ;純化的rh?。籐ane2 =IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌 全菌裂解液；Lane3 ;未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全菌裂解液。
[0043] 圖2、rh邸體外培養(yǎng)對人廝帶血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)的生長抑制作用。
[0044] 圖3、rh邸雞胚尿囊膜血管生成抑制作用。
[0045] 圖4、rh邸單獨用藥對荷瘤小鼠的腫瘤生長抑制作用。
[0046]A、人肺癌A549荷瘤小鼠的用藥效果；
[0047]B、肝癌QGY-7703荷瘤小鼠的用藥效果；
[0048]C、乳腺癌Bcap37荷瘤小鼠的用藥效果。
[0049]圖5、rh邸與傳統(tǒng)細(xì)胞毒性化療藥物順笛（A)，環(huán)磯醜胺度）對裸鼠肺癌A549 (A) 和黑色素瘤B16度）的協(xié)同抗腫瘤作用。
[0050] 圖6、rh邸聯(lián)合放療對裸鼠肺癌A549細(xì)胞皮下移植瘤的抗腫瘤作用。
【具體實施方式】
[0051] 本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，首次掲示一種新的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制素 (riiEndostatin，rhED)包涵體的純化和復(fù)性方法。本發(fā)明的方法可成本低廉、得率高地獲 得純化的rh邸蛋白，其生物活性優(yōu)異，藥效顯著。
[005引如本文所用，術(shù)語"含有"或"包括"包括了"包含"、"主要由……構(gòu)成（制成）"、 "基本上由......構(gòu)成"和"由......構(gòu)成"。
[0053] 蛋白的表達(dá)和純化
[0054] 本發(fā)明人嘗試了采用多種表達(dá)系統(tǒng)（如酵母系統(tǒng)，大腸桿菌系統(tǒng)）來表達(dá)rh邸蛋 白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腸桿菌系統(tǒng)可W最為高效地獲得大量rh邸蛋白，且成本低廉，但是表達(dá)獲 得的是包涵體形式的蛋白。
[0055] 原核表達(dá)系統(tǒng)（如大腸桿菌）W其易于操作、遺傳背景清楚、發(fā)酵成本低和蛋白表 達(dá)水平高等優(yōu)點，目前仍然是生產(chǎn)重組蛋白的首選表達(dá)系統(tǒng)。但是原核表達(dá)的蛋白當(dāng)高效 表達(dá)時一般W包涵體的形式沉積于細(xì)胞內(nèi)，表現(xiàn)為無活性的不溶性聚集物，如何高效地復(fù) 性蛋白是基因工程蛋白生產(chǎn)過程中最關(guān)鍵和最困難的一步。在大腸桿菌中表達(dá)的外源重組 蛋白質(zhì)包涵體，其蛋白質(zhì)分子間主要通過非共價作用相互結(jié)合在一起，送些非共價作用包 括疏水作用、范德華力、氨鍵W及離子鍵作用。包涵體溶解變性與復(fù)性是蛋白純化過程中的 最為關(guān)鍵的因素。
[0056] 依巧原核大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)從而高效（高產(chǎn)量）表達(dá)rh邸是已經(jīng)實